专利名称：细胞内生基因活性化的优化方法
技术领域：
本发明涉及细胞内基因表达的优化方法，首先，本发明涉及一个改变内生存于一个真核细胞内的目标基因的表达方法，其中借助于同源重组作用，把异源的表达控制序列或/和扩增基因引入到细胞的基因组中，而且该方法中还包括插入的外来DNA的、部位特异重组酶介导的切除，以及用其他的异源表达控制序列或/和扩增基因代替之。本发明还涉及把一个或多个结合到一个激活蛋白质或激活蛋白复合物例如一个缺氧诱发因子(HIF)上的核酸序列通过同源重组，引入到一个真核细胞的基因组内，以便修改目标基因的表达。本发明还涉及一种方法，它通过确定报道基因的表达来测定在5’部位或3，部位上的未编码的核酸片段对目标基因表达的影响。此外，本发明还涉及含有重组酶一一目标序列的DHFR负真核细胞的制备，以及插入到该重组酶一一目标序列中的核酸序列的表达。
细胞中的基因表达可以决定性地，例如对所谓的持家基因，或调节性地进行。尤其是对于必须只在细胞的一个确定的发展阶段中或在环境条件改变时必需进行调节表达。
通过与编码的核酸序列结合的有效启动子，可以在转录水平上调节该表达，并可通过阻遇物及激活剂来调节其活性。使阻遇物或激活剂结合到基因的未编码的核酸序列上，就可以起到降低或提高启动子活性的作用(L.Stryer，《生物化学》，第12章。科普出版社、海德堡，1990年)。另一方面，又可以通过一些因素，例如环境条件来调节细胞中所含的阻遇物或激活剂的量。上述激活剂的实例包括缺氧诱导因子(HIF)，它可以通过减少O2供给量诱导并导致促红细胞生成素基因表达的提高(Bianchard K.L.等人，人类促红细胞生成素基因的缺氧诱导启动子与增强子之间的协同作用，它们各自含有甾类受体响应要素，(1992年)，分子细胞生物学，12，5373-5385；Wang G.L.与SemenzaG.L.缺氧诱导因子1的特性及因缺氧造成的对DNA结合活性的调节，(1993年)，《生物化学》杂志，268，21513-21518；Wang G.L.等人，缺氧诱导因子1是一个受细胞的O2张力调节的基本的螺旋-环-螺旋-PAS异源二聚体(1995年)，美国国家科学院院报，92，5510-5514)。
此外，表达蛋白质的量取决于mRNA的稳定性。用于分解mRNA的酶的识别序列定位于mRNA的3’部位区域中，它们影响mRNA的稳定性及表达高度(Shaw G.与Kamen R.，从GM-CSF mRNA的3’-未翻译区域的保守All序列传递选择性mRNA的降解，《细胞》(1986年)，659-667。mRNA的半衰期与蛋白质的表达量有关。第三级表达调节就是转译。
基因的表达受到复杂调节机理的影响，在个别情况下，它们可以是极有区别的。
可以借助于重组DNA工艺获得蛋白质，其中利用了表达调节的识别(Sambrook等人。1989年《分子克隆》，实验室手册，Cold Spring Harbot)。在这里，使用了载体。它们包含在适合的启动子控制下，给相应的蛋白质编码的核酸序列，以及其他的用于表达蛋白质与复制载体所需的序列。可以根据已知方法，将载体加入到寄生细胞中，接着培养该细胞，并从该细胞或培养介质中获得重组蛋白质。
可以用原核细胞或真核细胞作为上述寄生细胞。原核细胞特别是大肠杆菌细胞在它们的操作中是不存在问题的，然而，在真核细胞蛋白质的重组表达方面则存在一系列的缺陷。
原核细胞与真核细胞的区别在于表达后的加工方式，细胞培养条件，以及在表达加工时参与的陪伴蛋白不同，因此，在原核细胞中制备的真核细胞蛋白质与相应的原生蛋白质相比较有很大的区别。例如，蛋白质的缩并形式与蛋白质的活性可以有所变化。在原核寄生细胞中的蛋白质通常也不能糖基化。然而，在许多情况下，一个正确的糖基化形式，例如在制备用于医药药剂的蛋白质过程中，具有显著的活性与相容性的特征。
因此，可以借用真核寄生细胞或细胞系，例如CHO(中国仑鼠卵巢)细胞，制备糖基化的蛋白质。尽管在使用真核细胞时，由于物种的区别，例如在非人类细胞中表达一个人类蛋白质时，可以在重组制备的蛋白质中出现变化。但是在许多应用方面却是无用的。
在蛋白质的重组制备过程中，可用表达载体瞬间地或稳定地转移寄生细胞。其中，特别是在大规模制备方法中，采用稳定转移的细胞。
在寄生细胞的基因组中的表达载体序列的非特异性随机整合，可以导致细胞生产率的减小或细胞的不稳定性。例如，在生产过程中使生产率下降，或者使细胞表达重组蛋白质的能力完全丧失。
提高基因表达的方法产生了基因的扩增。其中，用于编码蛋白质的核酸序列与扩增基因相结合。通过一个选择步骤，可以使两个序列达到复制扩大，这会导致表达的提高(Schimke R.T.(Ed.)(1982年)，基因扩增。Cold SpringHarbor实验室，Cold Spring Harbor，NY)。
可以用为二氢叶酸酯还原酶(DHFR)编码的核酸作为扩增基因(KaufmannR.J.Sharp P.A.(1982年)，与调节的二氢叶酸酯还原酶互补DNA基因共转染序列的扩增与表达，分子生物学杂志159601页)。
通过用氨甲喋呤实施的选择步骤，可以得到对氨甲喋呤呈抗性的细胞，而且在该细胞基因组中，为DHFR编码的，并与其相结合的核酸序列含有20-50倍的扩增(R.Knippers，1982年，分子遗传学，Thieme，Stuffgart)。
上述基因扩增的方法，可以最有效地用DHFR负细胞实施。日本专利文献JP-62265992就描述过人体的DHFR负细胞。可是应该指出，借助于在该细胞中的该序列的同源重组与扩增，却没有出现表达载体的部位特异的整合。
在实施基因扩增方法中，也会由于在该细胞的基因组中表达载体偶然整合，从而出现了上述的缺陷，例如细胞的不稳定特性。
唯有在通过同源重组，使外来DNA特异部位整合在选定的基因座上时，它导致了内生基因的活化，才有可能避免上述的缺陷。WO90/11354与WO91/09955公开了这种方法，并以基因目标为特征。其中，用载体使细胞转移，该载体中含有一个正的选择标志基因，并置于核酸序列的两侧，该序列与基因座上的序列是同源的。在该基因座上，该载体应该整合到该细胞的基因组中。在同源的核酸序列之间，还有异源的表达控制序列，以便使细胞中的目标基因的表达可得到提高。必要时，还可以有扩增基因，以便增加目标基因的复制数量。
迄今已知的基因目标方法存在一个缺点，即当以商业目的尽可能大批量制备所希望得到的高质量的蛋白质时，经常是成本高耗费大。特别是，为了选定用于表达所希望的目标蛋白质基因，最佳的表达控制序列或/和扩增基因，经常需要进行大量的、同源重组的一系列试验，由于进行昂贵的、用于实现所希望的重组作用的克隆(无性繁殖系)的分离工序，需要非常昂贵的耗费。
也可以采用同源的重组作用，以便在一个切除细胞的确定基因中进行表达及进行蛋白质的功能研究。这里是由剔除老鼠产生的。其中，通过同源重组，使为欲试验的蛋白质编码的、在胚胎干细胞中的基因被切除，经其他的处理步骤以后，该老鼠可以得到，即该基因的两个等位基因，由于失活，从无功能的蛋白质的孵育一开始，就可以进行表达。(Thomas K.R.，CapecckiM.R.，(1987年)，在老鼠胚胎衍出的干细胞中的，通过基因目标形成的定点诱变，《细胞》51503-512)。
为了对确定的基因进行组织特性及时间特性的切除与研究，可以加入Cre-Lox系统。其中，可以通过同源重组，把一个被两个loxp序列置于两侧的核酸片段插入到细胞的基因组中，接着，可以通过在该细胞中表达的Cre重组酶，重新从该基因组中切除出去(Sauer B.，Henderson N(1989年)置于哺乳动物细胞的基因组中的、在loxp部位上的部位特异DNA的重组。核酸研究17147-161；Sauer B.，Henderson N.(1990)，通过Cre重组酶的作用，使外源DNA目标插入到真核细胞的基因组中，New Biol 5441-449)。必须指出，在现有技术中，迄今没有发现，可以用Cre-lox系统或其他任一的部位特异重组酶系统，形成在真核细胞的基因组中的扩增基因或表达控制序列的部位特异整合，以达到内生基因表达的变化。
