专利名称：：减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌的制作方法本申请是1997年9月10日提交的申请系列号No．08／926，636的部分继续申请，该申请在此全文引入作为参考。1．发明领域本发明涉及一种沙门氏菌基因的分离，该基因在被遗传破坏时，能同时降低由这种生物引起的毒性和败血症休克，并提高其对促进这种细菌消除的试剂如螯合剂的敏感性。本发明提供这种基因的序列和对其进行遗传破坏的方法，并介绍使用在该基因中有破坏的肿瘤靶向细菌来抑制癌症(包括但不限于黑素瘤、结肠癌和其他实体瘤)生长的例子。本发明还提供该基因遗传破坏与一种营养缺陷型基因破坏的组合。2．发明背景第2部分或本申请的其他部分对任何参考文献的引用或注明并不意味着这些参考文献是本发明的现有技术。实体瘤癌症的化学疗法中的一个主要难题是，传递足够浓度的治疗试剂例如药物来消除肿瘤细胞，同时减少对正常细胞的损伤。因此，许多实验室的研究都针对生物传递系统的设计，例如用来将药物、药物前体转化酶、和／或基因靶向转移至肿瘤细胞的抗体、细胞因子、和病毒。Houghton和Colt，癌症诊断和治疗的新视角165-70；dePalazzo，eta1．，1992a，细胞免疫142338-347；dePalazzoetal．，1992b，癌症研究525713-5719；Weiner，eta1．，1993a，免疫治疗杂志13110-116；Weinereta1．，1993b，免疫学杂志1512877-2886；Adamsetal．，1993，癌症研究534026-4034；Fangeretal．，1990，FASEBJ．42846-2849；Fangeretal．，1991，今日免疫学1251-54；Segal，etal．，1991，纽约科学院年评636288-294；Segaletal．，1992，免疫生物学185390-402；Wunderlichetal．，1992；Intl．J．Clin．Lab．Res．2217-20；Georgeetal．，1994，免疫学杂志1521802-1811；Hustonetal．，1993，Intl．Rev．Immunol．10195-217；Staffordetal．，1993，癌症研究534026-4034；Haberetal．，1992，纽约科学院年评667365-381；FelonerandRhodes，1991，自然349351-352；SarverandRossi，1993，艾滋病研究与人类逆转录病毒9483-487；LevineandFriedmann，1993，美国儿童病学杂志1471167-1176；Friedmann，1993，分子遗传医学31-32；GilboaandSmith，1994，遗传学趋势10139-144；Saitoetal．，1994，癌症研究543516-3520；Lietal．，1994，血液833403-3408；Viewegetal．，1994，癌症研究541760-1765；Linetal．，1994，科学265666-669；Luetal．，1994，人类基因治疗5203-298；Gansbacheretal．，1992，血液802817-2815；Gastletal．，1992，癌症研究526229-6236．2．1细菌感染和癌症关于细菌和癌症，一篇历史综述揭示了大量的临床观察，这些临床病例报告，在患有细菌感染的病人体内，肿瘤萎缩了。Nautsetal．，1953，ActaMedica．Scandinavica1451-1-2，(Suppl．276)陈述道通过注射细菌产物来治疗癌症基于以下事实，200多年来，已经观察到肿瘤在急性感染主要是链球菌感染后萎缩。如果这些病例不是过于晚期，并且感染足够严重和持久，肿瘤将完全消失，病人将不会再复发。Shear，1950，J．A．M．A．142383-390(Shear)观察到，在Boston儿童医院中，未经治疗而自发缓解的白血病例中，75％发生在急性细菌感染事件之后。Shear提出了以下问题病原性和非病原性生物是自然控制恶性疾病的显微病灶之一吗在控制感染性疾病取得进步的过程中，我们是否正在解除癌症的一种自然控制随后来自大量研究实验室的证据指出，至少某些抗癌效应是通过刺激宿主免疫系统介导的，导致对癌细胞免疫排斥的增强。例如，革兰氏阴性细菌如沙门氏菌释放脂多糖(LPS)内毒素会激发宿主免疫系统的细胞如巨噬细胞释放肿瘤坏死因子---TNF，Christetal．，1995，Science26880-83。TNF水平的升高接着引发细胞因子介导的级联反应，最终导致肿瘤细胞的死亡。关于这一点，Carswelletal．，1975，Proc．Natl．Acad．Sci．USA723666-3669，证明，用细菌卡介苗(BCG)注射小鼠能提高TNF的血清水平，并且TNF阳性血清能导致小鼠中肉瘤MethA和其他移植肿瘤的坏死。而且，Klimpeletal．，1990，免疫学杂志145711-717，显示，体外感染志贺氏菌或沙门氏菌的成纤维细胞对TNF的敏感性提高。由于上面介绍的这些观察结果，用注射BCG来为癌症病人进行免疫接种目前正用于某些癌症的治疗过程。见，Sosnowski，1994，Compr．Ther．20695-701；BarthandMorton，1995，Cancer75(Suppl．2)726-734；Friberg，1993，Med．Oncol．Tumor．Pharmacother．1031-36的对BCG疗法的综述。2．寄生物和癌细胞虽然寄生物的天然生物特异性和进化上的适应性已经被认识了一段时间，并且已有人建议将它们的特殊系统用作新治疗方法的模型，但很少有报告或建议真正将寄生物用作载体。Leeetal．，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA891847-1851(Leeetal．)和Joneetal．，1992，Infect．Immun．602475-2480(Jonesetal．)分离了伤寒沙门氏菌的突变体，这类突变体能在体外以比野生型菌株大得多的数量入侵HEp-2细胞(人表皮样癌)。“高侵袭性”突变体是在细菌的有氧生长条件下分离的，这种条件通常抑制野生型菌株侵入HEp-2动物细胞的能力。但是，Lee等人和Jone等人并没有提出使用这种突变体作为治疗载体，也没有提出，通过筛选与机体的正常细胞相比优先感染黑素瘤或其他癌细胞的突变体，来分离肿瘤特异性的细菌。没有肿瘤特异性或其他形式的减毒，像Lee等人和Jones等人介绍的这种高侵袭性伤寒沙门氏菌很可能是泛侵袭性的，在癌症病人中将导致广泛的感染。2．3肿瘤靶向的细菌已经证明，遗传工程改造的沙门氏菌能够靶向肿瘤，具有抗肿瘤活性，并可用于将效应基因如单纯疱疹胸苷激酶(HSVTK)传递至实体瘤(Paweleketal．，W096／40238)。体内使用细菌明显要考虑的两个因素是它们的毒性和诱导肿瘤坏死因子α(TNFα)介导的败血症休克的能力。因为TNFα介导的败血症休克是与细菌有关的考虑中首要的东西之一，能减少这种形式免疫应答的修饰将十分有用，因为TNFα水平将不再变得有毒性，而更有效浓度和／或持续时间的治疗载体将可以使用。2．4修饰的细菌类脂A对肿瘤靶向细菌的脂类组分进行修饰，通过产生TNFα诱导产量降低来改变免疫应答，这是由Pawelek等人提出的(Pawelek等，WO96／40238)。Pawelek等提供了从红细菌中分离负责单磷酰类脂A(MLA)产生的基因的方法。MLA的作用是败血症的一种拮抗物。Pawelek等还提出类脂A生物合成途径中遗传修饰的使用，包括firA突变，firA编码类脂A生物合成的第三个酶---UDP-3-O(R-30羟基豆蔻酰)-葡糖胺N-乙酰转移酶(Kelley等，1993，J．Biol．Chem．26819866-19874)。Pawelek等人显示，firA基因中的突变诱导低水平的TNFα。但是这些作者没有提出修饰类脂A分子中豆蔻酸部分的酶。而且，Pawelek等人并没有提出，对细菌脂类成分的修饰将改变它们对特定试剂如螯合剂的敏感性。在大肠杆菌中，负责类脂A末端豆蔻酰化的msbB(mlt)基因已被鉴定(Engeletal．，1992，J．Bacteriol．1746394-6403；KarowandGeorgopoulos1992，J．Bacteriol．174702-710；Somervilleetal．，1996，J．Clin．Invest．97359-365)。该基因的遗传破坏将导致稳定的、不受环境影响的突变，这种突变可降低TNFα的诱导(Somervilleetal．，1996，J．Clin．Invest．97359-365)。但是，这些参考文献并没有提出，肿瘤靶向的沙门氏菌载体中msbB基因的破坏将产生这样一种细菌，它具有较低毒性，并对螯合剂更加敏感。与细菌用作基因传递载体有关的难题集中在，细菌普遍具有直接杀伤正常哺乳动物细胞的能力，并且它们具有通过TNFα过分刺激免疫系统的能力，这种对免疫系统的过分刺激对宿主具有毒性效果(Bone，1992JAMA2683452-3455；Dinarelloetal．，1993JAMA2691829-1835)。除了这些因素，对抗生素的抗性使得对付人体中细菌的存在大大复杂化(TschapE，1996，DTWDtschTierarztlWochenschr1996103273-7；Ramosetal．，1996，EnfermInfec．Microbiol．Clin．14345-51)。Hone和Powell，WO97／18837(“HomeandPowell”)公开了制备具有非致热原类脂A或LPS的革兰氏阴性菌的方法。虽然Hone和Powell泛泛地断言，在多种基因包括msbB、kdsA、kdsB、kdtA和htrB等等中的条件突变，可被引入大范围的、不同种类的革兰氏阴性菌中，包括大肠杆菌、各种志贺氏菌、各种沙门氏菌等等，但所举的惟一突变的例子是将一个htrB突变引入大肠杆菌中。而且，虽然Hone和Powell提出了在msbB基因中有一个突变的非致热原沙门氏菌的治疗用途，但却没有如何完成这种用途的介绍。而且，Hone和Powell仅提出将非致热原细菌用于疫苗目的。疫苗载体的目标与本申请的肿瘤靶向载体有明显的不同。因此，疫苗载体的要求与肿瘤靶向载体也明显不同。疫苗载体的目的是引发一种免疫应答。一种优选的细菌活疫苗应具有免疫原性，使它能引发保护性免疫；但疫苗不能在体内过量生长，因为这样会导致有害反应。根据Hone和Powell的技术，一种合适的细菌疫苗载体是温度敏感型的，在机体温度的正常生理范围内没有复制能力。相反，优选的肿瘤靶向寄生性载体，例如但不限于沙门氏菌，能被机体的正常组织安全地耐受，使免疫原性受到限制，而载体靶向肿瘤并在其中自由复制。因此，在正常机体温度下复制最小的疫苗载体将不适合用作肿瘤靶向载体。