制备核酸物质的方法

专利名称：制备核酸物质的方法
技术领域：
本发明涉及通过发酵制备核酸物质的方法。核酸物质在工业上用作调味剂等。
在通过发酵制备核酸物质如肌苷、鸟苷及其碱基(次黄嘌呤和鸟嘌呤等)时，通常使用具有腺嘌呤营养缺陷和核酸类似物抗性的突变菌株(日本特许公告昭55-2956和昭55-45199)，其培养基中含有限量的腺嘌呤物质。
通过常规诱变方法获得的突变菌株经常是在其靶基因以外的基因中导入突变。此外，因为核酸物质的生物合成途径中涉及复杂的调节机制，很难获得产生显著量核酸物质的微生物。因此，通过常规培养方法获得的突变菌株不一定是满意的菌株。
另一方面，已经公开了利用芽孢杆菌属(Bacillus)细菌制备肌苷或鸟苷的方法，其中的芽孢杆菌属细菌由于对编码涉及嘌呤生物合成的酶的基因序列(嘌呤操纵子)进行了修饰而表现出增强的嘌呤操纵子表达(未审查的日本特许公开平3-164185)。此方法特征在于嘌呤操纵子的启动子或操纵基因受到修饰从而增加了该操纵子的表达水平，因而增加了肌苷或鸟苷的产量。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)嘌呤操纵子(purEKBC(ORF)OLFMNHD，其中的ORF代表未知功能的开放阅读框)的表达受过量的腺嘌呤抑制，并且也受由鸟嘌呤所致弱化作用(attenuation)的调节。此外，与嘌呤操纵子5′侧翼区域结合的阻抑蛋白以及编码该蛋白的基因(purR)已被分离，并且已报导purR基因断裂的枯草芽孢杆菌菌株中，腺嘌呤对整合入嘌呤操纵子中的purC-lacZ融合基因的表达的抑制降至约1/10(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，7455-7549(1995))。
在枯草芽孢杆菌中，已知该阻抑蛋白除了调节嘌呤操纵子的基因表达外，还调节涉及腺嘌呤生物合成的purA基因及涉及嘧啶生物合成的嘧啶操纵子基因的表达(1997，J.Bacteriol.179，7394-7402，H.Zalkin)。
另一方面，在大肠杆菌中，已报导嘌呤操纵子阻抑蛋白除了影响嘌呤操纵子基因表达外，也影响涉及甘氨酸(为5＇-IMP(肌苷酸)生物合成底物)生物合成的glyA基因的表达(1990，J.Bacteriol.172，3799-3803，H.Zalkin等)以及涉及来自甘氨酸的C1与CO2产生的gcv操纵子基因的表达(1993，J.Bacteriol.175，5129-5134，G.V.Stauffer等)。
如上所述，已有许多有关嘌呤操纵子与肌苷或鸟苷产生间关系的报导。然而，存在各种涉及purR基因的生物合成途径。此外，枯草芽孢杆菌的嘌呤操纵子编码10种酶，并参与许多反应。因此，核酸物质的生物合成途径很复杂，并且人们对purR基因与核酸物质积累之间的关系知之甚少。
鉴于核酸物质的工业重要性，本发明的目的是提供较常规方法更为优越的制备核酸物质的方法。
为了达到上述目的，本发明人深入地进行了有关purR基因功能的研究，结果发现，purR基因断裂的枯草芽孢杆菌菌株积累了核酸物质。这样，本发明得以完成。
即，本发明提供(1)一种制备核酸物质的方法，包括以下步骤在培养基中培养其嘌呤操纵子阻抑蛋白不以正常方式起作用的微生物，从而在该培养基中产生并积累核酸物质，并从该培养基中收集该物质；(2)上面(1)中定义的方法，其中的阻抑蛋白不以正常方式起作用是因为位于此微生物染色体上的编码该阻抑蛋白的基因被断裂；(3)上面(1)中定义的方法，其中的阻抑蛋白具有示于SEQ IDNO6中的氨基酸序列；(4)上面(1)中定义的方法，其中的微生物为芽孢杆菌属的细菌；(5)上面(4)中定义的方法，其中的微生物为枯草芽孢杆菌；(6)上面(1)中定义的方法，其中的核酸物质为核酸碱基、核苷或核苷酸；(7)上面(6)中定义的方法，其中的核酸物质选自次黄嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤及腺嘌呤。
为本发明的目的，术语“嘌呤操纵子阻抑蛋白不以正常方式起作用”意为此阻抑蛋白结合到嘌呤操纵子的5′侧翼区，因此与正常水平比较，抑制该操纵子转录的功能降低，或该功能基本上已不具备。
在本发明中，核酸物质包括核酸碱基如次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶；核苷如肌苷、腺苷、鸟苷、尿苷、胸苷及胞苷；核苷酸如肌苷酸、腺苷酸、鸟苷酸、尿苷酸、胸苷酸及胞苷酸；以及由其核糖被脱氧核糖置换的任一核苷或核苷酸所组成的化合物。在这些物质中，核酸碱基是优选的。在本发明中，此核酸物质同时包括嘌呤化合物与嘧啶化合物。该嘌呤化合物包括嘌呤碱基和具有嘌呤碱基的核苷及核苷酸。嘧啶化合物包括嘧啶碱基和具有嘧啶碱基的核苷及核苷酸。在本发明中，作为嘌呤化合物，次黄嘌呤、腺嘌呤及鸟嘌呤是优选的；作为嘧啶化合物，尿嘧啶是优选的。


图1显示质粒pHSG 398 BSPR的结构。粗线表示来自枯草芽孢杆菌SB112的purR基团。括号中的数字代表当起始位置定为1时在编码区中的位置。正常线表示质粒pHSG398。
