专利名称：编码植物镁螯合酶chld亚基的dna序列及用于测定植物镁螯合酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及植物镁螯合酶(Mg-螯合酶)的CHLD亚基，编码植物镁螯合酶的CHLD亚基的DNA序列，制备植物镁螯合酶的CHLD亚基的方法，测定植物镁螯合酶活性的方法，以及用本发明的镁螯合酶DNA转化的转基因植物。
作为光合系统的辅助因子，叶绿素扮演着将光转变为化学能的角色，因而是植物生长和生存所必需的。
镁是在叶绿素生物合成过程中，在一种膜结合酶即由几个亚基组成的镁螯合酶的帮助下，掺入到卟啉中去的。
已经公开了细菌的镁螯合酶是由三个亚基(D，H和I)组成的，其相应的基因序列称为bchD、bchH和bchI(Burke等人(1993)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)175，2414-2422；Coomber等人(1990)，分子微生物学(Mol.Microbiol.)4，977-989；Gibson等人(1995)，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92，1941-1844；Jensen等人(1996)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271，16662-16667)。
表1已知的镁螯合酶亚基的基因
关于植物镁螯合酶，目前已有两个亚基被描述，它们似乎相当于细菌镁螯合酶的bchH和bchI亚基(Koncz等人，(1990)，EMBO J.9，1337-1346；Hudson等人，(1993)，EMBO J.12，3711-3719；Eibson等人，(1996)，植物生理学(Plant Physiol.)121，61-71)。目前仍然不知道其他亚基是否参与植物植镁螯合酶的结构。无论是单独或与已知的细菌D型亚基(CHLD和BCHD)在一起时，都没有观察到两个已知的植物亚基CHLI和CHLH的酶活性。
由于它们在叶绿素生物合成中所处的关键地位，植物镁螯合酶是开发新一代高特异性活性除草化合物的基本的、新的起点。另外，通过影响镁螯合酶的天然的或修饰的(例如经遗传工程修饰的)表达产物的基因表达，或通过特异性镁螯合酶抑制物，可以将光养的单细胞或多细胞生物，特别是细菌、藻类和植物的活力和/或生长得到高水平控制。
植物镁螯合酶的酶促活性最初是在完整的叶绿体上测定的(Castelfranco等人(1979)生物化学与生物物理学报(Arch.Biochem.Biophys.)192，592-598；Fuesler等人(1982)植物生理学69，421-423)。从那时起，酶促活性还在被破坏的质体上(Walker等人(1991)美国国家科学院院报88，5789-5793)和亚质体膜组分上(Lee，等人(1992)植物生理学99，1134-1140)进行测定。
令人惊奇地，现在已经发现了编码植物镁螯合酶亚基的DNA。该DNA后来被命名为chlD，而氨基酸序列称为CHLD。
而且，发现植物镁螯合酶的CHLD亚基与CHLI和CHLH亚基一起令人惊奇地适合于重建功能完整的，即具有酶促活性的植物镁螯合酶，因此本发明的植物镁螯合酶CHLD亚基提供了测试植物镁螯合酶活性的(体外和体内的)新的方法。
本发明因此涉及编码具有植物镁螯合酶CHLD亚基功能的蛋白质的核酸分子，优选地是如SEQ ID NO.1中所示的核酸分子、其具有生物学活性的片段、以及其互补序列或反义序列。
本发明涉及植物chlD序列，其优选地来自双子叶植物，特别优选地来自茄科(Solanaceae)，特别是烟草(Nicotiana tabacum)。
本发明进一步涉及编码与SEQ ID No.2一致的蛋白质的核酸分子，该蛋白质具有植物镁螯合酶CHLD亚基或其生物学活性片段的功能，或者它形成此核酸分子的互补序列或反义序列。
本发明的进一步的目的是一核酸分子，它是具有至少10个核苷酸长的寡核苷酸，能够与编码具有植物镁螯合酶CHLD亚基，优选地SEQ IDNo.1、其片段或其互补序列或反义序列功能的蛋白质的核酸分子特异地杂交。
术语“特异地杂交”通常理解为一单链核酸分子与一互补核酸分子形成氢键、碱基对、以及如果合适的话形成双链的特征。
本发明的另一个目的是编码选自SEQ ID NO.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.7中的肽的核酸分子，以及其互补序列或反义序列。
术语“重组生物”理解为通过体外改变其DNA或通过DNA整合进行改造的某一生物的细胞，例如重组酵母、细菌、藻类、昆虫或植物细胞。
写成小写字母的“chl”传统上用于镁螯合酶D、I和H亚基的基因，而大写的“CHL”指基因产物，即蛋白质。
本发明的一个进一步的目的是本发明的核酸分子在扩增、分离或鉴定编码具有植物镁螯合酶CHLD亚基或其生物学活性片段功能的蛋白质的核酸分子中的应用，特别是其它生物的chlD结构基因或chlD mRNA，优选地是源于植物或微生物的核酸分子。
本发明还涉及本发明的核酸分子在制备针对其表达产物的抗体中的应用。
本发明的另一个目的是非天然形成的嵌合基因，它含有一个有效地融合到本发明的DNA分子上的启动子。
本发明的另一个目的是载体，优选地是重组载体，它含有带有嵌合基因的本发明的核酸分子，其中嵌合基因含有有效地融合到本发明DNA分子上的启动子。
本发明的另一个目的是表达本发明的DNA分子的重组宿主细胞，这个宿主细胞优选地是用根据本发明的重组载体稳定转化的，重组载体含有嵌合基因，嵌合基因上有一个有效地融合到本发明的核酸分子上的启动子，或者该重组宿主细胞是通过其它为本领域技术人员已知的方法转化的，并表达本发明的DNA分子。
本发明进一步涉及本发明的核酸分子在产生转基因植物中的应用。
本发明的另一个目的是含有本发明的核酸分子的转基因植物、转基因植物细胞、转基因植物器官、转基因植物种子、转基因繁殖材料。
本发明的另一个目的是通过重组宿主细胞产生转基因植物、转基因植物细胞、转基因植物器官、转基因植物种子、转基因繁殖材料的方法，其中该宿主细胞是用本发明的DNA分子转化的。
本发明还涉及如本发明的植物的繁殖材料，比如果实、种子、块茎、根状茎、苗和插条。
本发明基因的合适的赋形剂(excipient)植物是所有的农业上重要的单子叶植物和双子叶植物，优选地是玉米和其它谷类，例如小麦、黑麦、大麦、黍、燕麦、木薯和水稻，还有棉花、烟草、甜菜、马铃薯、油籽油菜、向日葵、大豆或果实类的和蔬菜类的品种。
为了在植物细胞中表达本发明的核酸分子，将核酸分子连接到保证它们在植物细胞中转录的调节DNA元件上。这些元件包括，特别是启动子。一般地，任何在植物细胞中有活性的启动子都适合表达。
启动子的选择是根据其表达是组成型的或者仅仅是在特定的组织中、在植物发育的特定时间点或在由外部因子决定的时间点才能发生。对植物来说，启动子可以是同源的或是异源的。合适的启动子的例子有用于组成型表达的花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子和玉米泛素启动子，用于sink特异表达(例如马铃薯块茎、甜菜、番茄果实)的patatin基因B35启动子(Rocha-Sosa等人，EMBO J.8(1989)，23-29)或是保证仅在具有光合活性的组织中表达的启动子，例如ST-LS1启动子(Stockhaus等人，美国国家科学院院报84(1987)，7943-7947；Stockhaus等人，EMBO J.8(1989)，2445-2451)，所有的在质体中具有组成型活性的启动子，例如psbA盒式表达信号序列(Staub&Maliga(1993)EMBOJ.12601-606；Zoubenko等人(1994)，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)223819-3824)和Prn启动子(Svab+Maliga(1993)美国国家科学院院报90913-917)，或者在胚乳中特异表达的小麦HMG启动子，USP启动子，菜豆蛋白启动子，或来自玉米醇溶蛋白基因的启动子。而且，可以存在一个终止序列，它负责正确地终止转录并为转录产物加上poly-A尾巴，据说这在稳定转录产物上有作用。这些元件在文献(Gielen等人，EMBO J.8(1989)，23-29)中被描述，并且通常根据需要它们可以互换。
大量的克隆载体可用于将外源基因导入高等植物中，并且这些克隆载体含有一个大肠杆菌的复制信号和一个用于选择被转化细菌细胞的标志基因。这样的载体的例子有pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184。目的序列可导入到载体上合适的限制性切点上。得到的质粒用于转化大肠杆菌细胞。将被转化的大肠杆菌细胞培养在合适的培养基中，然后收集并裂解。将质粒回收。表征所获得的质粒DNA的分析方法一般有限制性酶切分析、凝胶电泳和其它生物化学和分子生物学分析方法。每次操作后，质粒DNA可以被酶切，而获得的DNA片段可以被连接到其它DNA序列上。每个质粒DNA序列都可以在同一个质粒或其它质粒中克隆。
许多技术可用于将DNA导入植物宿主细胞中。这些技术包括利用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂的T-DNA植物细胞转化技术、原生质体融合技术、注射技术、DNA电穿孔技术、通过biolistic方法的DNA导入技术等等。
当把DNA通过注射和电穿孔导入植物细胞时，所用的质粒不必满足任何特殊的需要。可以使用简单的质粒，如pUC衍生质粒。但是，如果需要从该转化细胞产生完整植株的话，则需要存在一个选择性的标志基因。
根据将基因导入植物细胞的方法的不同，可能需要其它DNA序列。例如，如果用Ti或Ri质粒转化植物细胞，至少Ti和Ri质粒T-DNA的右手边界区，但通常是右手和左手边界区，必须作为侧翼序列与待导入的基因相连。
如果土壤杆菌被用于转化，待导入的DNA必须被克隆到特定的质粒中，即被克隆到一个中间载体中或一个双元载体中。中间载体可以通过同源重组被整合到土壤杆菌的Ti或Ri质粒中，因为其序列与T-DNA中的序列同源。Ti或Ri质粒还含有转移T-DNA所需的vir区。中间载体在土壤杆菌中不能复制。中间载体可以通过帮助质粒被转移到根癌土壤杆菌(接合)。双元载体能够在大肠杆菌和土壤杆菌中复制。它们含有选择标志基因和界于T-DNA左右边界区之间的衔接物或多衔接物。它们可以被直接转化到土壤杆菌中(Holsters等人，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)163(1978)，181-187)。作为宿主细胞的土壤杆菌应含有一个带有vir区的质粒。vir区是将T-DNA转移到植物细胞中所需的；可以存在额外的T-DNA。这个被转化的土壤杆菌被用于转化植物细胞。
T-DNA在转化植物细胞中的应用在EP 120 516；Hoekema，双元植物载体系统，Offsetdrukkerij kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第五章；Fraley等人，植物科学批评综述(Criti.Rev.Plant.Sci.)4，1-46和An等人，EMBO J.4(1985)，277-287中有详细的描述。
为了将DNA导入植物细胞，将植物的外植体与根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌共培养具有优越性。完整的植株可以再生自生长于合适培养基中的被感染的植物材料(例如叶片部分、茎部分、根，以及原生质体或悬浮培养的植物细胞)，培养基中含有用于选择转化细胞的抗生素或杀虫剂。产生的植株再被检测导入的DNA存在与否。利用biolistic方法或原生质体转化导入外源DNA的其它可能的方法也是已知的(参考，例如，Willmitzer，L.，1993转基因植物，见生物技术，一本多卷的综合性的论文(H.J.Rehm，G.Reed，A.Puhler，P.Stadler编著)，第2卷，627-659，VCH Weinheim)。