肿瘤特异性沙门氏菌株的优选特性包括1)血清抗性，允许寄生物在寻找肿瘤的过程中穿过血管系统和淋巴系统，2)兼性厌氧，即能在厌氧或有氧条件生长，使之能在含氧量低的大的坏死性肿瘤中以及含氧量较高的小的转移性肿瘤中增殖，3)对宿主的防御能力敏感，这样可限制其在正常组织中的复制，但在肿瘤中不受限制，因为肿瘤中的宿主防御能力已被损坏，4)毒性降低，这样可提高对宿主防御的敏感性，寄生物能被宿主耐受，但不限制其在肿瘤中复制，5)针对肿瘤细胞的侵袭能力，有助于肿瘤靶向和抗瘤活性，6)运动性，有助于穿透肿瘤，7)抗生素敏感，用于在治疗中控制和在治疗后清除(例如对氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、环丙沙星敏感)，并缺少抗生素抗性标记，诸如那些用于菌株构建的抗性标记，以及8)较低的原养型回复率，有助于在接受个体中的安全性。3．发明简述本发明提供一种提高肿瘤靶向细菌安全性的方法，例如通过类脂A分子的遗传修饰。本发明的修饰的肿瘤靶向细菌诱导的TNFα少于野生型细菌，并且与野生型细菌相比，直接杀死正常哺乳动物细胞或引起全身性疾病的能力降低。本发明的修饰的肿瘤靶向细菌具有提高的治疗效果，即由于其诱导的TNFα和全身性疾病较少，毒性低，可以使用更为有效的剂量的细菌和更长的时间。本发明提供在细菌如沙门氏菌中进行msbB基因的遗传破坏的组合物和方法，这种破坏导致细菌如沙门氏菌与野生型细菌相比，具有较低的TNFα诱导能力和毒性。在一个实施方案中，本发明提供筛选msbB基因的遗传破坏的改进方法。此外，与携带野生型msbB基因的细菌相比，遗传修饰的细菌对螯合剂的敏感性升高。在一个优选实施方案中，具有一种被破坏的msbB基因的沙门氏菌对肿瘤组织具有高侵袭性，它能够在肿瘤中复制，并可用于抑制肉瘤、癌、淋巴瘤或其他实体瘤癌症如生殖系肿瘤和中枢神经系统瘤的生长和／或减少肿瘤体积，所述癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、星型细胞瘤、神经蚀质瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和黑素瘤。在本发明的一个实施方案中，细菌用其他方法减毒，包括但不限于导致营养缺陷型的生物合成途径突变。在一个具体实施方案中，这种生物合成途径突变是一种purⅠ基因的遗传破坏。在另一个实施方案中，细菌表达药物前体转化酶，包括但不限于HSV-TK、胞嘧啶脱氨酶(CD)和p450氧化还原酶。本发明还提供用于终止治疗和治疗终止后增加敏感性的方法。根据本发明的一个实施方案，带有遗传修饰的类脂A的肿瘤靶向细菌对特定试剂如螯合剂的敏感性也增加。用这种方法对肿瘤靶向细菌进行修饰有更进一步的优越性，因为这增加了用有抗生素样效果的试剂如螯合剂去除细菌的能力，这种螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)和柠檬酸钠。因此，通过外源方法增加消除细菌的能力的修饰将非常有用，所述外源方法如给予一种遗传修饰的细菌比相应的野生型菌株对其更为敏感的试剂。本发明进一步提供一种在msbB基因及一种营养缺陷型基因两者中都有删除突变的沙门氏菌株。在一个具体实施方案中，该营养缺陷型删除突变影响purⅠ基因。在一个优选实施方案中，这些突变导致菌株的安全性提高。在另一个优选的实施方案中，菌株还携带这里介绍的其他突变，这些突变可提高菌株的效率，而对其安全性则无关紧要。4．定义用于此处，沙门氏菌包括所有种类的沙门氏菌，包括伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。此处也包括沙门氏菌的各血清型，例如鼠伤寒，它是肠炎沙门氏菌的一个亚类，通常被称为鼠伤寒沙门氏菌。“减毒”减毒是一种使微生物或载体具有较低病原性的修饰。减毒的最终结果是，当微生物或载体接种给予病人时，毒性以及其他副作用的危险降低。毒性毒性是一个有相对含义的词，用来描述导致疾病的一般能力，包括杀死正常细胞的能力或诱发败血症休克的能力(见下面的专门定义)。败血症休克败血症休克是一种由复杂的细胞因子级联反应造成的体内器官衰竭症状，它主要由TNFα引发。一种微生物或载体诱导TNFα的相对能力被用作一种测量指标，来说明其诱导败血症休克的相对能力。螯合剂敏感性螯合剂敏感性被定义为，细菌繁殖受到影响的有效浓度，或细菌存活性被降低的浓度，细菌存活性可用复苏的菌落形成单位(c．f．u．)来确定。5．附图简述本发明可参考下面的详细介绍、具体实施方案的说明性实施例以及附图来更全面理解。图1。沙门氏菌野生型(WT)14028的msbB基因的全DNA序列(SEQIDNO1)以及推导的编码蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO2)。图2A-2C。用克隆的沙门氏菌WT14028msbB基因制备的敲除结构物。克隆基因用SphⅠ和MluⅠ酶切来去掉大约一半的msbB编码序列，然后将来自AatⅡ和AvaⅠ酶切的pBR322的四环素抗性基因(TET)，在用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段进行平端化后，插入该基因。A=敲除结构物。B=沙门氏菌msbB的染色体拷贝。C=同源重组后沙门氏菌msbB的被破坏的染色体拷贝。图中还显示了起始密码子(ATG)、终止密码子(TAA)以及AseⅠ、BamHⅠ、SphⅠ、MluⅠ和EcoRⅤ的酶切位点。图中还标出了产生野生型或破坏的msbB的不同大小PGR产物的两条引物，P1和P2。图3A-3C。染色体上被破坏的沙门氏菌WT14028msbB的Southern印迹分析。A)使用四环素基因为探针进行的Southern印迹，证明它在质粒结构物和两个克隆中存在，在WT14028细菌中不存在。B)使用32-P标记的、来自克隆的msbB的AseⅠ／BamHⅠ片段为探针，用相似凝胶进行的Southern印迹。AseⅠ酶的切点在msbB的上游，在野生型中BamHⅠ在一个位置切割，但在四环素基因中，它在第二个位置上切割，这将产生一个更高分子量的产物。泳道1(K0)显示敲除结构物中该条带的位置，与此相比较的是泳道2(WT)中的WT14028。泳道3和4显示具有更高分子量产物的克隆YS8211和YS861。C)使用32-P标记的、来自克隆的msbB的mluⅠ片段为探针，用相似凝胶进行的Southern印迹。详见正文章节7．2。图4。活的沙门氏菌WT14028在小鼠中的TNFα诱导。野生型或msbB-破坏菌株按溶于0．1cc磷酸缓冲盐水中的1×108活菌的剂量经静脉注射于Balb／c小鼠的尾静脉中。条形图用误差条表明TNFα的诱导。与沙门氏菌WT14028相比，克隆YS8211诱导32％的TNFα。图5。Sinclair猪对活的沙门氏菌WT14028和msbB-克隆YS8212的TNFα应答。在静脉导入1×109c．f．u．沙门氏菌WT14028和YS82121．5和6．0小时后，测量TNFα水平。在1．5小时，msbB删除突变型与野生型相比，TNFα应答明显低(p≤0．011)。图6A-6B。来自WT14028和msbB-克隆YS8212的LPS诱导的呼吸水平改变。Sinclair猪用A)5ug／kg的纯化LPS或B)500ug／kg的纯化LPS注射，并测量呼吸速率。500ug／kg来自沙门氏菌WT14028的LPS能提高呼吸速率，比正常情况下提高4倍，而在msbB-LPS处理的动物中呼吸速率的提高则少于2倍。图7。活的沙门氏菌WT14028对人单核细胞的TNFα诱导。将分离自外周血的人单核细胞用c．f．u．数量不断增加的沙门氏菌处理。在1．0×105c．f．u．时，WT14028诱导的TNFα浓度比由多种msbB-克隆即YS8211、YS8212、YS8658和YS1170诱导的要高3倍。图8。人单核细胞的TNFα产生。分离自外周血的人单核细胞用数量不断增加的纯化LPS处理。少至1纳克的来自野生型的LPS就足以诱导可以测量的TNFα应答，并在10ng达到最高。与此相对，100ug的来自每种msbB-克隆的LPS都不足以诱导任何应答。因此，在10ngLPS水平，沙门氏菌WT14028诱导的TNFα浓度至少比独立的msbB敲除即YS7216和YS8211及其衍生物即YS1170、YS8644、YS1604、YS8212、YS8658、YS1601、YS1629诱导的TNFα浓度高105倍。图9A-9B。分别注射了2×107或1×109活菌的小鼠和Sinclair猪的存活。A)WT14028在4天内杀死所有的小鼠，而msbB-克隆YS862处理的小鼠在20天后有90％存活。B)与此相似，WT14028在3天内杀死所有的猪，而msbB-克隆YS8212处理的猪在20天后100％存活。图10。msbB-沙门氏菌YS8211在B16F10黑素瘤肿瘤中的生物分布。在5天内，肿瘤中的msbB-沙门氏菌与肝脏中的比例超过1000∶1。图11。msbB-沙门氏菌的肿瘤抑制作用。将B16F10黑素瘤肿瘤移植到C57BL／6小鼠的体侧，并让其生长至第8天。小鼠不接受细菌(对照)或接受msbB-菌株YS8211、YS8212、YS7216、YS1629处理。两种菌株---YS8211和YS1629能明显抑制肿瘤的发展，而菌株YS7216和YS8212则不能。图12A-12B。WT14028和msbB破坏的细菌对螯合剂的敏感性。在存在或不存在1mMEDTA(图12A)的条件下，或者在存在或不存在10mM柠檬酸钠(图12B)的条件下，在无氯化钠的LB培养基(LB-zero)中，培养野生型和msbB破坏型沙门氏菌克隆YS8211和YS862。以时间为变量测量0D600并作图。与msbB-菌株相比，msbB+菌株显示几乎不被EDTA或柠檬酸钠抑制，而msbB-菌株显示在EDTA或柠檬酸钠处理3小时后，生长几乎完全停止。图13A-13B。msbB-细菌在鼠巨噬细胞中的存活。以鼠骨髓来源的巨噬细胞(图13A)和一种小鼠巨噬细胞系---J774(图13B)作为宿主，用于细菌内在化和按时间进行定量。数据以原始c．f．u．的百分数形式表示。图14。使用携带第二个版本的msbB-(msbB2(△)ampRsacB+)的阳性选择性自杀载体pCV0442，进行msbB1(△)tet至tets的转化。图15。由野生型鼠伤寒沙门氏菌衍生出菌株YS1456的示意图。详见正文章节8．1。图16。由野生型鼠伤寒沙门氏菌衍生出菌株YS1646的示意图。详见正文章节8．2。图17。YS1646剂量对B16-B10小鼠黑素瘤生长的影响。图18。致死感染后，YS1646诱导的死亡率的抗生素抑制作用。6．发明详述本发明基于一种沙门氏菌基因即msbB的分离，这种基因在以正常形式存在时，其作用为TNFα的诱导、一般毒性、巨噬细胞内存活，以及对特定试剂不敏感，这些特定试剂能促进细菌的消除。本发明涉及该基因的遗传修饰以及将遗传修饰导入肿瘤靶向细菌包括沙门氏菌来用于治疗，这种修饰导致该基因产物的正常功能被破坏。在一个优选实施方案中，细菌在msbB基因中有一种遗传修饰，并在一个生物合成途径中的一个基因例如purⅠ基因中带有一种遗传修饰，后者产生一种营养缺陷型菌株。在一个优选实施方案中，遗传修饰的细菌被用于动物包括人体中实体瘤的体积减小和／或生长抑制。在另一个优选实施方案中，对本发明来说有用的细菌显示，相对于正常组织，它们优先粘附至或穿透到特定的实体瘤癌症细胞中，或在肿瘤组织中增殖的倾向提高。这些细菌包括但不限于沙门氏菌，它们具有区分癌症或赘生细胞组织与正常细胞／组织的天然能力。