图2表示用HincII和EcoRV完全消化pHSG398 BSPR而获得的片段。
图3表示用于purR基因断裂的质粒pHSG398ΔBSPRSpr的结构。粗线表示枯草芽孢杆菌SB112的断裂的purR基团(ΔpurR)。括号中的数字表示当起始位置定为1时在编码区中的位置。正常线表示壮观霉素抗性基因，虚线表示质粒pHSG398。
本发明将在下面进行详细解释。
用于本发明方法的微生物为嘌呤操纵子阻抑蛋白(以下也简称为“阻抑蛋白”)不以正常方式起作用的微生物。该微生物没有特别的限制，只要求其嘌呤化合物生物合成的酶基因形成操纵子并且具有编码涉及该操纵子(purR)调节的阻抑蛋白的基因。此微生物的实例包括芽孢杆菌属的细菌等。此芽孢杆菌属细菌的具体实例包括，例如，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等。
阻抑蛋白不以正常方式起作用的微生物可用以下方法获得修饰其purR基因从而使该阻抑蛋白的活性降低或缺失，或者使purR基因的转录降低或缺失。例如，经过基于遗传重组技术的同源重组，以不以正常方式起作用的purR基因(以后偶尔称为“断裂purR基因”)置换染色体purR基因，可获得这样的微生物(《分子遗传学实验》，冷泉港实验室出版社(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，J.Bacteriol.，162，1196(1985))。
在同源重组中，当将带有与染色体序列表现出同源性的序列的质粒等导入相应的细菌细胞中时，重组以一定的频率在同源序列的某个位点发生，因此导入的质粒作为整体整合入染色体中。然后，通在该染色体中此同源序列位点处再次造成重组，可从该染色体中切下此质粒。然而，依据导致重组的位置，此断裂基因可能维持在该染色体上，而原始的正常基因可能与该质粒一起从染色体中切除。通过选择这样的菌株，可获得其中的正常purR基因被断裂purR基因置换的细菌菌株。
已经建立了基于同源重组的这种基因断裂技术，并且为此可采用利用线性DNA的方法、利用温度敏感性质粒的方法等。也可通过用含有purR基因并插入标记基因如药物抗性基因且不能够在靶微生物细胞中复制的质粒来断裂purR基因。即，在已用此质粒转化且因此获得药物抗性的转化子中，标记基因被整合入染色体DNA中。很有可能此标记基因是通过存在于该标记两侧的purR基因与染色体上的purR基因之间的同源重组而被整合的，因此可有效地选择出断裂基因菌株。
具体地，用于基因断裂的断裂purR基因可通过以下方式获得，即以限制酶消化并重新连接方法缺失purR基因的某个区域；插入另一个DNA片段(标记基因等)进入purR基因；用定点诱变方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，酶学方法，154，350(1987))或以化学试剂如次磺酸钠及羟胺处理(Shortle，D.和Nathans，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，270(1978))等方法，在purR基因编码区、其启动子区等区域的核苷酸序列中导入一个或更多个核苷酸的置换、缺失、插入、添加或倒位，从而使所编码的阻抑蛋白的活性降低或缺失，或者使purR基因的转录降低或缺失。在这些实施方案中，就可靠性和稳定性而言，优选采用通过以限制酶消化并重新连接而缺失purR基因的某个区域或插入另一个DNA片段至purR基因中的方法。
用根据purR基因已知的核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物，用PCR法可从具有嘌呤操纵子的微生物染色体DNA中获得purR基因。也可用根据purR基因已知的核苷酸序列制备的寡核苷酸作探针，通过杂交技术从具有嘌呤操纵子微生物的染色体DNA文库中获取purR基因。枯草芽孢杆菌168Marburg菌株的purR基因的核苷酸序列已有报导(GenBank编号D26185(编码区相应于核苷酸号118041-118898)、DDBB编号Z99104(编码区相应于核苷酸号54439-55296)。purR基因的核苷酸序列与该基因所编码的氨基酸序列示于序列表中的SEQ ID NO5和6中。对于本发明的目的，因为purR基因用于制备断裂的purR基因，它不一定需要含有全长，可能只含有导致基因断裂所需的长度。
用于获取purR基因的微生物没有特别的限制，只要求其purR基因与用于建立断裂基因菌株的微生物的purR基因之间的同源性达到能产生同源重组的程度。然而，使用相同的微生物一般是优选的。
用于PCR的引物可以是能够扩增purR基因的任何引物，其具体的实例包括具有示于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中的核苷酸序列的寡核苷酸。
标记基因的实例包括，例如，药物抗性基因如壮观霉素抗性基因。通过从可从枯草杆菌遗传保藏中心(BGSC)买到的大肠杆菌ECE101菌株中制备质粒pDG1726并从该质粒中切下此基因作为表达盒，可得到壮观霉素抗性基因。
