专利名称：由芽孢杆菌获得的新β－葡聚糖酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶，它能够将交替地以1，3-和1，4-β-葡糖苷键连接的混合葡聚糖水解裂解成低聚糖，以及涉及形成该酶的微生物。
这种酶属于内切-1，3-1，4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶类(EC3.2.1.73；地衣酶)或者内切-1，3-β-D-葡糖苷酶类(EC 3.2.1.39；昆布多糖酶)。在本发明中，这里这样的酶被称作β-葡聚糖酶或者Beta-葡聚糖酶。
实际上在存在的所有谷物产品中或多或少地包括上述种类的聚合混合葡聚糖。尤其在食品工业、饮料工业和饲料工业、纺织工业和淀粉加工业中需要能够裂解它们的酶(R.Borriss，“裂解β-葡聚糖的酶”(“β-Glucan-spaltende Enzyme”)H.Ruttloff的《工业用酶》(“IndustrielleEnzyme”)，第11.5章，Behr’s Verlag，Hamburg，1994)。β-葡聚糖酶的主要应用之一是在饮料工业和酿造工业中使用，这里这种酶用于分解麦芽-和大麦芽-β-葡聚糖。正如例如德国专利DD 226 012 A1中描述的，对此使用的酶通常由枯草芽孢杆菌产生，或者由解淀粉芽孢杆菌产生，虽然由其它的微生物，例如半月形无色杆菌、藤黄节杆菌、棘孢曲霉、黑色曲霉、Disporotrichum dimorphosporum、Humicola insolens、Penicillium emersonii、绳状青霉或Trichoderma reesei获得的β-葡聚糖酶也是已知的。商业上例如以商标Cereflo(制造商Novo NordiskA/S)购得的产品可以在酿造业中使用。
迄今为止已知的β-葡聚糖酶具有在弱酸至中性范围内的最佳pH值，这样其被限制为只能在该pH值下进行的方法中应用。申请人的目的是，扩大β-葡聚糖酶的应用范围，开发出这样的β-葡聚糖酶，其在碱性环境中进行的工业方法中应用时，在该条件下具有足够的稳定性。
本发明的内容是由嗜碱芽孢杆菌DSM 9956获得的酶，其具有开头提及的葡聚糖分解活性，产生β-葡聚糖酶的微生物嗜碱芽孢杆菌DSM 9956和编码来自嗜碱芽孢杆菌DSM 9956的β-葡聚糖酶的基因，其是在完成本发明的过程中被鉴定和测序(SEQ ID-NO.2)的，也属于本发明的范围。如果需要，该基因可以原则上已知的方式克隆在其它细菌中，并且在这里表达β-葡聚糖酶。因此，本发明的又一内容是通过基本上微生物的方法获得包括上述基因的宿主生物。从来自嗜碱芽孢杆菌的β-葡聚糖酶-基因的序列推导出的由该微生物获得的本发明β-葡聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID-NO1)描述在附
图1的字母密码中。来自嗜碱芽孢杆菌DSM9956的包括信号肽在内的β-葡聚糖酶由308个氨基酸组成，其中信号肽在通过微生物的细胞壁之后通过信号肽酶被分裂掉，并且在与现有技术中已知的数据[M.E.Louw，S.J.Reid，Watson，《微生物生物技术的应用》(Appl.Microbiol.Biotech.)39(1993)，507-513]相比之后被推测包括31个氨基酸。相应的微生物是革兰氏阳性的，其细胞形状为杆状(宽约O.7至0.9微米，长约2.5至4.0微米)；它被申请人于1995年4月13日保藏在DSM-德国微生物和细胞培养物保藏有限公司，Mascheroder Weg1b，38124 Braunschweig，保藏号是DSM 9956。
优选本发明β-葡聚糖酶与来自嗜碱芽孢杆菌DSM 9956的β-葡聚糖酶具有超过70％，特别是75至99％的同源性。这也适用于其基础基因。
本发明酶优选的应用领域是食品工业，特别是饮料和酿造工业，并且特别是在清洁这些工业部门的膜和其它设备时除去葡聚糖和/或地衣淀粉(Lichenan)。
本发明的又一内容是在清洁食品工业，特别是酿造工业的膜和其它设备时使用本发明β-葡聚糖酶除去葡聚糖和/或地衣淀粉的方法。