此外，对本发明来说有用的肿瘤细胞特异性的细菌，可以按照Pawelek等，W096／40238介绍的方法，依肿瘤靶向能力选择或改进，该文献在此引入作为参考。Pawelek等人介绍了分离肿瘤特异性细菌的方法，即使用一次或多次感染循环，将一种微生物循环通过预先选择的靶细胞，优选使用体外的实体瘤细胞，或者在体内通过实体瘤。6．1一种参与毒性的基因的分离／鉴定大肠杆菌基因msbB已被显示参与类脂A的豆蔻酰化(Somervilleetal．，1996，J．Clin．Invest．97359-365)。大肠杆菌msbB基因的染色体组成和编码msbB基因的DNA序列已有介绍(Engel，etal．，1992，J．Bacteriol．1746394-6403；KarowandGeorgopoulos，1992，J．Bacteriol．174702-710；Somervilleetal．，1996，J．Clin．Invest．97359-365)。如本发明所示，msb基因可以使用本领域的技术人员熟知的低严紧性DNA／DNA杂交技术(Sambrooketal．，MolecularCloning，ColdSpringHarborPress，1989)，从非大肠杆菌的细菌菌株中分离。分离细菌包括但不限于沙门氏菌各种类的msbB基因的一个说明性的实施例，见下文章节7．1。一个细菌DNA文库可用32P标记的来自大肠杆菌的msbB基因作为探针进行杂交。对杂交克隆进行测定，如果它们含有与已知的大肠杆菌msbB基因相似的DNA序列，它们就是正确的。6．1．1沙门氏菌msbB的遗传改变本发明的一个实施方案提供了一种组合物，它是在msbB基因中带有一种遗传改变的细菌菌株。在一个优选实施方案中，该细菌是沙门氏菌。破坏或删除形式的遗传改变可用本领域的技术人员熟知的几种方法来完成，包括使用一种抗生素抗性标记来进行同源重组。这些方法涉及以质粒为基础的克隆的msbB基因的破坏，使用能使部分或全部该基因被破坏或去除的限制内切酶，或使用能使正常的转录和翻译被干扰的限制内切酶，并将一种用于表型筛选的抗生素标记插入到该删除、破坏或其他改变区域。将线性化的DNA转化至沙门氏菌中，进一步检查携带抗生素抗性的细菌来证明遗传改变。检查遗传改变的方法包括PCR分析和Southern印迹。沙门氏菌msbB基因遗传破坏的说明性实施例参见章节7．2。在本发明的另一个实施例中，msbB-／抗生素抗性标记可被转染进一种新的细菌菌株。章节7．2中提供了一个说明性的实施例。噬菌体P22和一种msbB-沙门氏菌克隆可在一种无盐LB中培养，上清中的新噬菌体可用来感染一种新的沙门氏菌菌株。本发明的另一个实施方案还提供一种沙门氏菌，它以超过一种的方式被减毒，例如类脂A产生途径中的一种突变如这里介绍的msbB突变，以及一种或多种对一种或多种营养物质或代谢产物的营养缺陷型突变，例如Bochner，1980，J．Bacteriol．143926-933介绍的尿嘧啶生物合成、嘌呤生物合成和精氨酸生物合成途径的突变，该文献在此引入作为参考。在一个优选实施方案中，msbB沙门氏菌在肿瘤中集聚的能力被具有一种或多种导种营养缺陷型菌株的msbB-沙门氏菌保留。在本发明的该实施方案的一个更优选的模式中，能选择性靶向肿瘤并表达一种药物前体转化酶的细菌载体对尿嘧啶、芳香族氨基酸、异亮氨酸、缬氨酸营养缺陷，并合成一种改变的类脂A。在一个特别优选的实施方案中，msbB-沙门氏菌还含有一种生物合成途径基因purⅠ的遗传修饰，导致与野生型相比该菌株的毒性降低。一个说明性的实施例在章节7和8中提供。6．1．2带有被破坏msbB的沙门氏菌的特征这里介绍的msbB-沙门氏菌的一个特征是，诱导一种TNFα应答的能力与野生型细菌载体相比降低。全菌和分离或纯化的脂多糖(LPS)都能引发一种TNFα应答。在本发明的一个实施方案中，与野生型沙门氏菌株相比，msbB-沙门氏菌诱导的TNFα表达为约5％至约40％(用另一种方式表述，msbB-沙门氏菌诱导的TNFα表达为野生型沙门氏菌如WT14028诱导水平的约5％至40％)。在本发明的一个优选实施方案中，msbB-沙门氏菌诱导的TNFα表达是一种野生型沙门氏菌诱导水平的约10％至35％。在本发明的一个实施方案中，来自msbB-沙门氏菌的纯化LPS诱导的TNFα表达水平低于或等于纯化自野生型沙门氏菌的LPS诱导水平的0．001％。全菌或分离或纯化的LPS诱导的TNFα应答可以用商业化的试验系统如用酶联免疫试验(ELISA)在体外或体内进行评估。说明性的实施例见下文章节7．3．1和7．3．2。以每c．f．u．或ug／kg为基础的TNFα产生的比较，被用来确定相对活性。以每单位为基础的TNFα水平较低，说明TNFα诱导量的减少。毒性降低这里介绍的msbB-沙门氏菌的另一个特征是，与野生型细菌载体相比，对宿主癌症病人的毒性降低。野生型沙门氏菌在某些情况下显示能引起明显的进行性疾病。使用动物模型可确定正常野生型活沙门氏菌和活msbB-沙门氏菌的急性致死性。一个说明性的实施例见章节7．4和章节9，表Ⅲ。对一种固定接种量的动物存活的比较，被用来确定相对毒性。具有较高存活率的菌株具有降低的毒性。巨噬细胞中的存活性降低这里介绍的msbB-沙门氏菌的另一个特征是，与野生型细菌的存活性相比，在巨噬细胞中的存活性降低。野生型沙门氏菌(例如ATCC14028)以它们能在巨噬细胞中存活而著称(Baumler，etal．，1994，Infect．Immun．621623-1630；BuchmeierandHeffron1989，Infect．Immun．571-7；BuchmeierandHeffron1990，Science248730-732；Buchmeieretal．，1993，Mol．Microbiol．7933-936；Fieldsetal．，1986，Proc．Natl．Acad．Sci．USA835189-93；Fieldsetal．，1989，Science2431059-62；Fiereretal．，1993，Infect．Immun．615231-5236；Lindgrenetal．，1996，Proc．Natl．Acad．Sci．USA3197-4201；Milleretal．，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA865054-5058；Sizemoreetal．，1997，Infect．Immun．65309-312)。巨噬细胞中生存时间的比较可以使用一种体外细胞培养试验来进行。相对于时间的较低数量的c．f．u．．表明在巨噬细胞中的存活性降低。说明性的实施例见下文章节8。如同那里所显示的，使用庆大霉素为基础的内在化试验和骨髓来源的鼠巨噬细胞或小鼠巨噬细胞系J774，确定了WT14028和msbB-克隆YS8211的存活性比较。在本发明的一个实施方案中，产生的存活率是野生型菌株的约50％至约30％，优选为约30％至约10％，更优选为约10％至1％。敏感性增加这里介绍的msbB-沙门氏菌的一个实施方案的另一个特征是，肿瘤靶向细菌对特殊化学试剂的敏感性增加，这对体内给药后用于协助细菌的去除非常有优势。细菌对广泛的抗生素种类敏感。但是，我们惊奇地发现，本发明所包括的某些沙门氏菌msbB-突变体对通常不被认为是抗菌试剂的特定化合物敏感。具体地说，特定的msbB-沙门氏菌突变体比WT14028对螯合剂更敏感。以前对msbB-大肠杆菌的介绍并没有提出对这样的螯合剂的敏感性提高。相反，这样的报告包括对去污剂如脱氧胆酸的抗性增加(KarowandGeorgopoulos1992J．Bacteriol．174702-710)。为确定对化学试剂的敏感性，正常野生型细菌和msbB-细菌在存在或不存在螯合剂如EDTA、EGTA或柠檬酸钠的情况下培养，并对其生长进行比较。生长比较用光密度的函数表示，即msbB-菌株在存在一种试剂时的光密度比该菌在没有试剂时生长的光密度低，就表明其敏感性。而且，在存在一种试剂时，msbB-菌株生长的光密度与msbB+在存在试剂时生长的光密度相比较低，就说明是msbB突变导致敏感性。一个说明性的实施例见下文章节7．7。在本发明的一个实施方案中，在约0．25mMEDTA至约0．5mMEDTA时msbB-沙门氏菌的生长发生90％的抑制(与野生型沙门氏菌的生长比较)，优选在约0．25mMEDTA至约0．5mMEDTA时发生99％的抑制，更优选在约0．25mMEDTA至约0．5mMEDTA时发生大于99％的抑制。在相似浓度的EGTA时也观察到了相似范围的生长抑制。msbB突变体的衍生物在无盐Luria肉汤(LB)中生长时，本发明的msbB-突变体是稳定的，即产生较少的衍生物(见下文的定义)。msbB-突变体在修改的LB(每升含10g蛋白胨、5g酵母抽提物、2ml1NCaCl2、及2ml1NMgS04，用1NNaOH调至pH7)中连续培养时也维持稳定的突变体。相反，在普通LB中生长时，msbB-突变体提高衍生物的产生。用于此处，“衍生物”的意思是msbB-突变体的自发性变异体，其特征是与原来的msbB-突变体相比，毒性、肿瘤抑制活性和／或对螯合剂的敏感性的水平不同。与原来的msbB-突变体相比，衍生物的毒性、肿瘤抑制活性和对螯合剂的敏感性的水平可能更高、相同或较低。msbB-菌株的衍生物在未修改的LB上比原来的msbB-菌株生长更快。此外，衍生物可通过其在MacConkey琼脂(一种含有胆盐的琼脂)上的生长能力和通过它们对螯合剂如EGTA和EDTA的抗性来识别。衍生物可按本领域的技术人员熟知的方法在-70℃冷冻保藏或冻干稳定保藏(Cryzetal．，1990，《新生代疫苗》M．M．Levine(ed．)，MarcelDekker，NewYorkpp．921-932；Adams，1996，《分子医学方法疫苗规程》，Robinsonetal．(eds)，hUMANAPress，NewJersey，pp．167-185；Griffiths，Id．pp．269-288．)。毒性通过评估造成一半动物死亡的给药剂量(LD50)来确定。衍生物的LD50的比较可用来评价其相对毒性。与其msbB-亲本相比，一种自发衍生物的LD50降低，就说明其毒性增加。在一个说明性的实施例中，生长较快的衍生物可显示与其相应的原始突变菌株相同水平的毒性、更高水平的毒性或较低水平的毒性(见章节9，表Ⅲ)。在另一个实施例中，一种衍生物诱导TNFα的能力与原始突变菌株相同(见章节7．3，图7)。在一个说明性的实施例中，衍生物可比其相应的原始突变菌株抑制肿瘤生长的能力高或低(见章节7．6，图11)。章节7．6中证明，原来的msbB-突变体---YS8211能明显抑制肿瘤生长，而该克隆的一个衍生物---YS8212具有较低的肿瘤生长抑制活性。相反，与亲本msbB-克隆YS7216相比，衍生物YS1629显示提高的肿瘤生长抑制活性。如果一种衍生物比其亲本突变体具有更高的毒性，但与野生型相比，诱导较低水平的TNFα，即诱导水平为野生型诱导的约5％至40％，它就可进一步被修饰来含有一种或多种突变成为营养缺陷型。在一个说明性的实施例中，YS1170衍生物被突变来使之成为一种或多种芳香族氨基酸的营养缺陷型如aroA，这样就能减少毒性，并且根据本发明将更加有用。在另一个说明性的实施例中，purⅠ基因(参与嘌呤生物合成)的遗传修饰产生了比亲本菌株毒性低的沙门氏菌株(见章节7和8)。