专利名称：经过发酵生产l－丝氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及生产L-丝氨酸的方法和构建棒杆菌的方法，其中，L-丝氨酸用于生产在药物，化学药品和化妆品领域中使用的氨基酸混合物。
作为通过发酵制备L-丝氨酸的常规方法，已报导这样一种方法，即其中能够将甘氨酸和糖转化成L-丝氨酸的细菌菌株在含有30g/L甘氨酸的培养基中用于生产至多14g/L的L-丝氨酸。通过该方法将甘氨酸转化成L-丝氨酸的产量达到46％(Kubota K.农业生物化学，49,7-12(1985))。用能够将甘氨酸和甲醇转换成L-丝氨酸的细菌菌株，可从100g/L的甘氨酸中生产出53g/L的L-丝氨酸(T.Yoshida等，发酵和生物工程杂志，79卷，第2期，181-183,1995)。在使用诺卡氏菌属细菌的方法中，已知可通过培养那些对氧肟酸盐、重氮丝氨酸等具有抗性的菌株而提高该细菌L-丝氨酸的生产力(日本专利公开No.57-1235)。然而，这些方法包括使用作为L-丝氨酸前体的甘氨酸并且包括复杂的操作且从费用的角度也是不利的。
作为可直接从糖发酵L-丝氨酸并且无需在培养基中添加L-丝氨酸前体的菌株，已知有谷氨酸棒杆菌，该菌对D-丝氨酸、α-甲基丝氨酸、O-甲基丝氨酸、异丝氨酸(isoserine)、丝氨酸氧肟酸盐和3-氯丙氨酸具有抗性但是L-丝氨酸的积累低达0.8g/L(Nogei Kagakukaishi,48卷第3期，p201-208,1974)。因此，有必要进一步改进菌株以用于工业规模L-丝氨酸的直接发酵。
另一方面，关于棒杆菌，已经公开了能够在细胞中自主复制并且具有药物抗性标记基因的质粒(参考美国专利4,514,502)和将基因导入该细胞中的方法(公开的日本专利申请No.2-207791)和培养产生L-苏氨酸或L-异亮氨酸细菌的可能性(美国专利4,452,890和4,442,208)。同样，有关产生L-赖氨酸细菌的培养，已知一种包括掺入参与L-赖氨酸生物合成的基因至质粒载体中并在细胞中扩增该质粒的技术(公开的日本专利申请No.56-160997)。
在大肠杆菌的情况中，参与L-丝氨酸生物合成的酶包括相对于野生型中L-丝氨酸生产而言对反馈抑制敏感的酶并且已知有这样一种实例，即其中导入突变基因从而可对反馈抑制脱敏而导致L-丝氨酸的增加(日本专利No.2584409)。作为这种基因，具体地已知有3-PGDH基因(下文，编码3-PGDH蛋白的基因也将称为“SerA”)。
此外，在棒杆菌的情况中，已知有这样的实例，即其中3-PGDH基因的扩增影响了L-色氨酸的生产力(公开的日本专利申请No.3-7591)。
本发明的目的是提供将糖转变为L-丝氨酸的微生物并且提供了利用微生物将糖转变为L-丝氨酸的能力在培养基中积累L-丝氨酸的方法，即在工业规模的实践中优越的生产L-丝氨酸的方法。
为实现上述目的而进行了深入研究，作为其结果，现在本发明人已发现从具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，优选从L-丝氨酸分解活性缺陷型细菌或其具有对L-丝氨酸类似物抗性的突变体筛选至少一种磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性增强的菌株并使用所筛选的菌株进行L-丝氨酸发酵将大幅度增强L-丝氨酸的积累。基于这一发现完成了本发明。
即，本发明涉及具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，其中至少一种磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性增强。
另外，本发明涉及上文所述的磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性均增强的棒杆菌；上文所述的由于L-丝氨酸分解活性有缺陷而具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌；上文所述的由于其具有对L-丝氨酸类似物的抗性而具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌；上文所述的经过在其细胞中增加上述棒杆菌编码磷酸丝氨酸磷酸酶的基因和编码磷酸丝氨酸转氨酶的基因的拷贝数而增强了磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性的棒杆菌；以及上文所述的具有导入其中的编码D-3-磷酸甘油酸脱氢酶基因且其中L-丝氨酸的反馈抑制被脱敏的棒杆菌。
另外，本发明涉及生产L-丝氨酸的方法，包括在培养基中培养上文所述的棒杆菌以便在培养基中积累L-丝氨酸并从培养基中收集L-丝氨酸。
图1显示L-丝氨酸对各种菌株3-PGDH的反馈抑制方式。水平轴表示在该酶溶液中L-丝氨酸的浓度。纵轴表示L-丝氨酸存在时3-PGDH活性对L-丝氨酸不存在时的百分比。符号◆显示L-丝氨酸对ATCC14067菌株3-PGDH的反馈抑制方式。符号■显示L-丝氨酸对AJ13377菌株3-PGDH的反馈抑制方式。符号▲显示L-丝氨酸对AJ13324菌株3-PGDH的反馈抑制方式。符号×显示L-丝氨酸对AJ13325菌株3-PGDH的反馈抑制方式。符号*显示L-丝氨酸对AJ13327菌株3-PGDH的反馈抑制方式。
图2显示质粒pVK7和pVK6的构建。
图3说明了携带serB的质粒pSB的构建。
图4说明了携带serC的质粒pSC的构建。
图5说明了携带serB和serC的质粒pBC8和pBC14的构建。
本发明中提及的棒杆菌为伯杰氏细菌鉴定手册，第8版，第599页(1974)中定义的一组微生物，它们是不具有酸抗性并且无孢子形成能力的需氧格兰氏阳性杆菌。这些棒杆菌包括棒杆菌属的细菌、属于迄今分类进短杆菌属但目前统一到棒杆菌属中的短杆菌属细菌以及与棒杆菌属和微杆菌属细菌密切相关的短杆菌属的细菌。
