专利名称：噬菌蛭弧菌的提纯及其制剂的生产方法
技术领域：
本发明属于生物制品技术领域，涉及一种噬菌蛭弧菌的提纯及其生物制剂的生产方法。
现有技术中用于制造噬菌蛭弧菌生物制剂的蛭弧菌，是从自然环境中分离、并在菌种保藏单位保藏，由于从自然环境分离蛭弧菌的过程中，蛭弧菌的杂菌很难去除，因此其生物制剂中含有一定数量的杂菌，从而影响产品质量。并且菌种耐温能力差，需经耐温培养，从而造成生产成本的升高。中国专利局公开的申请号为93111749.6专利申请，公开了一种名称为生物制菌王及其生产方法的专利申请文件，提供了一种利用噬菌蛭弧菌生产的生物制剂和该生物制剂的生产方法，该生产方法，是用蛭弧菌常规培养方法制取培养物，选择25-30摄氏度的环境中在自来水双层琼脂平皿上噬斑典型的噬菌蛭弧菌，挑取噬菌斑，浸泡于灭菌自来水中4-6小时，然后，取上清液再制琼脂平皿，调高温度3-5摄氏度，并反复数次；选育出在37-43摄氏度的环境下能生长的噬菌蛭弧菌，最后与失活宿主菌按比例配合，在37-43摄氏度条件下培养10-24小时，校正PH值3.0-9.8，即制得噬菌蛭弧菌的生物制剂—生物制菌王。该方法在制取噬菌蛭弧菌时需对蛭弧菌进行耐温培养，同时对噬菌蛭弧菌没进行纯化，因此，其生产成本较高，产品中含有杂菌。
本发明的目的是提供一种噬菌蛭弧菌的提纯方法及对申请号为93111749.6的专利的生产方法的改进的噬菌蛭弧菌生物制剂的制备方法，从而提供一种制备高纯度、无杂菌的生物制剂，且操作简单、成本低廉、产出率高的生产方法，以克服现有技术的不足。
本发明噬菌蛭弧菌的提纯方法是这样完成的用常规方法将从菌种保藏单位索取的噬菌蛭弧菌，制成自来水琼脂双层平板，培养出噬菌斑(含有杂菌)后，用紫外线照射，杀灭杂菌和部分噬菌蛭弧菌，选取存活的噬菌蛭弧菌斑，即可得到纯菌斑。加入灭菌无氯自来水(以下简称溶剂)，浸泡4-8小时，取上清液，制备平板，在24-28摄氏温度下培养38-40小时，即可制得不含杂菌的噬菌蛭弧菌纯菌种。
本发明所用的宿主菌是大肠杆菌或枯草牙孢杆菌。
本发明的噬菌蛭弧菌的生物制剂的生产方法是在申请号为93111749.6的专利申请的基础上改进而实现的1、宿主菌灭活悬液的制备，取在菌种保藏单位采购的大肠杆菌或枯草牙孢杆菌，按常规方法培养复壮后，测定菌数，用灭菌蒸馏水稀释成1000亿/ml的菌悬液，在121摄氏度，经30分钟高压灭活。2、噬菌蛭弧菌种子母液制备，取经提纯的噬菌蛭弧菌种，经培养复壮后，测定菌数，用溶剂制成种子母液，浓度为105～7个/ml为宜。3、成品制备，将溶剂、经灭活的宿主菌悬液、种子母液按比例混合，其比例为每千克混合液中含宿主菌4×108～12个，蛭弧菌2×108～10个，34-39摄氏度培养10-48小时，调PH值6.0-8.2，即得噬菌蛭弧菌制剂。
下面详细说明本发明的实施例1、将从菌种保藏单位采购的噬菌蛭弧菌制成自来水琼脂双层平板，培养出噬菌斑(含有杂菌)后，用40W的紫外线灯照射20-200分钟，杀灭杂菌和部分噬菌蛭弧菌，选取存活的噬菌蛭弧菌斑，加入灭菌无氯自来水(以下简称溶剂)，浸泡4-8小时，取上清液，再用常规方法制备平板，在24-28摄氏温度下培养38-40小时，即可制得不含杂菌的噬菌蛭弧菌纯菌种。
2、实施例1中的紫外线照射剂量可以是用40W的紫外线灯照射40分钟。
3、本发明的生物制剂的生产方法是1、宿主菌灭活悬液的制备，取在菌种保存单位采购的大肠杆菌或枯草牙孢杆菌，按常规方法培养复壮后，测定菌数，用灭菌蒸馏水稀释成1000亿/ml的菌悬液，在121摄氏度，经30分钟高压灭活。2、噬菌蛭弧菌种子母液制备，取经提纯的噬菌蛭弧菌种，经培养复壮后，测定菌数，用溶剂制成种子母液，浓度为107个/ml。3、成品制备，将溶剂、经灭活的宿主菌悬液、种子母液按比例混合，其比例为每千克制剂中含宿主菌4×1010个，含噬菌蛭弧菌，2×106个，于37摄氏度培养30小时，调PH值为7.2，即得噬菌蛭弧菌制剂。
权利要求
1.一种噬菌蛭弧菌的提纯，是将现有的含杂菌的噬菌蛭弧菌经培养后，制成噬菌斑，用紫外线直接照射，选取存活的噬菌斑，再用常规方法培养出纯菌种。
2.根据权利要求1所述的一种噬菌蛭弧菌的提纯，其特征是紫外线的照射剂量为用40W的紫外线灯照射20-200分钟，选取存活的菌种。
3.根据权利要求2所述的一种噬菌蛭弧菌的提纯，其特征是紫外线的照射剂量为用40W的紫外线灯照射40分钟，选取存活的菌种。
4.一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法如下1)宿主菌灭活悬液的制备，取在菌种保存单位采购的大肠杆菌或枯草牙孢杆菌，按常规方法培养复壮后，测定菌数，用灭菌蒸馏水稀释成1000亿/ml的菌悬液，在121摄氏度，经30分钟高压灭活；2)噬菌蛭弧菌种子母液制备，取经提纯的噬菌蛭弧菌种，经培养复壮后，测定菌数，用溶剂制成种子母液，浓度为105-107/ml为宜；3)成品制备，将溶剂、经灭活的宿主菌悬液、种子母液按比例混合，其比例为每千克混合液中含宿主菌4×108～12个，含噬菌蛭弧菌2×108～10个，34-39摄氏度培养10-48小时，调PH值6.0-8.2，即得噬菌蛭弧菌制剂。
5.根据权利要求4所述的一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方方法，其特征是成品制备中，每千克混合液中含宿主菌4×1010个，含噬菌蛭弧菌2×109个，调PH值为7.2。
6.根据权利要求4或5所述的一种噬菌蛭弧菌的生产方法，其特征是宿主菌是大肠杆菌或枯草牙孢杆菌。
全文摘要
一种噬菌蛭弧菌的提纯及其制剂的生产方法,属于生物技术领域,涉及噬菌蛭弧菌的菌种提纯及其生物制剂的生产方法,其特征是采用紫外线照射的方法杀灭噬菌蛭弧菌中的杂菌,获得纯噬菌蛭弧菌菌种,用提纯的菌种生产噬菌蛭弧菌的生物制剂,可以不经耐温培养,而得到能在43摄氏度环境下生长的菌蛭弧菌的生物制剂,且不含杂菌。
文档编号C12N1/20GK1271773SQ99112188
公开日2000年11月1日 申请日期1999年4月22日 优先权日1999年4月22日
发明者徐钢, 阙宁宁 申请人:徐钢