本发明的目的在于提供一个新的、可以通过同源重组使得内生基因活性化达到优化的方法，其中，至少可以部分地克服现有技术中存在的缺陷。
本发明的上述目的通过采用新的方法与载体结构得以实现，它使在真核细胞内的基因表达功能的优化可非常容易实现。本发明的第一个方面涉及改变在真核细胞中内生存在的核酸序列的表达的方法，其特征是，(a)用第一种载体转移该细胞，其中包括(i)至少一个选自第一种异源表达控制序列和第一种扩增基因的序列，(ii)一个正的选择标记基因，(iii)用于部位特异重组酶的、至少两个位于序列(i)与顺序(ii)两侧的目标序列，(iv)置于序列(i)、(ii)与(iii)两侧的DNA序列，它们与细胞基因组中的核酸载段同源，以便可形成同源的重组，(b)在一定条件下培养该转移细胞，其中可形成载体的同源重组，(c)获得根据步据(b)制得的细胞。
根据本发明的方法，可以制备一种细胞，它具有与一种异源表达控制序列和/或扩增基因有效结合的内生基因。其中，该序列被用于部位特异的重组酶，例如，Cre重组酶的目标序列的两侧。这种细胞特别适用于试验目标基因表达的优化。因为由于该用于部位重组酶的目标序列的存在，就有可能很容易地用第二种异源的表达控制序列和/或第二种扩增基因代替第一种异源的表达控制序列和/或第一种扩增基因。
按本发明术语“部位特异重组酶”是指这样的蛋白质与蛋白质复合物，它们可促进DNA在特异的DNA目标序列上的重分布，它们包括整合酶一一或解离酶一一转化酶类的部位特异的重组酶(Stark等人，Trends Genet 8(1992年)，432-439；Abremski与Hoess，《蛋白质工程》5(1992年)，87-91；Khan等人，《核酸研究》19(1991年)，851-860)，以及通过内含子编码的内核酶促进的部位重组酶(Perrin等人，EMBO J.12(1993)，2939-2947)。较佳的重组酶蛋白质是选自酿酒酵母的2μ附加体的FLP重组酶(如，Falco等人，《细胞》(1982)，573-584；Cox，美国国家科学院院报，80(1983)，4223-4227；Konslaki等人，新生物学家4(1992)，551-557)，大肠杆菌噬菌体P1的Cre重组酶(如，Sauer与Henderson(1989).Supra)，由rouxii接合酵母质粒pSRl制成的R重组酶(Matsuaki等人，《细菌学》杂志172(1990)，610-618)。由果绳属克鲁维酵母菌属质粒pKDl制成的A重组酶(chen等人，《核酸研究》14(1986)，4471-4481)，由Waltii克鲁维酵母菌属质粒pKWl制成的A重组酶(chen等人.《基因微生物》杂志138(1992)，337-345)，一种λ-Int-重组系的成分(Landy，生物化学年度综述5(1989)，913-949)，以及一种噬菌体μ的Gin重组系的成分(Klippel等人，EMBOJ.12(1993年)，1047-1057)。此外，还有欧洲专利文献EP-B-0707599描述的由一种部位特异的重组酶与一种核受体或与其适应的配位结合的结构域所组成的融合蛋白。本发明的方法最好采用Cre重组酶的目标序列，即loxP序列。
通过异源基因的部位特异整合，重组制备蛋白质会带来一些缺点。与此相反，根据本发明的方法，通过同源重组，会有利于部位特异的内生的基因活化。通过对异源表达控制序列与扩增基因的相适应重组的简单选择，我们就会有更大的可能性得到具有稳定特性的最佳制备克隆，其中，可以制备一种蛋白质，该蛋白质在结构与活性方面与原蛋白质一致。
所选择的同源序列置于异源表达控制序列扩增基因、正的选择标记基因与重组酶目标序列的两侧，并可以据专利文献WO90/11354与WO91/09955所述的方法获得。
此外，在该同源序列中也可以含有改性因子，它们可在被表达的蛋白质中引起突变，例如，引起个别氨基酸或整个氨基酸片段的插入或/和缺失，以及点突变。
根据本发明的方法，可以只在一个方法步骤上，不仅能改变内生核酸序列的表达高度，而且同时还可以在内生的核酸序列的编码区域内引起突变。为此，本发明的方法特别有利于制备用于医药的蛋白质。这种蛋白质应该显示出，除了蛋白质的效力提高的突变外，与原蛋白质相比较，并没有其他的变化。
本发明可以采用任一个真核细胞，特别是哺乳动物的，尤其是人体的细胞。根据本发明的方法，可以用非无限增殖化细胞，例如成纤维细胞，或也可用无限增殖化细胞，如肿瘤细胞系加以实施。最好是用无限增殖化细胞实施。
在实施本发明方法中所选用的溶液与介质最好是这样选择，它们使得在每一个方法步骤中都有最佳条件。用介质完成对细胞的培养，该介质中含有用于细胞充分生长所需的全部物质，必要时是缓冲的。这些细胞最好是可在不含血清的介质中培养。所用的上述细胞最好是Namalwa-，HT1080或Hela S3细胞。
根据本发明的方法，可以使一种内生存于细胞中的核酸序列的表达得到优化。也就是说，通过选定一种最佳表达控制序列，一种最佳扩增基因或/和通过选定一种表达控制序列与扩增基因的最佳结合，使一种目标基因的表达得到优化。
可用任一种核酸序列作为异源表达控制序列。在前者整合到细胞基因组中后，就会影响目标基因的表达。它包括核酸序列，后者直接与转录成分相互作用，例如，可以接受转录引发因子或RNA聚合酶。而核酸序列，通过与激活剂或阻遇物的相互作用，将促进对转录的影响，该异源表达控制序列最好包括一个启动子/增强子，特别是病毒性启动子，最好是一个CMV启动子。
上述异源表达控制序列也可以包括一个在其3’部位上未编码的序列。上述在3’部位上未编码的序列可以对mRNA起稳定或不稳定性的作用，并因此提高或降低其半衰期。通过加一种稳定mRNA的序列，就会提高mRNA的半衰期，并为此提高被其编码的蛋白质的产率。
根据一个较佳的实施方案，通过上述同源重组，可以去掉目标基因的内生表达控制序列。当该内生序列包括结合阻遇物的序列时，这就特别有利了。一种在3’部位上未编码的序列也可以显示降低该表达的作用。该序列对mRNA起不稳定性的作用。由此可以使转释的蛋白质量减少。
此外，本发明的方法还可以选择一种最佳化的扩增基因。该扩增基因最好是以可表达形，即以与相应的启动子有效结合的形式插入的，并安置在载体上，以使得在把载体同源整合在真核细胞的基因组后，该扩增基因就处于靠近目标基因的空间位置上。实施上述扩增步骤，可以导致细胞中目标基因复制数量的增加。由此，可以形成内生的核酸序列的表达的进一步提高。上述扩增基因可以包括二氢叶酸酯还原酶(DHFR)，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶以及该基因的突变蛋白。上述扩增基因最好是一种DHFR基因或其突变物(Simomsen等人，《核酸研究》1998，16(5)2235-2246)，特别是含有内生的DHFR基因的细胞。
可以用每个适用于真核细胞的抗性基因作为正的选择标记基因，它可导向一种可选择的表现型，例如一种抗菌抗性。该正的选择标记基因最好是一个新霉素、卡那霉素、原生霉素或潮霉素的抗性基因。该正的选择标记基因最好是以可表达的形式，即与一个合适的启动子有效结合的形式存在。
若使用一种负的选择标记基因，则通常除了上述的正的选择步骤外，还辅加地实施一个第二个负的选择步骤。这会带来一个优点，即在实施上述选择步骤以后，这些鉴定的克隆就会含有更少的假的正克隆部分，即偶然地整合在基因组中的载体上。上述负的选择标记基因最好是一种胸苷激酶基因(TK)或/和次黄嘌呤一鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶基因(HGPRT)。
