专利名称：米曲霉菌固定化制备氨基酰化酶的方法及拆分混旋氨基酸的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种米曲霉菌固定化制备氨基酰化酶的方法及拆分混旋氨基酸的装置，它属于酶法制备光活性氨基酸技术。
光活性氨基酸是构成生命蛋白质的基本组分，是与人体生命健康密切相关的基础物质。研究开发制备光活性氨基酸具有重大意义。目前生产光活性氨基酸的方法大体有三种发酵法、化学合成法和酶法。由于酶法具有反应专一性强、制备的产品纯度高的特点，成为目前世界上公认的生产某些稀缺的光活性氨基酸和非天然氨基酸的最佳方法。采用氨基酰化酶生产L-氨基酸的反应表达式如下
采用米曲霉菌提取氨基酰化酶的技术已有不少的报道，但多数是采用固相培养，然后破碎分离提取氨基酰化酶，再制备载体将酶固定其上。这种固定化酶的方法，它的不足之处是工艺路线长，酶的利用率低。
另外，目前用于固定化酶拆分氨基酸的装置多数由于酶被污染或酶脱落等原因，造成酶反应器运行周期短，操作运行复杂，不利于生产成本的降低。
本发明的目的，在于提供一种米曲霉菌的固定化制备氨基酰化酶的方法及拆分混旋氨基酸的装置。本发明所提出的固定化制备氨基酰化酶的方法具有工艺简单、酶活保留率高的特点。所提出的拆分装置具有拆分效率高、操作简单、生产周期长的特点。
为达到上述目的，本发明是通过下述技术方案加以实现的。选用米曲霉菌(如3042或No.9)作为酶源，经在琼脂斜面上培养后，用无菌水制成浓度约为108孢子/ml的菌悬液，然后将该菌悬液接种在液相培养基中，搅拌发酵培养成直径为1-3毫米的米曲霉菌球，将米曲霉菌球与培养液分离后，立即放在液相固定液中进行交联固定，可得菌体酶活为200-1400U/g，酶活保留率达50-80％的固定化氨基酰化酶，培养液的组分重量体积比为黄豆汁8-15％、葡萄糖1.5-4.5％、酵母膏0.2-0.5％、KH2PO4 0.3-0.4％、MgSO4 0.05-0.2％、其余为无菌水；操作控制培养条件为温度28-30℃、PH值6-7.5、发酵时间30-46小时；固定液的组分重量体积比为明胶0.8-1.2％、乙二胺1.8-3.0％、戊二醛0.8-1.5％、其余为无菌水；控制固定化条件为温度20-60℃、反应时间0.5-2小时、PH值4-7、菌体与固定液体积比为1∶10。
上述的培养液或者采用如下组分重量体积比为土豆汁15-25％、酵母膏0.15-0.5％、蔗糖1.5-2.5％、KH2PO4 0.2-0.4％、MgSO4 0.1-0.3％、其余均为无菌水。
采用按上述方法制备的固定化氨基酰化酶催化剂，装在酶反应器中，进行氨基酸消旋体的拆分反应所采用的装置主要包括料液输送器、料液贮罐、酶反应器、产品贮罐，在酶反应器的进出口处串联耦合切割分子量为4万-7万的超滤膜分离反应器。
上述的膜分离反应器采用的膜组件是中空纤维膜。
上述的膜分离反应器采用的膜组件是平板膜。
下面结合附图及实施例对本发明的拆分过程加以说明。
图1为本发明采用固定化氨基酰化酶拆分混旋氨基酸的反应流程示意图。
由图1所示，将欲拆分的反应底物配制成一定浓度的溶液后，放在料液贮罐2中，由氮气瓶1中释放的氮气将贮罐2中底物溶液压送至前置膜分离器3，分离后的溶液由下至上通入装有固定化氨基酰化酶的酶反应器4进行拆分反应，由顶部溢出的拆分反应液流入后置膜分离反应器5，继续进行拆分反应，反应后的产品经膜分离后流入产品贮罐6中，酶被截留在膜反应器中。