实施例实施例1用Sau3A部分消化来自嗜碱芽孢杆菌C/M2-3的染色体DNA，并且用凝胶电泳分离3至8kb大的片段的部分。在连接入质粒pMK4的BamH1-位之后(所述质粒为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体[M.A.Sullivan等《基因》(Gene)29(1984)，21-26])，它被转化入感受态大肠杆菌DH5α-细胞中。具有β-葡聚糖酶活性的重组克隆通过在具有0.2％地衣淀粉(pH8.5)的LB-板上用刚果红染色来鉴定。
从大肠杆菌DH5α-pmK4中的克隆的细胞上清液中提纯出β-葡聚糖酶。在无细胞上清液对20mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.5)透析之后，将透析液加至Q-琼脂糖凝胶(Pharmacia)上，并用0至1MNaCl(在25mM的磷酸钠缓冲液中)(pH7.5或pH9.0)线性洗脱。
葡聚糖分解活性的测定是以改进的M.Lever在《生物化学分析》(Anal.Biochem.)47(1972)，273-279和《生物化学分析》(Anal.Biochem.)81(1977)，21-27中描述的方法为基础的。为此使用β-葡聚糖(Sigma No.G6513)于50mM甘氨酸缓冲液(pH9.0)中的0.5重量％的溶液。将250微升该溶液加入250微升包含待试验葡聚糖分解活性试剂的溶液中，在40℃下温育30分钟。随后，加入1.5毫升包含1mM硝酸铋和1mM酒石酸钾钠的、对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)于0.5M氢氧化钠中的1重量％溶液，并在70℃下加热该溶液10分钟。在冷却(2分钟0℃)之后，在室温下，使用葡萄糖-校准曲线与空白值相对比测定在410纳米下的吸收(例如使用光度计Uvikon930)。空白值涉及这样一种溶液，它如测量溶液一样制备，不同的是仅在加入PAHBAH溶液之后加入葡聚糖溶液。1U相当于在这些条件下产生1μmol葡萄糖/分钟的酶量。
这样获得的酶的比活性为4390mU/mg蛋白质，而起始溶液具有更低约152倍的活性。该酶在SDS-聚丙烯酰胺-凝胶电泳中被染色成均匀的带(银染色)。
借助于标志蛋白质(细胞色素c、马肌红蛋白、胰凝乳蛋白酶原、卵白蛋白、牛血清白蛋白)作为内标，通过SDS聚丙烯酰胺-凝胶电泳估计由嗜碱芽孢杆菌DSM 9956获得的β-葡聚糖酶的分子量约是30000。
在等电聚焦(pH3至9)中，借助于活性染色测定β-葡聚糖酶的等电点为pH5.2。
实施例2pH曲线在40℃下，在Davies-通用缓冲液(21.01克柠檬酸·H2O、13.61克KH2PO4、19.07克Na2B4O7·10H2O、12.11克三羟甲基氨基甲烷(Tris)和7.46克KCl于1升蒸馏水中；使用0.4N氢氧化钠将50毫升该原液调节至所需pH并用蒸馏水补足至200毫升)中温育30分钟之后测定不同pH值下的葡聚糖分解活性。从附图2中描述的pH曲线(相对葡聚糖分解活性(相对A)与pH值的关系图)清楚地看出，在pH6至pH10.5的范围中酶的活性最高。在pH9下为最佳值。
实施例3温度曲线在甘氨酸/氢氧化钠中，在pH9下，通过温育15分钟之久来测定由嗜碱芽孢杆菌DSM 9956获得的β-葡聚糖酶的葡聚糖分解活性与温度的关系。调节试液的pH值，因为该缓冲液与温度的关系是约pH0.033/℃。由附图3已知，葡聚糖分解活性的最大值在60℃，其中附图3是根据温度(T)变化描绘的酶的相对葡聚糖分解活性(相对A)。
序列记录一般信息申请人姓名Cognis Gesellschaft fuer Biotechnologie mbH街道Henkelstrasse 67，Gebaeude Y20地点杜塞尔多夫州名北莱茵-威斯特法伦州邮编40589电话0211-7976763传真0211-7987607发明名称由芽孢杆菌获得的新β-葡聚糖酶序列的数目2通信地址收信人Cognis Gesellschaft fuer Biotechnologie mbH街道Henkelstrasse 67，Gebaeude Y20地点杜塞尔多夫州名北莱茵-威斯特法伦州邮编40589计算机可读文本数据载体磁盘计算机IBM PC-kompatibel操作系统MS-WINDOWS软件MS WORD97对SEQ ID-NO1的说明序列特征长度308个氨基酸种类氨基酸拓扑结构未知分子种类蛋白质假设的无序列描述SEQ ID-NO1Met Lys Arg Lys Thr Phe Val Leu Phe Ser Leu Phe Thr Leu Leu Ile1 5 10 15Gly Met Phe Ser Thr Gly Phe Ala Asn Thr Gly Val Val Gln Ala Glu20 25 30Asp Gly Arg Pro Met Gly Ser Thr Phe His Glu Thr Phe Asp Thr Phe35 40 45Asn Thr Asp Arg Trp Ser Thr Ala Gly Val Trp Thr Asn Gly Ala Met50 55 60Phe Asn Ala Thr Trp Tyr Pro Glu Gln Val Thr Ile Ser Asp Gly Lys65 70 75 80Met Lys Leu Gln Ile Asp Lys Glu Asp Asp Glu Asp Ala Thr Pro Glu85 90 95Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Arg Thr Asn Gln Phe Tyr Gln Tyr Gly Leu100 105 110Phe Glu Val Asn Met Lys Pro Ala Lys Ser Thr Gly Thr Val Ser Ser115 120 125Leu Phe Thr Tyr Thr Gly Pro Trp Asp Trp Asp Asn Asp Pro Trp Asp130 135 140Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly Lys Asp Thr Thr Arg Val Gln Phe145 150 155 160Asn Tyr Phe Thr Asn Gly Val Gly Asn Asn Glu His Tyr His Glu Leu165 170 175Gly Phe Asp Ala Ser Glu Ser Phe Asn Thr Tyr Ala Phe Glu Trp Arg180 185 190Pro Glu Ser Ile Ser Trp Tyr Val Asn Gly Glu Leu Val Tyr Thr Ala195 200 205Thr Glu Asn Ile Pro Gln Thr Pro Gln Lys Ile Met Met Asn Leu Trp210 215 220Pro Gly Ile Gly Val Asp Gly Trp Thr Gly Val Phe Asp Gly Glu Asp225 230 235 240Thr Pro Val Val Thr Glu Tyr Asp Trp Val Arg Tyr Thr Pro Leu Glu245 250 255Glu Leu Asp Asn Asn Gly Glu Gln Pro Lys Pro Val Val Pro Gly Lys260 265 270Pro Glu Lys Pro Gly Lys Pro Gly Lys Asn Gln Lys Asn Gln Glu Asn275 280 285Gln Glu Asn Gln Lys Asn Gln Glu Asn Gln Lys Asn Gln Lys Ile Arg290 295 300Lys Thr Ser Ser305 308对SEQ ID-NO2的说明序列特征长度927个碱基对种类核酸链形状双链拓扑结构线性分子种类染色体组-DNA假设的无反义无最初来源菌株嗜碱芽孢杆菌DSM 9956序列描述SEQ ID-NO2ATG AAA AGG AAG ACA TTT GTA TTA TTT TCT TTA TTT ACG TTG TTA45ATT GGT ATG TTC TCA ACA GGG TTT GCA AAT ACA GGT GTG GTT CAG90GCA GAA GAT GGG AGA CCA ATG GGG TCG ACG TTT CAT GAA ACG TTT135GAT ACC TTT AAT ACG GAC CGC TGG TCA ACA GCT GGG GTA TGG ACA180AAT GGA GCA