单子叶植物转化的替代系统有通过biolistic法的转化、电或化学诱导使DNA被吸收到原生质体中、部分穿透细胞的电穿孔法、大量注射DNA到花序中、微量注射DNA到小孢子和前胚中、通过发芽的花粉吸收DNA，以及通过膨胀使DNA吸收到胚中(综述Potrykus，生理学植物(Physiol.Plant)(1990)，269-273)。
而在根癌土壤杆菌的帮助下通过Ti质粒载体系统的双子叶植物的转化已经建立得很完善了，近来文献提示甚至单子叶植物也确实可以通过以土壤杆菌为基础的载体所转化(Chan等人，植物分子生物学(Plant MolBiol.)22(1993)，491-506；Hiei等人，植物杂志(Plant J.)，6(1994)，271-282；Bytebier等人，美国国家科学院院报，84(1987)，5345-5349；Raineri等人，生物技术(Bio/Technology)8(1990)，33-38；Gould等人，植物生理学95(1991)，426-434；Mooney等人，植物细胞组织与器官培养(Plant Cell Tiss.& Org.Cult.)25(1991)，209-218；Li等人，植物生物学(Plant Boil.)20(1992)，1037-1048)。
在过去建立了三个可用于多种谷类的上述转化系统组织的电穿孔、原生质体的转化、和通过粒子轰击可再生组织和细胞的DNA转移(Jahne等人，Euphytica85(1995)，35-44)。
小麦的转化在各种文献中都有描述(综述Maheshwari等人植物科学批评综述14(2)(1995)，149-178)，另参考Hess等人(植物科学72(1990)，233)，Vasil等人(生物技术10(1992)667-674)，Weeks等人(植物生理学102(1993)，1077-1084)，以及Becker等人(植物杂志5(2)(1994)，299-307)。
一旦导入的DNA整合到植物细胞的基因组中，通常它就是稳定的并且保持在最初被转化的细胞的后代中。正常情况下它含有一个选择标志，以介导转化植物细胞对杀虫剂如phosphinothricin或抗生素如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素抗性。这个标志是被单独选择的，因此它应该允许将转化细胞从缺乏所导入的DNA的细胞中选择出来。
转化细胞以习惯的方式在植物内生长(还可参考McCormick等人，植物细胞报告(Plant Cell Report)5(1986)，81-84)。形成的植株可以正常生长并与被相同或其它遗传材料转化的植株杂交。形成的杂种具有相应的表型特征。种子可以从植物细胞中得到。
应该种植两代或多代以确保表型特征能够稳定保持并遗传。还应该收获种子以确保已经保持了相应的表型或其它特征。
本发明的另一个目的是，进一步地，产生本发明的核酸分子的方法，其中本发明的核酸分子是通过本质上已知的产生核酸的方法产生的。大量不同的分离与克隆基因序列的方法可以被那些cDNA克隆领域的技术人员采用。
另外，本发明的序列信息还可被用于为本领域的技术人员所知的许多其它的方法，例如筛选利用抗体分离基因的表达文库，或者用于制备抗体(多克隆或单克隆)。
完整的植物chlD cDNA，优选地是来自烟草的如在SEQ ID No.1中所示的chlD，SEQ ID No.1中的亚序列或由SEQ ID No.1衍生的寡核苷酸可被用作这些方法的探针，如果合适的话，它们可以选择性地与来自所选生物的克隆基因片段的文库中的其它CHLD-编码序列杂交，例如光养微生物或单子叶植物或双子叶植物。
这些技术还包括，例如，筛选克隆到合适的细胞或病毒的基因组或cDNA文库，以及利用由SEQ ID No.1衍生的寡核苷酸引物通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增。
本发明分离的chlD序列或亚序列可进一步通过基因工程的标准方法加以修饰或延伸以获得所需的特性。为了获得在体外或体内条件下的选择性杂交，chlD-特异的探针基因至少具有10个核苷酸的长度，优选地至少17个核苷酸。
本发明的杂交探针可用于，例如，从所选的生物中通过PCR的方法扩增或分析CHLD-编码序列(即编码CHLD的核酸分子)，这是本领域的技术人员所知道的，并且可以进一步用于从其它生物中分离CHLD-编码序列，或者作为检查其它生物中CHLD编码序列的诊断方法，或者鉴定和分离某一特定表型的经修饰的CHLD-编码序列，例如对除草剂的抗性、改变的叶绿素含量、改变的适合度(fitness)、改变的产量等等。
chlD-特异杂交探针还可用于利用标准的方法对植物基因组中自然发生的chlD基因的位置进行作图。这些方法包括，除了其它方法以外，DNA多态性的鉴定和利用这种多态性分析chlD基因与其它已知座位的标志的分离(segregation)现象。chlD基因作图在植物育种中具有特殊的意义。
chlD特异的杂交探针或CHLD编码序列或亚序列还可被用于抑制植物中的chlD基因的表达(反义技术)。
利用标准方法，还可能通过新的序列元件修饰CHLD-编码序列或亚序列或延伸它们，并将它们导入植物基因组中。利用传统的方法，植物转化可以是短暂的或是稳定的。衍生自chlD cDNA的序列向植物基因组中的整合可被用于改变植物的性状，因此，可以在转基因植物中形成例如具有较多或较少功能活性的镁鳌合酶、改变了特性的镁螯合酶的变体，或者chlD基因在转基因植物中的表达水平减低了。例如，有功能的镁螯合酶的数量可以通过标准方法得到增加，例如chlD基因单独或与其它的镁螯合酶亚基基因一起克隆到转基因植物中，并处于调节元件如启动子和增强子的转录控制下。增加的CHLD的活性可被用于比如提高叶绿素含量，这可能与更高的产量相关，或者用于增加对抑制叶绿素生物合成的除草剂的耐受性。还比如，克隆本发明经改变了的序列到转基因植物中可能与对除草剂更高的耐受性有关。
然而，还可以以一种导致降低转基因植物中最初的镁螯合酶的活性的方式(例如共阻遏、chlD反义RNA的形成)，为编码chlD序列或这些序列(分子)的片段并且被导入转基因植物中的核酸分子提供调节元件，比如启动子和增强子。降低的镁螯合酶活性可被用于产生患褪绿病的植物或具有褪绿病组织的植物。降低的叶绿素含量可能是所需要的，例如以后当植物或植物器官被用于工业加工时，或者当进行大量的作物或装饰植物的育种时，例如蔬菜如菊苣。
本发明进一步涉及具有植物镁螯合酶CHLD亚基的生物学功能的蛋白质，优选地是根据SEQ ID No.2的蛋白质，或者是其有生物学活性的片段。
本发明的另一个目的是具有植物镁螯合酶CHLD亚基的生物学功能的蛋白质，优选地是根据SEQ ID No.2的蛋白质，或者是其有生物学活性的片段，在测定镁螯合酶的活性和制备抗体中的应用。
本发明的另一个目的是在重组宿主细胞中产生具有植物镁螯合酶CHLD亚基功能的蛋白质的方法，其中宿主细胞是用编码植物镁螯合酶CHLD亚基或其活性片段的本发明的核酸分子转化的，优选地编码具有镁螯合酶功能的蛋白质或其生物学活性片段的DNA序列被插入到适于宿主细胞的表达盒中，产生的表达盒被以适当的方式插入到适合于宿主细胞的载体中，合适的宿主细胞用产生的载体转化，由此转化的宿主细胞生长在合适的培养基中，由该宿主细胞产生并具有植物镁螯合酶CHLD亚基功能的蛋白质被以适当的方法从培养基中或宿主细胞中分离出来。
而本发明的另一个目的是在重组宿主细胞中产生具有植物镁螯合酶功能的蛋白质或其生物学活性片段的方法，其中宿主细胞是用编码植物镁螯合酶或其活性片段的本发明的核酸分子转化的，优选地编码具有镁螯合酶功能的蛋白质的DNA序列被插入到适于宿主细胞的表达盒中，产生的表达盒被以适当的方式插入到适合于宿主细胞的载体中，合适的宿主细胞用产生的载体转化；由此转化的宿主细胞生长在合适的培养基中，由该宿主细胞产生并具有植物镁螯合酶功能的蛋白质被以适当的方法从培养基中或宿主细胞中分离出来。
在这个意义上，本发明涉及通过遗传工程产生植物镁螯合酶CHLD亚基及植物镁螯合酶。例如，为了在宿主生物中产生本发明的蛋白质，可以将本发明的DNA序列克隆到适于在所选择的宿主生物中进行结构基因异源表达的表达盒中。
适合这个目的的编码CHLD的DNA序列的例子有植物chlDcDNA，通过习惯方法改变了序列的植物chlD cDNA分子，以及衍生自植物chlD cDNA或植物CHLD蛋白或其片段并允许表达生物学活性的镁螯合酶CHLD的合成DNA序列。而且，可能还需要将特异的调节序列导入表达盒中，例如启动子、操作子序列、增强子、终止子、信号序列、5’-和3’-非翻译序列，或编码适当的融合蛋白的序列。调节序列的使用是一般习惯的技术，可以在很大范围内根据表达策略加以改变。形成的chlD表达盒，只要在chlD结构基因的正确阅读框内带有必需调节元件，可被插入到一个表达载体上，利用这个载体可以转化所选择的宿主生物。对于象大肠杆菌、昆虫细胞和植物细胞的宿主细胞来说，产生重组蛋白的适当的表达策略，以及相应的表达载体是周知的。
一般地，术语“载体”指本领域的技术人员所知的合适的工具，它使得单链或双链核酸分子有目的地转移到宿主细胞中，例如转移到DNA或RNA病毒中，病毒片段，存在或不存在调节元件的情况下适于转移核酸到细胞中去的质粒构件，金属粒子(由于它们可用于粒子枪的方法中)，但是载体还包括通过化学或物理方法可被直接导入细胞的核酸分子。
通过稳定的或短暂的转化例如用chlD表达盒得到的重组生物可用来获得重组镁螯合酶，优选地是CHLD蛋白，或含有CHLD的细胞组分。但是，重组生物还可以直接作为一个分析测试系统的一个成分。
还有可能利用传统的分子遗传学方法，将chlD结构基因与编码两个已知的镁螯合酶亚基，即CHLH和CHLI的结构基因一起导入宿主生物中，导致在这个宿主细胞中有功能的镁螯合酶的表达。
一个优选的表达系统是，例如，利用啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为宿主生物。采用的载体都是已知的酵母载体，它们具有合适的表达信号如启动子，以及合适的选择性标志如抗性基因或是互补某一营养缺陷的基因。
植物镁螯合酶的应用基本上是根据它作为异源寡聚酶复合体的活性，而且这种活性是直接与CHLD亚基的存在相联系的。有功能的完整的植物镁螯合酶使得生化反应不仅在体外(比如镁螯合酶的无细胞测试系统)，而且在体内也得以进行，例如在单细胞的或多细胞的重组生物或细胞培养物，特别是酵母、细菌、藻类、昆虫细胞和植物中，而且因此不限于光养型生物。
一方面，这些反应可用于产生镁-四吡咯，另一方面，这些生化反应可用于在测试系统中确定化合物的作用，以及与镁螯合酶的功能有关的异源物质的混合物。
本发明因而还涉及一种测定植物镁鳌合酶亚基之间相互作用的方法，其包括用编码带有CHLD亚基功能的蛋白质或其带有生物活性的片段的DNA序列以及至少编码另一种镁鳌合酶亚基的DNA序列转化宿主细胞，方法是镁鳌合酶基因产物的相互作用可导致一种能被直接或间接地、定性或定量地测量，优选为活化一种标志基因。
适于寻找植物镁鳌合酶的特异性抑制物或活化物方法允许(除了其它方式以外)带有潜在除草剂、生长抑制性或增强或有植物检疫作用的物质被鉴定。
这些(体内)细胞测试系统的原理是基于如下事实一种重组生物已用植物镁鳌合酶CHLD的结构基因转化，且有功能的表达一种或多种植物镁鳌合酶，其是以允许发现影响该功能的物质的方式显示一种或多种亚基的基本功能。
镁鳌合酶的一项功能在于相互之间的相互作用。该相互作用导致一种酶复合物的形式，且为镁鳌合酶酶功能的前提条件。
本发明因此涉及镁螯合酶CHLD亚基与待检测并将在体内定量测定的该酶的一个或两个其它亚基发生相互作用的测试系统。
例如，CHLD亚基与CHLI亚基的相互作用可以这样测定两个亚基都与两个其它的多肽或蛋白质相连，连接的方式使得亚基的相互作用直接或间接地在细胞中引起可被定性或定量检测的反应。
符合这个意图的多肽有，例如，来自细胞信号传导或转录过程的调节蛋白的亚基或结构域，其功能通过蛋白质-蛋白质相互作用来介导。
DNA转录的调节蛋白是合适的，在报告基因的帮助下，其中两个或多个亚基的蛋白质-蛋白质的相互作用可以被检测，因此报告基因的基因产物仅仅在两个或多个上述亚基相互发生作用时才形成。