当药物抗性基因用作标记基因时，通过插入药物抗性基因至质粒中所带purR基因的适当位点中，以该质粒转化微生物并选择药物抗性转化子，可获得purR基因断裂菌株。通过Southern印迹、PCR等分析位于染色体上的purR基因或标记基因，可证实位于染色体上的purR基因的断裂。用能够扩增壮观霉素抗性基因的引物(如具有示于SEQ IDNO3和4的核苷酸序列的寡核苷酸)，用PCR法可证实壮观霉素抗性基因整合到染色体DNA中。
通过在适当的培养基中培养按上述获得的其阻抑蛋白不以正常方式起作用的微生物，可在培养基中产生和积累核酸物质。
作为用于本发明的培养基，可以使用含有碳源、氮源、矿物盐及有机微量营养物如所需的氨基酸和维生素的普通营养培养基，并且可以常规方式进行培养。可以使用合成培养基或天然培养基。只要可被待培养的细菌菌株利用，用于此培养基的碳源和氮源可以是任何的种类。
作为碳源，可以使用糖类如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物及糖蜜，并且可使用有机酸本身如乙酸和柠檬酸或将其与另一种碳源联合使用。
作为氮源，可以使用氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵、硝酸盐等。
作为微量营养物，可以使用氨基酸、维生素、脂族酸、核酸以及含有前述物质的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白分解产物等。当使用需要氨基酸等用于其生长的营养缺陷型突变体时，补充所需的营养物是必需的。
作为矿物盐，可以使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。
培养条件依赖于待用微生物的种类。例如，枯草芽孢杆菌用通气培养法培养，同时调整发酵温度至20-50℃及pH至4-9。当培养过程中pH降低时，可用碱如氨气中和培养基。通过如上所述培养约40小时到3天，核酸物质便积累于培养基中。
培养完成后，可通过已知的方法回收此培养基中积累的核酸物质。例如，可通过沉淀、离子交换层析等方法进行分离。
如果使用于本发明的微生物的编码核苷酶或核苷酸酶的基因有缺陷，则可以积累相应的核苷或核苷酸。如果使其成为腺嘌呤或鸟嘌呤营养缺陷型，则可以积累这些物质及相关物质生物合成途径中的前体物质。
此外，通过以嘌呤核苷磷酸化酶或磷酸核糖基转移酶处理由本发明方法制备的核酸碱基，可得到相应于该碱基的核苷或核苷酸。
参考下面的实施例更为具体地解释本发明。<1>purR基因的克隆含有枯草芽孢杆菌168Marburg菌株(ATCC 6051)purR基因的DNA片段通过用该细菌的染色体DNA作为模板进行PCR而获得。
按下述方法制备染色体DNA。将枯草芽孢杆菌ATCC6051菌株接种于50ml LB培养基中，于37℃培养过夜，然后收集并用含有1mg/ml溶菌酶的裂解液裂解。以苯酚处理裂解物，然后用常规方式通过乙醇沉淀法沉淀NDA。通过将其缠绕到玻棒上来收集得到的DNA沉淀物，洗涤后用于PCR。
作为PCR引物，可以使用具有示于SEQ ID NO1与2中的核苷酸序列的寡核苷酸(其合成是委托Japan Bioservice Co.，Ltd完成的)，这些寡核苷酸是根据枯草芽孢杆菌168Marburg菌株purR基因的已知核苷酸序列(GenBank编号D26185(编码区相应于核苷酸号118041-118898)、DDJB编号Z99104(编码区相应于核苷酸号54439-55296))设计的。这些引物分别在靠近5′末端和3′末端具有HindIII及PstI限制酶识别序列。
用以下方法进行PCR在0.1ml含有6ng/μl染色体DNA和3μM引物的PCR反应液中重复30次下面的循环94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸反应1分钟。
用HindIII及PstI消化此反应产物及质粒pHSG398(TakaraShuzo)，并用连接试剂盒(Takara Shuzo)连接。用得到的重组质粒转化大肠杆菌JM109。将转化子于含有30μ/ml氯霉素(Cm)及X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的LB琼脂培养基上培养，获得氯霉素抗性转化子的白色菌落。从上述得到的转化子中提取质粒，并将插入有靶DNA片段的质粒命名为pHSG398BSPR(图1)。<2>含有断裂purR(ΔpurR)的质粒的构建从可从芽孢杆菌遗传保藏中心(BGSC)买到的大肠杆菌ECE101菌株中制备质粒pDG1726。从该质粒中可切出壮观霉素抗性(Spr)基因作为表达盒。