在本发明的方法中使用一种衍生物之前，应对衍生物进行评价，确定其毒性、诱导TNFα的能力、抑制肿瘤生长的能力和对螯合剂的敏感性。6．2将带有被破坏的msbB的沙门氏菌用于肿瘤靶向和体内治疗实体瘤根据本发明，msbB-突变体沙门氏菌优选应用于在一种动物包括患有实体瘤癌症的病人中产生肿瘤生长抑制应答或减小肿瘤体积的方法。为进行此类应用，msbB-突变体沙门氏菌优选具有肿瘤靶向能力或优选针对肿瘤细胞／组织而不是正常细胞／组织。此外，msbB-突变体沙门氏菌优选具有抑制或减少肿瘤生长的能力，和／或具有传递一种能抑制或减少肿瘤生长的基因或基因产物的能力。肿瘤靶向能力可用多种本领域的技术人员熟知的方法进行评价，包括但不限于癌症动物模型。例如，使用B16F10黑素瘤皮下动物模型，对带有一种msbB-修饰的沙门氏菌进行了分析，以确定它们是否具有肿瘤靶向能力。肿瘤对肝脏的阳性比例表明，遗传修饰的沙门氏菌具有肿瘤靶向能力。一个说明性的实施例见章节7．5。使用多种标准的体内模型中的任何一种，例如B16F10黑素瘤皮下动物模型，可对带有msbB-修饰的沙门氏菌进行分析，以确定它们是否具有抗肿瘤活性。在一个说明性而不是限制性的实施例中，肿瘤被移植到小鼠的体侧，并生长至第8天，然后用细菌菌株经腹膜内进行注射。监测肿瘤体积随时间的变化。如果肿瘤在细菌携带组中比在未处理的肿瘤携带动物中小，就确定抗肿瘤活性存在。一个说明性的实施例见下文章节7．6。用于体内治疗的本发明的沙门氏菌进行了遗传修饰，使之在对一种宿主给药时，细菌对宿主具有较低毒性，并且容易从宿主系统中清除。这种沙门氏菌是超感染的、减毒的、和对一种肿瘤靶细胞具有特异性。在一个更优选的实施方案中，这种沙门氏菌可对具有抗生素样活性的螯合剂具有敏感性。此外，用于本发明的方法的沙门氏菌能编码“自杀基因”，例如药物前体转化酶或其他基因，这些基因由沙门氏菌在靶肿瘤中或附近表达和分泌。Pawelek等的WO96／40238在34-45页的表2中提供了一个药物前体转化酶的说明性的名单，这些酶可由沙门氏菌msbB-突变体分泌或表达来用于本发明的方法。表2和35-43页在此引入作为参考。这种基因可处于组成型、诱导型或细胞种类特异型启动子的控制之下。其他对本发明的方法中有用的突变沙门氏菌有用的启动子等，见Pawelek等的35-43页，该文在此引入作为参考。在一个优选的实施方案中，一种自杀基因仅在沙门氏菌已经侵入靶肿瘤细胞的胞质后才被表达和分泌，由于自杀基因在肿瘤位置表达，因而使产生的效应局限。在一个优选的实施方案中，给予宿主的沙门氏菌能表达HSVTK基因。当同时进行TK基因的表达和将9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤给予宿主时，9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤在微生物的周质中磷酸化，微生物的周质对核苷酸三磷酸来说可以自由地通过。磷酸化的9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤是一种有毒的错误DNA前体，它易于从微生物的周质中穿过，并进入宿主的细胞质和核，在那里它整合进宿主细胞DNA，因而导致宿主细胞的死亡。本发明的抑制一种实体瘤生长或减小其体积的方法包括，给予一个患有一种实体瘤的病人有效剂量的一种分离的突变沙门氏菌，该菌含有一个遗传修饰的msbB基因，所说的突变体在体内给药时能靶向实体瘤。该msbB-突变沙门氏菌还可表达一种如上面介绍的自杀基因。此外，在一个实施方案中，分析了分离的沙门氏菌对螯合剂的敏感性，以确保在成功治疗后或如果病人由于给予该分离沙门氏菌而产生并发症时，容易从病人的机体中清除该沙门氏菌。这样，如果使用的沙门氏菌对一种螯合剂敏感，在抗肿瘤效果达到后，就可给予约0．25mM至1．0mM的螯合剂如EGTA、EDTA或柠檬酸钠来帮助清除沙门氏菌。在对一个患者进行给药时，例如对一种动物进行兽医方面的应用或对人进行临床方面的应用时，沙门氏菌突变体可单独使用，或与任何生理载剂如水、一种含水溶液、常规盐水或其他生理上可接受的赋形剂一起组合使用。在通常情况下，剂量范围为约1．0c．f．u．／kg至约1×1010c．f．u．／kg；可选用的范围有约1．0c．f．u．／kg至约1×108c．f．u．／kg；约1×102c．f．u．／kg至约1×108c．f．u．／kg；约1×104c．f．u．／kg至约1x108c．f．u．／kg。本发明的沙门氏菌突变体可通过多种途径进行给药，包括但不限于口、局部、注射(包括但不限于经静脉、腹膜、皮下、肌肉、肿瘤内即直接注射进肿瘤)等。下面的实施例系列是说明性的，而不是为了限制本发明的范围。7．实施例通过对沙门氏菌msbB基因的破坏，引起毒性丧失、TNFα刺激减少、以及对螯合剂的敏感性增加7．1沙门氏菌msbB基因的分离及组成首先构建一个沙门氏菌的基因组DNA文库。将野生型鼠伤寒沙门氏菌(ATCC菌株14028)培养过夜，按Sambrook等的方法(MolecularCloningALaboratoryManual2nd．，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，1989)提取基因组DNA。使用Sau3A的时间限制酶切，制备范围为2至10kb的限制性内切酶消化片段，并用琼脂糖凝胶电泳进行选择。将这些片段连接进pBluescriptSK-，并转化进大肠杆菌DH5α。对克隆进行随机分析显示，DNA插入≥87％，平均大小为5．1kb。文库由1．4×104独立克隆组成。为减少大肠杆菌来源的msbB探针与大肠杆菌中100％同源的染色体基因杂交，按下述方法从培养皿中收集整个文库使用磷酸缓冲盐溶液洗涤，并用一个玻棒取出克隆，对所获得的细菌群体进行大量质粒制备，产生一个扩增的沙门氏菌文库质粒混合物。然后将此质粒混合物转化进沙门氏菌LT2YS5010，这样就可消除大肠杆菌背景。一种针对msbB同源物的探针用一个大肠杆菌msbB基因的克隆来制备(KarowandGeorgopoulos1992J．Bacteriol．174702-710)用BglⅡ／HincⅡ消化大肠杆菌，并分离对应于一个编码序列部分的600bp片段。该片段用α32P-CTP标记，并在低严谨条件下用作探针与沙门氏菌文库杂交，这种低严紧条件为6XSSC、0．1％SDS、2XDenhardts、0．5％脱脂奶粉、55℃过夜。将显示强杂交性的克隆纯化，提取质粒，并进行限制酶切和在用于菌落杂交的相同条件下进行原位凝胶杂交(EhteshamandHasnain1991BioTechniques11718-721)。进一步的限制酶消化显示了一个能与探针强杂交的1．5kb片段的DNA，使用荧光染料终止热循环测序仪在耶鲁大学BoyerCenter对该DNA片段进行了测序。序列分析显示，该1．5kb片段含有一个msbB同源物，这个同源片段明显缺少对应的大肠杆菌基因的起始甲硫氨酸。使用EcoRⅠ／XbaⅠ限制酶切并与文库再次杂交，制备了一个含有该克隆的5’区域的探针。沙门氏菌msbB基因的全部核苷酸序列(SEQIDNO1)和推导的编码蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO2)见图1。该可能的沙门氏菌msbB与大肠杆菌msbB的DNA同源性为75％。蛋白同源性是98％，这证明该克隆沙门氏菌基因是一种真正的msbB。7．2沙门氏菌msbB的遗传改变使用克隆的沙门氏菌msbB基因构建了一个敲除结构物。用SphⅠ和MluⅠ酶切该克隆基因，从而切除大约一半的msbB编码序列，将用AatⅡ和AvaⅠ从pBR322中切下的四环素抗性基因，在用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段平末端化后，插入其中(图2A-2C)。敲除破坏用同源重组方法来完成(Russelletal．，1989，J．Bacteriol．1712609)；用SacⅠ和KpnⅠ将该结构物线性化，凝胶纯化，并用电转化转染至沙门氏菌LT2YS501。来自转化过程的细菌首先在四环素平板上进行选择，接着用氨苄青霉素抗性来检查是否有携带质粒的非染色体整合的污染物，并用标准的质粒小量制备方法检查是否有质粒存在(Titus，D．E．ed．PromegaProtocolsandApplicationsGuide，PromegaCorp，1991)。对具有四环素抗性但没有质粒的细菌克隆随后进行以PCR为基础的分析，分析它们的msbB基因的结构。PCR所用的引物能产生一段包括四环素基因插入的片段，其中上游引物为GTTGACTGGGAAGGTCTGGAG(SEQIDNO3)，它对应于碱基586-606，下游引物为CTGACCGCGCTCTATCGCGG(SEQIDNO4)，它对应于碱基1465-1485。野生型沙门氏菌msbB+产生一种约900碱基对的产物，而具有四环素插入的破坏的基因产生大约1850碱基对的产物。获得了数个只产生较大PCR产物的克隆，这说明msbB基因的破坏已经发生。Southern印迹分析被用来证明沙门氏菌msbB的染色体拷贝遭到破坏。将以质粒为基础的敲除结构物(K0)与由野生型和可能的破坏msbB克隆YS82、YS86、YS8211和YS861制备的基因组DNA进行比较。将DNA用AseⅠ／BamHⅠ双酶切，用琼脂糖凝胶电泳在0．9％或1．2％的琼脂糖上分离。YS821和YS861的结果示于图3A-3C。相似的凝胶按三个独立的标准进行比较3A)以32P标记的四环素基因片段为探针时，四环素基因的存在；3B)以来自克隆的msbB的32P标记的AseⅠ／BamHⅠ片段为探针时的限制酶切片段的长度；3C)为破坏msbB基因而去除的msbBmluⅠ片段及插入的四环素基因的存在或无(图3A-3C)。因为为了破坏msbB基因和插入四环素基因，mluⅠ片段已被去除，因此我们预计该探针将与野生型杂交(图3C，泳道2WT)，但不与敲除结构物(泳道1K0)或克隆(泳道3和4，YS8211和YS821)杂交，从而证明msbB基因的遗传改变。每个被检测的克隆都显示所有预期的msbB基因被删除(敲除)的标准。这些数据进一步证明，msbB以一个单拷贝存在于野生型沙门氏菌中，因为在用一个标记的来自克隆的DNA的寡核苷酸为探针时，没有观察到其他杂交带。在证明了msbB突变之后，制备了含有msbB-突变的其他菌株。使用的沙门氏菌株包括WT14028和YS72(来自WT14028的pur-xyl-高侵袭性突变体；Pawelek等，WO96／40238)。P22转导被用来以YS82为供体产生YS8211(msbBtet)和以YS86为供体产生YS861和YS862(msbB1tet)；它们均以WT14028为受体。通过转导以YS82为供体制备了YS7216(来自YS72的msbB1tet)。本发明包括数种衍生物，包括但不限于YS8211(YS8212、YS1170)、YS862(YS8644、YS8658)和YS7216(YS1601、YS1604、YS1629)的衍生物。在一个优选实施方案中，自发性的衍生物在Luria琼脂上比WT14028或由转导产生的msbB-克隆生长得快一些。msbB+菌株在LB肉汤或含有1．5％琼脂的LB平板上在37℃培养。