专利名称：源于解淀粉欧文氏菌的过敏反应诱导物及其用途的制作方法
本申请要求申请日为1997年8月6日的美国临时专利申请流水号60/055,108的优先权。
本发明领域本发明涉及源于解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)的过敏反应诱导物及其用途。
本发明背景细菌病原体及其植物宿主之间的相互作用一般分成两种类型(1)相容型(病原体-宿主)，在宿主植物上导致细胞间细菌生长，症状发展，和疾病发展；和(2)不相容型(病原体-非宿主)，导致过敏反应，发生一种特殊类型的不相容的相互作用，而没有逐渐发病症状。在宿主植物的相容性相互作用期间，细菌群体急剧增加，并逐渐出现症状。在不相容性相互作用期间，细菌群体不增加，并且不发生逐渐发展的症状。
所述过敏反应是一种快速的、局部的坏死，这种坏死与植物针对很多病原体的主动防御有关(Kiraly，Z.，“由入侵者引起的防御过敏反应”，201-224页，参见植物病害最新论文，第5卷，J.G.Horsfall和E.B.Cowling著，学术出版社，纽约(1980)；Klement，Z.，“过敏反应”，149-177页，参见植物致病性原核生物，第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy著，学术出版社，纽约(1982))。如果高浓度(≥107细胞/ml)的诸如丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)或解淀粉欧文氏菌的有限宿主范围的病原体浸入非宿主植物的叶片的话，很容易通过组织的崩解观察到由细菌引起的过敏反应(坏死仅发生在接种物的下部叶片的分离的植物细胞上)(Kiraly，Z.，“植物致病性假单胞菌的致病性快速检测”，自然199299-300；Kiraly等，“由植物致病性细菌在烟草叶片中诱导的过敏反应”，植物病理学54474-477，(1963)；Turner等，“与过敏反应有关的植物和细菌细胞之间的定量关系”，植物病理学64885-890(1974)；KLement，Z.，“过敏反应”，149-177页，参见植物致病性原核生物，第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy著，学术出版社，纽约(1982))。在非宿主中引起过敏反应的能力似乎与在宿主中的致病性有关。正如KLement，Z.(“过敏反应”，149-177页，参见植物致病性原核生物，第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy著，学术出版社，纽约)披露的，所述病原体还能在其与相容性宿主的相互作用中导致生理学上相似的(虽然是推迟的)坏死。另外，产生过敏反应或致病性的能力取决于同一类基因，被称为hrp(Lindgren，P.B.等，“控制豆类植物的致病性和在非宿主植物上的过敏反应的丁香假单胞菌菜豆致病变种的基因簇”，细菌学杂志168512-22(1986)；Willis，D.K.等，“植物病原性细菌的hrp基因”，分子植物-微生物相互作用4132-138(1991))。因此，过敏反应可以提供植物防御的性质和细菌致病性基础的线索。
所述hrp基因分布于革兰氏阳性植物病原体中，其中，这些基因是成簇的，保守的，并且在某些情况下是可以相互交换的(Willis，D.K.等，“植物病原性细菌的hrp基因”，分子植物-微生物相互作用4132-138(1991)；Bonas，U.“植物病原性细菌的hrp基因”，79-98页，参见微生物学和免疫学的现代主题植物和动物的细菌致病性-分子和细胞机制，J.L.Dangl著，Springer-Verlag，柏林(1994))。若干hrp基因编码的蛋白分泌途径的成分类似于由耶尔森氏菌、志贺氏菌和沙门氏菌用于分泌动物发病所必需的蛋白的成分(VanGijsegem等，“在植物和动物病原体细菌之间致病性决定子的进化保守性”1175-180(1993))。在解淀粉欧文氏菌，丁香假单胞菌和青枯假单胞菌(Pseudomonas solancearum)中，业已证实了hrp基因控制富含甘氨酸的过敏反应蛋白诱导物的产生和分泌(He，S.Y.等，丁香假单胞菌丁香致病变种HarpinPss通过Hrp途径分泌的蛋白，该蛋白能在植物中引起过敏反应，细胞731255-1266(1993)，Wei，Z.-H.等，“解淀粉欧文氏菌的HrpI在Harpin的分泌中起作用，并且是新的蛋白家族的一员”，细菌学杂志1757958-7967(1963)；Arlat，M.等，PopA1，“一种能在特殊的矮牵牛基因型上诱导过敏样反应的蛋白，该蛋白是通过青枯假单胞菌的Hrp途径分泌的”，EMBO杂志13543-553(1994))。
所述蛋白的第一种发现于解淀粉欧文氏菌Ea321中，这种细菌能导致蔷薇科植物的火疫，该蛋白被命名为harpin(Wei，Z.-M.等，“Harpin，由植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应诱导物”，科学25785-88(1992))。在编码hrpA基因中进行的突变揭示了harpin是解淀粉欧文氏菌在非宿主烟草叶片中诱导过敏反应所必需的，并且能在高度易感的梨果上引起发病症状。青枯假单胞菌GMI1000PopA1蛋白具有类似的物理特性，而且也能在烟草的叶片中引起过敏反应，而烟草不是这种菌株的宿主(Arlat，M.等，“PopA1，一种能在特殊的矮牵牛基因型上诱导过敏样反应的蛋白，该蛋白是通过青枯假单胞菌的Hrp途径分泌的”，EMBO杂志13543-553(1994))。不过，青枯假单胞菌popA突变型仍然能在烟草中引起过敏反应，并在番茄中导致发病。因此，所述富甘氨酸过敏反应诱导物的作用在革兰氏阳性植物病原体之间可以有很大的变化。
业已分离、克隆其它植物致病性过敏反应诱导物，并测定了其序列。其中包括菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)(Bauer等，“菊欧文氏菌HarpinEch软腐致病性”，MPMI8(4)484-91(1995))；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)(Cui等，“胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株Ecc71的RsmA-能超量表达hrpNEcc并且能在烟草叶片中引起过敏反应样反应”，MPMI9(7)565-73(1966))；施氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)(Ahmad等，“Harpin不是施氏欧文氏菌在玉米上的致病性所必需的”，第8卷，国际分子植物-微生物相互作用大会，1996年7月14-19日，以及Ahmad等，Harpin不是施氏欧文氏菌在玉米上的致病性所必需的”，美国植物病理学协会年会，1996年7月27-31日)；丁香假单胞菌丁香变种(WO94/26782，该专利属于Cornell Research Foundation公司)。
本发明是为了鉴定、克隆、和测序源于植物病原体的过敏反应诱导蛋白或多肽所做努力的进一步进展。
本发明概述本发明涉及能在植物中引起过敏反应的分离的蛋白或多肽，以及编码所述过敏反应诱导蛋白或多肽的分离的DNA分子。
所述过敏反应诱导蛋白或多肽可用于赋予植物抗病性，改善植物生长，和/或控制昆虫。其中包括以非感染形式将所述过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物或植物种子上，处理条件为赋予植物抗病性，改善植物生长，和/或控制植物或由所述植物种子长成的植物上的昆虫。
作为将所述过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物或植物种子上以便赋予抗病性，改善植物生长，和/或控制植物上的昆虫的另一种方案，可以使用转基因植物或植物种子。当使用转基因植物时，该方法包括提供用编码过敏反应诱导蛋白或多肽的DNA分子转化过的转基因植物，并在能有效产生抗病性，改善植物生长，和/或控制所述植物或由所述植物种子长成的植物上的昆虫的条件下生长所述植物。另外，可以提供用编码过敏性反应诱导蛋白或多肽的DNA分子转化过的转基因植物种子并将其播种到土壤中。在能有效产生抗病性，改善植物生长，和/或控制所述植物或由所述植物种子长成的植物上的昆虫的条件下繁殖植物。
附图的简要说明
图1A和B表示含有hrpW的解淀粉欧文氏菌的片段的分子结构。图1A表示含有解淀粉欧文氏菌的hrp簇的调节和分泌片段的粘粒pCPP430和pCPP450。位于所述粘粒克隆上方的箭头形方框表示转录单位，而特定操纵子的名称在其上方给出(Wei等，科学25785-88(1992)；Zumoff等，解淀粉欧文氏菌的hrp基因簇，Hennecke，H.&Verma，D.P.S.著(Kluwer学术出版社，Dordrecht，荷兰)，第1卷，53-60页(1991)；Bogdanove等，细菌学杂志，1781720-30(1996)；Kim等，细菌学杂志，1791690-97(1997)，以上文献被收作本文的参考文献)。图1B表示编码富甘氨酸蛋白的hrpW的位置，以及用于本研究的亚克隆pCPP1012。方框和箭头形方框表示基因或开放读框；实心三角形是推测HrpL依赖型启动子。限制位点为B，BamHI；E，EcoRI；H，HindIII；Ea，Eagl；Hp，Hpal。
图2A表示由T7RNA聚合酶指导的基因表达系统进行的hrpW的表达。泳道1，大肠杆菌DH5α(pGP1-2/pBC SK(-))；2，大肠杆菌DH5α(pGP1-2/pCPP1232)。在泳道2中箭头所指的、位于84kD和53kD之间的带相当于HrpW蛋白。
图3表示HrpW与红球藻丛赤壳(Nectria haematococca)交配型VI(豌豆腐皮镰孢)和胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种的果胶酸盐裂合酶的比较。所述序列是通过使用PILEUP程序(GCG软件包，7.3版)用缺省参数比较，并使用同一个软件包中的LINEUP程序进行人工编辑比较。保守的残基用方框标出，在高度保守的片段下面划线，并将HrpW上的潜在α-螺旋加上阴影。
图4A和B是表示HrpW在解淀粉欧文氏菌中hrp依赖型生产和分泌的免疫印迹。图4中的泳道1，大肠杆菌DH5α(pGP1-2/pCPP1232)；2，HrpN；3，Ea312的全细胞制剂(“CP”)；4，Ea321的上清液制剂(“SP”)；5，Ea321-K49的CP；6，Ea321-K49的SP；7，Ea321-G84的CP；8，Ea321-G84的SP。图4B中的泳道1，大肠杆菌DH5α(pGP1-2/pCPP1232)；2，HrpN；3，Ea273的CP；4，Ea273的SP；5，Ea321-K49的CP；6，Ea321-K49的SP；7，Ea321-G73的CP；8，Ea321-G84的SP。
