得自解淀粉欧文氏菌的过敏反应引发剂、其使用以及编码基因的制作方法

专利名称：得自解淀粉欧文氏菌的过敏反应引发剂、其使用以及编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及得自解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)的过敏反应引发剂、它的使用及编码基因。
背景技术：
细菌病原体与它们的植物宿主之间的相互作用通常分为两类(1)相容的(病原体-宿主)，在宿主植物中导致胞间细菌生长、症状发展和病害发展；和(2)不相容的(病原体-非宿主)，导致过敏反应，即出现特定类型的不相容相互作用，而没有进行性的病害症状。在与宿主植物的相容相互作用期间，细菌群体急剧增加并且发生进行性症状。在不相容的相互作用期间，细菌群体并不增加，并且不发生进行性症状。
过敏反应(“HR”)是一种与植物对付许多病原体的主动防御有关的快速局部坏死(Kiraly，Z.，“由侵入者触发的防御过敏性，”PlantDiseaseAn Advanced Treatise，第5卷，第201-204页，J.G.Horsfall和E.B.Cowling编辑，Academic Press New York(1980)；Klement，Z.，“过敏性，”Phvtopathogenic Prokaryotes.第2卷，第149-177页，M.S.Mount和G.H.Lacy编辑，Academic Press，New York(1982))。如果将高浓度(≥107细胞/ml)的宿主范围有限的病原体(如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)或解淀粉欧文氏菌)浸润入非宿主植物的叶中，则可以很容易地观察到表现为组织萎陷(tissue collapse)的由细菌引发的过敏反应(在较低水平接种物下，坏死仅发生在分离的细胞中)(Klement，Z.，“快速检测致植物病假单胞菌类的致病性，”Nature 199299-300；Klement等人，“由致植物病细菌在烟草叶中诱导的过敏反应，”Phytopathology 54474-477(1963)；Turner等人，“参与过敏反应的植物和细菌细胞之间的定量关系，”Phytopathology 64885-890(1974)；Klement，Z.，“过敏性，”Phytopathogenic Prokaryotes，第2卷，第149-177页，M.S.Mount和G.H.Lacy编辑，Academic Press，New York(1982))。看起来在非宿主中引发过敏反应的能力和在宿主中致病的能力是有关联的。如Klement，Z.，“过敏性，”PhytopathogenicProkaryotes.第2卷，第149-177页，M.S.Mount和G.H.Lacy编辑，Academic Press，NeW York(1982)所指出的，这些病原体在与相容宿主的相互作用中还导致虽然延迟、但生理上相似的坏死。此外，产生过敏反应或产生发病的能力依赖于共同的一组表示为hrp的基因(Lindgren，P.B.等人，“丁香假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonassyringae pv.‘phaseolicola’)的基因簇控制对菜豆植株的致病性和对非宿主植物的过敏性，”J.Bacteriol.168512-22(1986)；Willis，D.K.等人，“致植物病细菌的hrp基因，”Mol.Plant-Microbe Interact.4132-138(1991))。因此，过敏反应可能拥有关于植物防御的本质以及细菌致病性的基础的线索。
hrp基因在革兰氏阴性植物病原体中广泛存在，在这些病原体中它们聚集成簇、保守、在一些情况下是可以互换的(Willis，D.K.等人，“致植物病细菌的hrp基因，”Mol Plant-Microbe Interact.4132-138(1991)；Bonas，U.，“致植物病细菌的hrp基因，”Current Topics inMicrobiology and ImmunologyBacterial Pathogenesis of Plants andAnimals-Molecular and Cellular Mechanisms，第79-98页，J.L.Dangl编辑，Springer-Verlag，Berlin(1994))。几个hrp基因编码一个蛋白分泌途径的组分，其中所述蛋白分泌途径与耶尔森氏菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella)和沙门氏菌属(Salmonella)的菌种分泌在动物疾病中必要的蛋白时所用的途径相似(Van Gijsegem等人，“植物和动物致病细菌中的致病性决定簇在进化上保守，”Trends Microbiol.1175-180(1993))。在解淀粉欧文氏菌、丁香假单胞菌和茄假单胞菌(P.solanacearum)中，已经显示hrp基因控制过敏反应的富含甘氨酸的蛋白引发剂的产生和分泌(He，S.Y.等人，“丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)Harpinpss通过hrp途径分泌并在植物中引发过敏反应的蛋白质，”Cell 731255-1266(1993).Wei，Z.H等人，“解淀粉欧文氏菌的hrp I在harpin的分泌中起作用并且是一个新蛋白家族的成员，”J.Bacteriol.1757958-7967(1993)；Arlat，M.等人，“PopA1，一种在特定矮牵牛基因型中诱导过敏样反应的蛋白质，是通过茄假单胞菌的hrp途径分泌，”EMBO J.13543-553(1994))。
这些蛋白中的第一种在解淀粉欧文氏菌Ea321(一种引起蔷薇科植物的火疫的细菌)中发现，并被命名为harpin(Wei，Z.-M.等人，“harpin，由植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应引发剂，”Science 25785-88(1992))。在编码hrpN的基因中的突变揭示过敏反应引发剂对于解淀粉欧文氏菌在非宿主烟草叶中引发过敏反应以及在高度敏感的梨果实中刺激病害症状是必需的。茄假单胞菌GMI1000 PopA1蛋白具有相似的物理特性，并且也在烟草(并非这个菌株的宿主)的叶中引发过敏反应(Arlat，M.等人，“PopA1，一种在特定矮牵牛基因型中诱导过敏样反应的蛋白质，是通过茄假单胞菌的hrp途径分泌，”EMBO J.13543-53(1994))。然而，茄假单胞菌popA突变体仍然在烟草中引发过敏反应并在番茄中刺激病害。因此，在革兰氏阴性植物病原体中，这些富含甘氨酸的过敏反应引发剂的作用有很大不同。
已经分离了其它植物病原性过敏反应引发剂并克隆和测序了它们的编码基因。其中包括菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)(Bauer等人，“菊欧文氏菌HarpinEch软腐病的致病原因，”MPMI 8(4)484-91(1995))；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)(Cui等人，“胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)株Ecc71的RsmA-突变体超量表达hrpNEcc并在烟草叶中引发过敏反应样反应，”MPMI 9(7)565-73(1966)；斯氏欧文氏菌(Erwiniastewartii)(Ahmad等人，“harpin对于斯氏欧文氏菌对玉米的致病性不是必需的，”8th Int’l.Cong.Molec.Plant-Microb.Inter.1996年7月14-19，和Ahmad等人，“harpin对于斯氏欧文氏菌对玉米的致病性不是必需的，”Ann.Mtg.Am.Phytopath.Soc.1996年7月27-31)；和丁香假单胞菌丁香致病变种(Cornell Research Foundation，Inc.的WO94/26782)。
本发明是鉴定、克隆和测序来自植物病原体的过敏反应引发剂蛋白或多肽的努力中的另一个进步。
发明概述本发明涉及在植物中引发过敏反应的分离的蛋白或多肽，以及编码所述过敏反应引发蛋白或多肽的分离的DNA分子。
过敏反应引发蛋白或多肽可以用于赋予植物抗病性、增强植物生长和/或防治虫害。这涉及到在一定条件下，以非感染形式应用过敏反应引发剂蛋白或多肽于植株或植物种子上，所述条件是指有效地在植株或由所述植物种子长成的植株中赋予抗病性、增强植物生长和/或防治虫害的条件。
为在植物中赋予抗病性、增强植物生长和/或防治虫害，除施用过敏反应引发剂蛋白或多肽于植株或植物种子外，作为一种可替代的方法，可以利用转基因植物或植物种子。当利用转基因植物时，就涉及到提供用编码过敏反应引发剂蛋白或多肽的DNA分子转化的转基因植物，并在一定条件下培育所述植物，所述条件是指有效地在植株或由所述植物种子长成的植株中赋予抗病性、增强植物生长和/或防治虫害的条件。用另一种方法，可以提供用编码过敏反应引发剂蛋白或多肽的DNA分子转化的转基因植物种子，并将其种植在土壤中。然后在一定条件下繁殖植物，所述条件是指有效地在植株或由所述植物种子长成的植株中赋予抗病性、增强植物生长和/或防治虫害的条件。
附图简述

图1A-D显示了诱变构建物、互补构建物和异源表达构建物，以及丁香假单胞菌的avrE基因座上的突变体与解淀粉欧文氏菌的dspE操纵子同源并且互补。虚线框是未鉴定特征的可读框；实心三角形表示hrp(即过敏反应引发剂编码基因)；框是位于许多hrp基因之前的调节序列；空心三角形表示另一个启动子。粗线描绘了序列已经登记的DNA。图1A显示了在pCPP430上解淀粉欧文氏菌的dsp/hrp基因簇。上方标明了操纵子的名称和所编码蛋白的类型。B，BamH I；E，EcoR I；H，HindIII。半箭头表示与hrp框共有序列没有相似性的内部启动子。图1B显示了hrpN下游包含dspE操纵子的区。圆标明了缺失突变和典型的转座子插入黑色，不致病并且是HR+(即引发过敏反应)或HR降低的(dsp)；灰色，毒力和HR减低；白色，野生型。T104位于虚线双箭头标记的区域内。K，Tn5miniKm；P，Tn5phoA；T，Tn10tetr；Δ，缺失突变。灰框是富含A/T的DNA。图1C显示了dspE操纵子的克隆和亚克隆。质粒命名在左边标明，质粒带有的启动子在右边标明。上文未显示的用于亚克隆的限制位点在圆括号内显示。与B中代表突变的圆位于一条直线上的“+”表示所述亚克隆与该突变互补。图1D显示了pCPP2357上丁香假单胞菌番茄致病变种(P.syringae pv.tomato)DC3000的avrE基因座(转录单位III和IV)。标明了预测的蛋白AvrE和AvrF分别与DspE和DspF氨基酸同一性的百分率。黑色矩形是转录终止子(反向重复序列)。与图1B中显示的突变的互补如图1C上方描述。
图2显示了全长DspE和DspE的N端一半在重组大肠杆菌(E.coli)DH5α中的表达。将细胞的裂解物进行SDS-PAGE，然后考马斯染色(Coomassie staining)，其中所述细胞带有或是包含完整dspE操纵子的pCPP1259(泳道A)；克隆载体pCPP50(泳道B)；或是仅含有dspE基因5′一半的pCPP1244(泳道C)。对应于DspE(泳道A)和DspE的N端一半(泳道C)的带用箭头标出。左边显示了分子量标记的迁移。
图3A-D显示了dspe在致病性和HR引发中的作用。图3A显示了(从左到右)用菌株Ea321、Ea321dspEΔ1554或在pCPP1237上具有dspE的5′一半的Ea321dspEΔ1554接种后4天的未成熟的梨果实。图3B显示了用下列菌株浸润后24小时的Norchief大豆叶(1)Ea321，(2)Ea321dspEΔ1554，(3)Ea321hrpN∷Tn5(Wei等人，Science.25785-88(1992)，特此通过引用结合到本文中)和(4)Ea321hrpL∷Tn5(Wei等人，J.Bacteriol.，1776201-10(1995)，特此通过引用结合到本文中)。图3C显示了用菌株(左)Ea321和(右)Ea321dspEΔ1554的悬浮液的平行稀释系列浸润后48小时的烟草叶。浸润浓度(从上到下)是1×1010、1×109、5×108和5×107cfu/ml。图3D类似图3C，但还使用了毒力更强的菌株Ea273和对应突变体Ea273dspEΔ1554，浓度以对数增加，从5×109到5×105cfu/ml。
图4显示了与dspE融合的无启动子GUS构建物在解淀粉欧文氏菌Ea273中的表达。将Ea273和Ea273dspE∷uidA(部分二倍体，同时含有野生型dspE以及与uidA基因融合的截短的dspE；黑条)在LB或Hrp MM中培养，或接种到未成熟的梨果实中。Ea273dspE∷uidAhrpL∷Tn5(黑灰条)和Ea273hrcV∷Tn5uidA(亮灰条)也在hrp MM中培养。显示的数值代表了三份平行的样品根据细菌细胞浓度归一化的平均值。标准差用从每个条延伸出的线表示。在每次测定中，从由其它株获得的对应数值中减去三个Ea273的样品的平均值，并加上标准差。
图5A-C显示了dspE操纵子的转基因无毒(avirulence)功能以及dspE突变体与avrE基因座的互补性。将Norchief大豆叶或是(见图5A)用1×108cfu/ml带有(左)pCPP1250(含有dspE操纵子)或(右)pML 122(克隆载体)的丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)race4的悬浮物浸润，并在室温下24小时后照相，或是(见图5B)用8×105cfu/ml同样菌株的悬浮物浸润，并在22℃、高相对湿度下七天后照相。在用带有pCPP1250的菌株浸润的叶上，组织萎陷都是明显的。在培养了七天的叶上，用仅带有载体的菌株浸润的那一半明显地看到退绿扩展到浸润区域外(病害的典型症状)。在叶上用带有pCPP1250的菌株浸润的那一面上的黑色部分是由叶上起伏不平(buckle)造成的阴影。图5C显示了用(从左到右)Ea321、Ea321dspEΔ1521(pCPP2537，含有avrE基因座)、或Ea321dspEΔ1521(pCPP2537avrE∷Tn5uidA)接种并在七天后照相的半个梨。在用带有完整avrE基因座的dspE菌株接种的果实上，虽然症状与野生型相比大大减轻，但洞周围的坏死是明显的，并且在洞中可以看到一滴一滴的渗出液。用带有avrE的断裂的克隆的dspE菌株接种的果实是没有症状的。