ATG TTT AAT GCG ACA TGG TAT CCA GAA CAG GTG ACC225ATT TCA GAT GGG AAA ATG AAG TTG CAA ATT GAC AAG GAA GAT GAT270GAA GAT GCA ACC CCA GAA TAT AAG GCT GGG GAA TTA AGA ACG AAT315CAG TTT TAT CAA TAC GGG TTG TTT GAA GTC AAT ATG AAG CCA GCG360AAA TCA ACA GGA ACC GTC TCT TCA CTC TTT ACA TAT ACG GGT CCA405TGG GAT TGG GAT AAT GAT CCT TGG GAT GAA ATC GAT ATT GAG TTC450CTT GGA AAG GAT ACA ACA AGA GTC CAA TTT AAC TAT TTT ACT AAC495GGA GTA GGA AAC AAT GAA CAT TAC CAC GAA TTA GGG TTC GAT GCA540TCA GAA TCT TTT AAT ACG TAT GCT TTT GAA TGG AGA CCA GAA TCA585ATT AGT TGG TAC GTA AAC GGA GAA TTA GTA TAT ACA GCA ACA GAA630AAT ATC CCG CAA ACA CCA CAA AAA ATT ATG ATG AAC TTA TGG CCT675GGA ATT GGA GTG GAT GGA TGG ACA GGC GTT TTT GAC GGA GAA GAC720ACT CCA GTT GTA ACG GAG TAT GAT TGG GTA AGG TAC ACT CCA CTA765GAG GAA TTA GAT AAT AAC GGA GAA CAA CCG AAA CCT GTA GTG CCA810GGA AAA CCA GAA AAA CCA GGA AAA CCA GGG AAA AAC CAG AAA AAC855CAG GAA AAC CAG GAA AAC CAG AAA AAC CAG GAA AAC CAG AAA AAC900CAA AAA ATC AGA AAA ACC AGT AGT TGA 92权利要求
1.产生β-葡聚糖酶的嗜碱芽孢杆菌DSM 9956。
2.由嗜碱芽孢杆菌DSM 9956获得的酶，其具有β-葡聚糖分解活性。
3.权利要求2的酶，其特征在于，它具有附图1中描述的氨基酸序列或者其与具有在SEQ ID-NO1中描述的氨基酸序列的酶具有高于70％的同源性。
4.权利要求3的酶，其特征在于，其与具有在SEQ ID-NO1中描述的氨基酸序列的酶具有75％至99％的同源性。
5.基因，其用于编码权利要求2至4之任一项的酶。
6.权利要求5的基因，其特征在于，其具有在SEQ ID-NO2中描述的序列，或与该序列的同源性高于70％。
7.权利要求6的基因，其特征在于，其与在SEQ ID-NO2中描述的序列具有75％至99％的同源性。
8.基本上通过微生物方法获得的宿主生物，其包含权利要求5至7之任一项的基因。
9.由嗜碱芽孢杆菌DSM 9956获得的具有β-葡聚糖分解活性的酶的用途，其用于在清洁食品工业，特别是酿造工业的膜和设备时除去葡聚糖和/或地衣淀粉。
10.权利要求9的用途，其特征在于，酶具有附图1中描述的氨基酸序列或者其与具有在SEQ ID-NO1中描述的氨基酸序列的酶具有高于70％，特别是75％至99％的同源性。
11.在清洁食品工业，特别是酿造工业的膜和设备时除去葡聚糖和/或地衣淀粉的方法，其特征在于，使用由嗜碱芽孢杆菌DSM 9956获得的具有β-葡聚糖分解活性的酶。
全文摘要
本发明的目的是扩大通常在弱酸至中性环境中使用的β－葡聚糖酶的应用范围,以便在碱性环境中进行的工业方法中使用时,它们在这样的环境下也具有足够的稳定性。根据本发明使用由嗜碱芽孢杆菌DSM 9956获得的具有葡聚糖分解活性的酶。
文档编号C12N1/20GK1265703SQ98807684
公开日2000年9月6日 申请日期1998年7月21日 优先权日1997年7月30日
发明者W·希伦, K－H·莫勒 申请人:亨克尔两合股份公司