由于上述部位特异的重组酶的目标序列的存在，可以使定位于该序列中间的核酸序列，在使用部位特异重组酶的情况下，从该细胞的基因组中切除出去。上述定位于目标序列之间的核酸序列最好通过细胞中的相应重组酶瞬间激活，而从该基因组中切除出去。通过下列步骤实现上述的重组酶的瞬间激活，(a)用第二种载体转移细胞，其中包括为该重组酶编码的、并与在该细胞中活化的或可活化的表达控制序列有效结合的核酸序列，和(b)在使该重组酶表达和活化的条件下，培养由此转移的细胞，(c)必要时，获取该细胞。
在使用重组酶/核受体-融合蛋质时，可以通过有控制地加入用于核受体的配位体，实现细胞的瞬间激活。
在除去位于该目标序列之间的DNA以后，可以把剩余的目标序列，例如，loxP序列，再用于其他的方法步骤中。
在另一个较佳实施方案中，本发明方法的特征是，(a)用第三种载体转移该细胞，包括(i)至少一种选自第二种异源表达控制序列与第二种扩增基因的序列，(ii)一个正的选择标记基因，它最好与第一种载体的正的选择标记基因不同，(iii)至少两个位于序列(i)和(ii)两侧的重组酶一目标序列，(iii)在一定条件下培养该转移了的细胞，其中被目标序列置于两侧的序列整合在细胞基因组的目标序列上，(c)获得步骤(b)的细胞，(d)必要时，可以各用改变的表达控制序列和/或扩增基因至少重复一次(a)至(c)的步骤。
根据本发明的方法，可以容易与迅速地测试许多表达控制序列、扩增基因或表达控制序列与扩增基因的结合物。因此，不必进行为调查每单个目标基因的最佳表达/放大系统所进行的、为每单个异源表达控制序列或每单个扩增基因的耗时耗费的部位特异整合。
在第三种载体中的正的选择标记基因最好区别于在第一种载体中的正的选择标记基因，以便能简化选择方法，并使假的正克隆的数量达到最少。
本发明所用的载体重组酶目标因可以与天然存在的目标基因相适应，或者必要时呈现突变，其中不会削弱部位特异重组的效力。
本发明的另一个目的是得到一种用于同源重组的载体，特别是用于在一个细胞的基因组内部位特异地引入重组酶目标基因的载体，其中包括(i)至少一种选自一种表达控制序列与一种扩增基因的序列，(ii)一个正的选择标记基因，(iii)至少两种置于序列(i)与(ii)两侧的、用于部位特异重组酶的目标序列，(iv)该置于序列(i)、(ii)与(iii)两侧的DNA序列与细胞基因组中的核酸截段同源，并可形成一个同源的重组，(v)必要时，一个负的选择标记基因。
所有的本发明的载体最好还含有为在适宜的宿主细胞内的繁殖和增加数量所需的序列成分，例如复制源，选择标记基因，等。
本发明的另一个目的是得到一种载体，特别是借助一个部位特异重组酶系统，旨在向细胞的基因组内引入DNA的载体，其中包括(i)至少一种选自一种异源表达控制序列与一种扩增基因的序列，(ii)一种正的选择标记基因，(iii)至少两种位于序列(i)与(ii)两侧的重组酶一目标序列。
本发明的又一个目的是得到一种真核细胞，特别是人体的细胞，可以据上述的方法得到该细胞。该细胞，例如一种人体的细胞，具有一些特征，即(a)它含有至少一种染色体局限的序列，选自与一种内生存在的核酸序列相控制连接的异源表达控制序列和一种扩增基因，(b)该序列被重组酶一目标序列置于两侧。
本发明的另一个目的是提供一种改变内生存在于真核细胞中的核酸序列表达的方法，其特征是，(a)用一种载体转移该细胞，包括(i)至少一个激活蛋白质，例如能结合缺氧(Hypoxia)诱导因子(HIF)的核酸序列(ii)一个正的选择标记基因，(iii)置于序列(i)与(ii)两侧的DNA序列，它们与细胞基因组中的核酸截段同源，以便可形成同源重组，(b)在一定的条件下培养该转移了的细胞，该条件可使载体进行同源重组，(c)获得根据步骤(b)制得的细胞。
通过核酸序列的基因整合，其中结合一个或多个激活蛋白质(通过在核酸序列上的结合提高基因表达的蛋白质)，在目标基因表达控制序列区域内，特别是在其调节区域内，令人惊奇地是不会降低目标基因的表达，相反地，甚至在适宜的培养条件下，还会提高内生存在的目标基因的表达或者还会导诱未表达的、内生存在的目标基因的表达。
较适宜的激活蛋白质包括缺氧诱导因子HIF-1α与HIF-1β，以及干扰素调节因子1(IRF-1)，其中，通过在干扰素感序列(ICE)上的结合，可以提高转录(Tanaka.N.，Kawakami T.，Taniguchi T.，分子细胞生物学(1993)8月，13(8)4531-4538)。
经过一个或多个的、结合HIF或其他激活蛋白质的核酸序列与内生存在目标基因的有效结合，可以在选定的较适宜培养条件下，调节目标基因的表达。这对大规模的制备是特别有利的。因为蛋白质的表达会导致制备过程达到最佳化。这将有利地使合成产物在培养介质上清液中的平均停留时间缩短。由此，也可以使不希望得到的蛋白质分解产物的量减少。这势必会对后续的纯化步骤产生积极的影响，即降低制造成本，并会使最终产品的质量得到提高。
根据本发明的方法，可以满足一个或多个结合激活剂的核酸序列与目标基因有效结合的要求。最好是采用两个结合HIF的核酸序列。特别是选自根据序列ID No.1的53bp序列，根据序列1D No.2的43bp序列，一种对该序列同源的序列，或一种在严格条件下与该序列杂交的序列的结合HIF的核酸序列。
使用两种结合HIF的核酸序列，会令人惊奇地获得协同作用。由此，正如只单独使用单个序列一样，会使内生核酸的表达得到更大的提高。
一旦需要，与在目标基因区域内引入的激活序列相结合的激活蛋白质的表达，可以诱导到该细胞中或/和得到提高。这可以通过用一种载体来转移该细胞来实现，其中包括(i)一种用于编码激活蛋白质的核酸序列，它们与在这个细胞中活性的表达控制序列操纵结合，(ii)必要时，一个正的选择标记基因。
我们可以使用每种为激活蛋白质编码的核酸序列，其表达产物可以结合到在该基因组内整合的结合激活剂的核酸序列。该激活蛋白质最好是一种HIF-1α或/和HIF-1β蛋白质。当该内生存在的核酸序列已经含有结合激活剂或结合HIF的核酸序列时，只要在该细胞内加入一种载体，即可满足要求。其中包括为激活蛋白质或HIF蛋白质编码的核酸序列，后者可以与在细胞内活化的表达控制序列有效地结合，以及，必要时一个正的选择标记基因。
上述与为激活蛋白质编码的核酸序列有效结合的表达控制序列可以是可诱导的，以致于通过适当的培养条件，例如加入激素或重金属，可以达到附加的激活作用。由此，可以使内生目标基因的表达可以诱导出对制备过程最佳化的时刻。
使用一种结构上活性的表达控制序列有利于使该激活蛋白质不依赖于加入到培养介质中的激活剂，就可以得到结构上的表达。
当上述结合激活蛋白质的核酸序列是一种结合HIF的核酸序列时，就可以通过适当的培养条件，如0.1-2％的O2浓度，诱导出该目标基因的表达。
本发明的另一个目的是得到一种用于同源重组的载体，其中包括，(i)至少一种结合激活蛋白质的核酸序列，(ii)一个正的选择标记基因，(iii)位于序列(i)与(ii)两侧的DNA序列，它们与一个细胞基因组中的核酸截段同源，以便可形成同源重组。
本发明的另一个目的是得到一个真核细胞，特别是人体细胞，可根据上述方法制得该细胞。该细胞的特点是，至少含有异源的、染色体定位的、结合激活蛋白质/复合物的、并与内生存在于细胞内的基因有效结合的核酸片段。借助于上述部位特异的重组系统，可以替换基因组内的结合激活蛋白质的核酸片段。以致于可以容易地鉴别针对一个确定的目标基因的最佳化的激活剂序列。
因此，本发明的另一个方面还涉及一种方法，即一种测验在真核细胞中内生存在的目标基因范围的、未编码的核酸序列对该表达的影响的方法，其特征是，(a)用一种载体转移该细胞，其中包括，(i)一种异源的、在细胞中活性的或可能激活的、并与报道基因操纵结合的表达控制序列，(ii)目标基因范围内的、在5’部位或3’部位上未编码的核酸片段，(b)在一定条件下培养该细胞，在该条件下该表达控制序列是活性的，(c)测定报道基因的表达。
用本发明的方法可以容易地确定，为什么必须使异源的表达控制序列安置于基因组内的目标基因区域内，以便使目标基达到一个最佳的表达率，而且在目标基因区域的、在5’部位或/和3’部位上未编码的序列的存在或不存在对表达有什么样的影响。上述试验载体最好瞬间转移到细胞中，并确定报道基因的表达。为此，可以迅速并费用适中地测试许多的异源表达控制序列与目标基因的组合试验，以及许多不同的表达控制序列试验。上述异源的表达控制序列包括可以与转录成分、例如转录起始因子或RNA聚合酶、直接相互作用的核酸序列、以及通过与激活剂或阻遏物的相互作用可以影响转录的核酸序列。该异源的表达控制序列宜为一个启动子/增强子，尤其是一个病毒性启动子，而最好是一个CMV启动子。特别是在具有昂贵的制备步骤的方法中，本发明的方法有助于大大降低成本。例如，在制备动物，例如老鼠、羊或牛的转移基因时，其中，应该提高在确定细胞型中的确定的内生核酸序列的表达。
从目标基因区域选出的、在5’部位或3’部位上未编码的核酸片段最好是安置于载体内的相应于其基因组布置的、报道基因的5’部位或3’部位上。
我们可以采用一般技术人员熟悉的报道基因，它可以在细胞中表达。最好采用为氯酶素-乙酰基-转移酶(CAT)，β-半乳糖苷酶(β-Gal)或LacZ编码的报道基因。另一方面，也可以采用用于编码相关蛋白质如EPO的报道基因。并用免疫方法，如ELISA，证实其表达。
在一个较佳实施方案中，至少两个载体-它们彼此含有不同的在5’部位或/和3’部位上未编码的目标基因的核酸片段-向各自不同的细胞中转移，而且可用一般技术人员已知的方法，证实不同细胞的报道基因的表达。用本发明的方法可以轻松地证实，什么样的异源表达控制序列的配置可对一个确定的宿主细胞提供一个最佳化的表达。
另一方面，本发明还涉及DHFR-负的真核细胞，最好是哺乳动物细胞或人体细胞的制备方法，其特征是，(a)用第一种载体转移该细胞，其中包括(i)至少一种用于部位特异重组酶的目标序列，(ii)置于序列(i)两侧的DNA序列，它们与内生存在于该细胞中的DHFR核酸序列同源，以便可形成同源的重组，(iii)必要时，一种正的选择标记基因，以及一种负的选择标记基因，(b)在一定条件下培养该转移细胞，其中可使载体实现同源重组，(c)获得根据步骤(b)的细胞。
在本发明方法中，根据上文描述来选择与使用上述重组酶一目标基因与同源序列。
该正的选择标记基因被置于与DHFR基因同源的序列之间。上述负的选择标记基因被置于上述同源序列之外。
在DHFR-基因座上实现同源重组后，合成没有功能的细胞中的DHFR蛋白质。该载体序列可以如此安置，以使DHFR基因的启动子失活，或/和由于在DHFR基因的编码序列中的插入或缺失，再次合成没有功能的DHFR蛋白质。
为了使DHFR基因的两个等位基因失活，首先，用本发明的载体转移、选择和获得该细胞。该细胞中的DHFR基因的一个等位基因失活，也就是说，它们对于DHFR基因而言是异合子的(+/-)。然后，可以再次用本发明的载体转移该细胞。该载体最好含有与第一种载体的不同的正的选择标记基因。经选择步骤后获得该细胞。其中的两个DHFR等位基因已失活。或者选择压力的提高导致了基因转变，并使两个等位基因失活(参照，Mortensen等人，分子细胞生物学，12(1992)，2391-2395)。
本发明的方法可提供一种DHFR负的细胞，其应用有利于基因扩增方法。它没有合成内生的DHFR蛋白质。在实施用于扩增异源的核酸序列的选择步骤中，该序列与用于编码DHFR蛋白质的核酸序列相结合，而且对内生的DHFR基因的表达产物没有产生不利影响。因此，使基因扩增的效率提高了。
可以用每种适合的选择标记基因作为正的选择标记基因，它可以导致可选择的表现型。例如抗菌素抗性。这个为该正的选择标记基因编码的核酸序列最好是新霉素、卡那霉素、原生霉素或潮霉素的抗性基因。
我们可以使用一般技术人员公知的每种负的选择标记基因。用来编码负的选择标记基因的核酸序列最好是胸苷激酶基因(TK)，或/和次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶基因(HGPRT)。
这个被重组酶目标基因置于两侧的序列，可以通过相应重组酶的瞬间激活，从细胞基因组中切除出去，例如，通过(a)用一种载体转移该细胞，其中包括一种用来编码重组酶、并与在该细胞中活性的表达控制序列有效结合的核酸序列，(b)在一定条件下培养上述转移细胞，其中该重组酶被表达，而且是活性的，(c)必要时，获取该细胞。
用本发明的方法，不仅可以使DHFR基因失激活，而且通过重组酶参与的反应，使置于重组酶一目标基因之间的DHFR基因的序列、以及加入的选择标记基因从细胞基因组中切除。
当上述被重组酶一目标基因置于两侧的序列含有正的选择标记基因时，含有该序列的细胞是抗生素抗性的。它可以容易地根据一般技术人员公知的方法，进行选择。
本发明方法制备DHFR-负细胞的另一个优点在于，可以用一般技术人员已知的方法识别其特性，而且该细胞还可以被用于其他方法中。此外，可以通过在DHFR基因座上引入的重组酶-目标序列，把部位特异的核酸序列整合在该基因组中。
本发明的另一个较佳实施方案涉及向真核细胞引入异源DHFR基因的方法，其特征是，把按上述方法制得的DHFR负细胞，(a)用第三种载体转移，其中该载体包括(i)必要时，一种正的选择标记基因，它最好可被第一种载体的正的选择标记基因所识别，(ii)一种用来编码HDFR的核酸序列，(iii)一种待扩增的、用来编码蛋白质的核酸序列，其中，来自部分序列(i)、(ii)与(iii)的核酸序列在5’部位与3’部位上各自被至少一个重组酶一目标序列置于两侧，(b)在一定条件下培养该转移细胞，在该条件下上述被重组酶一目标序列置于两侧的核酸序列被整合到已经在细胞的基因组中存在的重组酶一目标细胞上，(c)获取根据(b)步骤得到的细胞。
上述正的选择标记基因、DHFR基因、以及为所希望的蛋白质编码的目标基因，最好各自与一种在该细胞中活性的或可激活的表达控制序列有效地结合。原则上也可以是一种具有内部核糖核蛋白体的结合部位的多顺反子结构。然而，上述目标基因待扩增的核酸序列应该被分离的启动子所驱动。上述表达控制序列最好是病毒的启动子/增强子。最好是用于表达蛋白质的CMV启动子。
本发明的在一个细胞基因组中的异源序列的整合最好是部分特异地进行。因此，排除了异源序列对基因组序列的干扰。所以，由此产生的上述缺点，例如不稳定的制备克隆，就可以得到避免。
为了提高异源的用来编码蛋白质的核酸序列的表达率，可以在已知的方法步骤之后，再实施一个用氨甲碟呤的扩增步骤。
本发明的目的还涉及一种载体，其中包括(i)必要时，一个正的选择标记基因，(ii)一种为DHFR编码的核酸序列，(iii)一种为所希望的蛋白质编码的，可表达的核酸序列，其中来自部分序列(i)、(ii)和(iii)的核酸序列在5’部位和3’部位上各自被至少一种重组酸-目标序列置于两侧。
本发明的目的还涉及一种用于同源重组的载体，其中包括(i)必要时，一个正的选择标记基因，(ii)至少一种重组酶一目标序列，它被放置于该序列(i)的两侧，(iii)置于序列(i)和(ii)两侧的DNA序列，它们与内生存在于细胞中的DHFR一核酸序列同源，以便能形成同源的重组，(iv)必要时，一个置于同源序列(iii)之外的负的选择标记基因。
本发明还涉及一种真核细胞，最好是人体细胞，可根据上述方法制备该细胞。该细胞的特征在于，(a)至少一种内生的、为DHFR编码的核酸序列是失活的，最好是两个内生的等位基因，(b)在为DHFR编码的核酸序列区域内，至少一种重组酶一目标序列整合在该基因组中。
本发明的另一个目的是一种真核细胞，最好是人体细胞，其特征是，在内生的DHFR基因座范围中的异源核酸序列，其中包括(i)一种为DHFR编码的核酸序列，(ii)一种为希望的蛋白质编码的核酸序列，(iii)至少一种重组酶一目标序列。
用下列实施例，附图与序列记录进一步详述本发明。