图5A是烟草叶片，表示hrpN突变型的残余过敏反应(“HR“)诱导活性，以及由HrpN和HrpW诱导的HR。部位1，大肠杆菌DH5(pCPP430)；2，大肠杆菌DH5(pCPP430-T5)；3，大肠杆菌MC4100(pCPP450)；4，大肠杆菌MC4100(pCPP450-T5)；5，5mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)；6，解淀粉欧文氏菌Ea321；7，解淀粉欧文氏菌Ea321-T5；8，HrpN CFEP(含有0.5mg/ml HrpN)；9，从含有源于大肠杆菌DH5α(pGP1-2/pCPP1232)的蛋白的凝胶上洗脱的HrpW制剂(0.5mg/ml)；10，以与9相同的方式从大肠杆菌DH5α(pGP1-2/pBCSK(-))制备的制剂。以上照片是在浸泡3天以后拍摄的。
图5B表示由植物代谢抑制剂产生的对由HrpW诱导的HR的抑制。部位1，5mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)；2，HrpW CFEP；3，HrpN CFEP+环己酰亚胺；4，HrpW CFEP+LaCl3；5，HrpW CFEP+Na3VO4；6，HrpN CFEP；7，HrpN CFEP+环己酰亚胺；8，HrpN CFEP+Na3VO4；9，溶解在10mMTris-HCl(pH7.8)中的PelE；10，PelE+环己酰亚胺；11，PelE+Na3VO4。CFEPs含有0.1mg/ml的HrpW或HrpN。烟草叶片的照片是在浸泡之后36小时拍摄的。
图6表示Southern印迹，该印迹表示解淀粉欧文氏菌Ea321的hrpW存在于其它细菌中。用含有Ea321hrpW的1.4-kbHpal片段检测菌株的基因组DNA。泳道1，Ea321；2，Ea266；3，Ea273；4，Ea246；5，Ea510；6，Ea528；7，Ea574；8，Ea546；9，Ea557；10，Ea562；11，Ea587；12，胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种ATCC15713；13，野梧桐欧文氏菌(E.mallotivora)1818；14，柳欧文氏菌(E.salicis)1822；15，菊欧文氏菌EC16的pCPP2157。
本发明详细说明本发明涉及一种分离的DNA分子，该分子具有下面的序列1所示的核苷酸序列ATGTCAATTC TTACGCTTAA CAACAATACC TCGTCCTCGC CGGGTCTGTT CCAGTCCGGG 60GGGGACAACG GGCTTGGTGG TCATAATGCA AATTCTGCGT TGGGGCAACA ACCCATCGAT 120CGGCAAACCA TTGAGCAAAT GGCTCAATTA TTGGCGGAAC TGTTAAAGTC ACTGCTATCC 100CCACAATCAG GTAATGCGGC AACCGGAGCC GGTGGCAATG ACCAGACTAC AGGAGTTGGT 240AACGCTGGCG GCCTGAACGG ACGAAAAGGC ACAGCAGGAA CCACTCCGCA GTCTGACAGT 300CAGAACATGC TGAGTGAGAT GGGCAACAAC GGGCTGGATC AGGCCATCAC GCCCGATGGC 360CAGGGCGGCG GGCAGATCGG CGATAATCCT TTACTGAAAG CCATGCTGAA GCTTATTGCA 420CGCATGATGG ACGGCCAAAG CGATCAGTTT GGCCAACCTG GTACGGGCAA CAACAGTGCC 480TCTTCCGGTA CTTCTTCATC TGGCGGTTCC CCTTTTAACG ATCTATCAGG GGGGAAGGCC 540CCTTCCGGCA ACTCCCCTTC CGGCAACTAC TCTCCCGTCA GTACCTTCTC ACCCCCATCC 600ACGCCAACGT CCCCTACCTC ACCGCTTGAT TTCCCTTCTT CTCCCACCAA AGCAGCCGGG 660GGCAGCACGC CGGTAACCGA TCATCCTGAC CCTGTTGGTA GCGCGGGCAT CGGGGCCGGA 720AATTCGGTGG CCTTCACCAG CGCCGGCGCT AATCAGACGG TGCTGCATGA CACCATTACC 780GTGAAAGCGG GTCAGGTGTT TGATGGCAAA GGACAAACCT TCACCGCCGG TTCAGAATTA 840GGCGATGGCG GCCAGTCTGA AAACCAGAAA CCGCTGTTTA TACTGGAAGA CGGTGCCAGC 900CTGAAAAACG TCACCATGGG CGACGACGGG GCGGATGGTA TTCATCTTTA CGGTGATGCC 960AAAATAGACA ATCTGCACGT CACCAACGTG GGTGAGGACG CGATTACCGT TAAGCCAAAC1020AGCGCGGGCA AAAAATCCCA CGTTGAAATC ACTAACAGTT CCTTCGAGCA CGCCTCTGAC1080AAGATCCTGC AGCTGAATGC CGATACTAAC CTGAGCGTTG ACAACGTGAA GGCCAAAGAC1140TTTGGTACTT TTGTACGCAC TAACGGCGGT CAACAGGGTA ACTGGGATCT GAATCTGAGC1200CATATCAGCG CAGAAGACGG TAAGTTCTCG TTCGTTAAAA GCGATAGCGA GGGGCTAAAC1260GTCAATACCA GTGATATCTC ACTGGGTGAT GTTGAAAACC ACTACAAAGT GCCGATGTCC1320GCCAACCTGA AGGTGGCTGA ATGA 1344参见GenBank保藏号94513。本发明的分离的DNA分子编码具有下面的序列2所示氨基酸序列的过敏反应诱导蛋白或多肽Met Ser Ile Leu Thr Leu Asn Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gly Leu1 5 10 15Phe Gln Ser Gly Gly Asp Asn Gly Leu Gly Gly His Asn Ala Asn Ser20 25 30Ala Leu Gly Gln Gln Pro Ile Asp Arg Gln Thr Ile Glu Gln Met Ala35 40 45Gln Leu Leu Ala Glu Leu Leu Lys Ser Leu Leu Ser Pro Gln Ser Gly50 55 60Asn Ala Ala Thr Gly Ala Gly Gly Asn Asp Gln Thr Thr Gly Val Gly65 70 75 80Asn Ala Gly Gly Leu Asn Gly Arg Lys Gly Thr Ala Gly Thr Thr Pro85 90 95Gln Ser Asp Ser Gln Asn Met Leu Ser Glu Met Gly Asn Asn Gly Leu100 105 110Asp Gln Ala Ile Thr Pro Asp Gly Gln Gly Gly Gly Gln Ile Gly Asp115 120 125Asn Pro Leu Leu Lys Ala Met Leu Lys Leu Ile Ala Arg Met Met Asp130 135 140Gly Gln Ser Asp Gln Phe Gly Gln Pro Gly Thr Gly Asn Asn Ser Ala145 150 155 160Ser Ser Gly Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Pro Phe Asn Asp Leu Ser165 170 175Gly Gly Lys Ala Pro Ser Gly Asn Ser Pro Ser Gly Asn Tyr Ser Pro180 185 190Val Ser Thr Phe Ser Pro Pro Ser Thr Pro Thr Ser Pro Thr Ser Pro195 200 205Leu Asp Phe Pro Ser Ser Pro Thr Lys Ala Ala Gly Gly Ser Thr Pro210 215 220Val Thr Asp His Pro Asp Pro Val Gly Ser Ala Gly Ile Gly Ala Gly225 230 235 240Asn Ser Val Ala Phe Thr Ser Ala Gly Ala Asn Gln Thr Val Leu His245 250 255Asp Thr Ile Thr Val Lys Ala Gly Gln Val Phe Asp Gly Lys Gly Gln260 265 270Thr Phe Thr Ala Gly Ser Glu Leu Gly Asp Gly Gly Gln Ser Glu Asn275 280 285Gln Lys Pro Leu Phe Ile Leu Glu Asp Gly Ala Ser Leu Lys Asn Val290 295 300Thr Met Gly Asp Asp Gly Ala Asp Gly Ile His Leu Tyr Gly Asp Ala305 310 315 320Lys Ile Asp Asn Leu His Val Thr Asn Val Gly Glu Asp Ala Ile Thr325 330 335Val Lys Pro Asn Ser Ala Gly Lys Lys Ser His Val Glu Ile Thr Asn340 345 350Ser Ser Phe Glu His Ala Ser Asp Lys Ile Leu Gln Leu Asn Ala Asp355 360 365Thr Asn Leu Ser Val Asp Asn Val Lys Ala Lys Asp Phe Gly Thr Phe370 375 380Val Arg Thr Asn Gly Gly Gln Gln Gly Asn Trp Asp Leu Asn Leu Ser385 390 395 400His Ile Ser Ala Glu Asp Gly Lys Phe Ser Phe Val Lys Ser Asp Ser405 410 415Glu Gly Leu Asn Val Asn Thr Ser Asp Ile Ser Leu Gly Asp Val Glu420 425 430Asn His Tyr Lys Val Pro Met Ser Ala Asn Leu Lys Val Ala Glu435 440 445该蛋白或多肽是酸性的，富含甘氨酸和丝氨酸，但缺少半胱氨酸。它还是热稳定性的，对蛋白酶敏感，并且能被植物代谢的抑制剂抑制。本发明的蛋白或多肽具有的预测分子量大小大约为4.5kDa。