发明详述本发明涉及具有如下所示的SEQ.ID.No.1的核苷酸序列的分离DNA分子ATGGAATTAA AATCACTGGG AACTGAACAC AAGGCGGCAG TACACACAGC GGCGCACAAC 60CCTGTGGGGC ATGGTGTTGC CTTACAGCAG GGCAGCAGCA GCAGCAGCCC GCAAAATGCC 120GCTGCATCAT TGGCGGCAGA AGGCAAAAAT CGTGGGAAAA TGCCGAGAAT TCACCAGCCA 180TCTACTGCGG CTGATGGTAT CAGCGCTGCT CACCAGCAAA AGAAATCCTT CAGTCTCAGG 240GGCTGTTTGG GGACGAAAAA ATTTTCCAGA TCGGCACCGC AGGGCCAGCC AGGTACCACC 300CACAGCAAAG GGGCAACATT GCGCGATCTG CTGGCGCGGG ACGACGGCGA AACGCAGCAT 360GAGGCGGCCG CGCCAGATGC GGCGCGTTTG ACCCGTTCGG GCGGCGTCAA ACGCCGCAAT 420ATGGACGACA TGGCCGGGCG GCCAATGGTG AAAGGTGGCA GCGGCGAAGA TAAGGTACCA 480ACGCAGCAAA AACGGCATCA GCTGAACAAT TTTGGCCAGA TGCGCCAAAC GATGTTGAGC 540AAAATGGCTC ACCCGGCTTC AGCCAACGCC GGCGATCGCC TGCAGCATTC ACCGCCGCAC 600ATCCCGGGTA GCCACCACGA AATCAAGGAA GAACCGGTTG GCTCCACCAG CAAGGCAACA 660ACGGCCCACG CAGACAGAGT GGAAATCGCT CAGGAAGATG ACGACAGCGA ATTCCAGCAA 720CTGCATCAAC AGCGGCTGGC GCGCGAACGG GAAAATCCAC CGCAGCCGCC CAAACTCGGC 780GTTGCCACAC CGATTAGCGC CAGGTTTCAG CCCAAACTGA CTGCGGTTGC 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Ser Lys Gly Ala Thr Leu Arg Asp Leu Leu Ala100 105 110Arg Asp Asp Gly Glu Thr Gln His Glu Ala Ala Ala Pro Asp Ala Alal15 120 125Arg Leu Thr Arg Ser Gly Gly Val Lys Arg Arg Asn Met Asp Asp Met130 135 140Ala Gly Arg Pro Met Val Lys Gly Gly Ser Gly Glu Asp Lys Val Pro145 150 155 160Thr Gln Gln Lys Arg His Gln Leu Asn Asn Phe Gly Gln Met Arg Gln165 170 175Thr Met Leu Ser Lys Met Ala His Pro Ala Ser Ala Asn Ala Gly Asp180 185 190Arg Leu Gln His Ser Pro Pro His Ile Pro Gly Ser His His Glu Ile195 200 205Lys Glu Glu Pro Val Gly Ser Thr Ser Lys Ala Thr Thr Ala His Ala210 215 220Asp Arg Val Glu Ile Ala Gln Glu Asp Asp Asp Ser Glu Phe Gln Gln225 230 235 240Leu His Gln Gln Arg Leu Ala Arg Glu Arg Glu Asn Pro Pro Gln Pro245 250 255Pro Lys Leu Gly Val Ala Thr Pro Ile Ser Ala Arg Phe Gln Pro Lys260 265 270Leu Thr Ala Val Ala Glu Ser Val Leu Glu Gly Thr Asp Thr Thr Gln275 280 285Ser Pro Leu Lys Pro Gln Ser Met Leu Lys Gly Ser Gly Ala Gly Val290 295 300Thr Pro Leu Ala Val Thr Leu Asp Lys Gly Lys Leu Gln Leu Ala Pro305 310 315 320Asp Asn Pro Pro Ala Leu Asn Thr Leu Leu Lys Gln Thr Leu Gly Lys325 330 335Asp Thr Gln His Tyr Leu Ala His His Ala Ser Ser Asp Gly Ser Gln340 345 350His Leu Leu Leu Asp Asn Lys Gly His Leu Phe Asp Ile Lys Ser Thr355 360 365Ala Thr Ser Tyr Ser Val Leu His Asn Ser His Pro Gly Glu Ile Lys370 375 380Gly Lys Leu Ala Gln Ala Gly Thr Gly Ser Val Ser Val Asp Gly Lys385 390 395 400Ser Gly Lys Ile Ser Leu Gly Ser Gly Thr Gln Ser His Asn Lys Thr405 410 415Met Leu Ser Gln Pro Gly Glu Ala His Arg Ser Leu Leu Thr Gly Ile420 425 430Trp Gln His Pro Ala Gly Ala Ala Arg Pro Gln Gly Glu Ser Ile Arg435 440 445Leu His Asp Asp Lys Ile His Ile Leu His Pro Glu Leu Gly Val Trp450 455 460Gln Ser Ala Asp Lys Asp Thr His Ser Gln Leu Ser Arg Gln Ala Asp465 470 475 480Gly Lys Leu Tyr Ala Leu Lys Asp Asn Arg Thr Leu Gln Asn Leu Ser485 490 495Asp Asn Lys Ser Ser Glu Lys Leu Val Asp Lys Ile Lys Ser Tyr Ser500 505 510Val Asp Gln Arg Gly Gln Val Ala Ile Leu Thr Asp Thr Pro Gly Arg515 520 525His Lys Met Ser Ile Met Pro Ser Leu Asp Ala Ser Pro Glu Ser His530 535 540Ile Sar Leu Ser Leu His Phe Ala Asp Ala His Gln Gly Leu Leu His545 550 555 560Gly Lys Ser Glu Leu Glu Ala Gln Ser Val Ala Ile Ser His Gly Arg565 570 575Leu Val Val Ala Asp Ser Glu Gly Lys Leu Phe Ser Ala Ala Ile Pro580 585 590Lys Gln Gly Asp Gly Asn Glu Leu Lys Met Lys Ala Met Pro Gln His595 600 605Ala Leu Asp Glu His Phe Gly His Asp His Gln Ile Ser Gly Phe Pne610 615 620His Asp Asp His Gly Gln Leu Asn Ala Leu Val Lys Asn Asn Phe Arg625 630 635640Gln Gln His Ala Cys Pro Leu Gly Asn Asp His Gln Phe His Pro Gly645 650 655Trp Asn Leu Thr Asp Ala Leu Val Ile Asp Asn Gln Leu Gly Leu His660 665 670His Thr Asn Pro Glu Pro His Glu Ile Leu Asp Met Gly His Leu Gly675 680 685Ser Leu Ala Leu Gln Glu Gly Lys Leu His Tyr Phe Asp Gln Leu Thr690 695 700Lys Gly Trp Thr Gly Ala Glu Ser Asp Cys Lys Gln Leu Lys Lys Gly705 710 715 720Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Leu Leu Lys Asp Gly Glu Val Lys Arg Leu725 730 735Asn Ile Asn Gln Ser Thr Ser Ser Ile Lys His Gly Thr Glu Asn Val740 745 750Phe Ser Leu Pro His Val Arg Asn Lys Pro Glu Pro Gly Asp Ala Leu755 760 765Gln Gly Leu Asn Lys Asp Asp Lys Ala Gln Ala Met Ala Val Ile Gly770 775 780Val Asn Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Asp Ile Arg Ser Phe785 790 795 800Gln Ile Lys Pro Gly Thr Gln Gln Leu Glu Arg Pro Ala Gln Thr Leu805 810 815Ser Arg Glu Gly Ile Ser Gly Glu Leu Lys Asp Ile His Val Asp His820 825 830Lys Gln Asn Leu Tyr Ala Leu Thr His Glu Gly Glu Val Phe His Gln835 840 845Pro Arg Glu Ala Trp Gln Asn Gly Ala Glu Ser Ser Ser Trp His Lys850 855 860Leu Ala Leu Pro Gln Ser Glu Ser Lys Leu Lys Ser Leu Asp Met Ser865 870 875 880His Glu His Lys Pro Ile Ala Thr Phe Glu Asp Gly Ser Gln His Gln885 890 895Leu Lys Ala Gly Gly Trp His Ala Tyr Ala Ala Pro Glu Arg Gly Pro900 905 910Leu Ala Val Gly Thr Ser Gly Ser Gln Thr Val Phe Asn Arg Leu Met915 920 925Gln Gly Val Lys Gly Lys Val Ile Pro Gly Ser Gly Leu Thr Val Lys930 935 940Leu Ser Ala Gln Thr Gly Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly 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Val115511601165Thr Ile Gly Glu Leu His Glu Leu Ala Asp Lyys Ala Lys Leu Val Ser11701175 1180Asp His Lyys Pro Asp Ala Asp Gln Ile Lys Gln Leu Arg Gln Gln Phe1185 119011951200Asp Thr Leu Arg Glu Lys Arg Tyr Glu Ser Asn Pro val Lys His Tyr120512101215Thr Asp Met Gly Phe Thr His Asn Lys Ala Leu Glu Ala Asn Tyr Asp122012251230Ala Val Lys Ala Phe Ile Asn Ala Phe Lys Lys Glu His His Gly Val123512401245Asn Leu Thr Thr Arg Thr Val Leu Glu Ser Gln Gly Ser Ala Glu Leu125012551260Ala Lys Lys Leu Lys Asn Thr Leu Leu Ser Leu Asp Ser Gly Glu Ser1265127012751280Met Ser Phe Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gly Val Ser Thr Val Phe Val128512901295Pro Thr Leu Ser Lys Lys Val Pro Val Pro Val Ile Pro Gly Ala Gly130013051310Ile Thr Leu Asp Arg Ala Tyr Asn Leu Ser Phe Ser