为了形成这样的测试系统，将待测的两个镁螯合酶亚基中的一个融合到DNA结合结构域上，而另一个镁螯合酶亚基融合到调节蛋白的转录激活结构域上。在这里，两个蛋白质中的哪一个融合到两个结构域中的哪一个上都没有关系。因此，CHLD可以连接到DNA结合结构域上，CHLI可以结合到转录激活结构域上。这种连接可以通过另一个辅助因子的相互作用调节，例如蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白质-配体相互作用，例如抗生蛋白链菌素-生物素。然而，例如通过目的基因的编码区的融合的共价连接是优选的。
这种调节蛋白的一个例子是啤酒酵母GAL4基因的产物。
对于指示基因和有关的启动子已经整合到基因组中的宿主生物，用上述镁螯合酶亚基的融合基因转化该宿主生物。这种宿主生物的优点在于它表达所用转录系统的所有功能，除了要作为重组蛋白表达的调节蛋白以外。如果微生物被用作宿主生物，那么重组生物就可以根据需要，利用微生物学的习惯方法被分离出来并且加以繁殖，因而微生物在测试系统中的应用是无限的。因此，优选采用的宿主生物是可以很容易转化并培养的微生物，例如酵母或大肠杆菌。
而且，适合转录系统的启动子连接到编码指示蛋白的结构基因上。这个重组基因的优点在于启动子的活化直接或间接引起指示蛋白的表达。这个指示蛋白的优点在于它在重组生物中引起容易检测的变化，例如通过催化色素的形成或化学发光反应，通过使自身染色或荧光化，亦或是通过促进微生物的生长。
其中指示基因的转录被激活的上述系统的应用对于后面所描述的生长测试具有优越性，在生长测试中，突变子被镁螯合酶亚基互补，前者给予与酶或酶功能的抑制剂有关的更特异的信号，而后者测试首先需要通过对比实验排除具有除镁螯合酶以外的作用点的细胞生长抑制剂。因此，本发明优选地将指示基因系统用于生长测试中。
将要提到的在转录系统调节蛋白的帮助下实现上述相互作用的这种系统的一个例子特别是由Clontech，Palo Alto，California，美国公司开发的MatchmakerTM双杂交系统，Catalog No.#K 1605-1，1995/96，在此将其引入作为参考。
为此，产生了在酵母细胞中引起CHLD、H和I表达的质粒，CHLD、H和I与GAL4结合结构域和GAL4激活结构域形成融合蛋白。为了构建表达质粒，将编码这三个镁螯合酶亚基的DNA片段通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增。
用于扩增的模板是含有目的基因cDNA的质粒。所用的PCR引物是合成的寡核苷酸，其特征为有义引物与目的基因的5’端同源，而反义引物与目的基因的3’端同源。还可为质粒提供限制酶切点以有利于在载体质粒中的克隆。
所采用的优选载体是MATCHMAKERTM双杂交系统(Clontech)含有编码GAL4激活结构域的pGBT9和pAS2。含有编码GAL4 DNA结合结构域的pGAD424和pACT2。pGBT9和pGAD424，以及pAS2和pACT2在每种情况下一起用在系统中。pGBT9和pGAD424与pAS2和pACT2是不同的，区别在于上述基因在前两者中的表达比在后两者中的表达更弱。
编码镁螯合酶的每个亚基被分别克隆到载体中。通过转化将重组质粒导入大肠杆菌中，扩增并分离质粒。以这种方式，进行所有三个亚基与所有四个载体的全部12种可能的组合。重组载体命名如下载体pAS2中的CHL D基因命名为pCBS1148载体pACT2中的CHL D基因命名为pCBS1149载体pGBT9中的CHL D基因命名为pCBS1150载体pGAD424中的CHL D基因命名为pCBS1151载体pAS2中的CHL H基因命名为pCBS1152载体pACT2中的CHL H基因命名为pCBS1153载体pGBT9中的CHL H基因命名为pCBS1154载体pGAD424中的CHL H基因命名为pCBS1155载体pAS2中的CHL I基因命名为pCBS1156载体pACT2中的CHL I基因命名为pCBS1157载体pGBT9中的CHL I基因命名为pCBS1158载体pGAD424中的CHL I基因命名为pCBS1159然后，双杂交系统中的一个报告酵母菌株在每种情况下用两个质粒转化。优选采用的报告酵母菌株是表达作为指示蛋白的、由GALA诱导的β-半乳糖苷酶的菌株，优选地采用Clontech公司的SFY526菌株。两个质粒的选择方法是根据在每种情况下，一个质粒编码与DNA结合结构域融合的亚基，而另一个质粒编码与激活结构域融合的亚基。酵母的转化是通过如Klebe等人，1983，基因(Gene)，25，333-341的方法进行的。为了测定指示基因的诱导情况，将用两个质粒转化的酵母生长在固体培养基上，转移到滤膜上后，测定β-半乳糖苷酶的活性，采用的方法是Breedon和Nasmyth(Breedon，L.和Nasmyth，K.(1985)酵母HO基因的调节。Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50，643-650。
或者，将转化的酵母培养在液体培养基中，将细胞破坏后在酵母粗提液中测定β-半乳糖苷酶的活性，采用的方法是Munder和Furst(Munder，T.和Furst，P.(1992).分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)12，2091-2099)。
为了测试物质，首先将重组生物培养在适当的培养基中。然后将重组细胞与待测试的物质一起温育。温育条件的选择是根据在温育时间内不用添加待测试的物质指示基因就发生可检测的诱导。将温育时间延长超过生长期会影响测试。
或者，在可诱导启动子的帮助下，表达在转录激活中起作用的蛋白质也可能影响诱导。指示基因的诱导可利用习惯的检测反应进行检测。如果在测试系统中指示基因被激活了，基因激活的结果是，与指示基因没有被激活相比，在宿主细胞中形成了更多的报告蛋白。测试系统是根据以至少两倍的数量产生报告蛋白进行优先选择的。报告蛋白的产生以至少10倍的量增加是特别优选的。如果报告蛋白是酶，酶的活性可通过习惯的测量方法进行测定，例如通过比色法、荧光测定法和发光法。为此，将完整的细胞或其通过不同程度纯化的提取物与适当的产色的酶底物一起温育。与底物的温育可早在温育的前期或其后受到影响。
如果一个化合物干扰亚基之间的相互作用，例如通过结合到亚基的“界面区”，该化合物就会抑制寡聚过程。因此，该化合物能够减少生物体中具有酶学活性的镁螯合酶的量，并且该化合物因此还具有潜在的除草作用。所以，也可能通过本测试系统寻找能够抑制活性镁螯合酶复合体形成的除草化合物。
为了检测某种物质与镁螯合酶蛋白特异的相互作用，该物质必须符合下列条件1)与不加该物质的细胞相比，在重组细胞中，在加入该物质后必须显著降低指示基因的诱导。
2)在一个类似的转录系统(对照系统)中，镁螯合酶亚基的相互作用被替换为不同的相互作用，对指示反应的抑制必须在加入该物质后仅仅略微降低或者是不可测量的。任何形式的连接，例如蛋白质的共价键，都可以用作另一个相互作用。
如果一个物质符合上面的条件，就可以在其它测试系统中检查它的作用，例如在用镁螯合酶的酶促测试中、在植物细胞培养物中或是在对完整植物的除草测试中。
而且，镁螯合酶基因可被导入一特定的突变体中，该突变体是这样一种生物，它离开了目的镁螯合酶的功能就不能生长，例如一种光养型微生物，通过突变使它的一个或多个镁螯合酶亚基失去了其功能。这种突变体的使用具有特殊的优越性，即该重组生物在合适培养基中的生长可以作为镁螯合酶作用的度量，因此可以定量地描述测试物质对镁螯合酶的作用。生长测试的优点是可以通过对物质特别简单的处理和迅速转变来进行。
为此，植物的chlD基因可以被导入到一种生物的突变体中，该突变体的特征在于它具有改变了的表型，或者如果没有镁螯合酶的功能它在特定培养条件下就不能生长，优选地是没有了CHLD蛋白的功能。这种突变体可以这样产生，例如首先在一种需要镁螯合酶活性以进行光养生长的微生物中改变其自身的镁螯合酶的结构基因，使其具有镁螯合酶功能的酶不再形成，或者形成的量不足，因而形成的生物不再能够进行光养生长。而且，植物的chlI和chlH结构基因在这个突变体中表达。通过额外表达植物的chlD结构基因，有功能的植物镁螯合酶能够在遗传工程生物中形成，并且这种植物的镁螯合酶重新赋予该生物光养生长的能力。那么这种重组生物的生长就是植物镁螯合酶活性的直接的度量。采用这种重组生物的生长测试使得能够确定植物镁螯合酶是否被加入到培养基中的化合物所抑制。为此，将遗传工程生物于具有或不具有待检查的化合物的光养生长条件下在培养基中培养。待检查化合物优选采用的浓度在10-9M和10-3M之间，特别优选浓度是在10-7M和10-4M之间。
为了检测待检查化合物对镁螯合酶的特异抑制作用，并且排除其它引起生长抑制的作用方式，该化合物必须符合下列标准1)遗传工程生物在该化合物存在时的生长必须比在没有该化合物的培养基中的生长显著地弱。2)该化合物必须不能显著地降低同一生物在异养条件下的生长。
象生长一样，被适当改变了的生物之改变的表型也可以用作植物镁螯合酶催化活性的指示。光养微生物的各种色素从镁-螯合酶、镁-原卟啉的反应产物中产生。如上述构建的重组微生物不含有自身的镁螯合酶，而是含有包括重组CHLD蛋白的重组植物镁螯合酶，它只能在当植物镁螯合酶具有足够活性时才能形成其衍生自镁-原卟啉的色素。这种重组生物的色素就是植物镁螯合酶活性的直接量度。利用这个重组生物，对色素组成的分析使得能够确定植物镁螯合酶是否被加入到培养基中的化合物所抑制。为此，将遗传工程生物在具有或没有待检查化合物的培养基中，在由镁-原卟啉形成色素的条件下培养。待检查化合物优选采用的浓度在10-9M和10-3M之间，特别优选浓度是在10-7M和10-4M之间。为了检测待检查化合物对镁螯合酶的特异抑制作用，并且排除其它引起生长抑制的作用方式，该化合物必须符合下列标准1.与在没有该化合物的培养基中相比，在该化合物存在的情况下遗传工程生物由镁-原卟啉开始形成的色素的量显著降低，或者色素的组成改变了。
2.在相同的培养条件下，该化合物必须不能显著地改变非遗传工程出发生物的色素形成。
如果两个标准都符合了，就可以假定所检查的化合物是植物镁螯合酶的特异抑制剂。如果仅符合标准1而不符合标准2，镁螯合酶的酶促反应使得能够确定所检查的化合物是否是植物镁螯合酶的特异抑制剂。
如果一种物质符合上面提到的条件，利用或不利用直接在完整的植物或合适的植物器官上作进一步的生化检查，可以进一步检查该物质在植物中的作用。习惯的除草法和生理学方法可用于这个目的。各种用途，比如形成用于确定蛋白质功能的生化测试系统的必须的前提是待检查的蛋白质能够尽可能纯地以有功能的状态得到，即没有干扰活性。所有的细胞蛋白质都是这样，对于植物镁螯合酶，可以利用习惯的蛋白质纯化技术从植物组织中分离出单独的亚基来实现这一点。本发明指出有功能的植物镁螯合酶除了含有CHLH和CHLI亚基以外还含有CHLD亚基，它的序列是象在SEQ ID No.2中的烟草的序列那样。杂合寡聚蛋白质的活性也是结合到植物细胞的膜组分上，就象镁螯合酶，它的分离通常比分离可溶的或同聚的、或单体的酶要困难得多，因为在纯化过程中蛋白质会失去它的酶促活性，而且在随后只能通过复杂的方法才能恢复。另外，叶绿素生物合成酶的形成是细胞分化类型和发育状态的函数。而且，这些蛋白质(镁螯合酶也是这样)仅仅代表了全部细胞蛋白质的一小部分，因此当从植物组织中分离它们时必须达到特别高的浓缩倍数。
由于所描述的困难，优选地根据本发明利用编码镁螯合酶的核酸分子产生重组的植物镁螯合酶，特别优选是由CHLD、CHLH和CHLI蛋白组成的重组镁螯合酶复合体。重组植物CHLD蛋白是非常特别优选地提到的。