本发明包括上述过敏反应诱导多肽或蛋白的片段。
可以通过若干方法生产合适的片段。首先，通过常规分子遗传学操作，通过亚克隆基因片段生产编码本发明诱导蛋白的基因的亚克隆。然后在细菌细胞中在体外或体内表达所述亚克隆，以便产生较小的蛋白或肽，按照下面所披露的方法可以测出所述蛋白或肽的诱导物活性。
另外，可以通过用诸如胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌蛋白酶A或胰蛋白酶的蛋白酶消化完整长度的诱导蛋白，生产诱导蛋白的片段。不同的蛋白酶根据诱导蛋白的氨基酸序列以类似方式裂解诱导蛋白的不同位点。由蛋白分解所产生的某些片段可能是抗性的活性诱导物。
在另一种方法中，根据对所述蛋白一级结构的了解，可以用PCR技术和被选择用于代表所述蛋白的特定部分的特殊类型的引物合成所述诱导蛋白基因的片段。然后将这些片段克隆到合适的载体上，以便加强截短的肽或蛋白的表达。
还可将化学合成用于制备合适的片段。所述合成应用了已知的氨基酸序列。另外，用高温和高压处理完整长度的诱导物也可以产生片段。然后可以通过常规方法分离这些片段(例如，亲和层析，SDS-PAGE)。
还可以修饰变体(或者以此作为替代方案)，例如，缺失或添加对所述多肽的特性、二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸。例如，可将一种多肽缀合到位于所述蛋白的N-末端的信号(或前导)序列上，它能在翻译同时或在翻译之后指导该蛋白的转移。还可将所述多肽缀合到接头或其它序列上，以便于合成、纯化、或鉴定所述多肽。
合适的DNA分子是能在严格条件下与包括序列1的核苷酸序列的DNA分子杂交的分子。合适的严格条件的一个例子是在65℃下在含有下列成分的介质中进行杂交20小时1M NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.4，10mM EDTA，0.1％十二烷基硫酸钠，0.2％Ficoll，0.2％聚丙烯吡咯烷酮，0.2％牛血清白蛋白，50μmg/ml大肠杆菌DNA。不过，任何能在所述严格条件下与包括序列1的核苷酸序列的DNA分子杂交的DNA分子必须不同于编码解淀粉欧文氏菌的，(如由Wei，Z.-M.等所披露的，“Harpin”，“由植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应诱导物”，科学25785-88(1992)，该文献被收作本文的参考文献)，菊欧文氏菌的(如由Bauer等所披露的，“菊欧文氏菌HarpinEch软腐致病性”，MPMI8(4)484-91(1995)，该文献被收作本文的参考文献)，胡萝卜软腐欧文氏菌的(如由Cui等所披露的，“胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种菌株Ecc71的RmsA-突变体，能在烟草叶片中超量表达hrpNEcc并能诱导过敏反应样反应”，MPMI9(7)565-73(1996)，该文献被收作本文的参考文献)，施氏欧文氏菌(Erwiniastewartii)(如由Ahmad等所披露的“Harpin不是施氏欧文氏菌在玉米上的致病性所必需的”，第8卷，国际分子植物-微生物相互作用大会(1996)，以及Ahmad等，Harpin不是施氏欧文氏菌在玉米上的致病性所必需的”，美国植物病理学协会年会(1996)，以上文献被收作本文的参考文献)，和丁香假单胞菌丁香致病变种过敏反应诱导蛋白或多肽的核酸(WO94/26782，该专利属于Cornell ResearchFoundation公司，该文献被收作本文的参考文献)。
本发明的蛋白或多肽优选通过常规技术以纯化形式生产(纯度优选为至少大约80％，更优选90％)。通常，本发明的蛋白或多肽被分泌到重组宿主细胞的生长培养基中，或者生产本发明的蛋白或多肽，但不分泌到生长培养基中。在以上情况下，为了分离所述蛋白，繁殖携带重组质粒的宿主细胞(例如，大肠杆菌)，通过超声波、加热、压力差、或化学处理裂解，并对匀浆物进行离心，以便除去细菌碎片。然后对上清液进行顺序硫酸铵沉淀。在合适大小的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱上对含有本发明多肽或蛋白的级份进行凝胶过滤，以便分离所述蛋白。如果必要，可以通过HPLC对所述蛋白级份进行进一步纯化。
可以用常规重组DNA技术将编码过敏反应诱导多肽或蛋白的DNA分子整合到细胞中。通常，该方法包括将所述DNA分子插入与该DNA分子异源的表达系统中(即，该系统正常情况下不存在该分子)。以正确的有义取向和正确的读框将所述异源DNA分子插入所述表达系统。该载体含有所插入的蛋白编码序列转录和翻译所必需的因子。
被收作本文参考文献的授予Cohen和Boyer的US4,237,224披露了用限制酶裂解和用DNA连接酶连接以重组质粒的形式生产表达系统。然后通过转化方法将所述重组质粒导入，并且在包括生长在组织培养物中的原核生物和真核细胞在内的单细胞培养物中复制。
还可将重组基因导入病毒如痘病毒。可以通过将质粒转染到感染了病毒的细胞中生产重组病毒。
合适的载体包括，但不限于以下病毒载体，如λ载体系统gt11，gtWES.tB，Charon4，和质粒载体，如pBR322，pBR325，pACYC177，pACYC1084，pUC8，pUC9，pUC18，pUC19，pLG339，pR290，pKC37，pKC101，SV40，pBluescriptII SK+/-或KS+/-(参见来自Stratagene的“Stratagene克隆系统”目录(1993)，La Jolla，加利弗尼亚，该资料被收作本文的参考文献)，pQE，pIH821，pGEX，pET系列(参见F.W.Studier等，“用T7RNA聚合酶指导克隆基因的表达”，基因表达技术，185卷，(1990)，该文献被收作本文的参考文献)，及其任何衍生物。可以通过转化，特别是通过转导、接合、转移或电穿孔将重组分子导入细胞。用本领域标准的克隆方法将DNA序列克隆到载体中，所述方法如Sambrook等所述，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)，该文献被收作本文的参考文献。
可将各种宿主载体系统用于表达所述蛋白编码序列。首先，所述载体系统必须与所使用的宿主细胞相容。宿主-载体系统包括，但不限于以下系统用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化过的细菌；诸如含有酵母载体的酵母的微生物；用病毒(例如，疫苗病毒，腺病毒等)感染过的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如，杆状病毒)感染过的昆虫细胞系统；和用细菌感染过的植物细胞。所述载体的表达因子在其强度和专一性方面有所不同。根据所使用的宿主-载体系统，可以使用多种合适转录和翻译因子中的任一种。
由不同的遗传信号和加工过程控制很多水平的基因表达(例如，DNA转录和信使RNA(mRNA)翻译)。
DNA的转录取决于启动子的存在，启动子是指导RNA聚合酶结合并因此促进mRNA合成的DNA序列。真核启动子的DNA序列不同于原核启动子的DNA序列。另外，真核启动子以及相伴的遗传信号在原核系统中不能被识别或者不能起作用，而且，原核启动子在真核细胞中也不能被识别并且不能起作用。
类似地，mRNA在原核生物中的翻译取决于不同于真核生物的正确原核信号在原核生物中的存在。有效翻译需要一个核糖体结合位点，该位点在mRNA上被称为Shine-Dalgarno(“SD”)序列。该序列是位于起始密码子(通常为AUG)之前的短的mRNA核苷酸序列，所述起始密码子编码该蛋白的氨基末端甲硫氨酸。SD序列互补于16SrRNA(核糖体RNA)的3’末端，并有可能通过与rRNA形成双链体对核糖体进行正确定位而促进mRNA与核糖体的结合。为了了解增强基因的表达，参见Roberts和Lauer，酶学方法，68473(1979)，该文献被收作本文的参考文献。
启动子的“强度”(即促进转录的能力)有所不同。为了表达克隆的基因，需要使用强的启动子，以便获得高水平的转录，也因此获得该基因的高水平表达。根据所使用的宿主细胞系统，可以使用多种合适启动子中的任一种。例如，当在大肠杆菌、其噬菌体或质粒中克隆时，可将以下启动子用于指导相邻DNA片段的高水平转录如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌λ噬菌体的PR和PL启动子以及其它启动子，包括，但不限于lacUV5，ompF，bla，lpp等。另外，通过重组DNA或其它合成DNA技术生产的杂种trp-lacUV(tac)启动子或其它大肠杆菌启动子可用于进行插入基因的转录。
可以选择细菌宿主细胞菌株和表达载体，使其能抑制所述启动子的作用，除非受到特别诱导。在某些操作中，为了有效转录插入的DNA，必须添加特殊的诱导物。例如，lac操纵子是通过添加乳糖或IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导的。诸如trp、pro等的多种其它操纵子受到不同的控制。
为了在原核细胞中进行有效的基因转录和翻译也需要特定的起始信号。这些转录和翻译起始信号的“强度”也可以变化，所述强度是通过分别定量基因特异信使RNA和所合成的蛋白测定的。所述含有启动子的DNA表达载体，还可以含有各种“强度”的转录和/或翻译起始信号的组合。例如，在大肠杆菌中的有效翻译需要与起始密码子(“ATG”)的5’末端间隔大约7-9个碱基的SD序列，以便提供核糖体结合位点。因此，可以使用能被宿主细胞核糖体采用的任何SD-ATG组合。所述组合包括，但不限于源于大肠杆菌λ噬菌体的cro基因或N基因或源于大肠杆菌色氨酸E、D、C、B或A基因的SD-ATG组合。另外，可以使用与采用合成核苷酸有关的重组DNA或其它技术生产的任何SD-ATG组合。
一旦将编码所述过敏反应诱导多肽或蛋白的分离的DNA分子克隆到表达系统中，即可将其整合到宿主细胞中。所述整合可以通过上文提到的各种转化形式完成，这要取决于载体/宿主细胞系统。合适的宿主细胞包括，但不限于细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞、昆虫、和植物等。