Arg Thr Ser Gly131513201325Gly Leu Asn Val Ser Phe Gly Arg Asp Gly Gly Val Ser Gly Asn Ile133013351340Met Val Ala Thr Gly His Asp Val Met Pro Tyr Met Thr Gly Lys Lys1345135013551360Thr Ser Ala Gly Asn Ala Ser Asp Trp Leu Ser Ala Lys His Lys 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Lys157015751580His Phe Lys Asp Ser Ala Thr Thr Lys Met Leu Ala Ala Leu Lys Glu1585159015951600Leu Asp Asp Ala Lys Pro Ala Glu Gln Leu His Ile Ieu Gln Gln His160516101615Phe Ser Als Lys Asp Val Val Gly Asp Glu Arg Tyr Glu Als Val Arg162016251630Asn Leu Lys Lys Leu Val Ile Arg Gln Gln Ala Als Asp Ser His Ser163516401645Met Glu Leu Gly Ser Ala Ser His Ser Thr Thr Tyr Asn Asn Leu Ser165016551660Arg Ile Asn Asn Asp Gly Ile Val Glu Leu Leu His Lys His Phe Asp1665167016751680Als Ala Leu Pro Als Ser Ser Ala Lys Arg Leu Gly Glu Met Met Asn168516901695Asn Asp Pro Als Leu Lys Asp Ile Ile Lys Gln Leu Gln Ser Thr Pro170017051710Phe Ser Ser Ala Ser Val Ser Met Glu Leu Lys Asp Gly Leu Arg Glu171517201725Gln Thr Glu Lys Ala Ile Leu Asp Gly Lys Val Gly Arg Glu Glu Val173017351740Gly Val Leu Phe Gln Asp Arg Asn Asn Leu Arg Val Lys Ser Val Ser1745175017551760Val Ser Gln Ser Val Ser Lys Ser Glu Gly Phe Asn Thr Pro Als Leu176517701775Leu Leu Gly Thr Ser Asn Ser Ala Als Met Ser Met Glu Arg Asn Ile178017851790Gly Thr Ile Asn Phe Lys Tyr Gly Gln Asp Gln Asn Thr Pro Arg Arg179518001805Phe Thr Leu Glu Gly Gly Ile Als Gln Ala Asn Pro Gln Val Ala Ser181018151820
Ala Leu Thr Asp Leu Lys Lys Glu Gly Leu Glu Met Lys Ser182518301835该蛋白或多肽约为198kDa，pI为8.98。
本发明涉及具有如下所示的SEQ.ID.No.3的核苷酸序列的分离DNA分子ATGACATCGT CACAGCAGCG GGTTGAAAGG TTTTTACAGT ATTTCTCCGC CGGGTGTAAA 60ACGCCCATAC ATCTGAAAGA CGGGGTGTGC GCCCTGTATA ACGAACAAGA TGAGGAGGCG120GCGGTGCTGG AAGTACCGCA ACACAGCGAC AGCCTGTTAC TACACTGCCG AATCATTGAG180GCTGACCCAC AAACTTCAAT AACCCTGTAT TCGATGCTAT TACAGCTGAA TTTTGAAATG240GCGGCCATGC GCGGCTGTTG GCTGGCGCTG GATGAACTGC ACAACGTGCG TTTATGTTTT300CAGCAGTCGC TGGAGCATCT GGATGAAGCA AGTTTTAGCG ATATCGTTAG CGGCTTCATC360GAACATGCGG CAGAAGTGCG TGAGTATATA GCGCAATTAG ACGAGAGTAG CGCGGCATAA420该DNA分子被称为dspF基因。本发明的这个分离DNA分子编码具有如下所示的SEQ.ID.No.4的氨基酸序列的过敏反应引发剂蛋白或多肽Met Thr Ser Ser Gln Gln Arg Val Glu Arg Phe Leu Gln Tyr Phe Ser1 5 10 15Ala Gly Cys Lys Thr Pro Ile His Leu Lys Asp Gly Val Cys Ala Leu20 25 30Tyr Asn Glu Gln Asp Glu Glu Ala Ala Val Leu Glu Val Pro Gln His35 40 45Ser Asp Ser Leu Leu Leu His Cys Arg Ile Ile Glu Ala Asp Pro Gln50 55 60Thr Ser Ile Thr Leu Tyr Ser Met Leu Leu Gln Leu Asn Phe Glu Met65 70 75 80Ala Ala Met Arg Gly Cys Trp Leu Ala Leu Asp Glu Leu His Asn Val85 90 95Arg Leu Cys Phe Gln Gln Ser Leu Glu His Leu Asp Glu Ala Ser Phe100 105 110Ser Asp Ile Val Ser Gly Phe Ile Glu His Ala Ala Glu Val Arg Glu115 120 125Tyr Ile Ala Gln Leu Asp Glu Ser Ser Ala Ala130 135该蛋白或多肽约为16kDa，pI为4.45。
本发明包括上述过敏反应引发剂多肽或蛋白的片段。
可以用几种方法产生合适的片段。在第一种方法中，通过亚克隆基因片段，用常规分子遗传操作产生编码本发明引发剂蛋白的基因的亚克隆。然后将所述亚克隆体外表达或在细菌细胞内体内表达，以产生可以根据下文所述程序测定引发剂活性的更小的蛋白或肽。
作为另一种可选择的方法，可以用蛋白酶如胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌A蛋白酶、或胰蛋白酶消化全长的引发剂蛋白，产生引发剂蛋白的片段。根据引发剂蛋白的氨基酸序列，不同的蛋白酶有可能在不同位点切割所述引发剂蛋白。一些得自蛋白酶解的片段可能是抗性的活性引发剂。
在另一种方法中，根据对所述蛋白的一级结构的知识，使用PCR技术以及选定的代表所述蛋白特定部分的特异性引物组，可以合成所述引发剂蛋白基因的片段。然后将这些片段克隆进合适的载体，以进行截短的肽或蛋白的增强表达。
也可以使用化学合成来制备合适的片段。使用要产生的引发剂的已知氨基酸序列来进行这样的合成。或者，将全长的引发剂在高温高压下处理也会产生片段。然后可以用常规方法(如层析、SDS-PAGE)分离这些片段。
也(或者)可以用例如对所述多肽的特性、二级结构和亲水性有最小影响的氨基酸缺失或添加来修饰变异体。例如，可以将一段多肽缀合到所述蛋白N末端的共翻译或翻译后指导该蛋白转运的信号(或前导)序列上。所述多肽也可以缀合一个接头或其它序列以便于所述多肽的合成、纯化或鉴定。
合适的DNA分子是那些在严格条件下与包含SEQ.ID.No.1和3的核苷酸序列的DNA分子杂交的DNA分子。合适的高严格条件的一个例子是杂交在含1M NaCl、50mM Tris-HCl pH7.4、10mMEDTA、0.1％十二烷基硫酸钠、0.2％菲可、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白、50μm g/ml大肠杆菌DNA的介质中65℃进行20小时。然而，任何在这样的严格条件下与包含SEQ.ID.No.1和3的核苷酸片列的DNA分子杂交的DNA分子，不必与编码下列细菌的过敏反应引发剂蛋白或多肽的核酸分子相同解淀粉欧文氏菌(如Wei，Z.-M.等人，“harpin，由植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应引发剂，”Science 25785-88(1992)所公开，特此通过引用结合到本文中)、菊欧文氏菌(如Bauer等人，“菊欧文氏菌HarpinEch软腐病的致病原因，”MPMI 8(4)484-91(1995)所公开，特此通过引用结合到本文中)、胡萝卜软腐欧文氏菌(如Cui等人，“胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种菌株Ecc71的RsmA突变体超量表达hrpNEcc并在烟草叶中引发过敏反应样反应，”MPMI 9(7)565-73(1966)所公开，特此通过引用结合到本文中)、斯氏欧文氏菌(如Ahmad等人，“harpin对于斯氏欧文氏菌对玉米的致病性不是必需的，”8th Int’l.Cong.Molec.Plant-Microb.Inter.1996年7月14-19和Ahmad等人，“harpin对于斯氏欧文氏菌对玉米的致病性不是必需的，”Ann.Mtg.Am.Phytopath.Soc.1996年7月27-31所公开，特此通过引用结合到本文中)和丁香假单胞菌丁香致病变种(Cornell Research Foundation，Inc.的WO 94/26782，特此通过引用结合到本文中)。
本发明的蛋白或多肽最好是用常规技术以纯化形式产生(纯度优选至少约80％，更优选约90％)。本发明的蛋白或多肽一般分泌入重组宿主细胞的生长培养基中。另一种情况下，本发明的蛋白或多肽产生但并不分泌入生长培养基中。在这样的情况下，为分离所述蛋白，增殖带有重组质粒的宿主细胞(如大肠杆菌)，用超声处理、热处理或化学处理裂解细胞，并离心匀浆物以去除细菌残渣。然后用连续的硫酸铵沉淀处理上清液。在一根尺寸合适的葡聚糖柱或聚丙烯酰胺柱上，将含有本发明的多肽或蛋白的组分进行凝胶过滤，以分离所述蛋白。如果需要，可以进一步用HPLC纯化蛋白组分。
可以使用常规的重组DNA技术将编码所述过敏反应引发剂多肽或蛋白的DNA分子引入细胞。通常这涉及将所述DNA分子插入一个表达系统，其中对该表达系统来说所述DNA分子是异源的(即非正常存在)。将所述异源DNA分子以恰当的有义取向并在正确的读框中插入所述表达系统或载体。所述载体包含所述插入的蛋白编码序列的转录和翻译所必需的元件。
Cohen和Boyer的美国专利第4,237,224号(特此通过引用结合到本文中)描述了使用限制酶切割并用DNA连接酶连接，以产生重组质粒形式的表达系统。然后将这些重组质粒通过转化引入单细胞培养物并在单细胞培养物中复制，所述单细胞培养物包括原核生物以及在组织培养中培养的真核细胞。
重组基因也可以引入病毒，如痘苗病毒。用质粒转染已感染病毒的细胞，可以产生重组病毒。
合适的载体包括但不限于下面的病毒载体，如λ载体系统gt11、gt WES.tB、Charon 4，以及质粒载体，如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101，SV40、pBluescript II SK+/-或KS+/-(见“Stratagene克隆系统”目录(1993)，Stratagene，La Jolla，Calif，特此通过引用结合到本文中)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(见F.W.Studier等人，“使用T7 RNA聚合酶指导克隆基因的表达，”Gene ExpressionTechnology第185卷(1990)，特此通过引用结合到本文中)，以及它们的任何衍生物。可以通过转化，特别是转导、细胞接合作用、带动转移或电穿孔，将重组分子引入细胞。使用本领域内的标准克隆程序将所述DNA序列克隆进载体，所述程序如Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual.Cold Springs Laboratory，ColdSprings Harbor，New York(1989)所述，特此通过引用结合到本文中。
可以利用多种宿主-载体系统来表达所述蛋白编码序列。首先载体系统必须与所使用的宿主细胞相容。宿主-载体系统包括但不限于以下所列用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌；微生物，如包含酵母载体的酵母；感染病毒(如痘苗病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统；感染病毒(如杆状病毒)的昆虫细胞系统；以及感染细菌的植物细胞。这些载体的表达元件在其强度和特异性上有所不同。根据所利用的宿主-载体系统，可以使用多种合适的转录和翻译元件中的任何一个。
不同的遗传信号和加工事件控制基因表达的多个水平(如DNA的转录和信使RNA(mRNA)的翻译)。
DNA的转录依赖于启动子的存在。启动子就是一段指导RNA聚合酶的结合并因此促进mRNA合成的DNA序列。真核启动子的DNA序列与原核启动子的DNA序列不同。而且真核启动子及伴随的遗传信号可能在原核系统中不被识别或者不发挥功能，此外，原核启动子在真核细胞中不被识别并且不发挥功能。