将在<1>中获得的质粒pDG1726和pHSG 398 BSPR分别用限制酶HincII和EcoRV完全(图2)和部分消化，并用苯酚处理。用连接试剂盒连接每种DNA，用此连接液转化大肠杆菌JM109并培养于含有50μg/ml氯霉素及100μg/ml壮观霉素的LB琼脂培养基上。从得到的转化子中提取质粒，得到其purR基因由于插入壮观霉素抗性基因而被断裂的质粒pHSG398ΔBSPRSpr(图3)。<3>purR基因断裂菌株的建立用在前述<2>中获得的质粒pHSG398ΔBSPRSpr转化枯草芽孢杆菌SB112(BGSC1A227)。用根据Ishiwa方法(Ishiwa H.等，1986，Jpn.J.Genet.61515-528)制备的感受态细胞进行转化。质粒pHSG398ΔBSPRSpr不能够在枯草芽孢杆菌细胞中复制DNA。然而，由于该质粒具有与壮观霉素抗性基因5′端与3′端的染色体purR基因同源的区域，它可通过双交换重组与染色体purR基因之间进行基因置换。
将前述的转化子培养于含有100μg/ml壮观霉素的LB琼脂培养基上，对所培养的菌株进行选择，得到其中的染色体purR基因被ΔBSPRSpr基因置换的菌株。通过用候选菌株的染色体DNA作为模板，用purR基因的引物(SEQ ID NO1和2)及具有示于SEQ IDNO3和4的核苷酸序列的Spr基因引物(其合成委托Japan BioserviceCo.，Ltd完成)进行PCR，根据ΔBSPRSpr部分的大小及壮观霉素抗性基因的插入，证实预期的基因置换已发生。将按上述获得的其中一个基因置换菌株命名为枯草芽孢杆菌SB112K。<4>用purR陷型菌株制备核酸将在前述<3>中制备的枯草芽孢杆菌SB112K菌株及母本菌株枯草芽孢杆菌SB112，于37℃下在含100μg/ml壮观霉素的LB及LB琼脂培养基中培养过夜，并将3环细胞接种于20ml示于表1中的生产培养基中，于32℃培养72小时。
表1发酵培养基的组成培养基组分浓度葡萄糖100g/LNH4C120g/LKH2PO40.5g/LMgSO4·7H2O 0.4g/LFeSO4·7H2O 2ppmMnSO4·5H2O 2ppmL-色氨酸 300mg/LL-苯丙氨酸300mg/LL-谷氨酸 15.0g/LDL-甲硫氨酸 0.3g/L大豆浓缩物(T-N) 1.5g/L消泡剂(GD-113)0.05mL/LpH调节剂(KOH) 7.2g/L
培养完成后，通过高效液相色谱测定培养基中积累的次黄嘌呤、尿嘧啶、鸟苷、鸟嘌呤、腺苷及腺嘌呤的量。结果示于表2中。在purR缺陷型菌株SB112K中，积累了显著量的次黄嘌呤，即大约600mg/L，因此与母本菌株相比，其积累量表现出约20倍的增加。尿嘧啶与母本菌株相比积累增加5倍。此外，在母本菌株中没有见到的腺嘌呤与鸟嘌呤的积累也在purR缺陷型菌株中见到。
表2发酵的评估菌株 产物(mg/L)次黄嘌呤尿嘧啶鸟嘌呤腺嘌呤SB112K 585 16620 127SB112 3030 00(母本菌株)
序列表<110>味之素株式会社<120>制备核酸物质的方法<130>OP853<140><141><150>JP10-165704<151>1998-06-12<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>1ctcaagcttg aagttgcgat gatcaaaa28<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>2ctcctgcaga catattgttg acgataat28<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>3gtgaggagga tatatttgaa t41<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>4ttataatttt tttaatctgt t21<210>5<211>1200<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<220><221>CDS<222>(259)..(1113)<400>5atatgcatcc tgaagttgcg atgatcaaaa accagatgaa acgctttggt gcagatgccg 60tgttaatgag cgggagcggc ccgacagtgt ttggactggt tcagtatgag tcgaaggtgc 120agagaattta taacgggtta agaggcttct gcgatcaagt ttatgcggtg agaatgatcg 180gcgaacagaa cgctcttgat taaatccgta tgttaagtta tattgatctt aaaatattcg 240gattttgggg gtgagttc atg aag ttt cgt cgc agc ggc aga ttg gtg gac 291Met Lys Phe Arg Arg Ser Gly Arg Leu Val Asp1 5 10tta aca aat tat ttg tta acc cat ccg cac gag tta ata ccg cta acc 339Leu Thr Asn