通过遗传工程产生的植物镁螯合酶，优选地通过遗传工程产生的CHLD蛋白，可以采用多种标准方法进行纯化。一种方法是否合适取决于在该种情况下所用的宿主生物、表达策略以及掌握重组蛋白的表达和纯化技术的人员所知的其它因素。为了纯化重组蛋白，还可以通过以适当的方式改变它在表达盒中的基因序列将它融合到其它的肽序列上。优选地使用的融合组分是肽或蛋白质，它们作为C-端或N-端融合，其赋予重组镁螯合酶亚基对特定的柱材料的亲和性，或者使得表达产物定位于细胞内或细胞外的特定位点，例如通过转运肽或信号肽(或者转运序列或信号序列)。这样的融合必须不会影响镁螯合酶的功能，或者必须能够被清除掉，例如通过引入适当的蛋白酶切位点。可能要提到的融合组分的例子有寡聚组氨酸尾巴、Strep-TagTM、谷胱苷肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MalE)，以举例或其片段方式给出的融合组分不限制本申请的范围。要纯化有活性的镁螯合酶复合体，只要复合体中的一个亚基融合到这种肽或蛋白质上就足够了。而且，还有可能从通过重组技术产生的少量的镁螯合酶，优选地是CHLD蛋白中制备特异的抗体，并且在这些抗体的帮助下，能够从重组生物或从植物中分离到镁螯合酶或镁螯合酶亚基。
通过遗传工程产生的镁螯合酶，优选地是CHLD蛋白及其纯化使得第一次能够获得不同纯度的具有镁螯合酶活性的植物酶，直至由CHLD、CHLH和CHLI亚基组成的纯的镁螯合酶复合体，或是纯的CHLD蛋白。分离或浓缩的镁螯合酶的可能用途有，例如，它在测定酶功能的生化测试系统中的应用。
本发明进一步涉及测定植物镁螯合酶活性的方法，其中蛋白质与CHLD的功能和编码镁螯合酶亚基I和H的DNA序列的基因产物相结合，其结合方式是镁螯合酶基因产物的酶促活性引起可直接或间接地、定性或定量测量的信号。
化合物对镁螯合酶的抑制作用可通过在该化合物存在时，该酶典型的催化活性的降低或镁螯合酶被完全失活来测量。为此，由CHLD、CHLH和CHLI亚基组成的植物镁螯合酶与其底物原卟啉、ATP和Mg2+一起温育在适当的反应缓冲液中。
通过优选的反应条件，要提到的反应缓冲液的pH在pH4和pH11之间，优选地5-10，特别是6-9，反应温度在2-50℃，优选地10-40℃等等。
通过简单比较在存在或不存在待测化合物时镁螯合酶的催化活性的差别，可以实现对酶抑制的测定。
为了测定镁螯合酶的活性可以采用各种生化测量方法，通过这些方法，可以测定镁螯合酶催化反应的反应产物例如镁-原卟啉、ADP或磷酸，或测定镁螯合酶的酶底物浓度的降低，例如原卟啉、ATP或Mg2+。大量的测定镁螯合酶活性的标准方法可以为那些对进行酶测试熟练的技术人员所用。需要优选地提到的方法是那些测量在反应批次中原卟啉到镁-原卟啉的转变速率的方法，即通过测量镁-原卟啉和原卟啉的不同荧光性质(例如Walker等人，植物生理生化，30263-269(1992))或通过光度法分析由原卟啉到镁-原卟啉转变时造成的光吸收的改变(例如Gorchein，生化杂志(Biochem.J.)，299869-874(1991))或通过HPLC定量分析原卟啉或镁-原卟啉。镁螯合酶的ATP酶活性的测定可能是要提到的更为优选的测量方法，因而有可能进行检测例如通过磷酸检测法检测磷酸的形成，例如通过以Fiske等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem)66375-400(1925)描述的系统为基础的方法。另外，化合物对于植物镁螯合酶的抑制类型可以通过改变底物及抑制物的浓度，利用习惯的生化方法进行测定。
除了使用纯化的镁螯合酶，也可能使用重组表达三种镁螯合酶亚基CHLD、CHLH和CHLI的重组生物的完整细胞，或使用该生物含蛋白质的提取物，或使用该生物被浓缩到不同程度的含镁螯合酶的组分。酵母细胞可能作为优选的重组宿主生物被提到以用于这个目的。或者，还可能使用从植物组织或植物细胞培养物中分离的含有CHLD、CHLH和CHLI亚基的有功能的镁螯合酶。
在生化或细胞生物学测试系统的帮助下，如果发现一化合物在体外抑制植物镁螯合酶，就可以直接检测这种化合物对植物(无论完整的植物还是植物的适当的部分)的作用。为此，大量习惯的除草学和生理学方法可以为那些评价活性物质对植物的作用的技术人员所用。
而且，通过遗传工程产生的镁螯合酶，优选的是具有通过遗传工程产生的CHLD亚基的镁螯合酶复合体，或是游离的CHLD亚基，可被用于阐明植物酶的空间结构。一般知道的方法如蛋白质晶体的X-射线结构分析或NMR光谱分析，可用于阐明空间结构。镁螯合酶的结构信息，优选地是CHLD亚基的结构信息，可用于如推理设计新的镁螯合酶抑制剂，以及潜在的除草剂。
本专利申请要求优先权的德国专利申请197 17 656.9的公开，以及伴随本申请的摘要，在此引入作为参考。
下面的实施例旨在更详细地阐述本发明，不应以任何方式理解为一种限制标准方法，如DNA和RNA分离、序列分析、限制性酶切、克隆、凝胶电泳、放射性标记、Southern和Northern杂交，是通过常规方法进行的(Sambrook等人，1989，分子克隆实验手册第二版。冷泉港实验室出版社，美国纽约；Sanger等人，1977，美国国家科学院院报，74，5463-5467)。实施例1克隆编码镁螯合酶CHLD亚基的烟草cDNA
为了鉴定烟草的chlD cDNA，分离出了相应于衍生自chlD基因集胞蓝细菌PCC6803(Jensen等人，生物化学杂志，271，16662-16667)的蛋白质序列的肽序列VDASGS(SEQ ID No.3)、TDGRGN(SEQ ID No.4)和AKGAVM(SEQ ID No.7)，以制备下列DNA引物序列的混合物1)GA(CT)GT(ACTG)GA(GA)AA(AG)(TA)C(ACGT)GT(ACGT)2)AT(AG)TT(ACGT)CC(ACGT)CG(ACGT)CC(AG)TC(ACGT)G3)GC(ACGT)AA(AG)GG(ACGT)GC(ACGT)GT(ACGT)ATG C这些引物被用于聚合酶链反应(PCR)中以从集胞蓝细菌PCC6803中扩增基因组DNA进行两个循环，在每个循环中条件为1分钟94℃，2分钟45℃，3分钟72℃，然后进行28个循环，在每个循环中条件为30秒94℃，90秒60℃，2分钟72℃。
PCR产生大约270bp的DNA片段，将它克隆到克隆载体pCRTMII(Invitrogen，San Diego)中，并分离用于通过限制性消化进行进一步处理。
所分离的并进行32P[dCTP]-标记的大约270bp长的片段被用作杂交探针，根据说明筛选烟草(Nicotiana tabacum SR1，Stratagene)λZAPIIcDNA文库。
分离并测序经过cDNA文库筛选后存在于噬菌粒pBluescript SK中的DNA。所鉴定的chlD cDNA序列示于SEQ ID No.1中，其含有一个2274个核苷酸长的开放阅读框，以及5’和3’端的非翻译区。
将烟草基因组DNA与CHLD基因的放射性标记DNA杂交。为此，用EcoRI和HindIII将CHLD基因从噬菌粒pBluescript SK中切下。产生的两个2069bp和426bp的片段用32P(dCTP)进行放射性标记。实施例2 chlD反义烟草植物的产生将根据实施例1在pBluescript SK-中得到的CHLD的烟草cDNA片段用KpnI和XbaI从载体pBluescript SK-中切下，连接到已用KpnI和XbaI切过的双元载体BinAR(Hofgen和Willmitzer，植物科学(1990)66，22-230)上。
首先，用该构件转化大肠杆菌DH5α菌株，然后转化根癌土壤杆菌GV2260菌株。利用叶盘转化法(Horsch等人，科学(Science)228，1229-1231)，将幼烟草叶盘与土壤杆菌共培养，CHLD反义基因被稳定地整合到植物的基因组中。实施例3 chlD有义烟草植物的产生为了产生chlD有义烟草植物，将chlD cDNA用SmaI和XbaI从pBluescript SK-中切下并克隆到经限制酶消化过的BinAR载体中。为了稳定地整合到烟草的基因组中，选择了在实施例2中描述的方法。实施例4 转基因烟草植物的分析分离到67株有义植物和56株反义植物。具有CHLD的反义或有义基因的转基因植物表现出逐渐不同的叶绿素缺陷。患有褪绿病的叶片表现出不同的类型。有均一脱色的、黄绿色的叶片，带不同色素点的叶片，和围绕叶脉及绿色脉间有白色区的叶片。随着叶片变老，它们失去了叶绿素。叶绿素含量降低的植物还表现出生长缓慢(见
图1a至1d)。
而且，通过Southern杂交分析证实了有义或反义chlD基因稳定整合到了烟草植物的基因组中，并通过Northern杂交分析确定了chlD转录本的mRNA含量。在反义植物中，mRNA的含量比在野生型中的含量有所降低。与野生型相比，chlD有义植物仅仅略微提高了chlD mRNA的含量。
通过Lee等人(1992，植物生理学99，1134-1140)的方法测定了转基因植物和野生型植物的镁螯合酶活性。有义和反义植物总是显示出降低的酶活性。在设想能够过量表达CHLD的转化子中，酶活性降低的现象可以负显性(negative dominance)解释。过量供应CHLD亚基导致镁螯合酶复合体的精密调节结构被破坏。
测定了在转基因植物和野生型植物中的原卟啉IX和叶绿素的含量(见表2)。必须强调的是，具有有义或反义CHLD mRNA的转化子在其所检测的幼叶中(叶片3，5和7)表现出的原卟啉含量高于野生型植物3-5倍，这已成为了规律。
叶绿素含量的测定证实了肉眼可见的表型。在个别植物中，叶绿素含量的降低高达25％。表2在有义和反义植物中原卟啉IX和叶绿素的相对含量植物 叶片原卟啉IX[％]叶绿素[％]SNN3100 10051007100 100AS73584 2555427157 28AS93135 505120 -7-49AS13 3160 785102 -7115 78AS18 3374 745470 -7295 80AS21 3231 955188 -798 101S1 3189 785262 -7297 80S203423 325293 -7144 25S223189 1175151 -7115 94S293298 255265 -7137 26S383257 1205127-7- 107SNN＝野生型S ＝有义AS＝反义实施例5 用于表达作为带有GAL4结合结构域和GAL4激活结构域的融合蛋白的CHLD、H和I的质粒的构建为构建表达质粒，编码三个镁螯合酶亚基的DNA利用聚合酶链反应(PCR)进行扩增。
为扩增chlD基因，100ng的质粒pNTCHLD用作模板。下面两个寡核苷酸用作PCR引物具有SmaI切点的5’-TGA CCC GGG GGTAGT GGA ACC TGA AAA ACA ACC-3’为有义引物，以及具有EcoRI切点的5’-GGC GAA TTC TCA AGA TTC CTT TAA TGC AGA TAA-3’或是具有SalI切点的5’-GCG GTC GAC TCA AGA TTC CTT TAATGC AGA-3’作为反义引物。
为扩增CHLH基因，100ng的质粒pNTCHLH用作模板。下面两个寡核苷酸用作PCR引物具有EcoRV切点的5’-GCT GAT ATC GGCTAT TGG CAA TGG TTT ATT CAC-3’为有义引物和具有SalI切点的5’-GCG TCG ACA TTT ATC GAT CGA TTC CCT CAA-3’为反义引物。为了扩增chlI基因，100ng的质粒pNTCHLI用作模板。下面两个寡核苷酸用作PCR引物具有SmaI切点的5’-CAG CCC GGG GGGTCC ACT ACT AGG-3’为有义引物，以及具有SalI切点的5’-CAG GTCGAG GCA CAG TAC AAA GCC-3’作为反义引物。
穿梭质粒MATCHMAKERTM双杂交系统(Clontech)用作载体pGBT9和pAS2各含有一个编码GAL4激活结构域的基因。pGAD424和pACT2各含有一个编码GAL4 DNA结合结构域的基因。pGBT9和pGAD424，以及pAS2和pACT2在每种情况下分别被一起用于系统中。pGBT9和pGAD424与pAS2和pACT2的不同之处在于，上述基因在前两者中的表达比在后两者中的表达更弱。
为了将chlD克隆至载体pACT2，将该基因用具有SmaI切点的有义引物和具有EcoRI切点的反义引物扩增，并且随后连接到被SmaI-和EcoRI切过的载体上。
为了将chlD在各种情况下克隆至载体pAS2、pGBT9和pGAD424，将该基因用带有SmaI切点的有义引物和带有SalI切点的反义引物扩增，并且随后连接到在被SmaI-和SalI切过的载体上。