附图描述
图1(A)示出了一种用于同源重组的载体，它被用作第一种载体。HR同源序列，Seql第一个异源表达控制序列，R1正的选择标记基因，LoxP带定位的LoxP序列，(B)显示基因组的序列(a)经过有效的同源重组以后，
(b)经过一个被LoxP序列置于两侧的序列的一个Cre重组酶催化切除以后，(C)显示一种用于Cre重组酶参与的整合的载体，它包括一个放置于LoxP序列之间的序列，(c)显示在一种第二种载体整合在LoxP序列后的基因组序列。R2正的选择标记基因，它必要时不同于R1，Seq2第二个异源表达控制序列。
图2(A)显示一种用于同源重组的载体，HR同源序列，R-box正的和，及必要时，负的选择标记基因，LoxP具有定位的LoxP序列，HSV-tk疤疹单纯胸苷激酶。
(B)显示一种为同源重组的、具有单侧面同源序列的载体。
图3显示CMV启动子/HIF控制的、HeLa S3细胞的促红细胞生成素(EPO)表达，用载体pHYG、pHIF-1α与pARNT(pHIF-1β)转移该细胞，在转染第3，4与5天后，测定在细胞上清液中的EPO表达(促红细胞生成素浓度是以μg/ml计)。
pHYG控制载体，pHIF-1α受一个SRα启动子控制的HIF-1αcDNA，pARNT受一个CMV启动子控制的HIF-βcDNA。
图4显示4种不同的载体，它们各自含有一个CMV启动子(C)与报道基因β-半乳糖苷酶(B)。其中，在这些序列之间，插入了目标基因(S)的不同长度的未编码的核酸片段。上述未编码的核酸片段的长度计为在A3-178载体中是Okb，在A3-177载体中2.5kb，在A3-175载体中是3.7kb，而在A3-181载体中是5.7kb。上述控制载体pNASSβ含有报道基因β-半乳糖苷酶，不含有CMV启动子。
图示5显示经过用图4的载体(稀释系列为1∶2-1∶128)对HeLa S3细胞的转染后，对报道基因β-半乳糖苷酶表达的测定。
图6(A)显示在DHFR基因座中同源重组的pNDI载体。一个正的选择标记基因(Neo)被两个LoxP序列置于两侧。一个LoxP序列的5’部位或另一个LoxP序列的3’部位上有与一个DHFR基因同源的序列(5’-，3’-DHFR区域)。
(B)显示在DHFR基因座中同源重组的pHDI载体，一个正的选择标记基因(Hyg)被两个LoxP序列置于两侧。一个LoxP序列的5’部位或另一个LoxP序列的3’部位上有与一个DHFR基因同源的序列(5’-，3’-DHFR区域)。
图7(A)显示具有Exon1，Exon2及Exon3(Exon即外显子)的一个DHFR基因的基因组结构，以及置于其间的内含子，(B)图示显示一个与图6相应的载体、目标结构，(C)显示用于在DHFR基因中同源重组的载体的有效同源重组后的基因组结构。在EcoR1切除部位之间的距离是，当使用pNDI载体时为2.9kb，当使用pHDI载体时为3.7kb。Neo新霉素，Hyg潮霉素，Kb千碱基图8显示一种载体，它包括用于蛋白质X编码的核酸序列与用于DHFR蛋白质编码的核酸序列，各自包括调节序列。它们被两个LoxP序列置于两侧。这种载体可用于使Cre重组酶催化整合到一个LoxP序列的基因组中。
SEQ ID NO.1显示第一个能结合HIF的核苷酸序列，SEQ ID NO.2显示第二个能结合HIF的核苷酸序列，SEQ ID NO.3显示一个LoxP序列实施例实例1由CMV启动子控制的促红细胞生长素基因的表达与HIF过表达将pHYG、pHIF-1α与pARNT载体(见图3)转移到基因改变了的HeLa-S3细胞中。在该细胞中，把CMV(巨细胞病毒)启动子插入到EPO同位基因的促红细胞生长素基因转译起始点近端，该启动子控制EPO表达。通常该细胞是每24小时，每107细胞生产1μg的促红细胞生长素。在转染前24个小时，向每个6孔板中通入浓度为6×104的细胞。在转染那天，用一种DMA-DOTAP混合物培育该细胞。该混合物含有1.25μg的各种载体，10μl的DOTAP(BoehringerMannheim 1202375)，及75μl的20mM的N-2-羟乙基-N’-2-乙基磺酸缓冲液(每孔)。将上述混合物在室温下预培育10-15分钟。用DNA-DOTAP将该细胞在每孔3ml介质中培育6个小时。接着用PBS缓冲液洗涤该细胞两次。然后，在全介质中培育5天。在第3，4与5天时，分别取100μl的上清液样，并用促红细胞生长素ELISA分析。第5天时结束上述试验，并确定细胞数量。每孔的促红细胞生长素的量按相同的细胞数量计算(参见图3)。
该实例表明，用HIF诱导促红细胞生长素基因总是可能的。虽然，会有异源的表达控制序列(CMV启动子)进入到该促红细胞生长素基的同位基因的启动子区域中，所测得的促红细胞生长素浓度的提高意味着单个缺氧诱导因子或多个缺氧诱导因子对两个同位基因的协同作用。
由此明显看出，通过加入异源的表达控制序列，可以提高内生的核酸序列的表达。当在细胞中表达激活结合剂(HIF)时，则使其存在于结合表达控制序列的核酸序列中，使得该基因的表达可以进一步提高。如果相关的序列并不存在该基因座时，它们可以通过本发明的方法，借助于同源重组加入到基因组中。
实例2表达控制序列的最佳布置以提高内生核酸的表达内生基因的5’部位序列不仅能够显示刺激特性，而且也能显示阻碍特性。当在目标基因的5’部位上将异源的表达控制序列加入到该基因组时，该表达高度将受到该内生的5’部位序列的影响。这样借助于一个异源的表达控制序列应该达到目标基因的最佳表达。为此，必须这样布置，即通过目标基因的5’部位未编码的序列，可以使异源表达控制序列的活性不会降低，最好是做到有目标的布置，以便达到各个序列的协同效应。以便能试验该异源表达控制序列的不同布置。以便确定，例如，该细胞的基因组中的异源表达控制序列必须以多大距离整合到目标基因的编码序列的转译起始点。为此，用不同的目标基因的5’部位未编码的核酸片段测试不同的载体(参见图4)。图4中的载体被转移到HeLaS3细胞中，并测试报道基因β-半乳糖苷酶的表达(参见图5)。
在试验前24个小时，向每10厘米的北特利平皿中通入浓度为1×106细胞的细胞，在转录的当天，用一种DNA-DOTAP混合物培育该细胞，该混合物含有1pmol的各种载体(A3-178，A3-177，A3-175，A3-181或PNASSβ，参见图4)，60μlDOTAP(Boehringer Mannheim 1202375)，以及300μl的20mM HEPES缓冲液。在室温中培育该混合物10-15分钟。每个平皿中的细胞在6ml无血清介质中用DNA-DOTAP预培育6个小时，然后用PBS缓冲液洗涤该细胞两次，并在全介质中培育22个小时，为了测定上述β-半乳糖苷酶表达，获取在200μlPBS中的细胞，冷却至-20℃，进行溶胞作用，并把10μl的溶胞产物用底物以1∶10稀释(3.29mM氯酚红-β-D-半乳糖吡喃糖苷(Boehringer Mannheim884308)，100mM HEPES，150mM NaCl，2mM MgCl2，1％BSA，0.1％Triton X-100，0.1％叠氮化合物，PH＝7。在1∶2步骤中稀释试样，并放入一个96孔板中，在37℃中培育，这时发现形成暗红色，然后，在570/580nm或550nm中测试该试样。
由图5可看出细胞中报道基因的表达最高，用载体A3-178转移该细胞，该异源的表达控制序列出现在该载体中编码序列的转译起始点近端。
用本方法可以容易与迅速地确定，必须选择什么样的异源表达控制序列在一个宿主细胞的基因组中的位置，才能达内生目标基因的最佳化表达。
实例3 DHFR-负细胞的制备在第一步骤中，制备本发明的用于重组的载体。在第二步骤中，将该载体转移到人体的细胞系中，并筛分在同源的重组事件上，据这方法可以首先将一个、然后将第二个用于DHFR基因的同位基因失活。