Tyr Leu Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr15 20 25ttt ttc tct gag cgg tat gaa tct gca aaa tca tcg atc agt gaa gat 387Phe Phe Ser Glu Arg Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp30 35 40tta aca att att aaa caa acc ttt gaa cag cag ggg att ggt act ttg 435Leu Thr Ile Ile Lys Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu45 50 55ctt act gtt ccc gga gct gcc gga ggc gtt aaa tat att ccg aaa atg 483Leu Thr Val Pro Gly Ala Ala Gly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met60 65 70 75aag cag gct gaa gct gaa gag ttt gtg cag aca ctt gga cag tcg ctg 531Lys Gln Ala Glu Ala Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu80 85 90gca aat cct gag cgt atc ctt ccg ggc ggt tat gta tat tta acg gat 579Ala Asn Pro Glu Arg Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp95 100 105atc tta gga aag cca tct gta ctc tcc aag gta ggg aag ctg ttt gct 627Ile Leu Gly Lys Pro Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala110 115 120tcc gtg ttt gca gag cgc gaa att gat gtt gtc atg acc gtt gcc acg 675Ser Val Phe Ala Glu Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr125 130 135aaa ggc atc cct ctt gcg tac gca gct gca agc tat ttg aat gtg cct 723Lys Gly Ile Pro Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro140 145 150 l55gtt gtg atc gtt cgt aaa gac aat aag gta aca gag ggc tcc aca gtc 771Val Val Ile Val Arg Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val160 165 170agc att aat tac gtt tca ggc tcc tca aac cgc att caa aca atg tca 819Ser Ile Asn Tyr Val Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ile Gln Thr Met Ser175 180 185ctt gcg aaa aga agc atg aaa acg ggt tca aac gta ctc att att gat 867Leu Ala Lys Arg Ser Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp190 195 200gac ttt atg aaa gca ggc ggc acG att aat ggt atg att aac ctg ttg 915Asp Phe Met Lys Ala Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu205 210 215gat gag ttt aac gca aat gtg gcg gga atc ggc gtc tta gtt gaa gcc 963Asp Glu Phe Asn Ala Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala220 225 230 235gaa gga gta gat gaa cgt ctt gtt gac gaa tat atg tca ctt ctt act 1011Glu Gly Bal Asp