例1拆分N-乙酰-D、L-丙氨酸在1000毫升三角瓶中装入100-200毫升培养液，该培养液的组份重量体积比为黄豆汁10％、葡萄糖2.5％、酵母膏0.3％、KH2PO40.3％、MgSO4 0.1％、其余为无菌水。接入一定量的菌悬液后，于30℃下在旋转半径为1.0-3.0厘米的摇床上以100-200转/分的转速振荡，培养30-45小时，可得到3.4g直径为1-3毫米的米曲霉菌球，经由明胶0.8％、乙二胺1.8％、戊二醛0.85％、其余为无菌水组成的固定液交联固定后，测定固定化氨基酰化酶的比酶活为420U/g；将此酶催化剂装入图1所示的拆分工艺流程中，在直径为1.2厘米的固定床酶反应器4中装总酶活为4600U的固定化氨基酰化酶。在料液贮罐2中装入0.1M的N-乙酰-D、L丙氨酸(含CoCl25×10-4M)，PH7.0。将氮气瓶1中的氮气以0.1MPa的压力通入料液贮罐2后，控制不同的流速将N-乙酰-D、L-丙氨酸溶液压送至前置膜分离器3，分离后的溶液由下至上通入装有固定化氨基酰化酶的酶反应器4进行拆分反应，由顶部溢出的拆分反应液流入后置膜分离反应器5，继续进行拆分反应。反应后的产品经膜分离后流入产品贮罐6中，酶被截留在膜反应器中，当流速低于10ml/h时，其拆分率为100％，连续操作20天后，酶反应器—膜耦联反应器的拆分率仍在87％以上。
例2拆分N-乙酰-D、L-苯丙氨酸按例1中所述制备固定化氨基酰化酶的方法，将制得一定量的固定化氨基酰化酶放在床体积为36.3cm3的固定床酶反应器4中，在料液贮罐2中放入0.1M N-乙酰-D、L-苯丙氨酸；用磷酸缓冲液调整PH＝7，在室温条件下按图1所述的流程进行拆分反应，当体积流速为12ml/h时，拆分率接近100％。用此体系连续拆分56天，体系的酶活保留率仍为64.6％。将拆分液用醋酸调PH值至5.0，减压蒸浓，用乙醇分离，得到白色L-苯丙氨酸产品，拆分收率为72.8％，产品旋光值[α]D20＝-34.74°，符合医用氨基酸旋光标准。
例3拆分N-乙酰-D、L-蛋氨酸在5升的机械搅拌发酵罐中装入3升培养液，该培养液的组分重量体积比为黄豆汁12％、葡萄糖2.0％、酵母膏0.4％、KH2PO4 0.3％、MgSO4 0.05％，并用流加NH3水保持发酵液PH值6.5-7.0，接入一定量的菌悬液后于30℃下以100-200转/分的转速搅拌发酵，同时按0.5-2倍V8/min气速通入无菌空气，经30-45小时发酵可得到36g直径为1-3毫米的米曲霉菌球体，经由明胶1.1％、乙二胺2.9％、戊二醛1.0％组成的固定液交联固定后，测定其固定化氨基酰化酶拆分N-乙酰-D、L-蛋氨酸的比酶活为450U/g，按附图的拆分工艺流程，在固定床酶反应器4中装入总酶活为11400U的酶催化剂，将0.1M N-乙酰-D、L-蛋氨酸，溶液PH7.0，用氮气以0.1MPa的压力由贮罐2流入固定床酶反应器4-膜分离反应器5，当流速低于12毫升/小时，其拆分率为100％，连续操作60天，体系的酶活保留率仍大于60％。将拆分液用醋酸调至PH5.0，减压蒸浓，再用乙醇分离，得白色L-蛋氨酸，拆分收率为71％。测定产品旋光值为[α]D20＝+23.0°，表明已符合医用蛋氨酸旋光标准。