类似地，mRNA在原核细胞中的翻译依赖于恰当的、与真核细胞中的信号不同的原核信号的存在。mRNA在原核细胞中的有效翻译需要mRNA上一个名为Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖体结合位点。该序列是mRNA的一段短核苷酸序列，位于起始密码子(通常是AUG，编码蛋白质氨基端的甲硫氨酸)之前。SD序列与16S rRNA(核糖体RNA)的3′端互补，可能是通过与该rRNA形成双链体，使核糖体能正确定位，从而促进mRNA与核糖体结合。关于使基因表达最大化的综述可见Roberts和Lauer，Methods in Enzymology，68473(1979)，特此通过引用结合到本文中。
各种启动子的“强度”(即它们促进转录的能力)有所不同。为表达克隆基因的目的，为了获得所述基因高水平的转录以及进而高水平的表达，最好使用强启动子。根据所利用的宿主细胞系统，可以使用多种合适启动子中的任何一个。例如，当在大肠杆菌、其噬菌体或质粒中进行克隆时，可以使用如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、repA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌λ噬菌体的PR和PL启动子以及其它，包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等等启动子来指导相连DNA区段的高水平转录。此外，可以使用杂种trp-lacUV5(tac)启动子或通过重组DNA技术或其它合成DNA技术产生的其它大肠杆菌启动子，提供插入基因的转录。
可以选择除非受到特异性诱导、否则抑制启动子作用的细菌宿主细胞株和表达载体。在某些操作中，加入特异性诱导物对于插入DNA的有效转录是必要的。例如，通过加入乳糖或IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，lac操纵子被诱导。多种其它操纵子，如trp、pro等，处于不同的控制之下。
原核细胞中的有效基因转录和翻译也需要特异性的起始信号。这些转录和翻译的起始信号在“强度”上有差异，其中它们的“强度”分别根据合成的基因特异性信使RNA以及蛋白的数量来衡量。包含启动子的DNA表达载体还可以包含各种“强”转录和/或翻译起始信号的任何组合。例如，大肠杆菌中的有效翻译要求距起始密码子(“ATG”) 5′约7-9个碱基的SD序列来提供核糖体结合位点。因此，可以使用任何能被宿主细胞核糖体利用的SD-ATG组合。这样的组合包括但不限于得自大肠杆菌λ噬菌体的cro基因或N基因的SD-ATG组合、或得自大肠杆菌色氨酸E、D、C、B或A基因的SD-ATG组合。此外，可以使用任何用重组DNA技术或其它涉及插入合成核苷酸的技术产生的任何SD-ATG组合。
一旦已经将分离的编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的DNA分子克隆进表达系统，就可以将其引入宿主细胞。根据载体/宿主细胞系统，可以采用上面提到的各种形式的转化进行这样的引入。合适的宿主细胞包括但不限于细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞、昆虫、植物等等。
本发明还涉及到赋予植物抗病性、增强植物生长和/或为植物实现虫害防治的方法。这些方法涉及到在一定条件下，以非感染形式应用过敏反应引发多肽或蛋白于整株或植株部分或植物种子上，所述条件是指所述多肽或蛋白接触所述植株或植物种子的全部或部分细胞。或者，可以将所述过敏反应引发剂蛋白或多肽应用于植株，以使得由这样的植株本身回收的种子能够赋予植物抗病性、增强植物生长和/或实现虫害防治。
为在植株或由植物种子长成的植株中赋予植物抗病性、增强植物生长和/或防治虫害，除施用过敏反应引发剂多肽或蛋白于所述植株或所述植物种子外，作为一种可替代的方法，可以利用转基因植物或植物种子。当利用转基因植物时，这就涉及到提供用编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的DNA分子转化的转基因植物，并在有效允许该DNA分子赋予植物抗病性、增强植物生长和/或防治虫害的条件下栽培所述植物。或者，可以提供用编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的DNA分子转化的转基因植物种子并将其种植在土壤中。然后在有效允许该DNA分子赋予植物抗病性、增强植物生长和/或防治虫害的条件下，由所种植的种子繁殖植株。
可以用多种方法实施本发明的应用过敏反应引发剂多肽或蛋白于植株或植物种子的实施方案，包括1)应用分离的引发剂多肽或蛋白；2)应用不致病并且用编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的基因转化的细菌；以及3)应用在一些植物物种中致病(但并不在其所应用的物种中致病)、并且天然包含编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的基因的细菌。
在本发明的一个实施方案中，可以如下文的实施例所述从解淀粉欧文氏菌中分离本发明的过敏反应引发剂多肽或蛋白。然而，本发明的分离的过敏反应引发剂多肽或蛋白最好是重组产生并如上文所述纯化。
在本发明的其它实施方案中，可以通过应用包含编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的基因的细菌，将本发明的过敏反应引发剂多肽或蛋白应用于植株或植物种子。这样的细菌必须能够分泌或输出所述多肽或蛋白，以便所述引发剂能够接触植株或植物种子细胞。在这些实施方案中，所述过敏反应引发剂多肽或蛋白由所述细菌在植物中或在种子上产生，或仅在将所述细菌引入所述植株或植物种子之前产生。
在本发明的细菌应用模式的一个实施方案中，所述细菌并不致病，并且已经用编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的基因转化(如通过重组)。例如，可以用编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的基因转化并不在植物中引发过敏反应的大肠杆菌，然后将其应用于植物。大肠杆菌外的其它细菌物种也可用于本发明的这个实施方案中。
在本发明的细菌应用模式的另一个实施方案中，所述细菌致病，并且天然包含编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的基因。这样的细菌的例子在上文提到。然而，在这个实施方案中，这些细菌应用于对所述细菌导致的病害并不易感的植物或其种子。例如，解淀粉欧文氏菌在苹果或梨中致病，但并不在番茄中致病。然而，这样的细菌会在番茄中引发过敏反应。因此，按照本发明的这个实施方案，解淀粉欧文氏菌可以应用于番茄植株或种子以增强生长，而不会在该物种中致病。
可以利用本发明的方法处理广泛种类的植物或其种子，以赋予抗病性、增强生长和/或防治虫害。合适的植物包括双子叶植物和单子叶植物。更具体地说，有用的作物可以包括苜蓿、稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、甘蓝、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、四季萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高梁以及甘蔗。合适的观赏植物的例子有拟南介(Arabidopsisthaliana)、Saintpaulia、矮牵牛、天竺葵、一品红、菊花、康乃磬和百日草。
关于在赋予抗病性中使用本发明的过敏反应引发剂蛋白或多肽这一方面，可能不会赋予对感染的绝对免疫，但病害的严重性降低，并且症状发展被延迟。侵蚀斑的数目、大小和真菌病原体的孢予生成的程度都减少了。这种赋予抗病性的方法具有以下潜力治疗以前无法治疗的病害、系统治疗由于费用可能无法单独治疗的病害以及避免使用感染性因子或对环境有害的材料。
按照本发明的赋予植物病原体抗性的方法可以用于赋予对广泛种类的病原体(包括病毒、细菌和真菌)的抗性。通过本发明的方法，可以获得尤其是对下列病毒的抗性烟草花叶病毒(Tobacco mosaicvirus)和番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus)。按照本发明也可以赋予植物对尤其是下列细菌的抗性茄假单胞杆菌、丁香假单胞菌烟草致病变种和野油菜黄单胞菌天竺葵致病变种(Xanthamonas campestrispv.pelargonii)。通过使用本发明的方法，可以使植物尤其对下列真菌有抗性尖镰孢(Fusarium oxysporum)和致病疫霉(Phytophthorainfestans)。
关于使用本发明的过敏反应引发剂蛋白或多肽以增强植物生长，可以获得各种形式的植物生长增强或促进。这可以在早至从种子开始的植物生长、或迟至在植物生活的较晚时期发生。例如，依照本发明的植物生长包括产量更大、所产生的种子量增加、种子发芽率提高、植株大小增加、生物量更高、果实更多和更大、果实着色更早、以及果实和植株成熟更早。结果是本发明为栽培者提供显著的经济效益。例如，早发芽和早成熟允许作物生长在短暂的生长季节在其它情况下会阻碍它们在该地生长的地区。种子发芽率的提高导致改善的作物植被(stand)以及更有效的种子使用。产量更大、大小增加和生物量生产增强允许给定的土地小区上年产出更高。
本发明的另一方面涉及为植物实现任何形式的虫害防治。例如，按照本发明，虫害防治包括防止昆虫接触已经施用过敏反应引发剂的植株、防止由于取食伤害(feeding injury)对植株造成的直接虫害、使昆虫离开这样的植株、杀死接近这样的植株的昆虫、干扰昆虫幼虫在这样的植株上的取食、防止昆虫定居于宿主植物、防止定居的昆虫释放毒植物素等等。本发明还防止由于昆虫感染导致的随后对植物的病害。
本发明有效对抗广泛种类的昆虫。玉米螟是玉米(马齿种玉米和甜玉米)的主要害虫，但也食用超过200种植物物种，包括菜豆、黄荚种菜豆和利马豆以及食用大豆、胡椒、马铃薯和番茄，还有许多杂草物种。损害广泛种类的蔬菜作物的其它昆虫幼虫取食害虫包括下列甜菜夜蛾、粉纹夜蛾、玉米穗蛾、草地贪夜蛾、菜蛾、甘蓝种蝇蛆(cabbage root maggot)、葱蝇、瓜种蝇、瓜野螟(甜瓜绢野螟)、胡椒实蝇和番茄蠹蛾。总起来说，这组昆虫害虫代表了对世界范围内的蔬菜生产而言在经济上最重要的一组害虫。
本发明的涉及应用过敏反应引发剂多肽或蛋白的方法在整株植株或植株部分，包括叶、茎、根、繁殖体(例如插条)等受到处理时，可以通过多种程序进行。这可能(但不是必须)涉及将所述过敏反应引发剂多肽或蛋白浸润所述植株。合适的应用方法包括高压或低压喷洒、注射以及在接近引发剂应用发生时打磨叶片(leaf abrasion)。在处理植物种子时，根据本发明的应用实施方案，可以通过高压或低压喷洒、包被、浸渍或注射来应用所述过敏反应引发剂蛋白或多肽。其它合适的应用程序可以由本领域内的技术人员设想出，只要它们能实现所述过敏反应引发剂多肽或蛋白与植株或植物种子的细胞的接触。一旦用本发明的过敏反应引发剂处理种子后，就可以将所述种子种植在天然或人工土壤中，用常规程序培育以产生植株。从按照本发明处理的种子繁殖出植株后，可以一次或多次施用过敏反应引发剂蛋白或多肽来处理所述植株，以赋予植物抗病性、增强植物生长和/或在所述植物上防治虫害。
所述过敏反应引发剂多肽或蛋白可以按照本发明单独或与其它材料混合起来应用到植物或植物种子上。可替代地，可以将所述过敏反应引发剂多肽或蛋白单独应用于植物，并在不同时间施用其它材料。
适于按照本发明的应用实施方案处理植株或植物种子的组合物包含处于一种载体中的过敏反应引发剂多肽或蛋白。合适的载体包括水、水溶液、浆液或干粉。在这个实施方案中，所述组合物包含多于500nM的过敏反应引发剂多肽或蛋白。
虽然并非必要，但这种组合物可以包含其它添加剂，包括肥料、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂以及它们的混合物。合适的肥料包括(NH4)2NO3。合适的杀虫剂的一个例子是马拉硫磷。可用的杀真菌剂包括克菌丹。
其它合适的添加剂包括缓冲剂、润湿剂、包被剂和磨擦剂。这些材料可用于促进本发明的方法。此外，所述过敏反应引发剂多肽或蛋白可以与其它常规种用制剂和处理材料(包括粘土和多糖)一起应用于植物种子。
在本发明的涉及到使用转基因植物和转基因种子的可替代的实施方案中，不必将过敏反应引发剂多肽或蛋白局部应用于植株或种子上。取而代之的是，按照本领域内熟知的方法产生用编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的DNA分子转化的转基因植物。
可以通过使用微量加液器以机械传递重组DNA，将上文所述载体直接显微注射入植物细胞。Crossway，Mol.Gen.Genetics，202179-85(1985)，特此通过引用结合到本文中。也可以使用聚乙二醇将所述遗传材料转移进所述植物细胞中。Krens等人，Nature，29672-74(1982)，特此通过引用结合到本文中。
另一种用赋予对病原体抗性的基因转化植物细胞的方法是粒子轰击(也称为生物弹道转化(biolistic transformation))所述宿主细胞。这可以用几种方法中的一种完成。第一种方法涉及向细胞发射惰性或生物活性颗粒。这种技术在Sanford等人的美国专利第4,945,050、5,036,006和5,100,792号中公开，特此通过引用结合到本文中。这种方法通常涉及到在使颗粒有效穿透所述细胞的外表面并被引入所述细胞内部的条件下，向所述细胞发射惰性或生物活性颗粒。当使用惰性颗粒时，通过用包含所述异源DNA的载体包被颗粒，可以将所述载体引入所述细胞。可替代地，可以用所述载体包围所述靶细胞，以便使所述载体被颗粒的尾流(wake)带入所述细胞。也可以将生物活性颗粒(如含有所述载体和异源DNA的干细菌细胞)发射入植物细胞。
再一种引入方法是将原生质体与其它实体融合，所述实体或者是小细胞、细胞、溶酶体，或者是其它可融合的液相表面体(liquid-surfaced body)。Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，791859-63(1982)，特此通过引用结合到本文中。