Glu Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr240 245 250ctt tca acc atc aac atg aaa gag aag tcc att gaa att cag aat ggc 1059Leu Ser Thr Ile Asn Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly255 260 265aat ttt ctg cgt ttt ttt aaa gac aat ctt tta aag aat gga gag aca 1107Asn Phe Leu Arg Phe Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr270 275 280gaa tca tgacaaaagc agtccacaca aaacatgccc cagcggcaat cgggccttat1163Glu Ser285tcacaaggga ttatcgtcaa caatatgttt tacagct 1200<210>6<211>285<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌<400>6Met Lys Phe Arg Arg Ser Gly Arg Leu Val Asp Leu Thr Asn Tyr Leu1 5 10 15Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr Phe Phe Ser Glu Arg20 25 30Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp Leu Thr Ile lle Lys35 40 45Gla Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu Leu Thr Val Pro Gly50 55 60Ala Ala 0ly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met Lys Gln Ala Glu Ala65 70 75 80Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu Ala Asa Pro Glu Arg85 90 95Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Ile Leu Gly Lys Pro100 105 110Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala Ser Val Phe Ala Glu115 120 125Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr Lys Gly Ile Pro Leu130 135 140Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro Val Val Ile Val Arg145 150 155 160Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val Ser Ile Asn Tyr Val165 170 175Ser Gly Ser Sar Asa Arg Ile Gln Thr Met Ser Leu Ala Lys Arg Ser180 185 190
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1.一种用于制备核酸物质的方法，该方法包括以下步骤在培养基中培养其嘌呤操纵子阻抑蛋白不以正常方式起作用的微生物，从而在该培养基中产生和积累核酸物质；从该培养基中收集此物质。
2.权利要求1的方法，其中的阻抑蛋白不以正常方式起作用是因为该微生物染色体上编码此阻抑蛋白的基因被断裂。
3.权利要求1的方法，其中的阻抑蛋白具有示于SEQ ID NO6中的氨基酸序列。
4.权利要求1的方法，其中的微生物为芽孢杆菌属的细菌。
5.权利要求4的方法，其中的微生物为枯草芽孢杆菌。
6.权利要求1的方法，其中的核酸物质为核酸碱基、核苷或核苷酸。
7.权利要求6的方法，其中的核酸物质选自次黄嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌呤。
全文摘要
通过以下方法有效地制备核酸物质在培养基中培养其嘌呤操纵子阻抑蛋白不以正常方式起作用的微生物，优选其染色体上编码阻抑蛋白的基因(purR)被断裂的菌株，使核酸物质在培养基中积累，并从该培养基中收集此物质。
文档编号C12N1/21GK1239143SQ99108379
公开日1999年12月22日 申请日期1999年6月14日 优先权日1998年6月12日
发明者佐藤胜明, 臼田佳弘 申请人:味之素株式会社