用于同源重组的DHFR-载体该人体的DHFR基因定位于染色体5上，并包含分成6个外显子的30kb。一个1.8kb大的EcoR1片段(其中含有部分启动子，部分外显子2与完整的外显子1)可以被用以制备用于同源重组的载体，可以用一个Aapl消化物除去外显子，并在形成的空隙(0.45kb)中，通过接头加入Neo-(1.4kb)-或Hyg-(2.2kb)抗性基因，该接头除了接合体核苷酸外，还含有最小的序列TAT TG AAG CATATT ACA TAC GAT ATG CTT CAA TA(loxP-序列)。该接头序列以相同的方法定向，即该抗性基因最好与DHFR基因抗性布置。在加入抗性基因后，该同源区域就扩大了，为此会使围绕EcoR1片段的载体从3’区域(6.0kb)扩展(图6)。这样就可以获得本发明的目标结构物pNDI(11.5kb)与pHDI(12.3kb)。
经过有效的同源重组以后，就可除去完整的外显子1(氨基酸1-28)与部分的DHFR基因的启动子。现在，该细胞就不再能表达功能的DHFR蛋白质。
细胞的转染上述所用的人体的细胞系不应该对染色体5呈多倍体，而且不能保持在MTX选样下。在上述两种情况下，有两个以上的同位基因失活。
HeLa S3-细胞(ATCC CCL-2.2)把该细胞放入装有RPMI 1640介质，其中含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺与1mM MEN(非基本的氨基酸)的细胞组织瓶中培育，并在37℃温度与5％CO2气氛中温育。该电泳缓冲液含有20mM Hepes(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙基磺酸)，138mM NaCl，5mM KCl，0.7mM Na2HPO4，6mM D-葡糖-单水化物，PH7.0。把10μg的线性载体DMA(pNDI)在960μF与250V的1×107细胞中电泳(多孔基因脉冲发生器)，经电泳后，采集在含有600μg/ml G418(原生霉素Boehringer Mannheim)介质中的该细胞中，并进行培育。经过10天的选择后(每2天更换介质)，离析其中的正克隆，并使其膨胀。
HT1080细胞(ATCC CCL-121)本细胞的培育与选择过程与上述HeLa S3细胞类同，采用了DMEM介质，其中含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺与1mM丙酮酸钠。
Namalwa细胞(ATCC CRL-1432)这种细胞系是悬浮液细胞系，而且必须进行相应培养，所用的介质相对应于用于Hela S3细胞的介质，经转染后，将细胞分布到40个96孔盘皿上，正的克隆是在48-，24-， 12-与6-孔盘皿中膨胀。用1mg/ml G418进行选样。
DHFR-负(+/-)细胞的证实借用Southern Blot分析仪或PCR证实载体的插入，在正确有效的同源重组中，通过EcoR1-消化物证实，除了一个代表未受损伤的DHFR基因的1.8kb带以外，还有一个2.9kb的带，它是通过插入Neo基因形成的(图7C)。混合克隆(在Southern Blot中显出不同比例的带区强度)通过在FACS的单细胞沉积进行分离，亚克隆且随后膨胀。其中，一个作为正的识别克隆的DHFR基因的同位基因失活。
DHR-负(+/-)细胞的制备细胞克隆(其中的DHFR-同位基因(+/-)失活)可以再进行同源重组，为此，如上述可用10μg的载体pHDI的线性DNA转移，并在含有500μg/ml潮霉素B(Boehringer Mannheim)的介质中进行选样。
通过提高介质中的G418浓度，可以提高在DHFR+/-细胞上的选择压力，并得到DHFR-/-细胞，基因转换导致了染色体间的重组，其中使第二个DHFR-同位基因失活。
该DHFR-/-细胞含有两个失活的DHFR同位基因，并且不能再合成四氢叶酸盐。为此，必须加入介质胸苷、甘氨酸与嘌呤(互补)，必要时，该细胞可以在α-介质(Gibco BRL)中培养。
如上述可以证实了DHFR-/-细胞。对于纯合子的DHFR-负细胞的情况，不能证实为野生区带(1.8kb)。用pHDI转移的细胞，经过同源重组后，在EcoRISouthern Blot中显示为一个新的3.7kb区带(图7C)。
DHFR-负细胞(-/-)的用途本发明的细胞可用于高产率地制备蛋白质。其中，把本发明的载体(据图8)和编码Gre-重组酶的表达载体转移到该DHFR-/-细胞中。该Cre重组酶将抗菌素抗性从该DHFR基因部位中除去，并整合到本发明的载体的DHFR-/-细胞的基因组中的LoxP序列中。该细胞将重新具有抗菌素过敏性，而且不依赖于胸苷、甘氨酸与嘌呤互补体。
通过使用不含互补体的介质，或通过向培养介质中加入适当的抗菌素进行选择。为此，该抗菌素适应抗性基因，它是通过Cre重组酶从细胞的基因组中去。上述整合在LoxP序列中的载体含有一个正的选择标记基因。通过向介质中加入该抗菌素进行上述选择。
通过基因放大提高生产效率为了提高用于重组蛋白质的细胞的生产效率，需进行氨甲喋呤(MTX)选择。其中，使引入到细胞中的DHFR基因与异源的、为蛋白质编码的核酸序列放大。
为了实现放大，应使上述细胞在有其浓度不断提高(100-1000mM)的MTX的参与下，进行培养。相对比较用的Southern Blots(在加入MTX之前，期间与之后)，通过密度测定法测评出上述放大的程度。
经过上述放大步骤后获得的本发明的细胞，在LoxP基因座上，含有多个引入的DHFR基因与引入的异源核酸序列的复制物。它们的特征是可以提高上述异源核酸的生产率。
下面是作为本发明说明的要素的本发明实施方案1、改变内生于真核细胞中的核酸序列的表达的方法，其特征是，(a)用第一种载体转移该细胞，其中包括(i)至少一种选自第一种异源表达控制序列与第一种扩增基因的序列，(ii)一个正的选择标记基因，(iii)用于部位特异重组酶的、至少两个位于序列(i)与序列(ii)两侧的目标序列，(iv)在序列(i)、(ii)与(iii)两侧的DNA序列，它们与细胞基因组中的核酸截段同源，以便可形成同源的重组，(b)在一定条件下培养该转移了的细胞，在该条件下可形成载体的同源重组，(c)获得按步骤(b)制得的细胞。
2、根据第1点的方法，其特征是，使用LosP-序列作为重组酶-目标序列。
3、根据第1或2点的方法，其特征是，该细胞是人体细胞。
4、根据前述几点中之一的方法，其特征是，该细胞是无限增殖化了的细胞。
5、根据第4点的方法，其特征是，该细胞是HT1080细胞，Namalwa细胞，或Hela S3细胞。
6、根据前述几点中之一的方法，其特征是，该异源表达控制序列优选启动子/增强子，最好是病毒启动子，特别是CMV启动子。
7、根据第1-6点中之一的方法，其特点是，该异源表达控制序列是3’-部位编码的序列。
8、根据前述几点中之一的方法，其特点是，该同源序列是这样选择的，即通过同源重组，除去内生存在的核酸序列的内生表达控制序列。
9、根据前述几点中之一的方法，其特点是，该正的选择标记基因是新霉素、原生霉素或潮霉素抗性基因。
10、根据前述几点中之一的方法，其特点是，该载体还包括负的选择标记基因，其中根据权利要求1的(a)(iv)安置于同源序列的外部。
11、根据前述几点中之一的方法，其特点是，该定位于重组酶-目标序列之间的核酸序列通过一个识别目标序列的部位特异重组酶的瞬时激活，从细胞基因组切除。
12、根据第11点的方法，其特点是，(12)用第二种载体转移该细胞，包括(i)至少一种选自第二种异源表达控制序列与第二种扩增基因的序列，(ii)一个正的选择标记基因，它最好与第一种载体的正的选择标记基因不同，(iii)至少两个位于序列(i)和(ii)两侧的重组酶一目标序列，(b)在一定条件下培养该转移细胞，在该条件下能将目标序列置于其两侧的序列整合在细胞基因组的目标序列上，(c)获得按步骤(b)制得的细胞，