msbB-菌株在每升含有10g蛋白胨、5g酵母抽提物、2ml1NCaCl2和2ml1NMgSO4用1NNaOH调至pH7的修改的LB中培养。为转导msbBltet，使用了含有4mg／L四环素的无NaCl的LB。液体培养物以225rpm振荡培养。为进行肿瘤靶向试验，细胞在LB中按1∶100稀释，生长至OD600=0．8至1．0，在磷酸缓冲盐(PBS)中洗涤，并重悬于PBS。7．2．1一种通过蔗糖预选择来选择msbB遗传改变的改进方法我们发现了一种通过蔗糖预选择来选择msbB遗传改变的改进方法。这种预选择方法以选择保留了sacB基因的克隆为基础。sacB基因负责将蔗糖转化为一种有毒的化学物质---果聚糖，而果聚糖对宿主细胞具有致死作用，因此可以用来选择重组子。只有那些sacB基因被删除的菌株才能在含有蔗糖的培养基中存活，并因此含有蔗糖抗性特性sucr。如下文所述，预选择保留了sacB基因的克隆，能省去常规蔗糖选择中稀释和比较蔗糖(+)和蔗糖(-)的必要。蔗糖酶系统的常规选择过程使用大肠杆菌SM10λpir作为一种供体，该菌携带了一种含有msbB(△)bla和sacB基因的质粒。编码β-内酰胺酶的bla基因提供对氨苄青霉素的抗性。在常规选择过程中，使用常规杂交技术将供体菌株与一种沙门氏菌株杂交，以将含有msbB(△)blasacB的质粒导入后者。因为沙门氏菌株含有第二个抗生素抗性标记(如链霉素抗性)，因此接着可以用氨苄青霉素和链霉素对重组沙门氏菌克隆进行双抗性选择。为检测单个克隆的消除，将每个克隆的稀释物涂布于缺少蔗糖的LB或含有5％蔗糖的LB。只有那些sacB基因被删除或改变的菌株才能在蔗糖上存活。蔗糖(+)或蔗糖(-)平板上的克隆数目的比较，表明了消除的细菌细胞的比例。接着进一步检测蔗糖抗性克隆对氨苄青霉素和四环素的敏感性。Tets和amps表明在部分msbB基因区域交换时sacB和bla基因被切除。然后用PCR证明msbB同种型在tetsamps克隆中存在。用于蔗糖酶系统的预选择方法常规蔗糖酶过程中的一种改变允许通过预选择保留了sacB基因的克隆来筛选更多数量的克隆。这种预选择省去了在大数量的克隆中检测和比较蔗糖(+)和蔗糖(-)的必要。在上面介绍的结合程序后，将克隆(此阶段不纯)直接铺于含有5％蔗糖的LB平板，并在30℃培养。所获得的不纯的克隆继续生长，而蔗糖上的存活者增加。从蔗糖抗性菌落中寻找那些显示一种“模糊”边缘的形态变异菌落，然后将它们稀释并铺于蔗糖(+)或蔗糖(-)平板。然后按上面的介绍检测菌落对四环素和氨苄青霉素的敏感性，并用PCR证实msbB同种型。这种改进方法被用来制备菌株，用于msbB(△)blasacB染色体元件的P22转导。然后这些菌株被用来制备YS1456和YS1646菌株，它们代表了本发明的新型msbB突变体的优选实施方案(见图15和16)。7．3沙门氏菌msbB的破坏减少TNFα的诱导7．3．1小鼠中的TNFα诱导WT14028和msbB-克隆YS8211首先在LB培养基中在37℃在225rpm振荡培养至饱和。然后将这些细菌菌株按1∶100稀释，转移至新鲜LB中，在37℃在225rpm振荡培养至OD600=1．0。将细菌在磷酸缓冲盐中稀释，并用1．0×108c．f．u．(约5×109／kg)注射进Balb／c小鼠的尾静脉中(n=4／菌株)，以PBS作为阴性对照。1．5小时后，用心脏穿刺收集三个重复的血清样品，离心去除细胞内含物，使用BiosourceInternationalCytoscreenELISA平板分析TNFα，用MolecularDevicesEmax微量板读数仪读数。结果示于图4，并以野生型沙门氏菌诱导的TNFα水平的百分比的形式表示。如图4中所证明的，YS8211诱导的TNFα明显少于WT14028。因此，如图4所示，msbB-菌株诱导的TNFα为野生型msbB+菌株诱导水平的约33％(即低3倍)。7．3．2在猪中的TNFα诱导一种msbB-沙门氏菌株---YS8212和WT14028首先在LB培养基中在37℃在225rpm振荡培养至饱和。然后将这些细菌菌株按1∶1000稀释，转移至新鲜LB中，在37℃在225rpm振荡培养至OD600=0．8。细菌用磷酸缓冲盐洗涤，并用1．0×109c．f．u．(约1×108／kg)注射进Sinclair猪的耳静脉中(n=6／菌株)。1．5和6．0小时后，收集血清，离心去除细胞内含物，冷冻以备后面的分析。使用GenzymePredictaELISA平板分析TNFα，使用Gilson分光光度计读数。结果示于图5，以每毫升血清的TNFα皮克数表示。如图5中所证明的，在第90分钟，msbB-菌株诱导的TNFα水平明显低于沙门氏菌WT14028。7．3．3沙门氏菌LPS在猪中诱导的呼吸作用来自沙门氏菌WT14028和msbB-克隆---YS8212的脂多糖(LPS)按Galanos等介绍的程序制备(1969，Eur．J．Biochem．9245-249)。简而言之，LPS从已经生长到OD600为1．0的细菌中提取。离心沉淀细菌，用蒸馏水洗涤两次，并在-20℃冷冻。在70℃在振荡水浴锅中使用18．3mlH2O∶15ml酚的混合物抽提来纯化LPS。将混合物在冰上冷却，在20，000xg离心15分钟，取出水相。加入NaCl至0．05M和2倍体积的乙醇，并在冰上温育，然后用2000xg离心10分钟，使LPS从水相中沉淀。将沉淀在0．05MNaCl中重新溶解后，再次沉淀，并将沉淀冷冻干燥。将LPS溶于无菌蒸馏水中，按5ug／kg或500ug／kgLPS注射进用异氟烷麻醉的Sinclair猪的耳静脉中。1．5和6．0小时后，测定和记录呼吸速率。结果示于图6，并以在0时间时的呼吸的百分比来表示。如图6所证明的，与接受来自msbB-菌株的LPS的猪相比，接受野生型LPS的猪的呼吸明显要高。因此，沙门氏菌中msbB基因的破坏在类脂A中产生了修饰，这导致其提高呼吸的能力降低。7．3．4在人单核细胞中的TNFα诱导人单核细胞用离心通过Isolymph(Pharmacia)的方法从外周血中制备，并使之粘附于含有RPMI1640的24孔板中。沙门氏菌WT14028和几种msbB-14028菌株YS8211、YS8212、YS8658和YS1170首先在LB培养基中在37℃在225rpm振荡培养至饱和。然后将这些细菌菌株按1∶100稀释，转移至新鲜LB中，在37℃在225rpm振荡培养至OD600=0．8。将细菌加入细胞培养孔中，2，0小时后收集培养物，离心去除细胞内容物，。使用GenzymePredictaELISA平板分析TNFα，使用Gilson分光光度计读数。结果示于图7，并以每毫升血清的TNFα皮克数表示。如图7中所证明的，msbB-菌株诱导的TNFα明显少于野生型菌株。7．3．5沙门氏菌msbB-LPS在人单核细胞中的TNFα的诱导人单核细胞用离心通过Isolymph(Pharmacia)的方法从外周血中制备，并使之粘附于含有RPMI1640的24孔板中。野生型和多种msbB-突变的沙门氏菌(即YS8211、YS8212、YS8658和YS1170)的脂多糖(LPS)按Galanos等介绍的程序制备(1969，Eur．J．Biochem．9245-249)(简要介绍见章节7．3．3)。将LPS溶于蒸馏水，将数量范围为0．001至100ng／ml的LPS加入细胞培养孔中。15小时后收集培养基，离心去除细胞内容物，使用GenzymePredictaELISA平板分析TNFα，使用Gilson分光光度计读数。结果示于图8，并以每毫升TNFα的皮克数表示。如图8中所证明的，纯化自msbB-菌株的LPS诱导的TNFα明显少于来自野生型菌株的LPS。7．4沙门氏菌msbB的破坏降低毒性7．4．1在小鼠中野生型沙门氏菌14028及其msbB-沙门氏菌克隆YS862在无氯化钠的LB培养基中在37℃在250rpm振荡培养至OD600为0．8。按1∶10的比例将细菌在磷酸缓冲盐(PBS)中稀释，并用2×107c．f．u．皮下注射进携带B16F10黑素瘤的C57BL小鼠中，每天或间隔2至4天检查存活。结果示于图9A，并以存活百分比的形式表示。如图9A中所示，WT14028在4天内杀死所有的小鼠，而msbB突变株经过20天后有90％小鼠存活，这证明msbB-突变株的毒性明显降低。7．4．2在猪中野生型沙门氏菌14028及其msbB-沙门氏菌克隆YS8212在无氯化钠的LB培养基中在37℃在250rpm振荡培养至OD600为0．8。细菌用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤，并用1．0×109c．f．u．注射进Sinclair猪的耳静脉中(n=4／菌株)，每天或间隔2至4天检查存活。结果示于图9B，并以存活百分比的形式表示。如图9B中所示，WT14028在3天内杀死所有的猪，而msbB-突变株经过20天后有100％小鼠存活，这证明毒性明显降低。7．5msbB-克隆的肿瘤靶向性使用B16F10黑素瘤皮下动物模型，对带有msbB-修饰的沙门氏菌WTl4028进行分析，以确定它们是否具有肿瘤靶向能力。msbB-克隆YS8211在无氯化钠的LB培养基中在37℃在250rpm振荡培养至OD600为0．8。按每份2．0×106c．f．u．经静脉注射进C57BL／6小鼠中，这些小鼠在细菌感染前16天预先用2×105B16黑素瘤细胞进行了移植。在细菌感染后2天和5天，处死小鼠，通过匀浆和系列稀释涂平板来分析肿瘤和肝脏中细菌的存在。结果示于图10，并以c．f．u．细菌／克组织的方式表示。如图10中所证明的，在第2天发现肿瘤对肝脏的一个阳性比例(700∶1)，在第5天提高到2000∶1的阳性比例。因此，msbB-突变株保持了靶向实体癌瘤的能力。7．6带有破坏的msbB的沙门氏菌用于体内抗肿瘤活性鼠伤寒沙门氏菌msbB-克隆YS8211、YS8212、YS7216和YS1629以及WT14028(对照)在无氯化钠的LB培养基中在37℃在250rpm振荡培养至OD600为0．8。按每份2．0×106c．f．u．腹膜内注射进C57BL／6小鼠中，这些小鼠在细菌感染前8天预先用2×105B16黑素瘤细胞进行了移植。检测不同时间的肿瘤体积。结果示于图11。两种菌株---YS8211和YS1629显示明显的肿瘤萎缩，即肿瘤生长抑制。7．7对螯合剂的敏感性提高为分析细菌菌株对螯合剂的敏感性，将带有或没有msbB突变的细菌在存在或没有1mMEDTA或10mM柠檬酸钠的无氯化钠LuriaBroth(LB)中培养。每种菌株的过夜培养物按1∶100在新鲜培养基中稀释，并在37℃在250rpm振荡培养。对生长的影响用分光光度计在OD600读数来确定。WT14028和msbB-克隆YS8211在存在或没有1mMEDTA时培养(图12A)。EDTA不抑制WT14028的生长。相反，msbB-克隆在EDTA存在3小时后，生长近似于完全停止。WT14028和msbB-克隆YS862在存在或没有10mM柠檬酸钠时培养(图12B)。与msbB-相比，msbB+WT14028菌株显示几乎不被柠檬酸钠抑制，msbB-在存在柠檬酸钠3小时后显示生长几乎完全停止。因此，msbB-沙门氏菌突变株显示对螯合剂敏感，这可促进细菌的清除，是一种类似抗生素效果的特征。预期这种特征对使用msbB-沙门氏菌突变株进行体内治疗是有利的。