本发明还涉及赋予植物抗病性、改善植物生长、和/或实现植物的昆虫控制的方法。所述方法包括以非感染形式将过敏反应诱导多肽或蛋白施加到植物或植物种子的全部或部分上，处理条件为所述多肽或蛋白接触所述植物或植物种子细胞的全部或部分。另外，还可将所述过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物上，以便由该植物所收获的种子本身能够在植物上产生抗病性，改善植物生长，和/或实现植物的昆虫控制。
作为将过敏反应诱导多肽或蛋白施加到植物或植物种子上以便在植物上产生抗病性，影响植物生产和/或控制所述植物或由所述种子长成的植物上的昆虫的另一种方案，可以使用转基因植物或植物种子。在使用转基因植物时，该方法包括提供用编码过敏反应诱导多肽或蛋白转化过的转基因植物，并在能够有效实现由所述DNA分子赋予植物抗病性，改善植物生长、和/或控制昆虫的条件下生长所述植物。另外，可以提供用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的DNA分子转化过的转基因植物种子，并种植在土壤中。然后在由所述DNA分子有效赋予植物抗病性，改善植物生长、和/或控制昆虫的条件下，由播种的种子繁殖植物。
本发明的将过敏反应诱导多肽或蛋白施加到植物或植物种子上的实施方案可以用多种方法完成，包括1)施加分离的诱导多肽或蛋白；2)施加不会导致发病并且用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的基因转化过的细菌；和3)施加能导致某些植物种(但不会导致其所施加的植物种)发病，并且天然含有编码所述过敏反应诱导多肽或蛋白的基因的细菌。
在本发明的一种实施方案中，可以从解淀粉欧文氏菌中分离本发明的过敏反应诱导多肽或蛋白，如在下面的实施例中所述。不过，本发明的分离的过敏反应诱导多肽或蛋白优选是通过重组方法生产并纯化的，如上文所述。
在本发明的其它实施方案中，可以通过施加含有编码所述过敏反应诱导多肽或蛋白的基因的细菌，将本发明的过敏反应诱导多肽或蛋白施加到植物或植物种子上。所述细菌必须能够分泌或输出所述多肽或蛋白，以便所述诱导物能够接触植物或植物种子细胞。在以上实施方案中，所述过敏反应诱导多肽或蛋白是在植物体内或在种子上由细菌生产的，或者是在将所述细菌导入植物或植物种子之前产生的。
在本发明的细菌施加方式的一种实施方案中，所述细菌不会导致发病，并且用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的基因转化过(例如通过重组方式转化)。例如，可以用编码过敏反应诱导多肽或蛋白转化不能在植物上诱导过敏反应的大肠杆菌，然后将其施加到植物上。在本发明的该实施方案中还可以使用除大肠杆菌之外的细菌种。
在本发明细菌施加模式的细菌另一种实施方案中，所述细菌能够致病，并天然含有编码过敏反应诱导多肽或蛋白的基因。所述细菌的例子在上文中提及。不过，在该实施方案中，将所述细菌施加到不易感由该细菌引起的病害的植物或其种子上。例如，解淀粉欧文氏菌能在苹果或梨上导致发病，但在番茄上不能导致发病。不过，所述细菌能在番茄上引起过敏反应。因此，根据本发明的该实施方案，可将解淀粉欧文氏菌施加到番茄植物或种子上，以便产生抗病性，改善生长，或控制昆虫，而不会在该物种上引起发病。
可将本发明的方法用于处理多种植物或其种子，以赋予抗病性，改善植物生长，和/或控制昆虫。合适的植物包括双子叶和单子叶植物。更具体地讲，有用的作物类植物可以包括苜蓿、稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣(endive)、甘蓝、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦(zucchini)、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、树莓(raspberry)、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。合适的观赏植物的例子有拟南芥(Arabidopsis thaliana)、非洲紫苣苔属、矮牵牛、天竺葵属、一品红、菊、香石竹和百日菊属。
就将本发明的诱导蛋白或多肽用于产生抗病性的用途而言，可能不会产生对感染的绝对免疫性，但病害的严重程度得到减轻，症状发生被推迟。损伤数量、损伤大小、和真菌病原体的产孢程度都得到减弱。这种赋予抗病性的方法具有处理以前不能处理的病害的潜力，能够系统性处理病害，这些病害由于成本原因而不可能单独处理，并避免使用感染制剂或对环境有害的材料。
本发明赋予病原体抗性的方法可用于赋予包括病毒、细菌、和真菌在内的多种病原体抗性。通过本发明方法可以获得抗性，特别是对以下病毒的抗性烟草花叶病毒和番茄花叶病毒。根据本发明，可赋予植物抗性，特别是对以下细菌的抗性青枯假单胞菌、丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonas syringae pv.tabaci)，和野油菜黄单胞菌天竺葵致病变种(Xanthomonas campestrispv.pelargonii)。使用本发明的方法可赋予植物抗性，特别是对以下真菌的抗性尖镰孢(Fusarium oxysporum)和Phytophthorainfestans。
就将本发明的诱导蛋白或多肽改善植物生长的用途而言，可以获得各种形式的植物生长改善或促进作用。这一过程可以在从种子开始的植物生长早期进行或在植物生命的更晚时期进行。例如，根据本发明的植物生长包括更高的产量、提高的所产生种子的质量，提高的种子发芽率增加的植物大小、更大的生物量、更多和更大的果实、更早的果实着色、和更早的果实和植物成熟。结果，本发明可以为种植者提供明显的经济效益。例如，萌发早和成熟早使得作物能够在生长期短的地区种植，否则的话，这些植物不能在这些地区种植。种子萌发百分比的提高，可导致改善的作物植被和更有效的种子利用。较高的产量、较大的体积、和提高了的生物量使得能够从特定的土地面积上获取更大的收益。
本发明的另一方面涉及对植物进行任何形式的昆虫控制。例如，本发明的昆虫控制包括防止昆虫接触业已施加了所述过敏反应诱导物的植物，防止由于采食损害对植物造成的直接昆虫损害，导致昆虫离开所述植物，杀伤接近所述植物的昆虫，干扰昆虫幼虫在所述植物上采食，防止昆虫寄居在宿主植物上，防止寄居的昆虫释放植物毒素等。本发明还避免了由于昆虫感染而对植物造成的后续病害。
本发明能有效地抗多种昆虫。欧洲玉米钻蛀虫是玉米(马齿玉米和甜玉米)的主要害虫，这种害虫还能采食200种以上的植物，包括绿荚菜豆、黄荚菜豆、和利马菜豆和食用大豆、胡椒、马铃薯、和番茄，以及许多杂草物种。其它昆虫幼虫采食害虫能损害蔬菜类作物，这些害虫包括甜菜粘虫、甘蓝尺蠖、玉米穗虫、草地夜蛾、菜蛾、甘蓝根蛆、葱蛆、玉米种子蛆、泡菜野螟(甜瓜野螟)、胡椒蛆和番茄蛲虫。总体上讲，这一类昆虫类害虫代表了世界范围内的蔬菜生产的在经济上最重要的一类害虫。
当对包括叶、茎、根、繁殖体(例如，插穗)等在内的植物的全部或部分进行处理时，施加过敏反应诱导多肽或蛋白的本发明的方法可以通过多种方法完成。该方法可以(但不一定)包括将过敏反应诱导多肽或蛋白浸入植物。合适的施加方法包括高压或低压喷雾、注射、和在进行诱导物施加时对邻近的叶片进行摩擦。在根据本发明的施加实施方案处理植物种子时，可以通过低压或高压喷雾、包衣、浸泡、或注射施加过敏反应诱导蛋白或多肽。本领域技术人员可以设计出其它合适的施加方法，这些方法能够实现过敏反应诱导多肽或蛋白与植物或植物种子的细胞接触。一旦用本发明的过敏反应诱导物进行处理，即可将所述种子播种到天然或人工土壤中，并用常规方法载培，以便形成植株。在由按照本发明处理的种子繁殖出植株之后，可以通过一次或几次施加过敏反应诱导蛋白或多肽处理所述植株，以便赋予植物抗病性，改善植物生长，和/或控制植物上的昆虫。
根据本发明，可将所述过敏反应诱导多肽或蛋白单独或与其它材料混合施加到植物或植物种子上。另外，可以在不同时间将所述过敏反应诱导多肽或蛋白与其它材料施加到植物上。
根据本发明施加实施方案的适于处理植物或植物种子的组合物含有包含在一种载体里的过敏反应诱导多肽或蛋白。合适的载体包括水、水溶液、糊剂、或干粉。在该实施方案中，所述组合物含有高于500nM过敏反应诱导多肽或蛋白。
尽管不是必须，该组合物可以含有其它添加成分，包括肥料、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、及其混合物。合适的肥料包括硝酸铵。合适的杀昆虫剂的例子是马拉硫磷。有用的杀真菌剂包括克菌丹。
其它合适的添加剂包括缓冲剂、湿润剂、包衣剂和摩擦剂，这些材料可用于促进本发明方法的完成。另外，可将所述过敏反应诱导多肽或蛋白与包括粘土和多糖在内的其它常规种子配制和处理材料一起施加到植物种子上。
在本发明的涉及使用转基因植物和转基因种子的另一种实施方案中，没有必要将过敏反应诱导多肽或蛋白局部施加到植物或种子上。相反，按照本领域众所周知的方法，生产用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的DNA分子转化过的转基因植物。
可以用微量移液管将上述载体直接显微注射到植物细胞中，以便通过机械方法转移重组DNA。Croosway，分子基因遗传学202179-85(1985)，该文献被收作本文参考文献。还可以用聚乙二醇将所述遗传材料转移到植物细胞中。Krens等，自然，29672-74(1982)，该文献被收作本文参考文献。
用能赋予对病原体的抗性的基因转化植物的另一种方法是对宿主细胞进行粒子轰击(又被称为生物轰击转化)。该方法可以用多种方法中的一种实现。首先包括将惰性或生物活性颗粒推进到细胞中。该技术披露于授予Sanford等的US4,945,050，US5,036,006和US5,100,792中，以上专利被收作本文参考文献。一般，该方法包括将惰性或生物活性颗粒推进到细胞中，以上过程是在能有效穿透所述细胞的外表面，并整合到其内部的条件下进行的。当使用惰性颗粒时，可以通过用含有内源DNA的载体涂敷所述颗粒，将所述载体导入所述细胞中。或者，可以用所述载体包围靶细胞，以便所述载体能够尾随颗粒带入所述细胞。还可将生物活性颗粒(例如含有所述载体和异源DNA的干燥细菌细胞)推进到植物细胞中。
导入的另一种方法将原生质体与其它实体、小细胞、细胞、脂质体或其它可融合脂类表面体融合。Fraley等，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，791859-63(1982)，该文献被收作本文参考文献。