本发明的棒杆菌是具有L-丝氨酸生产力的且其中磷酸丝氨酸磷酸酶或磷酸丝氨酸转氨酶的活性被增强的棒杆菌。例如，经过在具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌细胞中增加编码磷酸丝氨酸磷酸酶的基因(下文称为“serB”)或编码磷酸丝氨酸转氨酶的基因(下文称为“serC”)的拷贝数可获得该细菌。
另外，本发明的棒杆菌可经过赋予增强了磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶活性的棒杆菌以L-丝氨酸生产力来获得。
作为具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，可提到的有，例如，L-丝氨酸分解活性缺陷型棒杆菌，对L-丝氨酸类似物有抗性的棒杆菌，以及L-丝氨酸分解活性缺陷型且对L-丝氨酸类似物有抗性的棒杆菌。
在本发明中，L-丝氨酸类似物包括重氮丝氨酸或β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸。
对L-丝氨酸类似物有抗性且具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，更优选其中的L-丝氨酸分解活性缺陷型棒杆菌可使用野生型或具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌作为亲本菌株进行人工突变或诱导。
对L-丝氨酸类似物有抗性，L-丝氨酸分解活性缺陷型且具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌可按，例如，如下方式收集。以常规方法(与N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍接触，等)对黄色短杆菌ATCC14067进行突变处理以获得L-丝氨酸分解活性缺陷型突变株，然后从作为亲本菌株的突变株收集对诸如重氮丝氨酸或β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸的L-丝氨酸类似物有抗性的细菌。另外，在获得L-丝氨酸类似物抗性细菌后，可获得L-丝氨酸分解活性缺陷型突变株。在以上述方法获得的突变株中，存在以高浓度积累L-丝氨酸的菌株。
经过将下文所述突变的SerA导入亲本菌株或L-丝氨酸分解活性缺陷型突变株中可获得L-丝氨酸类似物抗性细菌。
术语“L-丝氨酸类似物抗性”是指细菌在含L-丝氨酸类似物的培养基中比野生型生长更快的特性。
更具体地说，例如，术语“重氮丝氨酸抗性”指细菌在含有重氮丝氨酸的培养基中较野生型细菌生长更快的特性。例如，在含有0.25g/L重氮丝氨酸的固体培养基上30℃在4-5天内形成菌落的菌株称为具有重氮丝氨酸抗性。
类似地，术语“β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸抗性”指细菌在含有β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸的培养基中较野生型细菌生长更快的特性。例如，在含有0.25g/Lβ-(2-噻吩)-DL-丙氨酸的固体培养基上30℃在4-5天内形成菌落的菌株称为具有β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸抗性。
下文将描述磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶活性的增强。
经过将serB或serC分别以可表达的形式导入棒杆菌可实现磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性的增强。经过借助于分开的启动子增强编码各自的酶的基因的表达或者增强在单个启动子控制下的两个基因的表达可做到这一点。不论这些基因是在质粒上还是在染色体上，可经过增强诸如基因启动子的表达控制序列，或者提高翻译效率来增强表达。另外，可经过扩增染色体上的基因数来增强酶活性。而且可使用以使得所编码的修饰酶比活增强的方式修饰的编码磷酸丝氨酸磷酸酶或磷酸丝氨酸转氨酶的修饰的基因实现这些酶活性的增强。
为了将SerB或SerC导入棒杆菌，可将含有SerB或SerC的DNA片断与在棒杆菌中具有功能的载体连接以产生重组DNA，随后将它导入具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌宿主以转化它。由于在转化菌株的细胞中SerB或SerC的拷贝数增加，结果扩增了其磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性。将含有SerB及SerC两者的重组DNA或者含有SerB的重组DNA以及含有SerC的重组DNA两者导入棒杆菌将同时扩增磷酸丝氨酸磷酸酶活性和磷酸丝氨酸转氨酶活性。
SerB和SerC的碱基序列是已知的(SerB:GenBank；XO3046M30784,SerC;GenBank；D90728)。可合成以其碱基序列为基础的引物并使用大肠杆菌，黄色短杆菌或其它微生物的染色体DNA作模板经PCR方法收集这些微生物的SerB基因或SerC基因。至于该引物，司提到的是具有序列鉴定号15至18所示的碱基序列的引物。
优选的是将SerB基因或SerC基因与能够在大肠杆菌和/或棒杆菌细胞中自主复制的载体DNA连接以制备重组DNA，并且将此重组DNA导入前述的大肠杆菌细胞中。这种前提使下面的操作变得容易。能够在大肠杆菌细胞中自主复制的载体优选为能够在包括，例如pUC19,pUC18,pBR322,pHSG299,pHSG399,pHSG398和RSF1010的宿主细胞中自主复制的质粒载体。
当SerB基因和SerC基因位于分开的载体上以导入棒杆菌时，优选使用两个具有互不相同的各自的标记基因的载体。
可利用转座子(国际
发明者菅美喜子, 杉本雅一, 大住刚, 中松亘, 日比野涉, 伊藤美佳 申请人:味之素株式会社