为了将基因chlH和I在各种情况下克隆至载体pAS2、pGBT9和pGAD424，在各种情况下通过有义和反义引物扩增这些基因，随后与用SmaI和SalI切过的载体连接。
为了将chlH或I在各种情况下克隆至载体pACT2，将该基因用有义引物和反义引物扩增，并且随后连接到被SmaI-和XhoI切过的载体上。将连接DNA通过转化导入大肠杆菌DH5α，转化克隆在含有100微克氨苄青霉素/毫升的琼脂培养基上进行选择。从重组细菌中分离出质粒DNA并利用限制性分析检测加以确定。
以这种方式制备了所有三个亚基与所有四个载体的全部12种可能的组合。实施例6利用双杂交系统在酵母中测定镁螯合酶亚基之间的相互作用用菌株SFY526+pAS2-chlD+pACT2-chlI在酵母中进行β-半乳糖苷酶液体分析(Munder和Furst，1992，分子细胞生物学12，2091-2099)，利用Klebe(Klebe等人，1983，基因，25，333-341)的方法制备感受态酵母细胞株SFY526(Harper等人，1993，细胞(Cell)，75，805-816)，并用实施例2中的质粒转化。SFY526用所有的质粒单独转化并且用其所有可能的组合转化，在添加氨基酸(腺嘌呤20毫克/升；L-组氨酸盐酸20毫克/升；L-赖氨酸盐酸30毫克/升；L-亮氨酸30毫克/升；L-色氨酸20毫克/升)的基本琼脂板(1.5％琼脂，10％YNB葡萄糖)上进行筛选。
待测的酵母菌株SFY526+pAS2-chlD+pACT2-chlI在添加了所需氨基酸(腺嘌呤20毫克/升；L-组氨酸盐酸20毫克/升；L-赖氨酸盐酸30毫克/升)的10毫升基本培养基中，30℃、180转/分条件下于无菌的50毫升大口带金属帽的三角瓶中培养过夜。记录过夜培养物的光密度(OD600)(用Beckman DU640光度计)，测得的数值在1.0和2.0之间。
取100微升该培养物检测β-半乳糖苷酶的活性。总的样品体积大约1毫升100微升培养物700微升Z缓冲液+巯基乙醇50微升三氯甲烷50微升0.1％SDS平行检测零值700微升Z缓冲液50微升三氯甲烷50微升0.1％SDS将样品和平行零值各振动混合30秒，将160微升的ONPG溶液(4毫克邻-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷对1毫升Z缓冲液+巯基乙醇)分别加入其中。将样品小心摇动并在30℃水浴中保温。1小时后，加入400微升1M Na2CO3终止反应，并将样品在13000转/分离心10分钟(HeraeusBiofuge fresco，固定角转子24)。取上清液在420nm处相对于零值进行测定(Bechman DU640光度计)，β-半乳糖苷酶的活性计算U＝1000E420(CVt)-1E420是在420nm的消光值，C是细胞悬浮液的密度(OD600)，V是所用细胞悬浮液的体积，而t是保温时间。
在另外两个克隆上重复测量，计算平均值。所需溶液Z缓冲液1000毫升16.1克Na2HPO4×7H2O5.5克NaH2PO4×7H2O0.75克KClMgSO4×7H2OZ缓冲液+巯基乙醇(新鲜配制)100毫升Z缓冲液+270微升巯基乙醇实施例7在酵母(Willows等人，1996，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem)235，438-443)菌株 SFY526+pAS2-chlD+pACT2-chlH+pSG28中重构测试镁螯合酶活性制备菌株SFY526+pAS2-chlD+pACT2-chlH的感受态细胞(Klebe等人，1983，基因，25，333-341)并用pSG28转化(p423TEF+chH；p423TEFMumberg等人，1995；基因，156；119-122)。在添加了腺嘌呤(20毫克/毫升)和L-赖氨酸盐酸(30毫克/毫升)的基本培养基(10％YNB葡萄糖；1.5％琼脂)上选择转化子。该菌株的15毫升预培养物(基本培养基10％YNB葡萄糖+20毫克/毫升腺嘌呤+30毫克/毫升L-赖氨酸盐酸)在30℃、180转/分条件下，于无菌带金属帽的50毫升大口三角瓶中培养24小时。150毫升主培养物(基本培养基10％YNB葡萄糖+20毫克/毫升腺嘌呤+30毫克/毫升L-赖氨酸盐酸)用7.5毫升预培养物接种，并用无菌带棉塞的500毫升三角瓶，在30℃、180转/分条件下震荡培养20小时。将细胞在5000转/分(Sigma 4K 10)离心5分钟沉淀并重新悬浮于1.5毫升测试缓冲液中(0.1M tricine pH 7.9，0.3M甘油，25mM MgCl2，4mMDTT)。随后细胞悬液在冰上以低强度超声破碎3×30秒。
将破碎的细胞在5000转/分(Sigma 4K 10)离心15分钟沉淀，上清液作进一步处理。此酵母提取液的蛋白质含量根据Bradford法利用BioRad蛋白质测试仪进行测定。
测试体积为1毫升。1毫升测试缓冲液含有l毫克破碎酵母培养物的蛋白质提取液、4mM ATP、1.5μM原卟啉IX、50mM磷酸肌酸和10U肌酸磷酸激酶。
将混合物在30℃避光保温1小时，然后用Perkin Elmer分光光度计LS50B测量500nm和650nm之间的荧光发射光谱，激发波长为420nm，并进行HPLC分析。
图1(a-d)表示转基因的chlD有义和反义烟草植物序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名Hoechst Schering AgrEvo GmbH(B)街道(C)城市Frankfurt(E)国家德国(F)邮政编码(ZIP)65926(G)电话069-305-82808(H)传真069-35-7175(ii)发明名称编码植物镁螯合酶CHLD亚基的DNA序列及用于测定植物镁螯合酶活性的方法(iii)序列数目7(iv)计算机可读信息(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度2495个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..39(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置40..2313(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置41..2495(xi)SEQ ID NO1的序列描述CATCTAAAAT CCTAAATCAA AAACTTCGAT GCTATAAAA ATG GGG TTT TGT TCA 54Met Gly Phe Cys Ser1 5ACT TCA ACC CTC CCA CAA ACA TCA CTA TCC AAT TCT CAA TCT TCA ACA 102Thr Ser Thr Leu Pro Gln Thr Ser Leu Ser Asn Ser Gln Ser Ser Thr10 15 20TTC TTC ACA TAC TTA AAA CCA TGC CCA ATT CTA TCC TCC ACA TAT TTA 150Phe Phe Thr Tyr Leu Lys Pro Cys Pro Ile Leu Ser Ser Thr Tyr Leu25 30 35AGG CCG GAA CGG CTA AAA TTT CGC CTC AGA ATA AGT GCC ACT GCA ACT 198Arg Pro Glu Arg Leu Lys Phe Arg Leu Arg Ile Ser Ala Thr Ala Thr40 45 50ATT GAT TCA CCT AAT GGC GCT GTT GCA GTA GTG GAA CCT GAA AAA CAA 246Ile Asp Ser Pro Asn Gly Ala Val Ala Val Val Glu Pro Glu Lys Gln55 60 65CCT GAG AAA ATT TCC TTT GGT AGA CAG TAT TTT CCT CTA GCT GCT GTT 294Pro Glu Lys Ile Ser Phe Gly Arg Gln Tyr Phe Pro Leu Ala Ala Val70 75 80 85ATT GGA CAG GAT GCT ATT AAA ACT GCT CTT TTA CTT GGG GCC ATT GAC 342Ile Gly Gln Asp Ala Ile Lys Thr Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ile Asp90 95 100CGT GAG ATA GGA GGA ATT GCA ATA TGT GGG AAG CGT GGA ACA GCG AAA 390Arg Glu Ile Gly Gly Ile Ala Ile Cys Gly Lys Arg Gly Thr Ala Lys105 110 115ACG TTA ATG GCA CGT GGA TTG CAT GCT ATT CTG CCA CCA ATT GAA GTA 438Thr Leu Met Ala Arg Gly Leu His Ala Ile Leu Pro Pro Ile Glu Val120 125 130GTT GTT GGC TCA ATG GCA AAT GCT GAT CCG AAC TGT CCC GAT GAG TGG 486Val Val Gly Ser Met Ala Asn Ala Asp Pro Asn Cys Pro Asp Glu Trp135 140 145GAA GAC GGG CTA GCT GAC AGA GCA GAA TAT GGG TCT GAT GGT AAT ATC 534Glu Asp Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Tyr Gly Ser Asp Gly Asn Ile150 155 160 165AAG ACC CAG ATA GTT AAA TCC CCA TTT GTT CAG ATT CCC CTT GGT GTC 582Lys Thr Gln Ile Val Lys Ser Pro Phe Val Gln Ile Pro Leu Gly Val170 175 180ACA GAA GAT AGA TTG ATT GGC TCT GTT GAT GTC GAG GAG TCC GTG AAA 630Thr Glu Asp Arg Leu Ile Gly ser Val Asp Val Glu Glu Ser Val Lys185 190 195TCT GGA ACC ACT GTC TTT CAA CCA GGC CTC CTC GCA GAA GCT CAT CGA 678Ser Gly Thr Thr Val Phe Gln Pro Gly Leu Leu Ala Glu Ala His Arg200 205 210GGA GTT CTA TAT GTT GAT GAG ATT AAT CTA TTA GAT GAA GGT ATA AGT 726Gly Val Leu Tyr Val Asp Glu Ile Asn Leu Leu Asp Glu Gly Ile Ser215 220 225AAC CTA CTT CTG AAT GTA TTG GAG GGA GTC GTC AAT ATT GTA GAA AGA 774Asn Leu Leu Leu Asn Val Leu Thr Glu Gly Val Asn Ile Val Glu Arg230 235 240 245GAG GGA ATC AGC TTT CGA CAT CCA TGC AAA CCA CTA CTA ATT GCT ACC 822Glu Gly Ile Ser phe Arg His Pro Cys Lys Pro Leu Leu Ile Ala Thr250 255 260TAT AAC CCT GAA GAG GGT GCG GTT CGT GAG CAT CTG CTA GAC CGT ATT 870Tyr Asn Pro Glu Glu Gly Ala