还可以通过电穿孔将所述DNA分子导入植物细胞。Fromm等，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，855824(1985)，该文献被收作本文参考文献。在该技术中，在存在含有所述表达弹头的质粒的条件下对植物原生质体进行电穿孔。高电场强度的电脉冲可逆地穿透生物膜，以便导入所述质粒。电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁、分裂、并再生。
将所述DNA分子导入植物细胞的另一种方法是在用所述基因转化之前用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物细胞。在本领域已知的合适条件下，让转化的植物细胞生长形成芽或根，并进一步发育成植株。一般，该方法包括用细菌悬浮液接种植物组织，并在25-28℃下在含抗生素的再生培养基上培养所述组织48-72小时。
农杆菌属是革兰氏阴性根瘤菌科的一个代表性的属。其种决定冠瘿病(根癌农杆菌)和毛根病(发根农杆菌)的发生。冠瘿瘤和毛根中的植物细胞被诱导产生被称为冠瘿碱的氨基酸衍生物，该衍生物仅能由细菌分解代谢。决定冠瘿碱表达的细菌基因，是嵌合表达框的控制元件的常见来源。另外，测定冠瘿碱的存在可被用于鉴定转化的组织。
可以用根癌农杆菌的Ti质粒或发根农杆菌的Ri质粒将异源遗传序列导入合适的植物细胞。通过农杆菌属将Ti或Ri质粒转入感染的植物细胞中，并稳定整合到植物基因组中。J.Schell，科学，2371176-83(1987)，该文献被收作本文参考文献。
在转化之后，必须对转化过的植物细胞进行再生。
由培养的原生质体进行的植物再生披露于以下文献中Evans等，植物细胞培养手册，第1卷(麦克米兰出版公司，纽约，1983)；和Vasil I.R.(著)，植物细胞培养和体细胞遗传学，学术出版社，Orlando，第1卷，1984，或第3卷(1986)，以上文献被收作本文参考文献。
众所周知，实际上所有植物都可以从培养的细胞或组织中再生，包括，但不限于甘蔗、甜菜、棉花、果树和豆科植物的所有主要种。
再生方法因植物种而有所不同，但通常首先提供转化过的原生质体的悬浮液或含有转化的外殖体的培养皿。形成愈伤组织，并由愈伤组织诱导发芽，然后长根。另外，可以在愈伤组织中诱导胚胎形成。这种胚胎像天然胚胎一样萌发形成植株。所述培养基通常含有各种氨基酸和激素，如生长素和细胞分裂素。将谷氨酸和脯氨酸加入所述培养基也是有利的，特别是对于诸如玉米和苜蓿的种来说尤其如此。有效的再生取决于培养基、基因型、和培养物的历史。如果对以上三个可变参数加以控制，再生通常是可以再现的和可以重复的。
在所述表达框稳定整合到转基因植物中之后，可以通过有性杂交将其转移到其它植物中。可以使用多种杂交技术中的任一种，这要取决于被杂交的物种。
一旦产生这种类型的转基因植物，可以按照常规方法在有编码所述过敏反应诱导物的基因的条件下培养所述植物，导致抗病性，改善植物生长，和/或控制所述植物上的昆虫。另外，从所述转基因植物上回收转基因种子，然后可将所述种子种植到土壤中，并用常规方法栽培，以便产生转基因植物。在能有效赋予植物抗病性、改善植物生长、和/或昆虫的条件下由播种的转基因种子繁殖转基因植物。尽管不希望受理论的限制，所述抗病性、生长改善作用、和/或昆虫控制可能是RNA介导的或是由于诱导多肽或蛋白表达所致。
当转基因植物和植物种子被用于本发明时，与通过施加过敏反应诱导多肽或蛋白处理过的植物和种子所使用还可以用相同的材料进行额外的处理。所述其它材料包括过敏反应诱导物，可通过上述方法将其施加到转基因植物和植物种子上，这些方法包括高压或低压喷雾、注射，包衣，和浸泡。类似地，在从所述转基因植物种子繁殖出植株之后，可以通过一次或几次施加过敏反应诱导物处理所述植株，以赋予其抗病性、改善生长、和/或控制昆虫。所述植物还可以用常规植物处理剂(例如，杀昆虫剂、肥料等)处理。
实施例例1-细菌菌株和质粒解淀粉欧文氏菌Ea321和Ea273是感染苹果类植物的野生型菌株(Beer等，解淀粉欧文氏的hrp基因簇，Hennecke，H.&Verma，D.P.S.著(Kluwer学术出版社，Dordrecht，荷兰)，第1卷，53-50页(1993)，该文献被收作本文参考文献)。大肠杆菌DH5α通常被用作质粒宿主。pCPP1012是pCPP430的亚克隆，而pCPP1152、pCPP1218、pCPP1219和pCPP1220是通过将pCPP1012的限制性片段克隆到pBluescriptKS(+)(Stratagene，La Jolla，CA)(图1B)上而构建的。pCPP1227是由pCPP1220克隆到相同载体上而制成的。例2-分子生物学技术和序列分析。
一般分子学方法是用披露的标准技术进行的(Sambrook等，分子克隆实验室手册，(冷泉港实验室，冷泉港，NY)(1989)，该书被收作本文的参考文献)。测序是用ABI373A自动DNA测序仪在康乃尔大学生物技术程序DNA测序设备上完成的。为了进行DNA和蛋白序列分析，使用GCG软件包，7.3版(遗传学计算机组，Inc，Madison，WI)和DNASTAR(DNASTAR，Inc，Madison，WI)中的程序。例3-在大肠杆菌中表达hrpW。
将含有hrpW的1.4kb的pCPP1227的Hpal片段亚克隆到pBC SK(-)(Stratagene，La Jolla，CA)上，使hrpW受T7φ10启动子的控制。将所得到的质粒pCPP1232(图1B)导入大肠杆菌DH5α(pGP1-2)(Tabor等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA821074-78(1985)，该文献被收作本文参考文献)。在42℃下培养细胞，以便诱导T7RNA聚合酶的表达，并按公开的方法用35S-Met对新合成的蛋白进行放射性标记(Tabor等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA821074-78(1985)，该文献被收作本文参考文献)。将所得到的样品重新悬浮在crackling缓冲液中，并加热至95℃保持3分钟，然后在10％的凝胶中进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。例4-HrpW的纯化。
通过在42℃下对大肠杆菌DH5α(pGP1-2，pCPP1232)进行热休克处理生产HrpW，并通过以下方法纯化切除含有HrpW的凝胶部位，用ELUTRAP(Schleicher&Schuell，Inc.，Keene，NH)洗脱所述蛋白，并用Centriprep-30(Amicon，Inc.，Beverly，MA)和5mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)对含有HrpW的溶液进行脱盐。另外，在有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的条件下对加热诱导过的并浓缩10倍的大肠杆菌DH5α(pGP1-2，pCPP1232)进行超声处理，在沸水浴中放置10分钟，并以17,500g的速度离心10分钟。对上清液进行脱盐得到HrpW的“无细胞诱导物制剂(CFEP)”。用相同方法从HrpN超量生产菌大肠杆菌DH5α(pCPP2139)制备HrpW的CFEP。例5-HrpW的免疫检测。
在康乃尔大学兽医学院制备抗HrpW的多克隆抗体。其做法是将大约100μg的HrpW以2-3周为间隔分3次注射到兔子体内。在最后一次注射之后2周收集抗血清，并用(DH5α，pBC SK(-))的热处理裂解物进行交叉吸附。
让解淀粉欧文氏菌Ea321Rp(Ea321的利福平抗性衍生物)，Ea321-K49(hrpLTn10-miniKm)(Wei等，细菌学杂志，1776201-10(1995)，该文献被收作本文参考文献)，Ea321-G84(hrcCTn5-gusA1)(Kim等，细菌学杂志，1791690-97(1997)，该文献被收作本文参考文献)，Ea273Rp，Ea273-K49和Ea273-673(hrcVTn5-gusA1)在Terrific培养液上生长过夜，转移到hrp基本培养基(Huynh等，科学，351374-77(1998)上，该文献被收作本文参考文献)，浓度为1H108cfu/ml，并在20℃下培养，直到细菌生长到1H109cfu/ml。以17,500g的速度对培养物进行离心，并将沉淀重新悬浮在加样缓冲液中。在添加1mMPMSF之后让上清液通过膜滤器(0.2μm孔度；Whatman Inc.，Fairfield，NJ)，并在4℃下用Centricon-10和Microcon-10(Amicon，Inc.，Beverly，MA)浓缩100倍。然后将所述细胞和上清液部分在10％凝胶中进行SDS-PAGE。
将凝胶中的蛋白转移到Immobilon-P(Millipore公司，Bedford，MA)上，并用包括生物素缀合的抗兔IgG、ExtrAvidin，和BCIP/NBT片剂的系统(Sigma，St.Louis，MO)对Ea273和大肠杆菌进行Western分析，并将Western-Light Plus系统(Tropix，Inc.，Bedford，MA)用于Ea321的菌株。例6-制备HrpW的N-末端片段。
用BamHI和BstEII消化pCPP1232，用Klenow片段和自身连接将4.1kb的片段末端补平。所得到的质粒pCPP1254编码HrpW的N-末端226个氨基酸和源于载体序列的Ile-His残基，将该质粒克隆到大肠杆菌DH5α上，然后转移到大肠杆菌DH5α(pGP1-2)，得到大肠杆菌DH5α(pGP1-2，pCPP1254)。例7-植物测定。
通过将蛋白或细菌制剂浸入烟草(Nicotiana tabacum L.‘xanthi’)和其它植物的叶片细胞间隙，进行HR诱导实验(Kim等，细菌学杂志，1791690-97(1997)，该文献被收作本文参考文献)。让细胞在Luria培养液(大肠杆菌DH5α和MC4100)或hrp基本培养基(解淀粉欧文氏菌Ea321和Ea321-T7)中生长(Huynh等，科学，3451374-77(1989)，该文献被收作本文参考文献)至5H108cfu/ml，并重新悬浮在5mM磷酸钾缓冲液中(pH6.5)，至2H108cfu/ml(大肠杆菌菌株)或5H108cfu/ml(解淀粉欧文氏菌菌株)。所使用的植物代谢抑制剂包括浓度为100μM的环己酸亚胺、1mM的LaCl3，和50μM的Na3VO4。例8-Southern印迹。
用EcoRI消化基因组DNA，在0.7％的琼脂糖凝胶上电泳，转移到Immobilon-N膜上(Millipore公司，Bedsord，MA)，并在65℃下与32P标记的pCPP1227的1.4kb-Hpal片段杂交24小时。在65℃下用2H SCC和1.0％SDS溶液洗涤所述膜两次，并用0.1H SCC洗涤直到在洗液中不再能检测到放射性。对于低严格性杂交来说，在50℃下温育所述膜，并在45℃下用2H SCC洗涤。例9-HrpW的果胶酶(pectic enzyme)测定。
让热诱导的大肠杆菌DH5α(pGP1-2，pCPP1232)沉淀，重新悬浮在1/10体积的5mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)或10mMTris-HCl(pH8.5)中，在冰上超声处理，离心，并检测上清液的PL活性。另外对浓缩50倍的Ea321培养物上清液进行测定。将稀释在10mMTris-HCl(pH7.8)中的菊欧文氏菌EC16的PglE稀释液用作对照。
将10μl的每一种制剂点滴到YC琼脂平板上(Keen等，细菌学杂志，159825-31(1984)，该文献被收作本文参考文献)，该平板中含有0.7％的聚半乳糖醛酸(Sigma，St.Louis，MO)或0.7％果胶(88％甲基化；Sigma，St.Louis，MO)，pH6.5、8.0或9.5，并点滴到果胶半固体琼脂平板上(Starr等，临床微生物学杂志，6379-86(1977)，该文献被收作本文参考文献)，该平板中含有3％果胶(88％甲基化)，pH6.5、8.0或9.5。让所述平板在37℃下培养24小时，用1M氯化钙浸泡，并检测卤基的存在。用溶解在2.5mM氯化钙和100mMTris-HCl，pH9.5中的1％聚半乳糖醛酸或1％果胶(68％甲基化)作底物进行粘度分析(Bateman，D.S.，植物病理学53197-204(1963)，该文献被收作本文参考文献)和改进的thioarbituric酸方法(Sherwood，R.T.，植物病理学56279-86(1996)，该文献被收作本文参考文献)。还试验了有可能比上述方法更灵敏的方法，包括等电点聚胶凝胶方法和分光光度法。将10μl的样品加样到含有0.2％果胶(88％甲基化)、1％琼脂糖、1.5mM氯化钙、和50mM Tris-HCl(pH8.8)的重叠凝胶上(Collmer等，细菌学杂志，161913-20(1985)，该文献被收作本文参考文献)，并用塑料薄膜包裹。在28℃下培养所述凝胶24小时，用1％的十六烷基溴化三甲胺浸泡，并检查透明度。为了通过产生双键检测PL活性，将1.9ml的由0.1％果胶(68％甲基化)、5mM氯化钙、和100mM Tris-HCl(pH5.5或pH9.5)组成的溶液与100μl的样品混合，并按公开方法记录在232nm波长下吸收值的变化30分钟(Alfano等，细菌学杂志1774553-56(1995)，该文献被收作本文参考文献)。例10-鉴定编码富含甘氨酸蛋白的基因。
大肠杆菌中的hrpN突变型pCPP430-T5和pCPP450-T5表现出残留的HR-诱导活性(图5A，幅2和4)，表明在所述克隆中存在另一种HR诱导物。因此，对与pCPP430和pCPP450重叠的hrpN的DNA下游进行亚克隆，并测定其序列。由此发现了4个开放读框，被命名为ORFA，ORFB，ORFC和hrpW(图1B)。发现推测的HrpL依赖型启动子(Bogdanove等，细菌学杂志1781720-30(1996)和Kim等，细菌学杂志1791690-97(1997)，该文献被收作本文参考文献)CGGAACC-N4-C-N10-CCACTCAAT位于hrpW起始密码子上游58bp处，这表明hrpW的表达受另一种σ因子hrpL的控制(Wei等，细菌学杂志1776201-10(1995)，该文献被收作本文参考文献)。pCPP1232上的hrpW(图1B)是用T7RNA聚合酶/启动子系统表达的，并产生一种表观分子量大约为60kDa的特异蛋白带。这一分子量大于预期的45kDa的分子量大小。不过，从解淀粉欧文氏菌的上清液中观察到了相同大小的带(图4)，这表明所述异常蛋白大小不是克隆假象。例11-hrpW产物的推测特征。
推测hrpW编码具有447个氨基酸残基的蛋白，该蛋白是酸性的(pl-4.5)，亲水，富含Gly、Ser、和Asn，而Glu、Arg、Trp、和Tyr的含量较低，并且缺少Cys(图3)。以上特征类似于harpins，不过，hrpW的一级结构似乎与它们都不同源。HrpW的序列表明该蛋白是由两个结构域组成。N-末端富含Gly-和Ser域和与PLs同源的C-末端域(参见下文)。大约2/3的Gly和Ser位于N-末端区。头240个氨基酸残基的Gly和Ser的含量分别为17.5％和14.2％。N-末端区可以分成5个亚区，并含有两个序列(残基40-59和131-145)，它们构成两亲性α-螺旋。N-末端的头39个残基含有很多Gly、Ser、Leu、和Asn，但很少带电荷的或芳族氨基酸。类似地，连接两个潜在α-螺旋的部位具有高的Gly、Asn、和Gln含量，但没有芳族残基。残基146-232含有Ser/Thr-Pro/Ser/Thr-Pro/Ser/Thr的若干重复片段，这表明该部位可能是一个接头(Gilkes等，微生物学综述55303-15(1991)，该文献被收作本文参考文献)。例12-HrpW的C-末端与果胶酸裂合酶同源。
用BLAST和FASTA算法(Altschul等，分子生物学杂志，215403-10(1990)和Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444-48(1988)，以上文献被收作本文参考文献)检索数据库，证实了HrpW的C-末端区与红球藻丛赤壳交配型VI(尖镰孢菜豆亚种)的PLA-D同源(Gonzalez等，细菌学杂志，1746343-49(1992)，Guo等，细菌学杂志，1777070-77(1995)，Guo等，Arch.Biochem.Biophys.，332305-12(1996)，以上文献被收作本文参考文献)。通过与缺省参数进行运算获得的BLAST P()值和FASTA E()值分别为4.0e-14至3.03-10和2.7e-08至1e-06。根据BESTFIT比较，HrpW与真菌PLs的相同性为27-33％，而Z-得分为8.14-13.3。另外，用红球藻丛赤壳的PLs进行的数据库检索证实，它们是胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种的同系物(Liu等，应用环境微生物学，602545-52(1994)和Heikinheimo等，分子植物-微生物相互作用，8207-17(1995)，以上文献被收作本文参考文献)。(BLAST P()值为9.0e-15至8.6e-10，BESTFIT相同性为31-36％)。以上真菌PLs和胡萝卜软腐欧文氏菌Pel-3/PelB，与HrpW一起构成一种不同于其它PL家族的类型。通过比较所述蛋白，发现了5个高度保守的区间(图3)。7个成员拥有20个相同的残基，其中5个是Gly。PHD算法预测了HrpW的PL-同源区的&-折叠和环，位于残基329-336处的序列除外，该序列具有形成α-螺旋的倾向(图3)。有趣的是，HrpW不合有任何Cys，而该残基在该类型的PLs之间是保守的。另外，使用在材料和方法部分披露的若干测定方法未检测到HrpW的PL活性。例13-HrpW的生产和分泌是hrp依赖型的。
用抗-HrpW抗体进行的免疫印迹仅从解淀粉欧文氏菌Ea321和Ea273的上清液制剂中检测到HrpW，这表明HrpW是有效分泌的(图4)。HrpW不存在于源于hrpL突变型Ea321-K49和Ea273-K49的制剂中，这表明HrpW的表达是hrpL依赖型的。另外，HrpW分别不存在于或局限于hrp分泌突变型Ea321-G84和Ea273-G73的全细胞制剂中。因此，HrpW的分泌是hrp途径依赖型的。抗-HrpW抗体不能与HrpW起反应(图4，泳道2)，这表明在两种诱导物之间存在结构差别。例14-HrpW以热稳定和蛋白酶敏感形式在植物上诱导快速组织坏死。
根据预测的HrpW的特性，它被认为是HR诱导物。为了检验这种可能性，将部分纯化的蛋白浸入烟草叶片中，在8-12小时之后浸入部位开始崩溃，并在接种之后24-36小时形成典型的组织坏死，这种坏死与由HrpN引起的坏死没有区别(图5A，幅9)。浓度为1.1μM(50μg/ml)的HrpW能在烟草上诱导组织坏死。HrpW还能在非洲紫罗兰、天竺葵、番茄、胡椒、大叶落地生根(Kalanchoediagremontiana)和拟南芥上引起坏死，但不能在大豆上引起坏死。处理过的HrpW制剂依然能在烟草叶片上导致快速坏死，这证明了其活性的热稳定性(图5A，幅2)。另一方面，用3mg/ml蛋白酶(XIV型；Sigma，St.Louis，MO)处理HrpW1小时，能破坏HR-诱导活性。例15-HrpW诱导需要植物代谢。
主要的问题是，由HrpW导致的组织坏死是否是由于与harpins相当的机制所致(He等，细胞，731255-66(1993)和He等，分子植物微生物相互作用，7289-92(1994)，以上文献被收作本文参考文献)。用HrpW CFEP和代谢抑制剂环己酰亚胺、LaCl3、或矾酸钠进行共浸入(其靶点分别是80S核糖体、Ca2+通道、ATPases/Yp磷酸酶)，可预防HR(图5B，部位3-5)，类似于HrpN CFEP与所述抑制剂(图5B，部位7-8)。这表明HrpW-诱导的HR需要有效的植物代谢。用菊欧文氏菌EC16PelE浸入烟草叶片还证实了快速组织坏死(图5B，部位9)。不过，与由harpins引起的坏死相比，由PelE引起的坏死较快，而且崩溃的部位是半透明的，较暗、较软、并且容易破碎。另外，无论是否存在抑制剂PelE都能诱导组织坏死(图5B，部位10-11)。例16-N末端区足以进行HR诱导。
构建编码N末端226个残基的hrpW的一个片段，被命名为hrpW(1-226)，并证实hrpW(1-226)的产生。典型的HR出现在hrpW(1-226)CFEP浸入烟草叶片24-36小时后，不过其活性弱于完整长度hrpW的活性。HrpW(1-226)能稳定产生，并独立于C-末端区诱导HR，这一现象支持了由所述序列资科推知的hrpW的两个域结构。例17-在解淀粉欧文氏菌的菌株之间hrpW是保守的。
通过Southern杂交检查hrpW在其它细菌中的存在。在高严格条件下，在试验过的解淀粉欧文氏菌的10个菌株中的每一个上观察到单一条带。其限制带的大小表明，有3个不同的类型。当使用低严格条件时，从欧文氏菌的若干其它菌种中可以观察到杂交带，如胡萝卜软腐欧文氏菌，和柳欧文氏菌，和pCPP2157，含有菊欧文氏菌的hrp基因簇的克隆(Bauer等，分子植物-微生物相互作用，8484-91(1995)，该文献被收作本文参考文献)(图6)。
以前，从每一种细菌中至多了解一种harpin。不过，解淀粉欧文氏菌编码的hrpW是一种不同于所披露的第一种harpin的harpin(HrpN；Wei等，科学，25785-88(1992)，该文献被收作本文参考文献)。Southern分析表明，hrpW存在于若干其它欧文氏菌中，这表明hrpW在致病性中所起的作用。另外，序列比较表明，EXP-60(被重新命名为丁香假单胞菌番茄致病变种的hrpW，Yuan等，细菌学杂志，1786399-640291996)，该文献被收作本文参考文献)与解淀粉欧文氏菌的hrpW同源。