也可以通过电穿孔将所述DNA分子引入所述植物细胞。Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，825824(1985)，特此通过引用结合到本文中。在这种技术中，在包含所述表达盒的质粒的存在下，电穿孔植物原生质体。高场强的电脉冲可逆地使生物膜透化，使得所述质粒可以引入。电穿孔后的植物原生质体重新形成细胞壁、分裂、并再生。
另一种将所述DNA分子引入植物细胞的方法是用已经事先以所述基因转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物细胞。在本领域内已知的合适条件下，将转化后的植物细胞培养到形成苗或根，并进一步发育成植株。通常这个方法涉及到用细菌悬浮液接种所述植物组织，并在25-28℃，在不含抗生素的再生培养基上培育所述组织48到72小时。
农杆菌是革兰氏阴性根瘤菌科(Rhizobiaceae)的有代表性的属。它的物种是造成冠瘿(根癌农杆菌)和发根病(毛根农杆菌)的原因。冠瘿瘤和毛根中的植物细胞被诱导产生只能被细菌分解代谢的名为冠瘿碱的氨基酸衍生物。负责冠瘿碱表达的细菌基因是嵌合表达盒的控制元件的便利来源。此外，测定冠瘿碱的存在可用于鉴定转化的组织。
借助于根癌农杆菌的Ti质粒或毛根农杆菌的Ri质粒，可以将异源遗传序列引入合适的植物细胞。在农杆菌的感染时，Ti或Ri质粒被传递给植物细胞并稳定地整合进所述植物的基因组。J.Schell，Science，2371176-83 (1987)，特此通过引用结合到本文中。
转化之后，必须使所述转化的植物细胞再生。
由培养的原生质体再生植物在Evans等人，Handbook of Plant CellCultures，第1卷(MacMillan Publishing Co.，New York，1983)；和VasilI.R.(编辑)，Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，Acad.Press，Orlando，第I卷，1984，和第III卷(1986)，特此通过引用结合到本文中。
已知在实践上所有植物都可以由培养的细胞或组织再生，其中包括但不限于甘蔗、甜菜、棉花、果树以及豆科植物的所有主要物种。
再生方法在植物的物种间各不相同，但通常首先提供转化后原生质体的悬浮液或包含转化后外植体的培养皿。形成愈伤组织，可以由愈伤组织诱导出苗并随后生根。用另一种方法，可以在愈伤组织中诱导胚胎形成。这些胚胎象天然产生的胚胎一样萌发以形成植株。培养基通常会包含各种氨基酸和激素，如生长素和细胞分裂素。在培养基中加入谷氨酸和脯氨酸也是有利的，特别是对于如玉米和苜蓿这样的物种。有效的再生取决于培养基、基因型和所述培养物的历史。如果这三个变量受到控制，那么再生一般是可重现和可重复的。
在将所述表达盒稳定地引入转基因植物之后，可以通过有性杂交将它转移到其它植株中。根据所要杂交的物种，可以使用多种标准育种技术中的任何一种。
一旦产生了这种类型的转基因植物，可以按照常规程序栽培这些植株本身，其中编码所述过敏反应引发剂的基因的存在在所述植株上导致抗病性、植物生长增强和/或虫害防治。用另一种方法，可以由所述转基因植物回收转基因种子。然后可以将这些种子种植在土壤中，并用常规程序栽培以产生转基因植物。在有效赋予植物抗病性、增强植物生长和/或防治虫害的条件下，由所种植的转基因种子繁殖出转基因植物。尽管不希望被理论所束缚，但这样的抗病性、生长增强和/或虫害防治可以由RNA介导或可以得自所述引发剂多肽或蛋白的表达。
当按照本发明使用转基因植物和植物种子时，它们还可以另外用其它材料处理，所述材料与用来处理应用了过敏反应引发剂多肽或蛋白的植株和种子的材料相同。这些其它材料，包括过敏反应引发剂，可以按上文提到的程序应用于转基因植物和植物种子，包括高压或低压喷洒、注射、包被和浸渍。类似地，在从所述转基因植物种子繁殖出植株后，可以一次或多次施用所述过敏反应引发剂处理所述植株，以赋予抗病性、增强生长和/或防治虫害。这样的植株也可以用常规的植物处理剂(如杀虫剂、肥料等)处理。
本发明的另一方面是利用题述引发剂蛋白或多肽来设计会失活、破坏或结合这些蛋白或多肽的分子。由于这些引发剂是在植物病原体，尤其是解淀粉欧文氏菌中发现，因此所设计的分子可以中和所述病原体本身，以便预防或改变病害和/或过敏反应。典型的病害预防分子有抗体，如针对本发明的引发剂蛋白或多肽或其结合部分而产生的单克隆抗体或多克隆抗体。其它典型的病害预防分子包括抗体片段、半抗体(half-antibody)、杂种衍生物、探针和其它分子构建物。
可以用本领域内熟知的技术实现单克隆抗体的生产。这个过程基本上涉及首先从哺乳动物(如小鼠)的脾中获得免疫细胞(淋巴细胞)，其中所述哺乳动物先前已经用目标抗原(如本发明的引发剂蛋白或多肽或其结合部分)或者体内或者体外免疫接种。然后将所述分泌抗体的淋巴细胞与能在细胞培养物中无限复制的(小鼠)骨髓瘤细胞或转化后的细胞融合，由此产生无限增殖、分泌免疫球蛋白的细胞系。培养得到的融合细胞或杂交瘤，根据所需单克隆抗体的产生筛选得到的集落。克隆产生这样的抗体的集落，并或者在体内或者在体外培养以产生大量抗体。融合这样的细胞的理论基础和实践方法学的描述在Kohler和Milstein，Nature 256495(1975)中陈述，特此通过引用结合到本文中。
通过用本发明的引发剂蛋白或多肽或其结合部分体内免疫接种哺乳动物(如小鼠)，使所述动物的淋巴细胞免疫。根据需要，以长至几周的间隔重复这样的免疫，以获得足够滴度的抗体。在最后一次抗原强化之后，处死动物并取出脾细胞。
通过标准和熟知的技术，如通过使用聚乙二醇(“PEG”)或其它融合剂(见Milstein和Kohler，Eur.J.Immunol.6511(1976)，特此通过引用结合到本文中)，实现与哺乳动物骨髓瘤细胞或其它能在细胞培养物中无限复制的融合伴侣的融合。对这种无限增殖细胞系(最好是鼠的，但也可以得自其它哺乳动物物种的细胞，包括但不限于大鼠)进行选择，以使其在利用某些营养物所必需的酶上有缺陷、能够快速生长并具有良好的融合能力。许多这样的细胞系对于本领域内的一般技术人员是已知的，并且其它细胞系经常被描述。
产生单克隆抗体的程序也是人们所熟知的。通过将本发明的引发剂蛋白或多肽或其结合部分皮下给予新西兰白兔(已经首先抽血以获取免疫前血清)，可以产生这样的抗体。在六个不同的位点以每个位点100μl的总体积注射所述抗原。每种注射材料都将包含其中含有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后的所述蛋白或多肽的合成的表面活性剂佐剂多聚醇或粉碎的丙烯酰胺凝胶。然后在第一次注射两周后从兔抽血，并定期用同样的抗原强化三次，每次间隔六周。每次强化后10天收集血清样品。然后通过亲和层析，用对应抗原捕获所述抗体，从血清回收多克隆抗体。最后，用150mg/Kg IV戊巴比妥无痛致死(euthenize)兔子。这种方法和产生多克隆抗体的其它方法在E.Harlow等人编辑，AntibodiesA Taboratory Manual(1988)中公开，特此通过引用结合到本文中。
除利用完整抗体外，本发明的方法还包括使用这样的抗体的结合部分。这样的结合部分包括Fab片段、F(ab’)2片段和Fv片段。可以通过常规方法制造这些抗体片段，所述常规方法如蛋白水解片段化方法，如J.Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice.第98-118页(N.Y.Academic Press 1983)，特此通过引用结合到本文中。
可替代地，本发明的方法可以利用或者在自然界中发现的、或者通过重组DNA方法或其它生物或分子方法合成制备的探针或配体。合适的探针或配体是结合本发明的所述引发剂蛋白或多肽或其结合部分的分子。
无毒(avr)基因(见Vivian，A.等人，Microbiology，143693-704(1997)；Leach，J.E.等人，Annu.Rev.Phytopathol.，34153-179(1996)；Dangl，J.L.“植物和动物的细菌致病原因分子机制和细胞机制，”Current Topics in Microbiology and Immunology，Dangl，J.L.，编辑(Springer，Berlin)，第192卷，第99-118页(1994)，特此通过引用结合到本文中)产生触发防御反应的信号，导致在具有对应抗性(R)基因的植物中的抗病性。通常通过在一种病原体中表达来自另一种病原体的粘粒文库并筛选缩小的宿主范围，分离avr基因。avr基因传统上被认为是在品种-栽培品种水平上宿主特异性的负决定子，但一些基因，包括来自细菌烂斑(bacterial speck)病原体丁香假单胞菌番茄致病变种的avrE基因座(Kobayashi，D.Y.等人，Proc Natl Acad Sci USA86157-61(1989)，特此通过引用结合到本文中)在致病变种-物种或物种-物种水平上限制宿主范围(Whalen，M.C.等人，Proc Natl Acad Sci.USA，856743-47(1988)；Swarup，S.等人，Mol.Plant-Microbe Interact.，5204-13(1992)，特此通过引用结合到本文中)。许多avr基因，包括avrE，是由Hrp调节的。avrE和avrPphE(Mansfield，J.等人，Mol.Plant-Microbe Interact.，7726-39(1994)，特此通过引用结合到本文中)与hrp基因物理相连。
当反式表达时，avrE基因座使得丁香假单胞菌大豆致病变种(导致大豆的细菌性枯萎病(bacterial blight))在所有栽培品种中无毒(Lorang，J.M.等人，Mol.Plant-Microbe Interact，849-57(1995)，特此通过引用结合到本文中)。该基因座包含两个趋同的转录单位，一个位于假定的σ54启动子之后，另一个位于hrp框之后，其中hrp框是一段在许多hrp和avr基因的上游发现的序列，由另外的σ因子HrpL正调节(Innes，R.W.等人，J.Bacteriol.，1754859-69(1993)；Shen H.等人，J.Bacterol，1755916-24(1993)；Xiao，Y.等人，J.Bacterol.，1763089-91(1994)，特此通过引用结合到本文中)。两种转录物的表达都需要HrpL。avrE基因座定量协助丁香假单胞菌番茄致病变种菌株PT23在番茄叶中的毒性，但不协助菌株DC3000的毒性(Lorang，J.M.等人，Mol Plant-Microbe Interact.，849-57(1995)；Lorang，J.M.等人，Mol Plant-Microbe Interact.，7508-515(1994))。
这样，植物病原体中的avr基因结合对该病原体并不易感的植物中的抗病性基因。考虑到本发明的所述DNA分子与植物病原体中的avr基因的同源性，这些DNA分子可用于鉴定对应的植物抗病性基因。通过传统植物育种技术进行这样的鉴定，其中用带有avr基因的病原体接种筛选中的植物，以追踪所述抗性的遗传或鉴定所述抗性的断裂。一旦被鉴定之后，可以用近年来被证明是成功的两种方法之一分离所述抗性基因(见Staskawicz等人，Science，68661-67(1995))。这些方法是定位克隆或作图克隆以及插入诱变或转座子标记。由于可能没有DspE不敏感的栽培品种(对带有dspE的假单胞杆菌属易感；四种测试的大豆栽培品种的每一种都对dspE起反应)，作图克隆(要求在易感系和抗性系之间杂交以鉴定抗性基因相对于其它基因的位置)可能是不可行的。优选的方法将更可能涉及插入诱变，在筛选中使用dspE基因或蛋白以鉴定由于转座子标记对应的抗性基因而丧失dspE产物的系。
实施例实施例1-重组DNA技术如Sambrook等人(Sambrook，J.等人，Moleeular cloningALaboratory manual，(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)(1989)，特此通过引用结合到本文中)所述，进行DNA分离、限制酶消化、连接、转化大肠杆菌以及构建丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000基因组文库和菌落杂交以筛选所述文库。使用pCPP47(Bauer，D.W.等人，Mol.Plant-Microbe Interact.，10369-379(1997)，特此通过引用结合到本文中)构建所述文库。除非指出，否则使用大肠杆菌DH5和大肠杆菌DH5α作为DNA克隆的宿主，并使用pBluescript或pBC质粒(Stratagene，La Jolla，CA)作为载体。如所述(Bauer，D.W.，“解淀粉欧文氏菌致病性的分子遗传学技术、工具及它们的应用，”(哲学博士论文)，Cornell University，Ithaca，NY(1990)，特此通过引用结合到本文中)通过电穿孔转化解淀粉欧文氏菌。使用pRK2013(Figurski，D.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761648-1652(1979)，特此通过引用结合到本文中)将质粒带动转移进解淀粉欧文氏菌和丁香假单胞菌。实施例2-核苷酸测序和分析使用pCPP430的亚克隆确定解淀粉欧文氏菌菌株Ea321的dsp区的核苷酸序列(Beer，S.V.等人，Advances in Molecular Genetics ofPlant-Microbe Interactions.Hennecke，H.等人编辑，(Kluwer AcademicPublishers，Dordrecht，The Netherlands)，第53-60页(1991)，特此通过引用结合到本文中)。使用pCPP2357的亚克隆以及(根据部分测序)它包含avrE基因座的发现，确定avrE基因座的核苷酸序列，其中pCPP2357是根据与丁香假单胞菌丁香致病变种的hrpRS操纵子的杂交从丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000基因组粘粒文库中选择出的克隆。核苷酸测序由Cornell Biotechnology Sequencing Facility在一台377型测序仪(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division，Foster City，CA)上进行。