(d)必要时，可以用各种改变的表达控制序列和/或扩增基因，至少重复一次(a)至(c)的步骤。
13、用于同源重组的载体，其中包括(i)至少一种选自一种表达控制序列与一种扩增基因的序列，(ii)一个正的选择标记基因，(iii)至少两个置于序列(i)与(ii)两侧的、用于部位特异重组酶的目标序列，(iv)置于该序列(i)、(ii)与(iii)两侧的DNA序列，它与细胞基因组中的核酸截段同源，以便可形成同源的重组，(v)必要时，一个负的选择标记基因。
14、载体，其中包括(i)至少一种选自异源表达控制序列与扩增基因的序列，(ii)一个正的选择标记基因，(iii)至少两个位于序列(i)与(iii)两侧的重组酶-目标序列，和(iv)必要时，一个负的选择标记基因。
15、真核细胞，最好是人体细胞，可根据第1-12点中之一的方法获得。
16、真核细胞，最好是人体细胞，其特征在于，(a)它含有至少一种染色体定位的序列，该序列选自与一种内生存在的核酸序列操作连接的异源表达控制序列与扩增基因，且其中(b)该序列被重组酶-目标序列置于两侧。
17、一种改变内生存在于真核细胞中的核酸序列的表达的方法，其特征是，(a)用一种载体转移该细胞，包括(i)至少一种能结合激活蛋白质的核酸序列，(ii)一个正的选择标记基因，(iii)置于序列(i)与(ii)两侧的DNA序列，它们与细胞基因组中的一个核酸截段同源，以便可形成同源的重组，(b)在一定的条件下培养该转移了的细胞，在该条件下可使载体进行同源重组，(c)获得按步骤(b)制得的细胞。
18、根据第17点的方法，其特征是，使用至少一种可结合缺氧诱导因子(HIF)的核酸序列。
19、根据第18点的方法，其特征是，该可结合HIV的核酸序列是选自根据序列ID NO.1的53bp序列，根据序列ID NO.2的43bp序列，一种与该序列同源的序列或一种在严格条件下与该序列杂交的序列。
20、根据第17-19点中之一的方法，它还包括用一种载体转移该细胞，其中包括(i)一种能为激活蛋白质编码的核酸序列，它与在这种细胞中活性的表达控制序列操纵结合，(ii)必要时，一个正的选择标记基因。
21、根据第20点的方法，其特征是，上述激活蛋白质是HIF-1α或/和HIF-1β蛋白质。
22、根据第18-21点中之一的方法，其特征是，该细胞在0.1-2％的氧浓度下培养。
23、用于同源重组的载体，其中包括(i)至少一种能连接激活蛋白质的核酸序列，(ii)一个正的选择标记基因，(iii)位于顺序(i)与(ii)两侧的DNA序列，它们与细胞基因组中的核酸截段同源，以便可形成一种同源重组。
24、真核细胞，最好是人体细胞，可根据第17-21点中之一的方法制得。
25、真核细胞，最好是人体细胞，其特征是，它至少含有一个异源的、染色体定位的、与一个存在于细胞中的内生基因操纵结合的、并能与一个激活蛋白质/复合物结合的核酸片段。
26、一种测验在真核细胞中内生存在的目标基因范围未编码的核酸序列对该表达影响的方法，其特征是，(a)用一种载体转移该细胞，其中包括(i)一种异源的、在细胞中活性的或可激活的、并与报道基因操纵结合的表达控制序列，(ii)来自目标基因范围的、在5’部位或/和3’部位上未编码的核酸片段，(b)在一定条件下培养该细胞，在该条件下该表达控制序列是活性的，(c)测定报道基因的表达。
27、根据第26点的方法，其特征是，该报道基因为氯霉素-乙酰基-转移酶(CAT)，β-半乳糖苷酶(β-Gal)或LacZ编码。
28、根据第26或27点中之一的方法，其特征是，(a)至少两个载体，它们含有相互不同的在5’部位或和3’部位上未编码的目标基因的核酸片段，被转移到各不同的细胞中，和(b)确定在不同的细胞中报道基因的表达。
29、一种DHFR负的真核细胞的制备方法，其特征是，(a)用第一种载体转移该细胞，其中包括(i)至少一种用于部位特异重组酶的目标序列，(ii)置于序列(i)两侧的DNA序列，它们与内生存在于该细胞中的DHFR核酸序列同源，以便可形成同源的重组，和(iii)必要时一个正的选择标记基因，以及必要时一个负的选择标记基因，(b)在一定条件下培养该转移细胞，在该条件下可使载体实现同源重组，(c)获得根据步骤(b)的细胞。
30、根据第29点的方法，其特征是，使用Lox-P序列作为重组酶目标序列。
31、根据第29点或30点中之一的方法，其特征是，上述能为该正的选择标记基因编码的核酸序列是新霉素-、卡那霉素-、原生霉素-或潮霉素抗性基因。
32、根据第29-31点中之一的方法，其特征是，上述能为负的选择标记基因编码的核酸序列是一个胸苷激酶基因(TK)和/或次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(HGPRT)。
33、根据第29-32点中之一的方法，其特征是，上述被重组酶-目标序列置于两侧的序列，通过相关的重组酶的瞬时激活作用，从基因组中切除。
34、向真核细胞中引入异源DHFR基因的方法，其特征是，把根据第33点的方法制得的细胞，(a)用第三种载体转移，其中该载体包括(i)必要时，一个正的选择标记基因，它最好与第一种载体的正的选择标记基因不同，(ii)一种能为DHFR编码的核酸序列，(iii)一种待扩增的、可为蛋白质编码的核酸序列，其中，来自部分序列(i)、(ii)与(iii)的核酸序列在5’部位与3’部位上各自被至少一个重组酶一目标序列置于两侧，(b)在一定条件下培养该转移了的细胞，在该条下上述被重组酶一目标序列置于两侧的核酸序列被整合到已经在细胞的基因组中存在的重组酶一目标序列上，(c)获取根据第(b)步骤得到的细胞。
35、载体，其中包括(i)必要时，一个正的选择标记基因，(ii)一种能为DHFR编码的核酸序列，(iii)一种能为所希望的蛋白质编码的、处于可表达形式的核酸序列，其中来自部分序列(i)、(ii)和(iii)的核酸序列在5’部位和3’部位上各自被至少一个重组酸一目标序列置于两侧。
36、用于同源重组的载体，其中包括(i)必要时，一个正的选择标记基因，(ii)至少各一种重组酶-目标序列，它被置于该序列(i)的两侧，(iii)置于序列(i)和(ii)两侧的DNA序列，它们与内生存在于一个细胞中的DHFR-核酸序列同源，以便能形成同源的重组，(iv)必要时，一个置于同源序列(iii)之外的负的选择标记基因。
37、真核细胞，最好是人体细胞，可通过根据第29-34点中之一的方法获得。
38、真核细胞，最好是人体细胞，其特征是，(a)至少使一个内生的能为DHFR编码的核酸序列失活，(b)在上述能为DHFR编码的核酸序列范围内，使至少一种重组酶一目标序列整合到基因组内。
39、真核细胞，最好是人体细胞，其特征是，在内生DHFR基因座范围中的异源核酸序列，其中包括(i)一种能为DHFR编码的核酸序列，(ii)一个能为希望的蛋白质编码的核酸序列和(iii)至少一个重组酶-目标序列。
顺序记录(1)一般资料(i)申请人(A)名字Boehringer Mannheim Gmbh(B)街号Sandhofer街112-132(C)地区Mannheim(E)国别德国(F)邮政编码D-68305(ii)发明名称“用于细胞中内生基因活化的最佳化方法”(iii)序列数量3个(iv)计算机可辨认的框架(A)数据载体软盘(B)计算机IBM相容型PC机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patent In Release#1.0，Version#1.30(EPA)(2)序列SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度53碱基对(B)种类核苷酸(C)绳状双(D)拓朴结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO1CCTCTCCTCT AGGCCCGTGG GGCTGGGCCCT GCACCGCCGA GCTTCCCGGGATG(2)序列SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度43碱基对(B)种类核苷酸(C)绳状双(D)拓朴结构线型