分析表明，hrpW是多结构域蛋白，包括N-末端富Gly/Ser域和C-末端PL-同源域。HrpW与PLs同源是令人惊奇的，因为解淀粉欧文氏菌被认为不能分解果胶(Seemuler等，植物病理学，66433-36(1976)，该文献被收作本文参考文献)。另外，未发现harpins的果胶酶活性(Alfano等，植物细胞，81683-98(1996)，该文献被收作本文参考文献)。尽管未检测到PL活性，hrpW不是尚未证实其果胶酶活性功能的第一种PL同系物。某些植物花粉蛋白是PL同系物，而由其编码基因的花粉特异表达所产生的果胶酶功能受到质疑(Wing等，植物分子生物学，1417-28(1990)，该文献被收作本文参考文献)；不过，它们不具有可检测的酶活性(Dircks等，植物生理学生物化学，34509-20(1996)，该文献被收作本文参考文献)。HrpW在底物专一性方面可能不同于其同系物，或者可能缺乏向α-乳白蛋白那样的果胶酶功能，乳白蛋白是溶菌酶的同系物，但不具备溶菌酶功能(Mckenzie等，蛋白质化学进展，41173-315(1991)，该文献被收作本文参考文献)。另外，不具备裂合酶功能，HrpW可能仅具有果胶物质结合功能(Kurosky等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，773388-92(1980)，该文献被收作本文参考文献)。
从几个方面看，作为PL同系物HrpW是一个例外。它不具有被Sec机构识别的N-末端信号肽；相反，它是通过III型途径分泌的。它不合有PLs中保守的Cys残基，该残基可能具有结构和功能作用。另外，由HrpW进行的HR诱导取决于植物代谢。Southern资料表明，胡萝卜软腐欧文氏菌具有不同于pel-3/pelB的HrpW同系物。考虑到其对hrp系统的依赖性以及缺乏可检测的PL活性，HrpW在致病过程中的作用可能不是简单地降解细胞壁以便用作碳源；相反，通过可能的果胶酶活性或细胞壁结合活性，它有可能帮助Hrp菌毛(Roine等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，943459-64(1997)，该文献被收作本文参考文献)或其它致病性/毒性/减毒蛋白通过细胞壁。
根据氨基酸比较和结构分析产生了果胶酶的若干进化相关类型i)一种类型被称为“细胞外PL超家族”(Henrissat等，植物生理学，107963-76(1995)，以及该文献所引用的参考文献，这些文献被收作本文参考文献)，该家族包括两个PL植物病原性细菌家族，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和某些真菌，胡萝卜软腐欧文氏菌的PelX，果胶裂合酶，和植物花粉和花柱蛋白，ii)一类包括假结核耶尔森氏菌(Yerinsinia pseudotuberculosis)和胡萝卜软腐欧文氏菌的外周质PLs(Hinton等，分子微生物学，31785-96(1989)，该文献被收作本文参考文献)和菊欧文氏菌的KdgC(Condemine等，分子微生物学，52191-2202(1991)，该文献被收作本文参考文献)，iii)一种类型包括红球藻丛赤壳的Pls，和胡萝卜软腐欧文氏菌的Pel-3-PelB，iv)菊欧文氏菌的PelX和PelL(Alfano等，细菌学杂志，1774553-56(1995)和Lojkowska等，分子微生物学，161183-95(1995)，该文献被收作本文参考文献)，和v)最近报导的菊欧文氏菌和胡萝卜软腐欧文氏菌的PelZ(Pissavin等，细菌学杂志，1787187-96(1996)该文献被收作本文参考文献)。第三种类型的同源组尚未被确认为蛋白家族，尽管在文献中业已提及其成员(Henrissat等，植物生理学，107963-769(1995)和Liao等，分子植物微生物相互作用，914-21(1996)，该文献被收作本文参考文献)。因此，所述第三种类型(解淀粉欧文氏菌的HrpW属于该类型)将被称为“III型果胶裂合酶”，以便与较早的两种类型相区别，较早的两种类型分别被称为“I型和II型”。“III型PLs”的成员似乎广泛分布于植物病原体中。除了丁香假单胞菌番茄致病变种中的HrpW之外，菊欧文氏菌具有非常接近胡萝卜软腐欧文氏菌的Pel-3/PelB的Pell。
令人难于理解的是，在序列上、并有可能在结构上明显异源的harpins如何能诱导相同的植物反应。Harpins的“细胞杀伤”作用似乎不是由于潜在的酶促或毒性功能，如在细胞膜上形成孔；HR活性是热稳定性的(Wei等，科学，25785-88(1992)，He等，细胞，731255-66(1993)，和Arlat等，EMBO杂志，13543-53(1994)，以上文献被收作本文参考文献)，需要植物代谢(He等，细胞，731255-66(1993)和He等，分子植物微生物相互作用，7289-92(1994)，以上文献被收作本文参考文献)，而且其片段能诱导所述反应(Arlat等，EMBO杂志，13543-53(1994)，Alfano等，分子微生物学，19715-28(1996)，和Laby等，解淀粉欧文氏菌及其宿主和非宿主植物之间相互作用的分子研究，康乃尔大学，Ithaca，NY(1997)，以上文献被收作本文参考文献)。Avr蛋白能在携带相应抗性基因的植物上诱导HR(Staskawicz等，科学，268661-67(1995)，该文献被收作本文参考文献)。似乎harpins不太可能是通过相同类型的机制引起HR，尽管下游信号传导过程可能是相同的。Novacky和同事披露了导致针对harpins的HR的可能的信号传导机制(Hoyos等，分子植物-微生物相互作用9608-16(1996)，该文献被收作本文参考文献)。
Gly/Ser丰度似乎对harpins的HR-诱导功能重要，因为能诱导HR的非重叠片段包括富含Gly/Ser区(Arlat等，EMBO杂志，13543-53(1994)，Alfano等，分子微生物学，19715-28(1996)，和Laby等，解淀粉欧文氏菌及其宿主和非宿主植物之间相互作用的分子研究，康乃尔大学，Ithaca，NY(1997)，以上文献被收作本文参考文献)。作为对以上假说的支持，含有N-末端富含Gly/Ser域的截短的HrpW具有HR诱导能力。另一方面，与完整蛋白相比，由片段引起的HR诱导较弱(Laby等，解淀粉欧文氏菌及其宿主和非宿主植物之间相互作用的分子研究，康乃尔大学，Ithaca，NY(1997)，该文献被收作本文参考文献)，这表明harpins其它部分构成了完整长度的HR。确定在创伤或病毒感染之后在木糖生成期间表达的植物细胞壁富Gly蛋白(“GRPs”)(Showelter，A.M.，植物细胞，59-23(1993)，该文献被收作本文参考文献)是否具有导致细胞死亡的能力是有价值的。
Harpins似乎定向于植物细胞的外部，如细胞壁。当通过浸入方式外源施加到植物组织上时，它可能诱导HR。当Harpins被添加到细胞悬浮培养物中时，K+流出量和培养基的碱化被称作交换反应(“XR”)，紧接着发生细胞死亡(Wei等，科学，25785-88(1992)和Popham等，生理学分子植物病理学，4739-50(1995)，以上文献被收作本文参考文献)。不过，XR不出现在原生质体培养物中。另外，HrpZ抗体定位于植物细胞的HrpZ外侧，并且不存在于原生质体内侧，而且，所述碱化和定位是由一种螯合剂抑制的，该螯合剂能萃取Ca2+和果胶(Hoyos等，分子植物-微生物相互作用，9608-169(1996)，该文献被收作本文参考文献)。HrpW与PLs的同源性与一种模型一致，在该模型中，harpins的作用位点是植物细胞壁。
动物病原体的III型系统分泌很多参与致病性的蛋白(例如，Cornelis等，分子微生物学23861-67(1997)，该文献被收作本文参考文献)。不过，直到最近，仅有harpins被证实是由植物病原体的III型机制输送的。最新的证据表明，多种蛋白是通过Hrp途径分泌的，而若干Avr蛋白是通过Hrp分泌机制直接转移到植物细胞中的(Gopalan等，植物细胞81095-1105(1996)，Leister等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9315497-15502(1996)，Scofield等，科学，2742063-65(1996)，Tang等，科学，2742060-63(1996)和Van Den Ackerveken等，细胞，871307-16(1996)，以上文献被收作本文参考文献)。
有趣的是，hrpW的旁侧是dspE和ORFB(图lB)，它们分别是丁香假单胞菌的avrE和野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种(X.campestris pv.vesicatoria)的avrRxv的同系物。Harpin基因和非宿主avr基因的同系物之间的连锁，提供了它们在致病性方面的关系的线索。实际上，harpins可能是一类Avr蛋白，或者Avr蛋白可以实际上是毒性蛋白。青枯假单胞菌GMI1000的PopA仅能在抗性矮牵牛品系上诱导HR(Arlat等，EMBO杂志，13543-53(1994)，该文献被收作本文参考文献)。另外，Avr表型的表达是受hrp系统控制的，而某些Avr基因具有毒性或致病功能(Dangl，现代微生物学免疫学主题，19299-118(1994)，该文献被收作本文参考文献)。事实上，dspE是一个致病性因子，因此，存在harpin基因和avr同系物解淀粉欧文氏菌的基因组的片段有可能构成用于轰击宿主细胞的不同部位的蛋白武器。揭示其特异目标和其在HR致病性中的作用对于理解植物细菌相互作用的机制是重要的。
尽管业已出于说明目的而对本发明进行了详细说明，但应当理解的是，以上细节仅仅是用于说明目的的，本领域技术人员可以在不脱离由以下权利要求书限定的本发明构思和范围的前提下作出各种变化。
序列表(1)一般资料(i)申请人Cornell Research Foundation，Inc.
(ii)发明名称源于解淀粉欧文氏菌的过敏反应诱导物及其用途(iii)序列数3(iv)相关地址(A)收件人尼克松，哈格雷佛，迪旺司&多伊尔LLP(B)街道邮政信箱1051，克林顿广场(C)城市洛切斯特(D)州纽约(E)国家美国(F)邮编14603(v)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)当前申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(vii)在先申请数据(A)申请号US60/055,108(B)申请日1996年8月6日(viii)律师/代理人资料(A)姓名戈德曼，米切尔L.