使用GCG软件包(版本7.1)(Genetics Computer Groups，Inc.，Madison，WI)和DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的程序进行序列装配、分析和比较。使用BLAST(Altschul，S.F.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，875509-5513(1990)，特此通过引用结合到本文中)进行数据库检索。实施例3-DspE和DspE’在大肠杆菌中的表达将dspE操纵子以两个片段克隆进pCPP50，产生pCPP1259，其中pCPP50是PINIII113-A2(Duffaud，G.D.等人，Methods in Enzymology，Wu，R.等人编辑(Academic Press，New York)，153492-50(1987)，特此通过引用结合到本文中)的具有延伸的多接头的衍生物。在pCPP1259中的表达是由大肠杆菌的Ipp启动子驱动的，处于lac操纵基因控制下。还分离了从所述操纵子的起点延伸到位于dspE中间的BamH I位点的一个中间克隆pCPP1244。将包含pCPP1259和pCPP1244的大肠杆菌DH5α株于37℃下在LB中培养直到OD620为0.3。然后加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至1mM，继续培养细胞直到OD620达到0.5。将细胞浓缩两倍，裂解并如以前所述使用7.5％丙烯酰胺进行SDS-PAGE处理(Sambrook，J.等人，Molecullar cloningA Laboratorymanual，(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)(1989)，特此通过引用结合到本文中)。包括含有pCPP50的细胞以进行比较。使用考马斯染色显现蛋白。实施例4-dspE的缺失诱变使用唯一的Stu I和Sma I位点，从pCPP1237中的dspE的5′HindIII-BamH I片段中删除1554bp。然后以大肠杆菌SM10λpir作为宿主，将诱变后的克隆插入自杀载体pKNG101(Kaniga，K.等人，Gene，109137-42(1991)，特此通过引用结合到本文中)，产生pCPP1241。然后如以前所述(Bogdanove，A.J.等人，J.Bacteriol.，1781720-30(1996)，特此通过引用结合到本文中)用标记收回(marker eviction)将所述名为Δ1554的突变转移进解淀粉欧文氏菌菌株。使用两个用克列诺片段平端化的BstEII位点，从pCPP1246中的dspE的3′HindIII片段中删除1521bp。如上将这个突变Δ1521转移进解淀粉欧文氏菌菌株。实施例5-致病性测定对于解淀粉欧文氏菌菌株，将每ml含5×108菌落形成单位(cfu)的细胞悬浮液加进在未成熟Bartlett梨果实上切的洞中，或刺进Jonamac苹果和枸子苗中，并如以前所述进行测定(Beer，S.V.，Methodsin Phytobacteriology，Klement，Z.等人编辑(Adadémiai Kiadoó，Budapest)，第373-374页(1990)；Aldwinckle，H.S.等人，phytopathology，661439-44(1976)，特此通过引用结合到本文中)。对于丁香假单胞菌大豆致病变种，用8×105cfu/ml的细菌悬浮液如下面HR测定一样浸润2周大的大豆幼苗(Glycine max，栽培品种Norchief)的初生叶的叶片。然后将植株用干净的塑料袋覆盖并于22℃在萤光灯(16小时/天)下培养5-7天。计数坏死和退绿的叶片。实施例6-HR测定如前所述(Wei，Z.M.等人，Science.25785-88(1992)；Bauer，D.W.等人，Mol.Plant-Microbe Interact.，4493-99(1991)，特此通过引用结合到本文中)用细菌细胞悬浮液浸润烟草叶片(Nicotiana tabacum L.‘xanthi’)。象处理烟草一样，用细菌细胞悬浮液浸润2周大的大豆幼苗(出现次生叶)的初生叶。在试验台上24-48小时后，计数HR(组织萎陷)的植株。将解淀粉欧文氏菌菌株悬浮于5mM KPO4，pH6.8缓冲液中，而丁香假单胞菌菌株悬浮于10mM MgCl2中。实施例7-GUS测定将细胞1)在LB中培养至OD620为0.9-1.0；2)在LB中培养至OD620为0.5，然后在诱导hrp基因的基本培养基(Hrp MM；Huynh，T.V.等人，Science，3451374-77(1989)，特此通过引用结合到本文中)中洗涤并重悬浮至OD620为0.2，然后在21℃下培养36小时到最终OD620为0.9-1.0；或3)在LB中培养至OD620为0.5，在0.5mM KPO4缓冲液，pH6.8中洗涤并浓缩2倍，然后转移到半个梨上新鲜切出的洞中，并象致病性测定一样培养36小时。基本根据Jefferson的方法(Jefferson，R.A.，Plant Molecular Biology Reporter，5387-405(1987)，特此通过引用结合到本文中)测定细胞的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)活性。对于在LB或Hrp MM中的细胞，将50μl细胞与含有2mM β-D-葡糖苷酸4-甲基伞形基酯(umbelliferyl)作为底物的200μl GUS提取缓冲液(50mMNaHPO4，pH7.0，10mM β-巯基乙醇，10mM Na2EDTA，0.1％十二烷基肌氨酸钠，0.1％Triton X-100)混合并在37℃下孵育100分钟。对于梨果实中的细胞，使用#4打孔器切下孔周围的组织并在5mM KPO4缓冲液pH6.8中匀浆。将200μl匀浆与800μl含有底物的GUS提取缓冲液混合，并如上所述孵育。在2ml的总体积中，加入Na2CO3至最终浓度为0.2M以终止反应。使用TKO100微荧光计(Hoefer ScientificInstruments，San Francisco，CA)测量荧光。对于所有样品，如Miller所述(Miller，J.H.，A Short Course in Bacterial GeneticsA LaboratoryManual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)(1992)，特此通过引用结合到本文中)通过稀释液铺平板估计细胞浓度，并将荧光读数转化为皮摩尔水解底物/108cfu/分钟。实施例8-解淀粉欧文氏菌的“病害特异性”(dsp)区包含一个6.6kb的双基因操纵子对以前消除了致病性但未消除HR引发能力的转座子插入的作图(Steinberger，E.M.等人，Mol.Plant-Microbe Interact.，1135-44(1988)，特此通过引用结合到本文中)，证实了在Ea321株中如在CFBP1430株中报道过的一样(Bamy，A.M.等人，Mol.Microbiol.，4777-86(1990)，特此通过引用结合到本文中)，在hrpN基因的下游存在“病害特异性”(dsp)区。确定了来自Ea321的hrpN下游约15kb DNA的序列，揭示了几个可读框(图1的ORF)。其中一个可读框位于带有一个更小的可读框的表观6.6kb的操纵子上，跨越dsp插入作图的区域。这两个可读框被命名为dspE和dspF，所述操纵子被命名为dspE。在dspE之前(开始于起始密码子上游70bp)是序列GGAACCN15CAACATAA，该序列匹配依赖于HrpL的启动子的共有序列或解淀粉欧文氏菌的“hrp框”(Kim，J.H.等人，J.Racteriol.，1791690-97(1997)，特此通过引用结合到本文中)，并与丁香假单胞菌的hrp和avr基因的hrp框(Xiao，Y.等人，J.Bacteriol.1763089-91(1994)，特此通过引用结合到本文中)极其相似。紧接在dspF下游的是富含A/T的DNA，其后是与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的spvR基因高度相似的一个可读框(ORF7)，其中所述spvR基因是调节基因的lysR家族的成员(Caldwell，A.L.和Gulig，P.A.，J.Bacteriol.，1737176-85(1991)，特此通过引用结合到本文中)。紧接在dspE操纵子下游的是受Hrp调节的基因hrpW，该基因编码一种新型harpin。
dspE的推导产物含有1838个氨基酸并且是亲水的。在大肠杆菌中的表达(图2)证实了其预测的分子量198kD。仅含有dspE的5′半的一个中间克隆的表达产生了一种具有相应的预测迁移率的蛋白，暗示所述蛋白的N端一半可能形成一个独立稳定的域。预测为16kD、酸性(pI，4.45)、主要是α-螺旋、在C端具有两性α螺旋的dspF，与动物致病性细菌的毒力因子陪伴分子在物理上相似(Wattiau，P.等人，Mol.Microbiol.，20255-62(1996)，特此通过引用结合到本文中)。实施例9-dspE是火疫病所需的在Ea321和Ea273(分别是低毒力株和高毒力株)中，在dspE内制造两个符合读框的缺失(图1)。第一个(Δ1554)对应于氨基酸残基G203到G720，第二个(Δ1521)对应于氨基酸残基T1064到V1570。每个缺失都消除了两个株在接种到未成熟的梨果实(图3)、苹果苗或枸子苗后引起火疫病的能力。Δ1554由仅带有dspE重叠5′一半的克隆互补，进一步暗示该蛋白的N端形成一个稳定的域(图1和图3)。实施例10-dspE操纵子以定量和依赖于菌株的方式促使解淀粉欧文氏菌在烟草中引发HR，并且不是解淀粉欧文氏菌在大豆中引发HR所需的dsp区中的转座子插入降低了解淀粉欧文氏菌在烟草中引发HR的能力(Bamy，A.M.等人，MolMicrobiol.，4777-86(1990)，特此通过引用结合到本文中)。将Ea321和Ea273的dspEΔ1554突变株的悬浮液的稀释系列与它们的野生型亲本并列地浸润烟草叶，评价dspE在HR引发中的作用(图3)。所有的菌株都能够引发HR，但在每个细胞的基础上，Ea321 dspEΔ1554在引发组织萎陷上大约只有野生型十分之一有效。然而，Ea273和Ea273dspEΔ1554之间在HR引发活性上没有显著差异。Ea321dspEΔ1554在Acme、Centennial、Harasoy和Norchief大豆叶上引发野生型HR(图3)。实施例11-dspE操纵子是受Hrp调节的将无启动子的uidA基因构建物克隆进用于将Δ1554突变(图1)引入解淀粉欧文氏菌野生型菌株的pCPPl241的dspE片段下游(此构建物包含一个带有内部缺失的3′截短的dspE基因)。将得到的质粒pCPP1263带动转移进Ea321和Ea273。分离其中质粒整合已经保留dspE的完整拷贝的致病株以及其中dspE的天然拷贝已经突变的非致病株。在Luria Bertani培养基(LB)和Hrp MM中测定所有菌株的GUS活性，并在梨果实中测定致病株的活性。从在Hrp MM和梨中培养的菌株获得了高水平的活性，但从在LB培养的菌株中未获得高水平活性。在Hrp MM中的表达水平与用作阳性对照的hrcV-uidA融合体(“G73，”Wei等人，J.Bacteriol.，1776201-10(1995)，特此通过引用结合到本文中)的表达水平相当。dspE-uidA融合体在野生型背景和dspE突变背景中的表达水平没有显著差异，表明dspE可能不是自身调节的。dspE-uidA融合体在hrp MM中Ea321和Ea273的hrpL突变体中的表达比在HrpL+菌株中的表达低两个数量级。图4显示了针对Ea273及其衍生细胞的数据。实施例12-dspE和dspF与丁香假单胞菌番茄致病变种的avrE基因座上的基因同源对遗传数据库的BLAST(Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol，215403-10(1990)，特此通过引用结合到本文中)检索揭示，dspE与丁香假单胞菌番茄致病变种的avrE基因座上的部分序列(Lorang，J.M.等人，Mol.Plant-Microbe Interact.849-57(1995)，特此通过引用结合到本文中)相似。构建了丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000基因组DNA的粘粒文库，并分离了重叠hrp基因簇并包含avrE基因座的克隆(pCPP2357)。确定了avrE基因座的完整核苷酸序列，揭示在一个以前命名为转录单位III的操纵子中单独存在dspE的同源物(编码一个195kD、有30％相同的含1795个氨基酸的蛋白)，以及在与之并列且反向(juxtaposed and opposing)的以前命名为转录单位IV的操纵子的末端存在aspF的同源物(编码一个14kD、有43％相同的含129个氨基酸的蛋白)(图1)。这些基因被命名为avrE和avrF。DspE和AvrE C端一半的序列对比(从DspE的V845开始)显示比N端一半(26％相同)更保守(33％相同)。AvrE包含一个在ATP-结合蛋白或GTP-结合蛋白中保守的基序(氨基酸残基A450到T457)(“P-loop”；Saraste，M.等人，Trends Biochem.Sci.，15430-34(1990)，特此通过引用结合到本文中)。然而，这个基序在DspE中并不保守，并且它在AvrE中的功能意义(functional significance)，如果有的话，是不清楚的。在整个DspF和AvrF的序列对比中，氨基酸同一性均匀分布，并且AvrF具有与DspF相同的预测的物理特性。在avrF上游与所述操纵子竞争的是一个与遗传数据库中的序列没有相似性的2.5kb的基因。实施例13-dspE操纵子作为一个无毒基因座起作用将dspE操纵子克隆进pML 122(Labes，M.等人，Gene.8937-46(1990)，特此通过引用结合到本文中)中nptII启动子的下游，并将这个构建物pCPP1250带动转移进丁香假单胞菌大豆致病变种race 4。得到的菌株在大豆栽培品种Acme、Centennial、Harasoy和Norchief中引发HR，而含有pML122的对照菌株并不引发HR；在有利条件下培养的Norchief植株中，带有pCPP1250的race 4无法引起病害症状，而对照菌株导致从接种点扩展的坏死和退绿(图5)。实施例14-avrE互补dspE突变将粘粒pCPP2357带动转移进Ea321 dspE突变株Δ1554和Δ1521。得到的转接合子致病但毒力低。带有在avrE基因中具有一个转座子插入的pCPP2357的Ea321dspEΔ1521是不致病的，显示所观察到的互补是avrE特异性的(图1和图5)。从Ea273dspEΔ1521突变体的转接合子观察到同样的结果。