(xi)序列描述SEQ ID NO2CTACGTGCTG TCTCACACAG CCTGTCTGAC CTCTCGACCC TAC(2)序列SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度34碱基对(B)种类核苷酸(C)绳状双(D)拓朴结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO3TATTGAAGCA TATTACATAC GATATGCTTC AATA
权利要求
1.改变内生于真核细胞中的核酸序列表达的方法，其特征是，(a)用第一种载体转移该细胞，其中包括(i)至少一种选自第一种异源表达控制序列与第一种扩增基因的序列，(ii)一个正的选择标记基因，(iii)用于部位特异重组酶的，至少两个位于序列(i)与序列(ii)两侧的目标序列，(iv)在序列(i)、(ii)与(iii)两侧的DNA序列，它们与细胞基因组中的核酸截段同源，以便可形成同源的重组，(b)在一定条件下培养该转移细胞，在该条件下可形成载体的同源重组，(c)获得根据步骤(b)制得的细胞。
2.根据权利要求1的方法，其特征是，使用LoxP-序列作为重组酶-目标序列。
3.根据前述权利要求中之一的方法，其特征是，该载体还包括一个负的选择标记基因，它安置于根据权利要求1的(a)(iv)同源序列的外部。
4.根据前述权利要求中之一的方法，其特征是，该定位于重组酶-目标序列之间的核酸序列，通过一个能识别目标序列的部位特异的重组酶的瞬时激活，从细胞的基因组切除。
5.用于同源重组的载体，其中包括(i)至少一种选自一种表达控制序列与一种扩增基因的序列，(ii)一个正的选择标记基因，(iii)至少两种置于序列(i)与(ii)两侧的、用于部位特异重组酶的目标序列，(iv)置于该序列(i)，(ii)与(iii)两侧的DNA序列，它与细胞基因组中的核酸截段同源，以便可形成一种同源的重组，(v)必要时，一个负的选择标记基因。
6.载体，其中包括(i)至少一种选自异源表达控制序列与扩增基因的序列(ii)一个正的选择标记基因，(iii)至少两个位于序列(i)与(ii)两侧的重组酶-目标序列，(iv)必要时，一个负的选择标记基因。
7.真核细胞，最好是人体细胞，其特征在于，(a)它含有至少一种染色体定位了的序列，它选自一种与内生存在的核酸序列操纵连接的异源表达控制序列与扩增基因，且其中(b)该序列被重组酶-目标序列置于两侧。
8.一种改变内生存在于真核细胞中的核酸序列表达的方法，其特征是，(a)用一种载体转移该细胞，包括(i)至少一种能结合激活蛋白质的核酸序列，(ii)一个正的选择标记基因，(iii)置于序列(i)与(ii)两侧的DNA序列，它们与细胞基因组中的一个核酸截段同源，以便可形成同源的重组，(b)在一定的条件下培养该转移了的细胞，在该条件下可使载体进行同源的重组，(c)获得按步骤(b)制得的细胞。
9.根据权利要求8的方法，其特征是，使用至少一种能连接缺氧诱导因子(HIF)的核酸序列。
10.用于同源重组的载体，其中包括(i)至少一种能连接激活蛋白质的核酸序列，(ii)一个正的选择标记基因，(iii)位于顺序(i)与(ii)两侧的DNA序列，它们与细胞基因组中的核酸截段同源，以便可形成一种同源重组。
11.真核细胞，最好是人体细胞，可根据权利要求8-10之一的方法获得。
12.真核细胞，最好是人体细胞，其特征是，它至少含有异源的、染色体定位的、与存在于细胞中的内生基因操纵结合的、并可与一个激活蛋白质/复合物结合的核酸片段。
13.一种测验在真核细胞中内生存在的、目标基因范围的未编码的核酸序列对该表达影响的方法，其特征是，(a)用一种载体转移该细胞，其中包括:(i)一种异源的、在细胞中活性的或可激活的、并与报道基因操纵结合的表达控制序列，(ii)来自目标基因范围的、在5’部位或/和3’部位上未编码的核酸片段，(b)在一定条件下培养该细胞，在该条件下该表达控制序列是活性的，(c)测定报道基因的表达。
14.一种DHFR负的真核细胞的制备方法，其特征是，(a)用第一种载体转移该细胞，其中包括(i)至少一种用于部位特异重组酶的目标序列，(ii)置于序列(i)两侧的DNA序列，它们与内生存在于该细胞中的DHFR核酸序列同源，以便可形成同源的重组，(iii)必要时一个正的选择标记基因，以及必要时一个负的选择标记基因，(b)在一定条件下培养该转移了的细胞，在该条件下可使载体实现同源重组，(c)获得根据步骤(b)的细胞。
15.向真核细胞中引入一种异源DHFR基因的方法，其特征是，把根据权利要求14的方法制得的细胞，(a)用第三种载体转移，该载体包括(i)必要时，一个正的选择标记基因，它最好与第一种载体的正的选择标记基因不同，(ii)一种可为DHFR编码的核酸序列，(iii)一种待扩增的、为蛋白质编码的核酸序列，其中，来自部分序列(i)、(ii)与(iii)的核酸序列在5’部位与3’部位上各自被至少一个重组酶一目标序列置于两侧，(b)在一定条件下培养该转移了的细胞，在该条件下上述被重组酶一目标序列置于两侧的核酸序列被整合到已经在细胞的基因组中存在的重组酶一目标细胞上，和(c)获取根据第(b)步骤得到的细胞。
16.载体，其中包括(i)必要时，一个正的选择标记基因，(ii)一种能为DHFR编码的核酸序列，和(iii)一种能为所希望的蛋白质编码的、处于可表达形式的核酸序列，其中来自部分序列(i)、(ii)和(iii)的核酸序列在5’部位和3’部位上各自被至少一个重组酶一目标序列置于两侧。
17.用于同源重组的载体，其中包括(i)必要时，一个正的选择标记基因，(ii)至少一种重组酶-目标序列，它置于该序列(i)的两侧，(iii)置于序列(i)和(ii)两侧的DNA序列，它们与内生存在于细胞中的DHFR-核酸序列同源，以便能形成同源的重组，(iv)必要时，一个置于同源序列(iii)之外的负的选择标记基因。
18.真核细胞，最好是人体细胞，其特征是，(a)使至少一种内生的、能为DHFR编码的核酸序列失活，(b)在上述能为DHFR编码的核酸序列范围内，使至少一种重组酶一目标序列整合到基因组内。
19.真核细胞，最好是人体细胞，其特征是，在内生DHFR基因座范围中的异源的核酸序列，其中包括(iii) 一种能为HDFR编码的核酸序列，(iv)一种能为希望的蛋白质编码的核酸序列，(iii)至少一个重组酶-目标序列。
全文摘要
本发明涉及细胞内生基因表达的优化方法。首先,涉及一种改变内生存在于真核细胞中的目标基因的表达的方法,其中,借助于同源重组作用,把一种异源表达控制序列引入到细胞的基因组中,而且该方法中还包括使插入的外来DNA的、部位特异重组酶介导的切除,以及用其他的异源表达控制序列或/和扩增基因代替之;本发明还涉及把一个或多个在其上结合存在一个激活因子蛋白质或一个激活蛋白质复合物例如一个缺氧诱导因子(HIF)上的核酸序列通过同源重组引入到一个真核细胞的基因组内,以便改变目标基因的表达。本发明还涉及一个通过对报道基因表达的确定,测定在5’部位或3’部位上未编码的核酸片段对目标基因表达的影响的方法。此外,本发明还涉及一种含有重组酶—目标序列的、DHFR－负真核细胞的制备方法,以及插入在该重组酶—目标序列中的核酸序列的表达。
文档编号C12N5/22GK1240829SQ98127178
公开日2000年1月12日 申请日期1998年12月1日 优先权日1997年12月1日
发明者K·豪诺德, T·浩特史克, A·斯特恩 申请人:伯伦格曼海姆有限公司