Val Arg Glu His Leu Leu Asp Arg Ile265 270 275GCG ATT AAT TTA AGT GCA GAT CTT CCA ATG AGT TTT GAC GAT CGT GTT 918Ala Ile Asn Leu Ser Ala Asp Leu Pro Met Ser Phe Asp Asp Arg Val280 285 290GCA GCT GTT GAC ATA GCA ACA CGT TTT CAG GAG TGT AGC AAT GAG GTT 966Ala Ala Val AsP Ile Ala Thr Arg Phe Gln Glu Cys Ser Asn Glu Val295 300 305TTT AAA ATG GTG GAT GAA GAA ACA GAC AGT GCA AAA ACC CAG ATA ATA 1014Phe Lys Met Val Asp Glu Glu Thr Asp Ser Ala Lys Thr Gln Ile Ile310 315 320 325TTG GCA AGG GAG TAT TTA AAG GAT GTC ACA ATC AGT AGA GAT CAA CTA 1062Leu Ala Arg Glu Tyr Leu Lys Asp Val Thr Ile Ser Arg Asp Gln Lau330 335 340AAA TAC TTG GTC ATG GAA GCA ATT CGT GGT GGC TGC CAG GGG CAC CGA 1110Lys Tyr Leu Val Met Glu Ala Ile Arg Gly Gly Cys Gln Gly His Arg345 350 355GCT GAA CTT TAT GCT GCT CGT GTA GCC AAA TGC TTA GCT GCC ATC GAT 1158Ala Glu Leu Tyr Ala Ala Arg Val Ala Lys Cys Leu Ala Ala Ile Asp360 365 370GGA CGT GAA AAA GTT GGT GTT GAT GAG CTG AAA AAA GCT GTA GAG CTT 1206Gly Arg Glu Lys Val Gly Val Asp Glu Leu Lys Lys Ala Val Glu Leu375 380 385GTC ATC CTC CCA CGT TCA ACT ATA GTT GAA AAC CCA CCA GAC CAG CAA 1254Val Ile Leu Pro Arg Ser Thr Ile Val Glu Asn Pro Pro Asp Gln Gln390 395 400 405AAC CAG CAG CCA CCT CCT CCC CCT CCC CCT CCC CAA AAT CAA GAT TCT 1302Asn Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Asn Gln Asp Ser410 415 420TCA GAA GAG CAG AAT GAA GAA GAA GAA AAA GAA GAA GAA GAT CAA GAG 1350Ser Glu Glu Gln Asn Glu Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu Asp Gln Glu425 430 435GAT GAG AAA GAT AGA GAA AAT GAA CAG CAA CAG CCa CAA GTC CCT GAT 1398Asp Glu Lys Asp Arg Glu Asn Glu Gln Gln Gln Pro Gln Val Pro Asp440 445 450GAG TTT ATT TTT GAT GCG GAA GGT GGT TTA GTG GAT GAA AAA CTT CTC 1446Glu Phe Ile phe Asp Ala Glu Gly Gly Leu Val Asp Glu Lys Leu Leu455 460 465TTC TTT GCA CAA CAA GCA CAA AGA CGC AAA GGA AAA GCT GGA CGA GCA 1494Phe Phe Ala Gln Gln Ala Gln Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Arg Ala470 475 480 485AAg AAG GTC ATC TTT TCC GAA GAT AGA GGT CGA TAT ATA AAG CCA ATG 1542Lys Lys Val Ile Phe Ser Glu Asp Arg Gly Arg Tyr Ile Lys Pro Met490 495 500CTT CCA AAG GGT CCA GTG AAG AGA TTG GCA GTT GAT GCA ACT CTA AGA 1590Leu Pro Lys Gly Pro Val Lys Arg Leu Ala Val Asp Ala Thr Leu Arg505 510 515GCA GCG GCA CCA TAT CAG AAG TTA CGA AGA GCA AAG GAC ATC CAA AAA 1638Ala Ala Ala Pro Tyr Gln Lys Leu Arg Arg Ala Lys Asp Ile Gln Lys520 525 530ACT CGC AAG GTT TAT GTA GAG AAA ACT GAC ATG AGA GCC AAA AGA ATG 1686Thr Arg Lys Val Tyr Val Glu Lys Thr Asp Met Arg Ala Lys Arg Met535 540 545GCA CGC AAA GCC GGA GCT CTG GTG ATA TTC GTA GTT GAC GCT AGT GGG 1734Ala Arg Lys Ala Gly Ala Leu Val Ile Phe Val Val Asp Ala Ser Gly550 555 560 565AGT ATG GCA CTG AAT AGA ATG CAG AAT GCC AAA GGA GCA GCA CTT AAA 1782Ser Met Ala Leu Asn Arg Met Gln Asn Ala Lys Gly Ala Ala Leu Lys570 575 580CTA CTT GCA GAG AGT TAT ACA AGC AGA GAT CAG GTC TGT ATC ATT CCC 1830Leu Leu Ala Glu Ser Tyr Thr Ser Arg Asp Gln Val Cys Ile Ile Pro585 590 595TTC CGC GGA GAT GCT GCT GAA GTT TTG TTG CCA CCT TCT AGG TCA ATA 1878Phe Arg Gly Asp Ala Ala Glu Val Leu Leu Pro Pro Ser Arg Ser Ile600 605 610TCG ATG GCA AGA AAT CGT CTT GAG AGA CTT CCC TGT GGA GGG GGt TCT 1926Ser Met Ala Arg Asn Arg Leu Glu Arg Leu Pro Cys Gly Gly Gly Ser615 620 625CCC CTT GCT CAT GGG CTT ACG ACG GCA GTT AGA GTT GGA ATG AAT GCA 1974Pro Leu Ala His Gly Leu Thr Thr Ala Val Arg Val Gly Met Asn Ala630 635 640 645GAA AAG AGT GGT GAT GTT GGA CGT ATC ATG ATT GTT GCA ATT ACT GAT 2022Glu Lys Ser Gly Asp Val Gly Arg Ile Met Ile Val Ala Ile Thr Asp650 655 660GGT AGA GCT AAC ATC TCT CTT AAA AGA TCC ACA GAC CCT GAA GCT GAA 2070Gly Arg Ala Asn Ile Ser Leu Lys Arg Ser Thr Asp Pro Glu Ala Glu665 670 675GCT TCT GAT GCA CCC AGA CCT TCT TCC CAA GAG CTG AAG GAT GAG ATT 2118Ala Ser Asp Ala Pro Arg Pro Ser Ser Gln Glu Leu Lys Asp Glu Ile680 685 690CTC GAG GTG GCT GGT AAA ATA TAC AAA ACA GGA ATG TCT CTC CTC GTC 2166Leu Glu Val Ala Gly Lys Ile Tyr Lys Thr Gly Met Ser Leu Leu Val695 700 705ATA GAT ACA GAA AAT AAG TTT GTT TCT ACT GGT TTT GCG AAA GAA ATC 2214Ile Asp Thr Glu Asn Lys Phe Val Ser Thr Gly Phe Ala Lys Glu Ile710 715 720 725GCG AGA GTA GCT CAA GGG AAG TAC TAT TAT TTA CCA AAT GCT TCA GAT 2262Ala Arg Val Ala Gln Gly Lys Tyr Tyr Tyr Leu Pro Asn Ala Ser Asp730 735 740GCT GTG ATA TCT GCA GCA ACA AAG GAT GCA TTA TCT GCA TTA AAG GAA 2310Ala Val Ile Ser Ala Ala Thr Lys Asp Ala Leu Ser Ala Leu Lys Glu745 750 755TCT TGACCTAAAC TCGATCGAAT TAATTGTAAA TGTTGTTTTG AGTATAGATT 2363SerATTGGGAGGA TATAAGAGCT TGCTTGATAA TTCTTATCTT TTGTTGTACT AATTGAACTT 2423ATTTCTCAAT TATGCAATCA GGGTAATGAA GATTCTTTTC ATTTCAAAAA AAAAAAAAAA 2483AAAGGAATTC GA 2495(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度758个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO2的序列描述Met Gly Phe Cys Ser Thr Ser Thr Leu Pro Gln Thr Ser Leu Ser Asn1 5 10 15Ser Gln Ser Ser Thr Phe Phe Thr Tyr Leu Lys Pro Cys Pro Ile Leu20 25 30Ser Ser Thr Tyr Leu Arg Pro Glu Arg Leu Lys Phe Arg Leu Arg Ile35 40 45Ser Ala Thr Ala Thr Ile Asp Ser Pro Asn Gly Ala Val Ala Val Val50 55 60Glu Pro Glu Lys Gln Pro Glu Lys Ile Ser Phe Gly Arg Gln Tyr Phe65 70 75 80Pro Leu Ala Ala Val Ile Gly Gln Asp Ala Ile Lys Thr Ala Leu Leu85 90 95Leu Gly Ala Ile Asp Arg Glu Ile Gly Gly Ile Ala Ile Cys Gly Lys100 105 