已经发现了超过三十种细菌avr基因。avr基因过多被认为是源于“进化上激烈竞争(evolutionary tug-of-war)”(Dangl，J.L.，BacterialPathogenesis of Plants and AnimalsMolecular and Celluar Mechanisms(Current Topics in Microbiology and Immunology)，Dangl，J.L.编辑(Springer，Berlin)，19299-118(1994)，特此通过引用结合到本文中)，即一个由于R基因的选择、反选择以及avr基因的修饰或取代的反复过程，这个过程首先由Flor认识，他假设“在宿主和寄生物的平行进化中，它们发展出互补的基因系统”(Flor，H.H.，Adv Genet.，829-54(1956)，特此通过引用结合到本文中)。然而，只有几个avr基因(包括菌株PT23中的avrE)在它们天然的遗传背景中在毒力或病原体适合度(pathogen fitness)中起可检测的作用(Lorang，J.M.等人，MolPlant-Microbe Interact.，7508-15(1994)；Kearney，B.等人，Nature，346385-86(1990)；Swarup，S.等人，Phytopathology，81802-808(1991)；DeFeyter，R.D.等人，Mol.Plant-Microbe Interact.，6225-37(1993)；Ritter，C.等人，Mol.Plant-Microbe Interact.，8444-53(1995)，特此通过引用结合到本文中)，而驱使许多这些限制宿主范围的因子维持在病原体基因组中的选择压力仍然是个谜。但是现在清楚知道，几个Avr蛋白通过Hrp途径被送入植物细胞(Gopalan，S.等人，Plant Celli，81095-1105(1996)；Tang，X.等人，Science，2742060-63(1996)；Scofield，S.R.等人，Science，2742063-65(1996)；Leister，R.T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93l5497-15502(1996)；Van Den Ackerveken，G.等人，Cell，871307-16(1996)，特此通过引用结合到本文中)并因此可能在根本上是毒力因子，其(直接地、或通过酶产物间接地)与宿主靶相互作用以促进寄生。这样的靶的突变(因为易感性降低而选定)以及识别Avr蛋白的R蛋白的进化将迫使新的或修饰的Avr蛋白的获得或进化，并导致avr基因的增殖。这些协同进化过程有可能累积地驱动一种趋势，朝着在致病原因中具有定量和丰余效应而不是决定性重要作用的avr基因发展(Alfano，J.R.等人，Plant Cell，81683-16988(1996)，特此通过引用结合到本文中)。
已经发现同源物dspE和avrE以显著不同的程度影响病害。无毒基因座可以转基因取代致病性操纵子，而dspE的无毒功能也跨越了病原体属。这些发现支持avr基因在病害中具有首要功能的假说。此外，它们支持并扩展了上面讨论的avr基因增殖的协同进化模型，并且它们具有涉及到控制多年生植物的火疫病和其它细菌性病害的实用意义。
可以由该模型预言特定因子对致病性的相对贡献将部分反映该病原体的遗传史，特别是与它的宿主的协同进化的程度。dspE是致病性所必需的；avrE具有定量、依赖于菌株的毒力表型。与该预言相一致，与推测与解淀粉欧文氏菌一起进化的木本宿主相比，在通常被丁香假单胞菌致病变种感染的草本宿主中，对应R基因的进化和病原体毒力因子的靶的修饰可能随时间更频繁地发生并达到更深的程度。此外，或者或另外，解淀粉欧文氏菌获得aspE(通过进化或水平转移(horizontal transfer))比丁香假单胞菌获得avrE发生得相对更近，使得导致修饰或丰余功能的发展的协同进化的时间更少。
从该模型也可以假设毒力因子可能在多种病原体中保守，但各自适应以避免在特定宿主中被检测到。由DNA印迹杂交得到的初步结果表明丁香假单胞菌大豆致病变种带有一个avrE同源物，该同源物如果有功能的话，将支持这样的假说。相似地，在丁香假单胞菌大豆致病变种中存在来自丁香假单胞菌番茄致病变种的大豆栽培品种特异性基因avrA和avrD的同源物(Kobayashi，D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86157-161(1989)，特此通过引用结合到本文中)。
dspE和avrE的同源性以及转基因作用的能力扩展了avr基因增殖的模型。向多因子毒力进化的主要组分可能是由异源病原体获得编码新型毒力因子的基因，并保持使它们能够散开的普遍发挥功能的毒力因子传送系统(也可能所述因子本身保持通用的指向Hrp途径的信号)。许多avr基因确实位于质粒上并散布于病原体菌株中(Dangl，J.L.，Bacterial Pathogenesis of Plants and Animals Molecular andCelluar Mechanisms(Current Topics in Microbiology and Immunology)，Dangl，J.L.编辑(Springer，Berlin)，19299-118(1994)，特此通过引用结合到本文中)，而各个hrp基因是保守的，甚至是可交换的(Arlat，M.等人，Mol.Plant-Microbe Interact.4593-601(1991)；Laby，R.J.等人，Mol.Plant-Microbe Interact.，5412-19(1992)，特此通过引用结合到本文中)。aspE和avrE在不同的属中的存在暗示了祖先基因座的水平转移，并且虽然dspE和avrE是同源的并且与hrp相关，但这些基因能够转基因发挥功能表明解淀粉欧文氏菌和丁香假单胞菌中的Hrp途径仍然对DspE和AvrE在进化中产生的差异并不敏感。预测甚至非同源的Avr样蛋白都将跨越致植物病细菌属起作用。
还需要展示dspE基因座的无毒功能是否依赖于Hrp途径。确定aspE和dspF基因产物在植物-细菌相互作用中的定位看起来是可能的，也将是重要的。DspF(和AvrF)与毒力因子从动物病原菌中的III型分泌所需的陪伴分子(Wattiau，P.等人，Mol.Microbiol.，20255-62(1996)，特此通过引用结合到本文中)的物理相似性在致植物病细菌中是吸引人并且新颖的。对这些陪伴分子的需要看来是由于除指向分泌途径(Woestyn，S.等人，Mol.Microbiol.，201261-71(1996)，特此通过引用结合到本文中)之外的某种功能陪伴分子可以稳定蛋白，使蛋白为分泌保持合适的构象，或防止成熟前多聚化或与其它蛋白相结合。可能DspF结合DspE(AvrF结合AvrE)并起相似作用，由于后一种蛋白的大尺寸和可能是多结构域的本质，这对它来说可能是特别重要的。
dspE操纵子是解淀粉欧文氏菌中第一个被描述的无毒基因座。在dspE操纵子附近已经发现了野油菜黄单胞菌的avrRxv(Whalen，M.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，856743-47(1988)，特此通过引用结合到本文中)的同源物(Kim，J.F.，Molecular Characterization of aNovel Harpin and Two hrp Secretory Operons of Erwinia amylovora anda hrp Operon of E.chrysanthemi(哲学博士论文)，Cornell University，Ithaca，NY(1997))。还未有报道对火疫病的单基因(R基因介导的)抗性，但已经观察到解淀粉欧文氏菌在苹果栽培品种上的不同毒力(Norelli，J.L.等人，Phytopathology，74136-39(1984)，特此通过引用结合到本文中)。同时，一些解淀粉欧文氏菌菌株感染悬钩子属(Rubus)的种而不是苹果类植物，反之亦然(Starr，M.P.等人，Phytopathology，41915-19(1951)，特此通过引用结合到本文中)。应该确定aspE操纵子和avrRxv同源物或其它潜在的引发剂是否在这些特异性中发挥功能。
虽然dspE操纵子在丁香假单胞菌大豆致病变种中表达时触发大豆中的防御反应，但它并不是解淀粉欧文氏菌引发的大豆的HR所必需的。hrpN也不是必需的(图3)。有可能解淀粉欧文氏菌必须具有aspE或hrpN的其中之一以在大豆中引发HR。然而，已经观察到纯化的harpin并不在大豆中引发HR，表明有可替代的解释，即解淀粉欧文氏菌带有另一个被这种植物所识别的avr基因。
解淀粉欧文氏菌无毒信号在大豆中的识别表明存在一个或多个可能可用于工程改造抗火疫病的苹果树和梨树的R基因。R基因介导的对苹果黑星病的病原体苹果黑星菌(Venturia inaequalis)的抗性(Williams，E.B.等人，Ann.Rev.Phytopathol.，7223-46(1969)，特此通过引用结合到本文中)以及为防治火疫病用attacin E对苹果的成功转化(Norelli，J.L.等人，Euphytica，77123-28(1994)，特此通过引用结合到本文中)证实了这样一种方法的可行性。R基因介导的对苹果黑星病的抗性在大田中已经被克服(Parisi，L.等人，Phytopathology，83533-37(1993)，特此通过引用结合到本文中)，但病害对aspE的需要对aspE特异性R基因的相对耐久性有利(Kearney，B.等人，Nature，346385-86(1990)，特此通过引用结合到本文中)。在遗传上易管理的植物如拟南介属的病原体中对aspE和其它解淀粉欧文氏菌基因的无毒筛选，可以扩大候选R基因的库并加速它们的分离。可以用相似方法分离有效对抗木本植物的其它病害的R基因。此外，假如dspE操纵子如它与avrE基因座的同源性所提示那样广泛保守，那么对应的R基因可以有效对抗木本植物和草本植物的多种病原体。
还未曾以足够量产生天然(未变性的)DspE蛋白，以测试其以与过敏反应引发剂相似的方式(即通过外源应用)引发HR(即过敏反应)的能力。因此，还没有人演示当解淀粉欧文氏菌的dspE作为分离的无细胞材料应用于植物时，其引发HR。然而，当编码所述蛋白的基因转移到(与较小的dspF一起)另一种一般在某些植物中致病的细菌时，如丁香假单胞菌，所述受体细菌不再致病而是引发HR。这种变化的机制还不是确切明白的，但怀疑涉及(有引人注目的证据)一种机制，在该机制中所述细菌细胞确实将DspE蛋白注入活植物细胞、触发植物细胞萎陷的发展(即HR)。大概当DspE蛋白处于活的植物细胞内时，它发信号给植物以发展出对昆虫和病原体的抗性。
根据DspE预测的物理特性与那些来自动物病原体的已知陪伴蛋白的物理特性的相似性，相信这种相当小的蛋白是DspE的陪伴分子。动物病原体中的陪伴分子结合细胞质中要分泌的特定蛋白。它们看起来是所述蛋白分泌所必需的，但它们本身并不分泌。证据表明所述陪伴分子并不直接参与将要分泌的蛋白导向分泌装置。取而代之的是，它们可能在细胞质中稳定所述蛋白和/或防止它们成熟前聚合或与其它蛋白(如指导穿过宿主细胞膜的转运的细菌蛋白)结合。
DspE基因与除avrE外的已知基因没有相似性。目前还无法消除DspE的酶促功能(即导致引发HR的次级分子的产生)。事实上，已知一种avr基因产物通过催化一种可扩散的引发剂分子的合成来间接地引发HR。然而，对于观察到的在假单胞杆菌属物种中表达的dspE操纵子的HR引发功能的最简单的解释是由dspE基因编码的蛋白从所述细菌分泌并有可能被转运进植物细胞，在此它直接触发了导致HR的植物防御反应，并且这个过程是由一种识别DspE蛋白(作为DspE蛋白的受体)的特异性抗性基因产物介导。事实上，已经显示四个在细菌中表达时依赖于Hrp分泌途径以发挥功能的avr基因，当在植物细胞内转基因表达时引起HR。已经显示这些蛋白的其中之一编码与其对应抗性基因的产物直接相互作用的蛋白。最后，必须确定DspE是从植物细胞外还是从植物细胞内、是直接还是通过次级分子间接地引发植物防御反应，以便确定这种蛋白及其编码基因作为植物防御反应引发剂的实践应用。
虽然本发明已经为说明目的详细描述，但应当理解为这些详细叙述仅仅是为此目的，并且本领域的技术人员可以做出不偏离由下面的权利要求书所确定的本发明的精神和范围的变更。
序列表(1)一般资料(i)申请人Cornell Research Foundation，Inc(ii)发明名称得自解淀粉欧文氏菌的过敏反应引发剂、其用途和编码基因(iii)序列数5(iv)通信地址(A)收信人Nixon，Hargrave，Devans和Doyle LLP(B)街道P.O.Box 1051，Clinton Square(C)城市Rochester(D)州New York(E)国家美国(F)邮政编码14603(v)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本1.30(vi)当前申请数据(A)申请号(B)提交日期(C)分类(vii)在先申请数据(A)申请号US 60/055,105(B)提交日期1997年8月6日(viii)代理律师/代理人资料(A)姓名Goldman，Michael L.