本发明的实施，其关键技术有两点一是采用较便宜的黄豆汁或土豆汁为主的培养液将米曲霉菌培养成球，并用明胶-乙二胺-戊二醛三元体系作交联剂进行交联，实现氨基酰化酶的固定化。采用黄豆汁或土豆汁为主的培养液是本发明的一个突出优点，它比一般采用牛肉膏、蛋白胨为主的培养液不但经济 便宜、来源丰富，而且所产酶量高、菌体与培养液分离容易，采用的明胶-乙二胺-戊二醛三元体系固定液，固定化后的菌体其比酶活在200-1400U/g，酶活保留率高达50-80％。二是采用本发明的固定化氨基酰化酶进行拆分反应的酶反应器串联耦合了膜分离反应器，前置膜分离器主要起到了分离作用，后置膜分离反应器既起分离作用又起进一步反应作用，这样不但可有效延长酶反应器的操作周期，而且又可净化产品，简化了后续分离操作。
权利要求
1.一种米曲霉菌固定化制备氨基酰化酶的方法，它是选用米曲霉菌作为酶源，经在琼脂斜面上培养后，用无菌水制成浓度约为108孢子/ml的菌悬液，然后将该菌悬液接种在液相培养基中，经搅拌发酵培养成直径为1-3毫米的米曲霉菌球，将米曲霉菌球与培养液分离后，立即放在液相固定液中进行交联固定，得到菌体酶活为200-1400U/g，酶活保留率达50-80％的固定化氨基酰化酶，其特征在于培养液的组分重量体积比为黄豆汁8-15％、葡萄糖1.5-4.5％、酵母膏0.2-0.5％、KH2PO40.3-0.4％、MgSO4 0.05-0.2％、其余为无菌水；操作控制培养条件为温度28-30℃、PH值6-7.5、发酵时间30-46小时；固定液的组分重量体积比为明胶0.8-1.2％、乙二胺1.8-3.0％、戊二醛0.8-1.5％、其余为无菌水；控制固定化条件为温度20-60℃、反应时间0.5-2小时、PH值4-7、菌体与固定液体积比为1∶10。
2.根据权利要求1所说米曲霉菌固定化制备氨基酰化酶的方法，其特征在于培养液组分重量体积比为土豆汁15-25％、酵母膏0.15-0.5％、蔗糖1.5-2.5％、KH2PO4 0.2-0.4％、MgSO40.1-0.3％、其余均为无菌水。
3.一种以根据权利要求1所说的米曲霉菌固定化方法所制备的氨基酰化酶，拆分混旋氨基酸的装置主要包括料液输送器、料液贮罐、酶反应器、产品贮罐，其特征在于在酶反应器的进出口处串联耦合切割分子量为4万-7万的超滤膜分离反应器。
4.根据权利要求3所说的拆分混旋氨基酸的装置，其特征在于膜分离反应器采用的膜组件是中空纤维膜。
5.根据权利要求3所说的拆分混旋氨基酸的装置，其特征在于膜分离反应器采用的膜组件是平板膜。
全文摘要
本发明公开了一种米曲霉菌固定化制备氨基酰化酶的方法及拆分混旋氨基酸的装置。属于酶活制备光活性氨基酸技术,所述的固定化方法是以米曲霉菌为酶源,经在黄豆汁或土豆汁为主的培养液中培养并在明胶—乙二胺—戊二醛三元体系固定液中进行固定化制备而成。其制备工艺路线短,酶活保留率可达50—80%。所述的拆分装置,采用了酶反应器进出口处串联耦合超滤膜分离反应器,该装置不但具有拆分效率高,而且还具有操作简单、生产周期长等特点。
文档编号C12M1/12GK1263153SQ9912092
公开日2000年8月16日 申请日期1999年9月24日 优先权日1999年9月24日
发明者崔英波, 贾晓波, 张新法, 刘引青, 丁彩平 申请人:崔英波, 贾晓波