110Arg Gly Thr Ala Lys Thr Leu Met Ala Arg Gly Leu His Ala Ile Leu115 120 125Pro Pro Ile Glu Val Val Val Gly Ser Met Ala Asn Ala Asp Pro Asn130 135 140Cys Pro Asp Glu Trp Glu Asp Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Tyr Gly145 150 155 160Ser Asp Gly Asn Ile Lys Thr Gln Ile Val Lys Ser Pro Phe Val Gln165 170 175Ile Pro Leu Gly Val Thr Glu Asp Arg Leu Ile Gly Ser Val Asp Val180 185 190Glu Glu Ser Val Lys Ser Gly Thr Thr Val Phe Gln Pro Gly Leu Leu195 200 205Ala Glu Ala His Arg Gly Val Leu Tyr Val Asp Glu Ile Asn Leu Leu210 215 220Asp Glu Gly Ile Ser Asn Leu Leu Leu Asn Val Leu Thr Glu Gly Val225 230 235 240Ash Ile Val Glu Arg Glu Gly Ile Ser Phe Arg His Pro Cys Lys Pro245 250 255Leu Leu Ile Ala Thr Tyr Asn Pro Glu Glu Gly Ala Val Arg Glu His260 265 270Leu Leu Asp Arg Ile Ala Ile Asn Leu Ser Ala Asp Leu Pro Met Ser275 280 285Phe Asp Asp Arg Val Ala Ala Val Asp Ile Ala Thr Arg Phe Gln Glu290 295 300Cys Ser Asn Glu Val Phe Lys Met Val Asp Glu Glu Thr Asp Ser Ala305 310 315 320Lys Thr Gln Ile Ile Leu Ala Arg Glu Tyr Leu Lys Asp Val Thr Ile325 330 335Ser Arg Asp Gln Leu Lys Tyr Leu Val Met Glu Ala Ile Arg Gly Gly340 345 350Cys Gln Gly His Arg Ala Glu Leu Tyr Ala Ala Arg Val Ala Lys Cys355 360 365Leu Ala Ala Ile Asp Gly Arg Glu Lys Val Gly Val Asp Glu Leu Lys370 375 380Lys Ala Val Glu Leu Val Ile Leu Pro Arg Ser Thr Ile Val Glu Asn385 390 395 400Pro Pro Asp Gln Gln Asn Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro405 410 415Gln Asn Gln Asp Ser Ser Glu Glu Gln Asn Glu Glu Glu Glu Lys Glu420 425 430Glu Glu Asp Gln Glu Asp Glu Lys Asp Arg Glu Asn Glu Gln Gln Gln435 440 445Pro Gln Val Pro Asp Glu Phe Ile Phe Asp Ala Glu Gly Gly Leu Val450 455 460Asp Glu Lys Leu Leu Phe Phe Ala Gln Gln Ala Gln Arg Arg Lys Gly465 470 475 480Lys Ala Gly Arg Ala Lys Lys Val Ile Phe Ser Glu Asp Arg Gly Arg485 490 495Tyr Ile Lys Pro Met Leu Pro Lys Gly Pro Val Lys Arg Leu Ala Val500 505 510Asp Ala Thr Leu Arg Ala Ala Ala Pro Tyr Gln Lys Leu Arg Arg Ala515 520 525Lys Asp Ile Gln Lys Thr Arg Lys Val Tyr Val Glu Lys Thr Asp Met530 535 540Arg Ala Lys Arg Met Ala Arg Lys Ala Gly Ala Leu Val Ile Phe Val545 550 555 560Val Asp Ala Ser Gly Ser Met Ala Leu Asn Arg Met Gln Asn Ala Lys565 570 575Gly Ala Ala Leu Lys Leu Leu Ala Glu Ser Tyr Thr Ser Arg Asp Gln580 585 590Val Cys Ile Ile Pro Phe Arg Gly Asp Ala Ala Glu Val Leu Leu Pro595 600 605Pro Ser Arg Ser Ile Ser Met Ala Arg Asn Arg Leu Glu Arg Leu Pro610 615 620Cys Gly Gly Gly Ser Pro Leu Ala His Gly Leu Thr Thr Ala Val Arg625 630 635 640Val Gly Met Asn Ala Glu Lys Ser Gly Asp Val Gly Arg Ile Met Ile645 650 655Val Ala Ile Thr Asp Gly Arg Ala Asn Ile Ser Leu Lys Arg Ser Thr660 665 670Asp Pro Glu Ala Glu Ala Ser Asp Ala Pro Arg Pro Ser Ser Gln Glu675 680 685Leu Lys Asp Glu Ile Leu Glu Val Ala Gly Lys Ile Tyr Lys Thr Gly690 695 700Met Ser Leu Leu Val Ile Asp Thr Glu Asn Lys Phe Val Ser Thr Gly705 710 715 720Phe Ala Lys Glu Ile Ala Arg Val Ala Gln Gly Lys Tyr Tyr Tyr Leu725 730 735Pro Asn Ala Ser Asp Ala Val Ile Ser Ala Ala Thr Lys Asp Ala Leu740 745 750Ser Ala Leu Lys Glu Ser755(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1..6(xi)SEQ ID NO3的序列描述Val Asp Ala Ser Gly Ser1 5(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1..6(xi)SEQ ID NO4的序列描述Thr Asp Gly Arg Gly Asn1 5(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度1579个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..1579(xi)SEQ ID NO5的序列描述
CCCAAAATTC TTCTTCTTCT TCTTCACTGA AAAATTCTAA ACAAAATGGC TTCACTACTA 60GGAACTTCCT CTTCAGCAGC AGCTGCAATA TTAGCTTCTA CACCCTTGTC TTCTCGCTCC 120TGTAAGCCTG CCGTTTTCTC CCTCTTCCCT TCTTCAGGGC AGAGTCAAGG GAGGAAGTTT 180TATGGAGGGA TTAGAGTCCC AGTTAAGAAA GGGAGGTCCC AATTCCATGT GGCAATTTCA 240AATGTTGCGA CGGAAATCAA CCTGCTCAAG AACAGGGTCA GAAACTTGCT GGAGGAGAGC 300CAGAGACCGG TGTATCCATT TGCAGCTATA GTGGGACAAG ATGAAATGAA GTTATGTCTT 360TTGCTGAATG TAATTGATCC AAAGATTGGA GGTGTGATGA TAATGGGTGA TAGGGGAACC 420GGGAAGTCCA CCACGGTTAG ATCTTTGGTA GATTTACTTC CTGAAATCAA AGTTATTTCT 480GGTGATCCGT TCAATTCAGA TCCAGATGAC CAAGAAGTAA TGAGTGCAGA AGTCCGTGAC 540AAATTGAGGA GCGGACAGCA GCTTCCTATA TCTCGTACGA AAATCAACAT GGTTGATTTA 600CCGCTTGGTG CTACTGAGGA CAGGGTGTGT GGCACAATCG ACATTGAGAA AGCTCTTACT 660GAGGGTGTGA AGGCTTTCGA GCCTGGTCTT CTTGCTAAAG CTAACAGAGG AATACTTTAC 720GTCGATGAGG TTAATCTTTT GGACGACCAT TTAGTAGATG TTCTTTTGGA TTCTGCAGCA 780TCGGGATGGA ACACTGTTGA AAGAGAGGGG ATATCAATAT CACACCCTGC CCGGTTTATC 840CTTATTGGTT CGGGTAATCC TGAAGAAGGA 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TCACTTGAAA AAAGAGAGGA 60AAAAAGTGAA GCAGAAATCT TTTCTCAAAA CACAATCTAT AGGAAGTTAA ATTCAACTTC120CACACTTCCA AGATTCTTGT TTCAAGTTTC GTTTAGTTTT TTTTTCTTGG TTTTTTTTAT180AGTTTTCTGT ACAATTTTGT GTAGAATCAA GAAACGAAAG AGTTAAAGTT TGAAACTTTT240TTACAAGTTT GAAACAATGG CTTCTTTGGT TTCTTCACCA TTTACATTGC CAAATTCAAA300AGTAGAACAC TTGTCATCCA TTTCTCAAAA GCATTACTTT CTTCACTCAT TTCTTCCCAA360GAAAATAAAC CCCACTTACT CAAAATCACC AAAGAAATTC CAATGTAATG CTATTGGCAA420TGGTTTATTC ACTCAAACAA CTCAAGAAGT TAGGAGAATT GTGCCTGAAA ATACTCAGGG490ACTTGCTACT GTGAAAATAG TCTATGTTGT ATTGGAAGCT CAGTACCAAT CATCACTTAC540TGCTGCTGTT CAGACACTGA ACAAGAATGG TCAGTTTGCT TCTTTTGAGG TTGTGGGGTA600CTTGGTTGAG GAGCTTAGAG ATGAGAATAC TTATAAAATG TTTTGTAAAG ATCTTGAGGA660TGCAAATGTG TTTATTGGTT CATTGATTTT TGTGGAAGAA TTGGCTTTAA AGGTAAAATC720TGCAGTGGAG