为进一步分析沙门氏菌菌株对螯合剂的敏感性，将超侵袭性pur菌株YS72、其msbB-菌株YS7216以及YS7216的一个衍生物---YS1629在存在浓度不断提高的EDTA时培养。将YS72、其msbB-菌株YS7216和其快速生长衍生物YS1629的新鲜培养物在含有0、0．25、0．5、1．0或2．0mMEDTA的新鲜无盐LB培养基中按1∶100稀释，37℃在225rpm振荡培养4小时，通过在LB平板上系列稀释涂布确定c．f．u．(表Ⅰ)。msbB-菌株YS7216在EDTA浓度大于0．25mM时获得大于99％的抑制，其衍生物YS1629在浓度0．50mM时获得大于90％的抑制，在浓度2．0mM时获得大于99％的抑制。相反，虽然YS72克隆对EDTA显示一些敏感性，但即使在2．0mM时也没有90％水平的抑制。表Ⅰ<tablesid="table1"num="001"><table>菌株无EDTA的c．f．u．+EDTA(％抑制)c．f．u．[1．0mM][2．0mM]YS723．0×1092．4×109{20％}1．5×109{50％}7．3×108{75％}4．8×108{84％}YS72166．3×1092．1×106{99．6％}1．1×106{99．8％}3．2x106{99．4％}4．3×106(99．3％}YS16291．3×1096．0×108{54％}1．0×108{92％}2．9×107{97％}7．5×106{99．4％}</table></tables>7．8细菌在巨噬细胞中的存活为确定msbB-沙门氏菌对巨噬细胞的敏感性，使用了两种类型的巨噬细胞(A)获自C57BL／6小鼠的股骨和胫骨的骨髓来源的巨噬细胞，这种细胞在加入来自LADMAC细胞系的培养上清时能够繁殖，因为LADMAC细胞能分泌巨噬细胞集落刺激因子(Sklaretal．，1985．J．Cell．Physiol．125403-412)；和(B)获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的J774细胞(一种鼠巨噬细胞系)。所使用的沙门氏菌株是WT14028及其msbB-衍生物YS8211和YS1170。细菌培养至对数生长后期OD600=0．8，在一个24孔培养皿中，用1×106细菌感染哺乳动物细胞汇合层30分钟，然后用培养基洗涤并加入50ug／ml庆大霉素，以除去细胞外细菌(Elsinghorst，1994，MethodsEnzymol．236405-420)。用0．01％脱氧胆酸取出细胞层，并系列稀释涂平板，记录细菌数目，并以最初时间的c．f．u．的百分数形式表示。结果示于表13，并以相对于时间的c．f．u．百分数形式表示。msbB-菌株显示在巨噬细胞中的存活明显较低。7．9msbB衍生物的LD50msbB-菌株的自发衍生物YS8211和YS7216按照生长速度提高的特征从没有修改的LB培养基上的体外培养物中选择。将这些细菌培养至OD600为0．8，用c．f．u范围为1×102至1×108的细菌注射进C57BL／6小鼠的尾静脉中。在第3天测定急性致死活性，按Welkos和O'Brien介绍的方法(MethodsinEnzymology23529-39，1994)确定LD50。结果示于表Ⅱ。因此，虽然所有的msbB-菌株诱导TNFα的能力都降低(见章节7．3．5)，但结果证明，菌株YS1170明显比其他msbB-菌株的毒性低，因此不是所有的msbB-菌株都能用来同时提供TNFα诱导减少和毒性降低。表Ⅱ菌株LD50WT140281×103YS82114×106YS82123．9×107YS16291×107YS11701×1078．msbB突变组合一种生物合成途径突变为了评价营养缺陷型突变的兼容性(这可通过测量靶向肿瘤和在肿瘤中复制能力的保留来进行)，制备msbB突变与营养缺陷型突变的组合。msbB+菌株在LB肉汤或含有1．5％琼脂的LB平板上在37℃培养。msbB-菌株在每升含10g蛋白胨、5g酵母抽提物、2ml1NCaCl2、及2ml1NMgSO4、用1NNaOH调至pH7的修改的LB中培养。为进行msbB1tet转导，使用无NaCl的LB，并加入4mg／l的四环素。液体培养物用225rpm振荡培养。将msbBltet转导进营养缺陷型菌株，以产生YS1604(msbB-、pur-、超侵袭性)、YS7232(msbB-、purI-、超侵袭性)、YS7244(msbB-、purI-、aroA-、超侵袭性)、YS1482(msbB-、purI-、purA-)。为进行肿瘤靶向实验，细胞在LB中1∶100稀释，培养至OD600=0．8至1．0，在磷酸缓冲盐(PBS)中洗涤，重悬于PBS，并用2×106注射进C57BL／6小鼠的尾静脉中。在第7天，切下肿瘤，进行称量，并匀浆化，将其系列稀释后涂于如上介绍的修改的LB平板，确定c．f．u．。结果示于表Ⅲ，并以c．f．u．／克肿瘤组织的形式表示。一些菌株---YS8211、YS1604和YS7232在肿瘤中显示高水平的c．f．u．，而YS7244和YS1482则低约500至5000倍。表Ⅲ<tablesid="table2"num="002"><table>菌株遗传标记c．f．u．／克肿瘤组织YS8211msbB-3×109YS1604msbB-、pur-、超侵袭性9×109YS7232msbB-、purⅠ-、超侵袭性9×109YS7244msbB-、purⅠ-、aroA-、超侵袭性5×105YS1482msbB、purⅠ-、purA-6×106</table></tables>8．1在msbB和purⅠ中含有删除的YS1456菌株的制备从野生型鼠伤寒沙门氏菌中制备沙门氏菌株YS1456的过程概述于图15。用能提供四环素抗性的purⅠ1757Tn10转导野生型鼠伤寒沙门氏菌，产生了菌株YS1451。然后对YS1451菌株进行Bochner选择，以获得四环素敏感的菌株，并导入tets基因和导入一个purⅠ删除(Bochneretal．，1980，J．Bacteriol．143926-933)，从而产生菌株YS1452。菌株1452为tets和purⅠ-。然后以菌株YS8211(msbBtet)为供体，通过P22用msbBltet转导菌株YS1452。所获得的菌株YS1453开始时对10mM乙二醇双(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)敏感，接着自发转变为一种EGTA抗性表型。一种这样的转变菌株---表示为YS1454，通过将YS1453在EGTA(在Luria琼脂中2mM)上铺板进行选择。然后用msbB2(△)blasacB染色体元件转导菌株YS1454，以选择氨苄青霉素抗性。这个转导过程引入了表示为msbB2(△)的第二个版本的破坏msbB基因以及bla和sacB基因。bla基因负责β-内酰胺酶的转录，β-内酰胺酶能代谢氨苄青霉素，并被用于选择氨苄青霉素抗性的转导子。sacB基因负责将蔗糖转化为一种有毒的化合物---果聚糖，而果聚糖对宿主细胞具有致死作用，它可随后用于选择失去sacB或在sacB中有突变的重组子(见章节7．2．1的使用蔗糖的改进的预选择方法)。bla和sacB基因的存在允许对ampr和sucs菌株(表示为菌株YS1455)进行选择，后者同时含有msbBltet和msbB2(△)基因。然后将菌株YS1455铺于LuriaBertani(LB)蔗糖，以选择sucrampstets衍生物，来去除msbBltet，并保留抗生素活性。该衍生物表示为YS1456。总的来说，YS1456在purⅠ和msbB中带有删除突变。它还是tetsamps和EGTAr。8．2在msbB和purⅠ中含有删除的YS1646菌株的制备从野生型鼠伤寒沙门氏菌(野生型菌株ATCC14028)中制备沙门氏菌株YS1456的过程概述于图15。野生型鼠伤寒沙门氏菌用亚硝基胍和紫外线(UV)诱变，并选择在黑素瘤细胞中有超侵袭性的菌株。抗性菌株表示为YS72，它被证实具有肿瘤超侵袭性、pur-和xyl-特性(Paweleketal．，1997，CancerRes574537-4544)。为了用一个purⅠ删除在菌株YS72中置换染色体purⅠ基因，用purⅠ1757Tn10基因转导菌株YS72，purⅠ1757Tn10基因能提供四环素抗性。purⅠ1757Tn10基因的供体是沙门氏菌株TT11(purⅠ1757Tn10)。原始供体菌株获自沙门氏菌遗传保藏中心(Dept．ofBiologicalScience，Univ．Calgary，Calgary，Alberta，CanadaT2N1N4)。转导用噬菌体P22(突变体HT105／1int-201)进行。在四环素上选择后获得了转导子，表示为YS1641。然后对YS1641菌株进行Bochner选择，以去除四环素基因，并引入一个purⅠ删除(Bochneretal．，1980，J．Bacteriol．143926-933)，从而产生菌株YS1642。菌株1642为tets和purⅠ-。选择的tet-删除菌株可进一步用tet基因转导进行遗传修饰(如msbB基因破坏，见下一段)。由于purⅠ(△)，因此菌株YS1642对嘌呤有严格的要求，并且所显示的转变为purⅠ+的频率低于每1010细胞中1个。然后以菌株YS8211(msbBtet)为供体，通过P22用msbB1tet转导菌株YS1642。msbB基因的DNA序列示于图1。msbB1tet中的tet基因提供对5mg／L四环素的抗性。这样获得的菌株为YS1643。菌株YS1643开始时对10mM乙二醇双(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)敏感，它可自发转变为一种EGTA抗性表型。一种这样的转变菌株---表示为YS1644，通过将YS1643在EGTA(在Luria琼脂中2mM)上铺板进行选择。然后用msbB2(△)blasacB染色体元件转导菌株YS1644。这个转导过程引入了表示为msbB2(△)的第二个版本的破坏msbB基因以及bla和sacB基因。bla基因负责β-内酰胺酶的转录，β-内酰胺酶能代谢氨苄青霉素，并被用于选择转导子。sacB基因负责将蔗糖转化为一种有毒的化合物---果聚糖，而果聚糖对宿主细胞具有致死作用，该基因可用来选择重组子。bla和sacB基因的存在允许对ampr和sucs菌株(表示为菌株YS1645)进行选择，后者同时含有msbBltet和msbB2(△)基因。将菌株YS1645铺于LuriaBertani(LB)蔗糖，以选择sucrampstets衍生物，来去除msbBtet，并保留抗生素活性(即一个带有msbBltetblasacB删除的衍生物)。该衍生物表示为YS1646。总的来说，YS1646在purⅠ和msbB中带有删除突变。它还是tets、amps和EGTAr。8．3用YS1646菌株抑制肿瘤生长静脉(Ⅳ)给予一种鼠伤寒沙门氏菌的减毒株---YS1646，可产生在肿瘤中的选择性繁殖，并伴随着肿瘤生长的抑制(见图17和表Ⅳ)。在所有情况下，使用一种阶段性的肿瘤模型，其中在肿瘤细胞接种后和YS1646给药前，使肿瘤建立。