专利名称：释放细胞内的l－天门冬酰胺酶的溶液及方法
技术领域：
本发明涉及的是一种释放细胞内酶的溶液及方法，尤其是一种释放细胞内的L-天门冬酰胺酶(EC3.5.1.1)的溶液及方法，属于生物化学类领域。
许多微生物代谢产物都存在于细胞内。通常需将细胞破碎，使细胞内产物释放到细胞外，以便于下一步提取。常用的破碎细胞的方法有机械破碎、超声波处理、渗透压冲击、化学试剂处理、溶菌酶处理等。大肠杆菌产L-天门冬酰胺酶(EC3.5.1.1)是治疗白血病的药物，属于细胞内酶。国内外普遍采用制丙酮粉的方法破坏细胞壁。即将大肠杆菌细胞加入丙酮中，使细胞破碎。过滤除去丙酮，得到已破碎的细胞。干燥后加入硼酸缓冲液，将酶萃取到缓冲液中。去除细胞碎片，就得到酶的无细胞提取液。这种方法消耗丙酮多，细胞内其它物质(如核酸)也释放出来，对后续提取过程会造成困难。用化学试剂处理微生物细胞，增大细胞壁与细胞膜的通透性，使细胞内物质易于释放，已有不少研究者作过这方面的工作。如用盐酸胍、Triton X100可以使大肠杆菌内的蛋白质释放，而核酸释放较少。但盐酸胍是蛋白变性剂，易使蛋白质变性而失去活性，价格也较贵。国内外文献中有许多用TritonX100溶解和释放膜蛋白的报道，均未谈到蛋白的释放率。不用磷酸盐、仅用TritonX100释放大肠杆菌细胞内的L-天门冬酰胺酶，释放率在20％以下，如同时使用磷酸盐和Triton X100，酶释放率在60％以上。经对现有技术的文献检索，至今尚未发现有关用磷酸盐和Triton类非离子型表面活性剂处理大肠杆菌细胞，使细胞内的L-天门冬酰胺酶释放到细胞外的溶液及方法。
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种释放细胞内的L-天门冬酰胺酶的溶液及方法。
本发明的技术方案如下本发明用化学试剂处理大肠杆菌细胞，释放细细胞内的L-天门冬酰胺酶。用磷酸盐和Triton类非离子型表面活性剂配制的溶液协同作用，增大细胞壁的通透性，细胞内的L-天门冬酰胺酶透过细胞壁进入胞外液体。溶液中的磷酸盐能提高细胞外溶液的渗透压，使细胞收缩，并使细胞壁与细胞膜分离。溶液中的Triton类表面活性剂能溶解细胞壁上的脂类物质，释放细胞周质的蛋白质(包括L-天门冬酰胺酶)。当磷酸盐使细胞壁与细胞膜分离后，Triton类表面活性剂更易于将蛋白质从细胞周质上释放，进入胞外溶液中。
本发明的方法为将大肠杆菌培养液离心沉淀或过滤，除去液体，得到细胞，用水和磷酸盐、Triton类表面活性剂配制成溶液，将大肠杆菌细胞加入到溶液中，置于搅拌釜中搅拌，或置于摇瓶中振摇一段时间，酶即从细细胞内释放到液体中，再经离心沉淀或过滤，除去细胞，溶液中的酶用于进一步纯化，操作温度为常温，即4-37℃，在上述温度范围内，温度变化对酶的释放无显著影响，酶释放时间以4-20小时为宜，在释放操作的开始阶段酶释放较快，到4小时以后逐渐减慢，到20小时基本上不再释放酶。
本发明溶液的配制如下磷酸盐10％-15％，Triton类表面活性剂1％-45％，其余为水，在这一组分内，酶释放率为60％以上。其优选配比为磷酸氢二钾为12％-13％，Triton X100为2％-3％，其余为水，在这一组分内，酶释放率为70％-80％。磷酸盐包括钾盐、钠盐；可以是正盐，也可以是酸式盐。加入不同的磷酸盐，溶液的pH值会不同，而溶液的pH值会影响酶的释放。适用的pH范围为6.5-11.0。如使用磷酸氢二钾或磷酸氢二钠，溶液pH在适用范围内。如使用磷酸钾或磷酸钠，溶液pH会高于适用范围，需加入酸调节pH到适用范围。如使用磷酸二氢钾或磷酸二氢钠，溶液pH会低于适用范围，需加入碱调节pH到适用范围。Triton类表面活性剂为聚乙二醇与有机基团以醚键联结而成，可用的有Triton X100、聚乙二醇辛基苯基醚(乳化剂O.P.)，效果均好。