(B)注册号30,727(C)参考/档案号19603/1662(ix)电讯资料(A)电话(716)263-1304(B)传真(716)263-1600(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度5517个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性
(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGAATTAA AATCACTGGG AACTGAACAC AAGGCGGCAG TACACACAGC GGCGCACAAC 60CCTGTGGGGC ATGGTGTTGC CTTACAGCAG GGCAGCAGCA GCAGCAGCCC GCAAAATGCC 120GCTGCATCAT TGGCGGCAGA AGGCAAAAAT CGTGGGAAAA TGCCGAGAAT TCACCAGCCA 180TCTACTGCGG CTGATGGTAT CAGCGCTGCT CACCAGCAAA AGAAATCCTT CAGTCTCAGG 240GGCTGTTTGG GGACGAAAAA ATTTTCCAGA TCGGCACCGC AGGGCCAGCC AGGTACCACC 300CACAGCAAAG GGGCAACATT GCGCGATCTG CTGGCGCGGG ACGACGGCGA AACGCAGCAT 360GAGGCGGCCG CGCCAGATGC GGCGCGTTTG ACCCGTTCGG GCGGCGTCAA ACGCCGCAAT 420ATGGACGACA TGGCCGGGCG GCCAATGGTG AAAGGTGGCA GCGGCGAAGA TAAGGTACCA 480ACGCAGCAAA AACGGCATCA GCTGAACAAT TTTGGCCAGA TGCGCCAAAC GATGTTGAGC 540AAAATGGCTC ACCCGGCTTC AGCCAACGCC GGCGATCGCC TGCAGCATTC ACCGCCGCAC 600ATCCCGGGTA GCCACCACGA AATCAAGGAA GAACCGGTTG GCTCCACCAG CAAGGCAACA 660ACGGCCCACG CAGACAGAGT GGAAATCGCT CAGGAAGATG ACGACAGCGA ATTCCAGCAA 720CTGCATCAAC AGCGGCTGGC GCGCGAACGG GAAAATCCAC CGCAGCCGCC CAAACTCGGC 730GTTGCCACAC CGATTAGCGC CAGGTTTCAG CCCAAACTGA CTGCGGTTCG GGAAAGCGTC 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(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ IDNO3ATGACATCGT CACAGCAGCG GGTTGAAAGG TTTTTACAGT ATTTCTCCGC CGGGTGTAAA 60ACGCCCATAC ATCTGAAAGA CGGGGTGTGC GCCCTGTATA ACGAACAAGA TGAGGAGGCG 120GCGGTGCTGG AAGTACCGCA ACACAGCGAC AGCCTGTTAC TACACTGCCG AATCATTGAG 180GCTGACCCAC AAACTTCAAT AACCCTGTAT TCGATGCTAT TACAGCTGAA TTTTGAAATG 240GCGGCCATGC GCGGCTGTTG GCTGGCGCTG GATGAACTGC ACAACGTGCG TTTATGTTTT 300CAGCAGTCGC TGGAGCATCT GGATGAAGCA AGTTTTAGCG ATATCGTTAG CGGCTTCATC 360GAACATGCGG CAGAAGTGCG TGAGTATATA GCGCAATTAG ACGAGAGTAG CGCGGCATAA 420(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度139个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Thr Ser Ser Gln Gln Arg Val Glu Arg Phe Leu Gln Tyr Phe Ser1 5 10 15Ala Gly Cys Lys Thr Pro Ile His Leu Lys Asp Gly Val Cys Ala Leu20 25 30Tyr Asn Glu Gln Asp Glu Glu Ala Ala Val Leu Glu Val Pro Gln His35 40 45Ser Asp Ser Leu Leu Leu His Cys Arg Ile Ile Glu Ala Asp Pro Gln50 55 60Thr Ser Ile Thr Leu Tyr Ser Met Leu Leu Gln Leu Asn Phe Glu Met65 70 . 75 80Ala Ala Met Arg Gly Cys Trp Leu Ala Leu Asp Glu Leu His Asn Val85 90 95Arg Leu Cys Phe Gln Gln Ser Leu Glu His Leu Asp Glu Ala Ser Phe100 105 110Ser Asp Ile Val Ser Gly Phe Ile Glu His Ala Ala Glu Val Arg Glu115 120 125Tyr Ile Ala Gln Leu Asp Glu Ser Ser Ala Ala130 . 135(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO5GGAACCNNNNNNNNNNNNNNN NCAACATAA 29
权利要求
1.编码过敏反应引发蛋白或多肽的分离的DNA分子，其中所述分离的DNA分子是由以下选出(a)包含SEQ.ID.No.1或3的核苷酸序列的DNA分子，(b)编码包含SEQ.ID.No.2或4的氨基酸的蛋白的DNA分子，(c)在严格条件下与包含SEQ.ID.No.1或3的核苷酸序列的DNA分子杂交的DNA分子，以及(d)与DNA分子(a)、(b)和(c)互补的DNA分子。
2.依照权利要求1的分离的DNA分子，其中所述DNA分子是包含SEQ.ID.No.1或3的核苷酸序列的DNA分子。
3.依照权利要求l的分离的DNA分子，其中所述DNA分子是编码包含SEQ.ID.No.2或4的氨基酸的蛋白的DNA分子。
4.依照权利要求1的分离的DNA分子，其中所述DNA分子是在严格条件下与包含SEQ.ID.No.1或3的核苷酸序列的DNA分子杂交的DNA分子。
5.依照权利要求1的分离的DNA分子，其中所述DNA分子是与DNA分子(a)、(b)和(c)互补的DNA分子。
6.用权利要求1的DNA分子转化的表达载体。
7.依照权利要求6的表达载体，其中所述DNA分子是使用合适的有义取向并处于正确的读框内。
8.用权利要求1的DNA分子转化的宿主细胞。
9.依照权利要求8的宿主细胞，其中所述宿主细胞是由以下选出植物细胞或细菌细胞。
10.依照权利要求8的宿主细胞，其中所述DNA分子用表达载体转化。
11.用权利要求1的DNA分子转化的转基因植物。
12.依照权利要求11的转基因植物，其中所述植物由以下选出苜蓿、稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、甘蓝、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、四季萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高梁以及甘蔗。
13.依照权利要求11的转基因植物，其中所述植物由以下选出拟南介、Saintpaulia、矮牵牛、天竺葵、一品红、菊花、康乃磬和百日草。
14.用权利要求1的DNA分子转化的转基因植物种子。
15.依照权利要求14的转基因植物种子，其中所述植物种子由以下选出苜蓿、稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、甘蓝、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、四季萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高梁以及甘蔗。
16.依照权利要求14的转基因植物种子，其中所述植物种子由以下选出拟南介、Saintpaulia、矮牵牛、天竺葵、一品红、菊花、康乃磬和百日草。
17.由以下选出的分离的过敏反应引发蛋白或多肽具有包含SEQ.ID.No.2或4的氨基酸的蛋白或多肽，以及由与包含SEQ.ID.No.1或3的核苷酸序列的DNA分子杂交的核酸编码的氨基酸。
18.依照权利要求17的分离的蛋白或多肽，其中所述蛋白或多肽具有包含SEQ.ID.No.2或4的氨基酸。
19.依照权利要求17的分离的蛋白或多肽，其中所述蛋白或多肽由与包含SEQ.ID.No.1或3的核苷酸序列的DNA分子杂交的核酸编码。
20.将抗病性赋予植物的方法，包括在有效赋予抗病性的条件下，以非感染形式应用依照权利要求17的蛋白或多肽于植物或植物种子上。
21.依照权利要求20的方法，其中在所述应用中植株受到处理。
22.依照权利要求20的方法，其中在所述应用中植物种子受到处理，所述方法还包括将用所述过敏反应引发剂处理过的种子种植在天然或人工土壤中，并由种植在土壤中的种子繁殖植株。
23.增强植物生长的方法，包括在有效增强植物生长的条件下，以非感染形式应用依照权利要求17的蛋白或多肽于植物或植物种子上。
24.依照权利要求23的方法，其中在所述应用中植株受到处理。
25.依照权利要求23的方法，其中在所述应用中植物种子受到处理，所述方法还包括将用所述过敏反应引发剂处理过的种子种植在天然或人工土壤中，并由种植在土壤中的种子繁殖植株。
26.为植物进行虫害防治的方法，包括在有效防治虫害的条件下，以非感染形式应用依照权利要求17的蛋白或多肽于植物或植物种子上。
27.依照权利要求26的方法，其中在所述应用中植株受到处理。
28.依照权利要求26的方法，其中在所述应用中植物种子受到处理，所述方法还包括将用所述过敏反应引发剂处理过的种子种植在天然或人工土壤中，并由种植在土壤中的种子繁殖植株。
29.赋予植物抗病性的方法，包括提供用依照权利要求1的DNA分子转化的转基因植株或植物种子，并在有效赋予抗病性的条件下，栽培所述转基因植物或由所述转基因植物种子产生的转基因植株。
30.依照权利要求29的方法，其中提供了转基因植株。
31.依照权利要求29的方法，其中提供了转基因植物种子。
32.增强植物生长的方法，包括提供用依照权利要求1的DNA分子转化的转基因植株或植物种子，并在有效增强植物生长的条件下，栽培所述转基因植物或由所述转基因植物种子产生的转基因植株。
33.依照权利要求32的方法，其中提供了转基因植株。
34.依照权利要求32的方法，其中提供了转基因植物种子。
35.为植物进行虫害防治的方法，包括提供用依照权利要求1的DNA分子转化的转基因植株或植物种子，并在有效防治虫害的条件下，栽培所述转基因植物或由所述转基因植物种子产生的转基因植株。
36.依照权利要求35的方法，其中提供了转基因植株。
37.依照权利要求35的方法，其中提供了转基因植物种子。
38.组合物，包括依照权利要求17的蛋白或多肽以及一种载体。
39.依照权利要求38的组合物，其中还包括由以下选出的添加剂肥料、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂以及它们的混合物。
40.识别依照权利要求17的蛋白或多肽的抗体或其结合部分。
41.依照权利要求40的抗体或其结合部分，其中所述抗体是一种单克隆抗体。
42.依照权利要求40的抗体或其结合部分，其中所述抗体是一种多克隆抗体。
43.改变植物中的病害或过敏反应的方法，包括为所述植物提供依照权利要求40的抗体或其结合部分，并在有效改变病害或过敏反应的条件下使所述抗体或其结合部分结合过敏反应引发剂蛋白或多肽。
全文摘要
本发明涉及在植物中引发过敏反应的分离的蛋白或多肽以及编码所述过敏反应引发蛋白或多肽的分离的DNA分子。这种分离的蛋白或多肽以及所述分离的DNA分子可以用于赋予植物抗病性、增强植物生长和/或在植物中防治虫害。这可以通过在有效地在植株或植物种子中赋予抗病性、增强植物生长和/或防治虫害的条件下,以非感染形式应用所述过敏反应引发剂蛋白或多肽于植株或所述植物种子。或者,可以提供用编码过敏反应引发剂蛋白或多肽的DNA分子转化的转基因植物或植物种子,并将所述转基因植物或由所述转基因植物种子得到的植株在有效地在植株或由植物种子长成的植株中赋予抗病性、增强植物生长和/或防治虫害的条件下培养。
文档编号C12N15/52GK1272760SQ98809709
公开日2000年11月8日 申请日期1998年7月24日 优先权日1997年8月6日
发明者A·J·波格达诺维, J·F·金, Z·M·韦, S·V·贝尔 申请人:康乃尔研究基金会有限公司