AAAGAAAGGG ACAGACTTGA TGCAGTTTTG GTGTTTCCAT CAATGCCTGA780GGTGATGAGG TTGAACAAGT TGGGATCTTT TAGTATGTCA CAATTGGGGC AATCAAAGAG840TCCATTTTTT GAGCTTTTCA AGAAGAAGAA ACCTTCTTCT GCAGGTTTTT CTGATCAGAT900GTTGAAGCTT GTGAGAACAT 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TTGTGGTAGG 2640AAAAGTATAC TCTAAGATTA TGGAGATCGA GTCTCGTCTT CTTCCGTGTG GACTTCACAT2700CATTGGTGAA CCTCCAACCG CGATGGAAGC AGTTGCTACT CTTGTCAATA TTGCGACATT2760GGACCGTCCT GAAGAGGGTA TTTCTGCCCT TCCATCTATA TTGGCTGCGA CGGTTGGAAG2820AAGCATTGAG GAGATTTACA GAGGCAATGA CCAGGGCATC TTACGAGATG TGGAGCTGCT2880CCGTCAAATT ACTGAGGCAT CACGTGGAGC AATATCAGCA TTTGTTGAAC GTACGACAAA2940CAACAAGGGT CAGGTTGTGA ATGTCAATGA CAAGCTAACC TCAATCCTTG GTTTTGGTAT3000AAATGAACCA TGGATCCAGT ATTTGTCAAA CACCCAATTT TACAGAGCTG ATAGGGACAA3060GCTCAGAGTT CTATTCCAGT TCTTGGGAGA GTGTCTGAAG CTAATTGTCG CTAACAACGA3120GGTGGGAAGC TTGAAACAGG CTCTAGAAGG GAAATATGTT GAACCAGGTC CAGGAGGGGA3180TCCGATCAGA AACCCGAAAG TTTTGCCTAC TGGGAAAAAC ATCCATGCTT TGGACCCACA3240AGCTATTCCC ACAATAGCAG CAGTGCAGAG TGCCAAAATT GTTGTTGAAA GATTGTTGGA3300GAGGCAAAAG GCCGACAACG GGGGCAAGTA CCCGGAGACT GTTGCTCTGG TTCTTTGGGG3360AACAGACAAC ATCAAGACCT ATGGAGAGTC ATTGGCACAG GTTATGTGGA TGATTGGTGT3420TAGGCCAGTT ACAGACTCGT TAGGACGGGT TAACCGGGTG GAACCTGTTA GCCTTGAAGA3480GCTTGGAAGG CCTAGAGTTG ATGTTGTTGT CAACTGCTCT GGGGTGTTCA GAGATCTCTT3540CATCAATCAG ATGAATCTCC TTGACCGAGC AGTCAAGATG GTTGCAGAGC TCGACGAGCC3600AGAAGACCAA AACTACGTCA GGAAACATGC ACTAGAACAA GCAAAAACAC TCGGAGTTGA3660TGTTCGTGAA GCTGCTACAA GGATCTTCTC AAATGCTTCA GGATCTTACT CCTCCAACAT3720TAACCTTGCT GTTGAGAATT CAACATGGAA TGATGAGAAG CAACTTCAAG ACATGTACTT3780GAGCCGAAAG TCATTTGCAT TTGACTGTGA TGCCCCTGGT GTTGGCATGA CTGAGAAGAG3840GAAAGTTTTT GAGATGGCTC TTAGCACGGC TGATGCCACA TTCCAGAACC TTGACTCATC3900TGAAATTTCA TTCACAGACG TGAGTCACTA CTTCGATTCA GACCCAACCA ACCTTGTGCA3960AAACCTCAGG AAAGACGGGA AGAAGCCTAG TGCATACATT GCTGACACCA CTACTGCTAA4020TGCTCAGGTA CGTACGTTGT CTGAGACTGT GAGGCTTGAC GCAAGGACAA AGTTGTTGAA4080CCCCAAGTGG TATGAAGGCA TGCTATCCAC TGGCTACGAG GGTGTTCGTG AGATTGAGAA4140ACGATTAACT AACACAGTGG GGTGGAGTGC AACTTCAGGC CAAGTTGATA ATTGGGTGGA4200TGAAGAAGCC AACACAACCT TCATTCAAGA TCAGGACATC TTGAACAGGC TCATGAACAC4260AAATCCAAAT TCTTTCAGGA AGTTGCTTCA GACATTCTTG GAAGCCAACG GGCGTGGATA4320CTGGGAAACT TCTGCAGAGA ACATTGAGAA ACTCAAGCAA TTATACTCAG AAGTTGAAGA4380CAAGATTGAG GGAATCGATC GATAAATGTA TAGCAAAAAG AATGATCTCT GATTATTGCC4440TGTTTGTTCC TAACTGTTTC TGATGTGAAT TCCTTTGACA GTCCCCAGTG TAATTTTGTT4500CATTTTTGGG GATGTCCTAC TTCTATGAGA AAATACTGCT TCCATATATT CAAATTTGAG4560CTTGAAAAAA AAAAAAAAAA(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1..6(xi)SEQ ID NO7的序列描述Ala Lys Gly Ala Val Met1 权利要求
1.一种编码具有植物镁螯合酶CHLD亚基功能的蛋白质或其活性片段的核酸分子。
2.如权利要求1中所要求的核酸分子，它包括SEQ ID No.1或其活性片段。
3.如权利要求1中所要求的核酸分子，它编码根据SEQ ID No.2的蛋白质或其活性片段。
4.一种代表至少10个核苷酸长度的寡核苷酸的核酸分子，它可与在权利要求1至3中的一项或多项中所要求的核酸分子特异性杂交。
5.一种编码选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.7中的肽的核酸分子。
6.一种代表如权利要求1至5中的一项或多项中所要求的核酸分子的反义或互补序列的核酸分子。
7.在权利要求1至6中的一项或多项中所要求的核酸分子在扩增、分离或鉴定编码具有植物镁螯合酶CHLD亚基功能的蛋白质或其生物学活性片段的核酸分子中的应用。
8.在权利要求1至6中的一项或多项中所要求的核酸分子在制备抗体中的应用。
9.在权利要求1至6中的一项或多项中所要求的核酸分子在产生转基因植物中的应用。
10.一种具有植物镁螯合酶CHLD亚基或其活性片段功能的蛋白质，优选地是重组蛋白质。
11.在权利要求10中要求的蛋白质，它包括SEQ ID No.2或其活性片段，优选地是重组蛋白质。
12.在权利要求10和11中的一条或两条中所要求的蛋白质在测定镁螯合酶活性中的应用。
13.在权利要求10和11中的一条或两条中所要求的蛋白质在制备抗体中的应用。
14.一种在重组宿主细胞中产生具有植物镁螯合酶CHLD亚基功能的蛋白质的方法，其中该宿主细胞用编码植物镁螯合酶CHLD亚基或其活性片段的本发明的核酸分子转化，优选地在权利要求1-3中的一项或多项中所要求的DNA序列插入到适于宿主细胞的表达盒中，形成的表达盒以适当的方式插入到适于宿主细胞的载体中，将合适的宿主细胞用形成的载体转化，由此形成的转化宿主细胞生长在合适的培养基中，将由该宿主细胞产生并具有植物镁螯合酶CHLD亚基功能的蛋白质以适当的方式从培养液或从宿主细胞中分离出来。
15.一种在重组宿主细胞中产生具有植物镁螯合酶功能的蛋白质的方法，其中该宿主细胞用编码植物镁螯合酶或其活性片段的本发明的核酸分子转化，优选地在权利要求1-3中的一项或多项中所要求的DNA序列插入到适于宿主细胞的表达盒中，形成的表达盒以适当的方式插入到适于宿主细胞的载体中，将合适的宿主细胞用形成的载体转化，由此形成的转化宿主细胞培养在合适的培养基中，将由该宿主细胞产生并具有植物镁螯合酶功能的蛋白质以适当的方式从培养液或从宿主细胞中分离出来。
16.一种测定植物镁螯合酶亚基相互作用的方法，包括用在权利要求1至3的一项或多项中所要求的DNA序列以及至少用编码另一种镁螯合酶亚基的DNA序列转化宿主细胞，其方式为镁螯合酶基因产物的相互作用导致直接或间接、定性或定量可测的信号，优选地是通过激活标志基因。
17.一种测定植物镁螯合酶活性的方法，包括将在权利要求10和11的一项或两项中所要求的蛋白质与编码镁螯合酶I和H亚基的DNA序列的基因产物相结合，其方式为镁螯合酶基因产物的酶促活性导致直接或间接、定性或定量可测的信号。
18.在权利要求16和17的一项或两项中所要求的方法在鉴定植物镁螯合酶的效应物中的应用。
19.一种镁螯合酶酶促活性的效应物，在权利要求16至17的一项或两项中是可鉴定的，优选地是镁螯合酶的抑制剂或激活剂，特别优选地是镁螯合酶的具有除草活性的抑制剂或镁螯合酶的具有植物检疫和/或促进生长作用的激活剂。
20.一种控制不需要的营养体的方法，包括应用一种或多种具有除草活性的镁螯合酶抑制剂于植物、植物的种子和/或植物所生长的地区，该抑制剂在权利要求16至17的一项或多项中是可鉴定的。
21.一种促进有用植物作物生长的方法，包括应用一种或多种作为生长促进剂的镁螯合酶激活剂于植物、植物的种子和/或植物所生长的地区，该激活剂在权利要求16至17的一项或多项中是可鉴定的。
22.一种保护有用植物作物免受除草剂毒害植物作用的方法，包括应用一种或多种具有植物检疫作用的镁螯合酶激活剂于植物、植物的种子和域植物所生长的地区，该激活剂在权利要求16至17的一项或多项中是可鉴定的。
23.在权利要求19中所要求的效应物在作物保护中的应用，其用于控制不需要的营养体，促进有用植物作物生长或保护有用植物作物免受除草剂的毒害植物作用。
24.一种含有启动子的非天然发生的嵌合基因，该启动子有效地融合到在权利要求1至6的一项或多项中所要求的DNA分子上。
25.一种含有在权利要求1至6的一项或多项中所要求的核酸分子的载体。
26.一种表达在权利要求1至6的一项或多项中所要求的核酸分子的重组宿主细胞，优选地是用在权利要求25中所要求的载体稳定地转化的。
27.一种含有权利要求1至6的一项或多项中所要求的核酸分子的转基因植物、转基因植物细胞、转基因植物器官、转基因植物种子、转基因繁殖材料。
28.一种通过权利要求26的重组宿主细胞产生转基因植物、转基因植物细胞、转基因植物器官、转基因植物种子、转基因繁殖材料的方法。
29.一种产生在权利要求1至6的一项或多项中所要求的核酸分子的方法，包括通过已知的产生核酸的方法产生在权利要求1至6的一项或多项中所要求的核酸分子。
全文摘要
本发明涉及编码一种具有植物镁螯合酶CHLD亚基的蛋白质或其活性片段的核酸分子;具有植物镁螯合酶CHLD亚基的蛋白质或其活性片段功能,优选地是一种重组蛋白质;一种测定植物镁螯合酶亚基的相互作用的方法,其中用在权利要求1至3的一项或多项中所要求的DNA序列以及至少用编码另一种镁螯合酶亚基的DNA序列转化宿主细胞,其方式为镁螯合酶基因产物的相互作用可导致直接或间接、定性或定量可测的信号,优选地是通过激活标志基因,以及含有上述核酸分子的转基因植物、转基因植物细胞、转基因植物器官、转基因植物种子、转基因繁殖材料。
文档编号C12N15/82GK1253592SQ98804486
公开日2000年5月17日 申请日期1998年4月27日 优先权日1997年4月25日
发明者B·格里姆, J·帕彭布洛克, F·哈奈尔, S·格拉夫, F·施米特, W·斯特雷伯 申请人:赫彻斯特-舍林农业发展有限公司