(B)注册号30,727(C)资料/档案号19603/1582(ix)通信资料(A)电话(716)263-1304(B)传真(716)263-1600(2)序列1资料
(i)序列特征(A)长度1344个碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述序列1ATGTCAATTC TTACGCTTAA CAACAATACC TCGTCCTCGC CGGGTCTGTT CCAGTCCGGG 60GGGGACAACG GGCTTGGTGG TCATAATGCA AATTCTGCGT TGGGGCAACA ACCCATCGAT 120CGGCAAACCA TTGAGCAAAT GGCTCAATTA TTGGCGGAAC TGTTAAAGTC ACTGCTATCG 180CCACAATCAG GTAATGCGGC AACCGGAGCC GGTGGCAATG ACCAGACTAC AGGAGTTGGT 240AACGCTGGCG GCCTGAACGG ACGAAAAGGC ACAGCAGGAA CCACTCCGCA GTCTGACAGT 300CAGAACATGC TGAGTGAGAT GGGCAACAAC GGGCTGGATC AGGCCATCAC GCCCGATGGC 360CAGGGCGGCG GGCAGATCGG CGATAATCCT TTACTGAAAG CCATGCTGAA GCTTATTGCA 420CGCATGATGG ACGGCCAAAG CGATCAGTTT GGCCAACCTG GTACGGGCAA CAACAGTGCC 480TCTTCCGGTA CTTCTTCATC TGGCGGTTCC CCTTTTAACG ATCTATCAGG GGGGAAGGCC 540CCTTCCGGCA ACTCCCCTTC CGGCAACTAC TCTCCCGTCA GTACCTTCTC ACCCCCATCC 600ACGCCAACGT CCCCTACCTC ACCGCTTGAT TTCCCTTCTT CTCCCACCAA AGCAGCCGGG 660GGCAGCACGC CGGTAACCGA TCATCCTGAC CCTGTTGGTA GCGCGGGCAT CGGGGCCGGA 720AATTCGGTGG CCTTCACCAG CGCCGGCGCT AATCAGACGG TGCTGCATGA CACCATTACC 780GTGAAAGCGG GTCAGGTGTT TGATGGCAAA GGACAAACCT TCACCGCCGG TTCAGAATTA 840GGCGATGGCG GCCAGTCTGA AAACCAGAAA CCGCTGTTTA TACTGGAAGA CGGTGCCAGC 900CTGAAAAACG TCACCATGGG CGACGACGGG GCGGATGGTA TTCATCTTTA CGGTGATGCC 960AAAATAGACA ATCTGCACGT CACCAACGTG GGTGAGGACG CGATTACCGT TAAGCCAAAC1020AGCGCCGGCA AAAAATCCCA CGTTGAAATC ACTAACAGTT CCTTCGAGCA CGCCTCTGAC1080AAGATCCTGC AGCTGAATGC CGATACTAAC CTGAGCGTTG ACAACGTGAA GGCCAAAGAC1140TTTGGTACTT TTGTACGCAC TAACGGCGGT CAACAGGGTA ACTGGGATCT GAATCTGAGC1200CATATCAGCG CAGAAGACGG TAAGTTCTCG TTCGTTAAAA GCGATAGCGA GGGGCTAAAC1260GTCAATACCA GTGATATCTC ACTGGGTGAT GTTGAAAACC ACTACAAAGT GCCGATGTCC1320GCCAACCTGA AGGTGGCTGA ATGA 1344(2)序列2资料(i)序列特征(A)长度447个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线形(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述序列2Met Ser Ile Leu Thr Leu Asn Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gly Leu1 5 10 15Phe Gln Ser Gly Gly Asp Asn Gly Leu Gly Gly His Asn Ala Asn Ser20 25 30Ala Leu Gly Gln Gln Pro Ile Asp Arg Gln Thr Ile Glu Gln Met Ala35 40 45Gln Leu Leu Ala Glu Leu Leu Lys Ser Leu Leu Ser Pro Gln Ser Gly50 55 60Asn Ala Ala Thr Gly Ala Gly Gly Asn Asp Gln Thr Thr Gly Val Gly65 70 75 80Asn Ala Gly Gly Leu Asn Gly Arg Lys Gly Thr Ala Gly Thr Thr Pro85 90 95Gln Ser Asp Ser Gln Asn Met Leu Ser Glu Met Gly Asn Asn Gly Leu100 105 110Asp Gln Ala Ile Thr Pro Asp Gly Gln Gly Gly Gly Gln Ile Gly Asp115 120 125Asn Pro Leu Leu Lys Ala Met Leu Lys Leu Ile Ala Arg Met Met Asp130 135 140Gly Gln Ser Asp Gln Phe Gly Gln Pro Gly Thr Gly Asn Asn Ser Ala145 150 155 160Ser Ser Gly Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Pro Phe Asn Asp Leu Ser165 170 175Gly Gly Lys Ala Pro Ser Gly Asn Ser Pro Ser Gly Asn Tyr Ser Pro180 185 190Val Ser Thr Phe Ser Pro Pro Ser Thr Pro Thr Ser Pro Thr Ser Pro195 200 205Leu Asp Phe Pro Ser Ser Pro Thr Lys Ala Ala Gly Gly Ser Thr Pro210 215 220Val Thr Asp His Pro Asp Pro Val Gly Ser Ala Gly Ile Gly Ala Gly225 230 235 240Asn Ser Val Ala Phe Thr Ser Ala Gly Ala Asn Gln Thr Val Leu His245 250 255Asp Thr Ile Thr Val Lys Ala Gly Gln Val Phe Asp Gly Lys Gly Gln260 265 270Thr Phe Thr Ala Gly Ser Glu Leu Gly Asp Gly Gly Gln Ser Glu Asn275 280 285Gln Lys Pro Leu Phe Ile Leu Glu Asp Gly Ala Ser Leu Lys Asn Val290 295 300Thr Met Gly Asp Asp Gly Ala Asp Gly Ile His Leu Tyr Gly Asp Ala305 310 315 320Lys Ile Asp Asn Leu His Val Thr Asn Val Gly Glu Asp Ala Ile Thr325 330 335Val Lys Pro Asn Ser Ala Gly Lys Lys Ser His Val Glu Ile Thr Asn340 345 350Ser Ser Phe Glu His Ala Ser Asp Lys Ile Leu Gln Leu Asn Ala Asp355 360 365Thr Asn Leu Ser Val Asp Asn Val Lys Ala Lys Asp Phe Gly Thr Phe370 375 380Val Arg Thr Asn Gly Gly Gln Gln Gly Asn Trp Asp Leu Asn Leu Ser385 390 395 400His Ile Ser Ala Glu Asp Gly Lys Phe Ser Phe Val Lys Ser Asp Ser405 410 415Glu Gly Leu Asn Val Asn Thr Ser Asp Ile Ser Leu Gly Asp Val Glu420 425 430Asn His Tyr Lys Val Pro Met Ser Ala Asn Leu Lys Val Ala Glu435 440 445(2)序列3资料(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述序列3CGGAACCNNN NCNNNNNNNN NNCCACTCAA T 3权利要求
1.一种编码过敏反应诱导蛋白或多肽的分离的DNA分子，其中，所述分离的DNA分子选自下列一组(a)包括序列1所示核苷酸序列的DNA分子，(b)编码包括序列2所示氨基酸的蛋白的DNA分子，(c)能在严格条件下与包括序列1所示核苷酸序列的DNA分子杂交的DNA分子，和(d)互补于DNA分子(a)、(b)、和(c)的DNA分子。
2.如权利要求1的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子是包括序列1所示核苷酸序列的DNA分子。
3.如权利要求1的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子是编码包括序列2所示氨基酸的蛋白的DNA分子。
4.如权利要求1的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子是能在严格条件下与包括序列1所示核苷酸序列的DNA分子杂交的DNA分子。
5.如权利要求1的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子是互补于DNA分子(a)、(b)、和(c)的DNA分子。
6.一种用权利要求1的DNA分子转化过的表达载体。
7.如权利要求6表达载体，其中，所述DNA分子处于合适的有义取向和正确的读框。
8.一种用权利要求1的DNA分子转化过的宿主细胞。
9.如权利要求8的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自下列一组植物细胞或细菌细胞。
10.如权利要求8的宿主细胞，其中，所述DNA分子是用表达载体转化过的。
11.一种用权利要求1的DNA分子转化过的转基因植物。
12.如权利要求11的转基因植物，其中，所述植物选自下列一组苜蓿、稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、甘蓝、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。
13.如权利要求11的转基因植物，其中，所述植物选自下列一组拟南芥、非洲紫苣苔属、矮牵牛、天竺葵属、一品红、菊、香石竹和百日菊属。
14.一种用权利要求1的DNA分子转化过的转基因植物种子。
15.如权利要求14的转基因植物种子，其中，所述植物种子选自下列一组苜蓿、稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃著、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、甘蓝、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨，甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。
16.如权利要求14的转基因植物种子，其中，所述植物种子选自下列一组拟南芥、非洲紫苣苔属、矮牵牛、天竺葵属、一品红、菊、香石竹和百日菊属。
17.一种分离的过敏反应诱导蛋白或多肽，选自下列一组包含序列2所示氨基酸的蛋白或多肽和由能与包括序列1的核苷酸序列的DNA分子杂交的核酸编码的氨基酸。
18.如权利要求17的分离的蛋白或多肽，其中，所述蛋白或多肽具有包括序列2的氨基酸。
19.如权利要求17的分离的蛋白或多肽，其中，所述蛋白或多肽是由能与包括序列1所示核苷酸序列的DNA分子杂交的核酸编码。
20.一种赋予植物抗病性的方法，包括在能有效赋予抗病性的条件下以非感染形式将权利要求17的蛋白或多肽施加到植物或植物种子上。
21.如权利要求20的方法，其中，在所述施加期间处理植物。
22.如权利要求20的方法，其中，在所述施加期间处理植物种子，所述方法还包括将用所述过敏反应诱导物处理过的种子播种到天然或人工土壤中，和由所述播种到土壤中的种子繁殖植物。
23.一种改善植物生长的方法，包括在能有效改善植物生长的条件下以非感染形式将权利要求17的蛋白或多肽施加到植物或植物种子上。
24.如权利要求23的方法，其中，在所述施加期间处理植物。
25.如权利要求23的方法，其中，在所述施加期间处理植物种子，所述方法还包括将用所述过敏反应诱导物处理过的种子播种到天然或人工土壤中，和由所述播种到土壤中的种子繁殖植物。
26.一种赋予植物抗病性的方法，包括在能有效控制昆虫的条件下以非感染形式将权利要求17的蛋白或多肽施加到植物或植物种子上。
27.如权利要求26的方法，其中，在所述施加过程中处理植物。
28.如权利要求26的方法，其中，在所述施加期间处理植物种子，所述方法还包括将用所述过敏反应诱导物处理过的种子播种到天然或人工土壤中，和由所述播种到土壤中的种子繁殖植物。
29.一种赋予植物抗病性的方法，包括提供一种用权利要求1的DNA分子转化过的转基因植物或植物种子，和在能有效赋予抗病性的条件下生长转基因植物或由所述转基因植物种子产生的转基因植物。
30.如权利要求29的方法，其中，提供了一种转基因植物。
31.如权利要求29的方法，其中，提供了一种转基因植物种子。
32.一种改善植物生长的方法，包括提供一种用权利要求1的DNA分子转化过的转基因植物或植物种子，和在能有效改善植物生长的条件下生长转基因植物或由所述转基因植物种子产生的转基因植物。
33.如权利要求32的方法，其中，提供了一种转基因植物。
34.如权利要求32的方法，其中，提供了一种转基因植物种子。
35.一种对植物进行昆虫控制的方法，包括提供一种用权利要求1的DNA分子转化过的转基因植物或植物种子，和在能有效控制昆虫的条件下生长转基因植物或由所述转基因植物种子产生的转基因植物。
36.如权利要求35的方法，其中，提供了一种转基因植物。
37.如权利要求35的方法，其中，提供了一种转基因植物种子。
38.一种组合物，包括一种如权利要求17的蛋白或多肽，和一种载体。
39.如权利要求38的组合物，还包括选自下列一组的添加剂肥料、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、及其混合物。
全文摘要
本发明涉及能在植物中引起过敏反应的分离的蛋白或多肽,以及编码所述过敏反应诱导蛋白或多肽的分离的DNA分子。所述分离的蛋白或多肽以及分离的DNA分子可用于赋予植物抗病性,改善植物生长,和/或控制植物上的昆虫。这一目的可以通过以非感染形式将所述过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物或植物种子上而实现,处理条件为能够有效赋予抗病性,改善植物生长,和/或控制植物或由所述植物种子长成的植物上的昆虫。另外,可以提供用编码过敏反应诱导蛋白或多肽的DNA分子转化过的转基因植物或植物种子,并且生长所述转基因植物或由所述转基因植物种子产生的植物,生长条件为能有效赋予抗病性,改善植物生长,和/或控制植物或由所述植物种子长成的植物上的昆虫。
文档编号C12N1/21GK1274260SQ98809923
公开日2000年11月22日 申请日期1998年7月27日 优先权日1997年8月6日
发明者J·F·金, S·V·贝尔 申请人:康乃尔研究基金会有限公司