YS1646在肿瘤中繁殖的能力的一个结果是，确定了一个在有效剂量范围内的简单剂量应答关系，其中由低剂量的YS1646引起的肿瘤抑制的程度接近较高剂量产生的肿瘤抑制水平。这说明，即使在低剂量时也可以达到明显的临床效果，只要细菌能够到达肿瘤并在肿瘤中积累。低于1×102的剂量给出了不一致的结果，这可能是由于YS1646到达和在肿瘤中定居的能力与动物清除YS1646的能力之间竞争而引起的。YS1646的效果在预先移植了B16-F10黑素瘤的小鼠中进行了评价。在此研究中，一个单一Ⅳ剂量的YS1646在104、105或106c．f．u．／鼠时，与对照处理相比，能明显减小肿瘤体积，并且肿瘤大小减小的程度是剂量依赖型。用最高剂量的YS1646观察到的效果优于使用阳性对照CYTOXANTM(也称为环磷酰胺)的效果，而中等剂量的YS1646的效果与CYTOXANTM相当。应当注意，YS1646产生的效果是由一个单独的Ⅳ剂量诱导的，而CYTOXANTM诱导的效果是由多次Ⅳ剂量产生的(每周给药，共3周)。在1×104至1×106c．f．u．／鼠的给药剂量范围内，对相对于剂量的YS1646抑制肿瘤生长的能力进行了检测。每个剂量组包括10只荷瘤动物，这些动物在用细菌给药前随机分组。在第7天用细菌对小鼠进行给药，并在第10、13、17、20和24天测量肿瘤的体积。为进行比较，用CYTOXANTM(环磷酰胺)按一个剂量200mg／kg每周一次进行给药，也在第7天开始给药。在第24天每组的平均肿瘤体积示于表Ⅳ。表Ⅳ<tablesid="table3"num="003"><table>接种剂量(cfu／鼠)平均肿瘤体积(mm3)±S．D．T／C抑制百分比04728±80401041011±3750．21478105560±1760．11888106279±910．05994</table></tables>在用Wilcoxon符号秩检验分析或用双侧t检验进行分析时，在各组之间观察到的差异都被认为是明显的。如表Ⅳ所示，在YS1646剂量增加时，能观察到肿瘤抑制增强。按照DrugEvaluationBranch0ftheDivisionofCancerTreatment，NationalCancerInstitute(Bethesda，MD)(Vendett，J．M．，Preclinicaldrugevaluationrationaleandmethods，Semin．Oncol．8349-361；1981)的定义，所有的剂量都被发现有明显的肿瘤抑制活性(T／C比平均小至42％)。并且1×105cfu／鼠的剂量所给出的结果相当于或优于环磷酰胺。在YS1646剂量与肿瘤抑制之间没有观察到一个线性关系，因为YS1646具有优先在肿瘤中的能力，这导致在低剂量时比预期的能力强。经静脉注射一种鼠伤寒沙门氏菌的减毒菌株---YS1646，导致在肿瘤中的选择性繁殖，并伴随着肿瘤生长的抑制。当接种剂量在1×104至1×106cfu／鼠之间时，能够得到一个肿瘤生长抑制的剂量应答，其肿瘤生长抑制的范围是78％至94％。在两个最高接种剂量时，肿瘤生长抑制的水平相当于或优于环磷酰胺最佳处理时达到的水平。8．4毒性在剂量为1×106cfu／鼠时，YS1646没有引起致死性，这与其亲本野生型菌株ATCC14028相对，后者在1×102cfu／鼠的剂量时，导致100％的死亡。这说明YS1646的毒性比亲本野生型菌株低10，000倍。在剂量为104至106cfu／鼠时就能观察到抗肿瘤效应，而直到剂量＞106cfu／鼠时也没有观察到致死性。导致死亡的剂量比诱导抗肿瘤效应的剂量高1至100倍(见图18)。8．5致死感染后YS1646诱导死亡的抗生素抑制氨苄青霉素和环丙沙星抑制YS1646感染的能力，可通过确定抗生素阻止接种了5×106cfu(等于LD50)的C57BL／6小鼠死亡的能力来评价。按下面的处理类别进行分组1)未处理对照，2)氨苄青霉素处理，3)环丙沙星处理，以及4)环丙沙星和氨苄青霉素处理。抗生素处理在细菌给药后第3天开始，每天观察动物的表现和死亡，直至第14天。这里所示的结果证明，抗生素的使用能抑制致死性细菌感染后的死亡(见图18)。9．微生物的保藏下面的微生物已于1997年9月9日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd．，Manassas，VA20110-2209进行了保藏，并被给予了所示的保藏编号微生物ATCC编号YS8211202026YS1629202025YS1170202024下面的微生物已于1998年8月25日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd．，Manassas，VA20110-2209进行了保藏，并被给予了所示的保藏编号微生物ATCC编号YS1646202165YS1456202164这里宣布和介绍的本发明包括但不限于保藏的微生物实施方案不是用具体的实施方案来限制其范围，之所以在这里公开是因为，这些实施方案是为了说明本发明的几个方面。事实上，除了这里显示和介绍的内容，按前面的介绍对本发明进行各种修改，对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这种修改也被包含在所附的权利要求的范围内。这里引用了大量参考文献，这些引入的全部公开物均全文引入作为参考。序列表<110>VIONPHARMACEUTICALS，INC.YALEUNIVERSITY<120>减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌<130>8002-042<140>PCT／US98／<141>1998-09-09<160>4<170>PatentInVer．2．0<210>1<211>2019<212>DNA<213>沙门氏菌<220><221>CDS<222>(244)．．(1212)<400>lgatcaaccagcaagccgttaaccctctgacagcaaaattgccgcgcacggaaggtctgac60ggggtcagatcgtcgtgaatacctggcacaggtgaaagaggttctgccgcaactgcgctt120cgattaacaaatgcgctgacagagccggtacgcgatgtgtgccggcttttttgttttgtg180tgagacgcagacgtcgctacactattcacaattccttttcgcgtcagcagaccctggaaa240agcatggaaaccaaaaaaaataatagtgagtatatccctgaattcgaa288MetGluThrLysLysAsnAsnSerGluTyrIleProGluPheGlu151015aaatcctttcgctatccacagtattggggcgcctggttgggcgcggcg336LysSerPheArgTyrProGlnTyrTrpGlyAlaTrpLeuGlyAlaAla202530gcaatggcggggarcgcattaacaccggcatcattccgcgaccctttg384AlaMetAlaGlyIleAlaLeuThrProAlaSerPheArgAspProLeu354045ctggcgacgctggggcgttttgccggacggctggggaagagttctcgt432LeuAlaThrLeuGlyArgPheAlaGlyArgLeuGlyLysSerSerArg505560cgccgggcgctaattaatctgtcgttgtgctttccgcagcgtagcgaa480ArgArgAlaLeuIleAsnLeuSerLeuCysPheProGlnArgSerGlu657075gctgagcgcgaagcgattgtcgatgagatgttcgccaccgcgccacag528AlaGluArgGluAlaIleValAspGluMetPheAlaThrAlaProGln80859095gcaatggcgatgatggctgagttggcgatgcgcggtccgaaaaaaatt576AlaMetAlaMetMetAlaGluLeuAlaMetArgGlyProLysLysIle100105110caacagcgtgttgactgggaaggtctggagattarcgaggagatgcgt624GlnGlnArgValAspTrpGluGlyLeuGluIleIleGluGluMetArg115120125cgtaacgacgaaaaagtcatttttcrcgtaccgcatggctggggcgtc672ArgAsnAspGluLysValIlePheLeuValProHisGlyTrpGlyVal130135140gacattccagccatgctgatggcctctcaggggcaaaaaatggcggcg720AspIleProAlaMetLeuMetAlaSerGlnGlyGlnLysMetAlaAla145150155atgtttcataatcagggtaatccggtttttgactatatctggaacaca768MetPheHisAsnGlnGlyAsnProValPheAspTyrIleTrpAsnThr160165170175gtgcgtcggcgtttcggcggacgtttgcatgcgcgtaatgacgggatt816ValArgArgArgPheGlyGlyArgLeuHisAlaArgAsnAspGlyIle180185190aaaccctttattcagtctgttcgtcagggctactggggttactacctg864LysProPheIleGlnSerValArgGlnGlyTyrTrpGlyTyrTyrLeu195200205ccggaccaggatcacggcccggagcatagtgaattcgttgatttcttt912ProAspGlnAspHisGlyProGluHisSerGluPheValAspPhePhe210215220gcgacatacaaagcgacgctgcctgcaattggtcggctgatgaaagtg960AlaThrTyrLysAlaThrLeuProAlaIleGlyArgLeuMetLysVal225230235tgccgcgcacgcgtgataccgcttttcccggtgtataatggtaaaacg1008CysArgAlaArgValIleProLeuPheProValTyrAsnGlyLysThr240245250255catcgcctgactatccagattcgcccgccaatggacgatctgctcacg1056HisArgLeuThrIleGlnIleArgProProMetAspAspLeuLeuThr260265270gctgacgaccacactatcgccagacggatgaacgaagaggtcgaaatt1104AlaAspAspHisThrIleAlaArgArgMetAsnGluGluValGluIle275280285tttgtcggcccgcatccggaacagtacacctggatcctgaagctgctc1152PheValGlyProHisProGluGlnTyrThrTrpIleLeuLysLeuLeu290295300aaaacccgcaagccaggcgagattcagccgtataagcgtaaagatctt1200LysThrArgLysProGlyGluIleGlnProTyrLysArgLysAspIeu305310315tatcccatcaaataaataaagcctctcgtaagagaggctttatgctgacaaa1252TyrProIleLys320ccctgtactacctgatgaacaggcgtgggggagttttactcaacggtcaaaatacgcgtg1312gtattggttgaaccgacggtgctcatgacatcgccctgggtcacgataaccaggtcgccg1372gaaaccagataccctttatcgcgcagcagattaacagcttcatgtgccgcgacaacgcca1432tcagccgcgctatcaaaatgcaccggcgttactccgcgatagagcgcggtcaggttcagc1492gtgcgttcatggcgcgacatggcgaaaatcggcaggccggagctgatacgggaagtcatt1552agcgcggtacgaccggattccgtcatggtgatgatcgcggtaacgcctttcagatggttt1612gccgcatacactgcagacatggcaatggcttcttcaacgttgtcgaactgcacgtcgaga1672cggtgtttagacacattgatgctggggattttttctgcgcccaggcacacgcgcgccatt1732gcggcaacggtttcagaaggatactgaccggctgcggtttcggcagacagcataaccgca1792tccgtgccatccaggacggcgttcgccacgtccatcacttccgcacgggtcggcatcggg1852ttggtgatcatcgactccatcatttgcgttgcggtgatgactgcgcggtttagctgacgc1912gcacggcgaatcagcgctttctggataccaaccagctccggatcgccgatttcaacgccc1972agatcgccacgtgcgaccatcacaacgtcagaggccagaatgatatc2019<210>2<211>323<212>PRT<213>沙门氏菌<400>2MetGluThrLysLysAsnAsnSerGluTyrIleProGluPheGluLys151015SerPheArgTyrProGlnTyrTrpGlyAlaTrpLeuGlyAlaAlaAla202530MetAlaGlyIleAlaLeuThrProAlaSetPheArgAspProLeuLeu354045AlaThrLeuGlyArgPheAlaGlyArgLeuGlyLysSerSerArgArg505560ArgAlaLeuIleAsnLeuSerLeuCysPheProGlnArgSerGluAla65707580GluArgGluAlaIleValAspGluMetPheAlaThrALaProGlnAla859095MetAlaMetMetAlaGluLeuAlaMetArgGlyProLysLysIleGln100105110GlnArgValAspTrpGluGlyLeuGluIleIleGluGluMetArgArg115120125AsnAspGluLysValIlePheLeuValProHisGlyTrpGlyValAsp130135140IleProAlaMetLeuMetAlaSerGlnGlyGlnLysMetAlaAlaMet145150155160PheHisAsnGlnGlyAsnProValPheAspTyrIleTrpAsnThrVal165170175ArgArgArgPheGlyGlyArgLeuHisAlaArgAsnAspGlyIleLys180185190ProPheIleGlnSerValArgGlnGlyTyrTrpGlyTyrTyrLeuPro195200205AspGlnAspHisGlyProGluHisSerGluPheValAspPhePheAla2l0215220ThrTyrLysAlaThrLeuProAlaIleGlyArgLeuMetLysValCys225230235240ArgAlaArgValIleProLeuPheProValTyrAsnGlyLysThrHis245250255ArgLeuThrIleGlnIleArgProProMetAspAspLeuLeuThrAla260265270AspAspHisThrIleAlaArgArgMetAsnGluGluValGluIlePhe275280285ValGlyProHisProGluGlnTyrThrTrpIleLeuLysLeuLeuLys290295300ThrArgLysProGlyGluIleGlnProTyrLysArgLysAspLeuTyr305310315320ProIleLys<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>3gttgactgggaaggtctggag<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>4ctgaccgcgctctatcgcgg权利要求1．含有一种遗传修饰的msbB基因的突变沙门氏菌，其中突变的沙门氏菌在体内给药时能靶向一种实体瘤。2．权利要求1的突变沙门氏菌，它被命名为YS1629，并且其ATCC保藏号为No．202025；或它被命名为YS1170，并且其ATCC保藏号为No．202024；或它被命名为YS8211，并且其ATCC保藏号为No．202026。3．权利要求1的突变沙门氏菌，它选自伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。4．权利要求1的突变沙门氏菌，它表达一种改变的类脂A分子。5．权利要求1的突变沙门氏菌，它诱导的TNFα表达是野生型沙门氏菌诱导水平的约5％至约40％。6．权利要求1的突变沙门氏菌，它诱导的TNFα表达是野生型沙门氏菌诱导水平的约10％至约35％。7．从权利要求1的突变沙门氏菌纯化的脂多糖，它诱导的TNFα表达少于或等于野生型沙门氏菌诱导水平的0．001％。8．权利要求1的突变沙门氏菌，其中与野生型沙门氏菌相比，一种螯合剂能抑制其约90％的生长。9．权利要求1的突变沙门氏菌，其中与野生型沙门氏菌相比，一种螯合剂能抑制其约99％的生长。10．权利要求1的突变沙门氏菌，其中与野生型沙门氏菌相比，一种螯合剂能抑制超过其99％的生长。11．权利要求8、9或10的突变沙门氏菌，其中螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)和柠檬酸钠。12．权利要求1的突变沙门氏菌，它在巨噬细胞中的存活水平为野生型沙门氏菌存活水平的约50％至约30％。13．权利要求1的突变沙门氏菌，它在巨噬细胞中的存活水平为野生型沙门氏菌存活水平的约30％至约10％。14．权利要求1的突变沙门氏菌，它在巨噬细胞中的存活水平为野生型沙门氏菌存活水平的约10％至约1％。15．一种抑制实体瘤癌症生长或减小其体积的方法，包括使用有效剂量的权利要求1的突变沙门氏菌对患有一种实体瘤癌症的病人进行给药。16．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌选自选自伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。17．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌表达一种改变的类脂A分子。18．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌诱导的TNFα表达是野生型沙门氏菌诱导水平的约5％至约40％。19．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌诱导的TNFα表达是野生型沙门氏菌诱导水平的约10％至约35％。20．权利要求15的方法，其中从突变沙门氏菌纯化的脂多糖诱导的TNFα表达少于或等于野生型沙门氏菌诱导水平的0．001％。21．权利要求15的方法，其中与野生型沙门氏菌相比，一种螯合剂能抑制约90％的突变沙门氏菌的生长。22．权利要求15的方法，其中与野生型沙门氏菌相比，一种螯合剂能抑制约99％的突变沙门氏菌的生长。23．权利要求15的方法，其中与野生型沙门氏菌相比，一种螯合剂能抑制超过99％的突变沙门氏菌的生长。24．权利要求21、22或23的方法，其中螯合剂选自EDTA、EGTA和柠檬酸钠。25．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌在巨噬细胞中的存活水平为野生型沙门氏菌存活水平的约50％至约30％。26．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌在巨噬细胞中的存活水平为野生型沙门氏菌存活水平的约30％至约10％。27．权利要求15的方法，其中突变沙门氏菌在巨噬细胞中的存活水平为野生型沙门氏菌存活水平的约10％至约1％。28．权利要求15的方法，其中实体瘤癌症是黑素瘤。29．权利要求15的方法，其中实体瘤癌症是结肠癌。30．权利要求15的方法，其中实体瘤癌症选自肺癌、肝癌、肾癌、前列腺癌和乳腺癌。31．一种药物组合物，它包括能有效抑制一种实体瘤癌症生长或减少其体积的一定量权利要求1的突变沙门氏菌；以及一种可药用的载体。32．一种突变沙门氏菌，它包含一种遗传修饰的msbB基因和一种遗传修饰的purⅠ基因，其中该突变沙门氏菌在体内给药时能够靶向一种实体瘤。33．权利要求32的突变沙门氏菌，其中遗传修饰是一种删除突变。34．权利要求32的突变沙门氏菌，它被命名为YS1646，并且其ATCC保藏号为No．202165；或它被命名为YS1456，并且其ATCC保藏号为No．202164。35．一种突变沙门氏菌，它包含一种遗传修饰的msbB基因和一种遗传修饰的生物合成途径基因，其中生物合成途径突变提供降低的毒性。36．一种抑制实体瘤癌症生长或减小其体积的方法，包括包括使用有效剂量的权利要求32的突变沙门氏菌对患有一种实体瘤癌症的病人进行给药。37．一种选择细菌遗传改变的改进方法，其中的改进包括选择一种表型变异体，当它在一种含有蔗糖的培养基上生长时，产生边缘模糊或粗糙的菌落。全文摘要本发明涉及含有一种遗传修饰的msbB基因的突变沙门氏菌,该突变沙门氏菌具有靶向实体瘤的能力。本发明还涉及含有一种遗传修饰的msbB基因以及在生物合成途径基因如purI基因中有一种遗传修饰的沙门氏菌。本发明进一步涉及将该突变沙门氏菌用于实体瘤的生长抑制和/或体积减小的用途。文档编号C12N1/21GK1278864SQ98811030公开日2001年1月3日申请日期1998年9月9日优先权日1997年9月10日发明者D·伯穆德斯,K·B·罗,M·伊滕索恩申请人:维昂药品公司,耶鲁大学