本发明具有实质性特点和显著的进步，本发明与现在普遍采用的制丙酮粉的方法相比，酶释放率基本相当，但成本低，时间短。以处理1L大肠杆菌发酵液计，本方法需用磷酸氢二钾116g、Triton X100 13g，价值5.1元。如果制丙酮粉、缓冲液抽提，再经丙酮沉淀，需用丙酮400ml、甘氨酸3g，价值9.2元。本发明降低原料成本45％。本发明还可应用于L-天门冬酰胺酶的工业化生产中，取代制丙酮粉的方法。本方法的释放率较高。在适用的条件范围内，酶释放率在60％以上。优化条件下的释放率可达70％-80％。成本低，价廉。磷酸盐的用量较大，但价格低，仅为盐酸胍的1/10，对纯度要求不高，用过的磷酸盐可以回收再次使用。Triton类表面活性剂的用量少，成本也不高。
以下再结合实施例进一步描述实施例1大肠杆菌ATCC 11303菌种在摇瓶中培养15小时，离心得到菌体。用蒸馏水洗涤菌体，再次离心。得到的菌体混悬于蒸馏水配制的溶液中。液体总体积20ml，内含湿细胞1g、磷酸氢二钾10％、Triton X100 2％，置于250ml摇瓶内。在25℃振摇20小时，离心。细胞沉淀于离心管底部。取上清液，其中含L-天门冬酰胺酶，释放率61％。
实施例2大肠杆菌ATCC 11303，培养和洗涤菌体过程同例1。得到的菌体混悬于蒸馏水配制的溶液中。液体总体积20ml，内含湿细胞1g、磷酸氢二钾15％、Triton X100 2％，置于250ml摇瓶内。在25℃振摇20小时，离心。细胞沉淀于离心管底部。取上清液，其中含L-天门冬酰胺酶，释放率65％。
实施例3大肠杆菌ATCC 11303，培养和洗涤菌体过程同例1。得到的菌体混悬于蒸馏水配制的溶液中。液体总体积20ml，内含湿细胞1g、磷酸氢二钾12.5％、Triton X100 2％，置于250ml摇瓶内。在25℃振摇20小时，离心。细胞沉淀于离心管底部。取上清液，其中含L-天门冬酰胺酶，释放率70％。
实施例4大肠杆菌AS 1.588，细胞培养和酶释放的条件同例1。所得上清液中，L-天门冬酰胺酶的释放率为65％。
实施例5大肠杆菌ATCC 11303，培养方法同例1。离心得到菌体。用蒸馏水洗涤，再次离心，得到菌体。用蒸馏水配制20ml溶液，内含磷酸氢二钾10％、聚乙二醇辛基苯基醚35％、湿细胞1g，置于250ml摇瓶内。在25℃振摇20小时。将摇瓶内的混悬液离心。细胞沉淀于离心管底部。上清液分为两相，上相中含聚乙二醇辛基苯基醚较多，而下相中含磷酸氢二钾较多。释放出的L-天门冬酰胺酶98％以上都集中在下相，释放率达80％。
权利要求
1.一种释放细胞内的L-天门冬酰胺酶的方法，其特征在于将大肠杆菌培养液离心沉淀或过滤，除去液体，得到细胞，用水和磷酸盐、Triton类表面活性剂配制成溶液，将大肠杆菌细胞加入到溶液中，置于搅拌釜中搅拌，或置于摇瓶中振摇一段时间，酶即从细胞内释放到液体中，再经离心沉淀或过滤，除去细胞，溶液中的酶用于进一步纯化，操作温度为常温，即4-37℃，酶释放时间以4-20小时为宜。
2.一种释放细胞内的L-天门冬酰胺酶的溶液，其特征在于磷酸盐10％-15％，Triton类表面活性剂1％-45％，其余为水。
3.根据权利要求2所述的这种释放细胞内的L-天门冬酰胺酶的溶液，其特征还在于其优选配比为磷酸氢二钾为12％-13％，Triton X100为2％-3％，其余为水。
4.根据权利要求2所述的这种释放细胞内的L-天门冬酰胺酶的溶液，其特征还在于磷酸盐包括钾盐、钠盐；可以是正盐，也可以是酸式盐。
5.根据权利要求2所述的这种释放细胞内的L-天门冬酰胺酶的溶液，其特征还在于Triton类表面活性剂为聚乙二醇与有机基团以醚键联结而成，可用的有Triton X100、聚乙二醇辛基苯基醚。
全文摘要
本发明的方法为将大肠杆菌培养液离心沉淀或过滤,除去液体,得到细胞,用水和磷酸盐、Triton类表面活性剂配制成溶液,将大肠杆菌细胞加入到溶液中,置于搅拌釜中搅拌,或置于摇瓶中振摇一段时间,酶即从细胞内释放到液体中,再经离心沉淀或过滤,除去细胞,溶液中的酶用于进一步纯化,操作温度为常温,即4—37℃,酶释放时间以4—20小时为宜。溶液配制为磷酸盐10%—15%,Triton类表面活性剂1%—45%,其余为水。
文档编号C12N9/82GK1252443SQ99116930
公开日2000年5月10日 申请日期1999年9月30日 优先权日1999年9月30日
发明者赵风生 申请人:上海交通大学