专利名称：具有甲状腺素5'脱碘酶活力抗体酶的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于具有甲状腺素5’脱碘酶活力抗体酶的制备方法。
甲状腺素是人体的一种必须激素，甲状腺素与临床上许多疾病相关。人体内的甲状腺素以两种活性形式存在3，5，3’，5’-四碘甲状腺素原氨酸(T4)和3，5，3’-三碘甲状腺素原氨酸(T3)。T3的生物学活性是T4的8倍，是体内活性甲状腺素的主要形式。所有外周组织和血液中的T4都由甲状腺合成，T3有85％以上来自于外周组织的甲状腺素5’脱碘酶的催化产物。可见甲状腺素5’脱碘酶对于甲状腺素发挥生理功能具有重要意义。目前，人们共发现三种甲状腺素脱碘酶，其中，I型甲状腺素脱碘酶(IT45’D)是一种含硒的膜蛋白，广泛存在于肝、肾、甲状腺、肌肉等部位，大部分T3都由这种酶催化产生。1990年，有报道采用凝胶电泳法从相关组织中分离到了IT45’D。采用放射性同位素Se75标记，发现IT45’D是一种含硒酶。1991年Berry等(Nature，1991，349438-440)在蟾蜍卵母细胞中运用克隆表达技术从鼠肝中分离到了IT45’D的互补DNA，其中含有一个TGA密码子来编码硒代半胱氨酸。IT45’D中的硒以硒代半广氨酸形式存在，并且是酶催化的必须氨基酸。抗体酶是80年代后期发展起来的新的研究领域。它将免疫球蛋白的可变区赋予了酶的属性，是具有催化活性的抗体蛋白。1986年，在单克隆抗体技术的基础上，Schultz和Lerner才分别报道了首例具有水解酶活性的单克隆抗体。在短短十几年中，抗体酶催化的反应已达到了70多种。疏水腔修饰法是抗体酶设计的最新思想。中国专利96112628．0公开了丁兰等人利用这种方法首次成功地制备出比天然酶活力高八倍的具有GSH-Px活力的抗体酶，采用谷胱甘肽衍生物为半抗原，以戊二醛共价交联到牛血清白蛋白上，得到抗原结合部位存在疏水腔的与抗原具有强结合力的抗体，将催化中心通过化学诱变的方法，引入抗原结合部位，使抗体具有GSH-Px活性。
本发明的目的是提供一种具有甲状腺素5’脱碘酶活力抗体酶的制备方法。该方法以甲状腺素为半抗原，与牛血清白蛋白连接，免疫小鼠，制备具有与甲状腺素结合能力的抗体，通过化学修饰，将IT45’D催化中心引入抗体，获得具有IT45’D活力的抗体酶。
天然甲状腺素侧链为两个卤代的苯环，具有在抗体的抗原结合部位诱导出疏水结合环境的能力，本身就是很好半抗原分子。由于天然甲状腺素不具备免疫原性，不能刺激动物产生抗体，所以首先将甲状腺素通过戊二醛连接到牛血清白蛋白上，选择个体较小，免疫机理较为清晰，免疫过程相对简单、易于操作的纯系Bab／C小鼠为免疫对象，通过对小鼠免疫，刺激免疫细胞，使其分泌具有甲状腺素结合能力的抗体。为使免疫细胞的快速分裂，以便于大规模制备抗体，将小鼠免疫细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞进行克隆化，得到分泌目的抗体的单细胞克隆。将得到的细胞株扩大培养，注射入小鼠腹腔，从小鼠腹腔中制备含有目的抗体的腹水。通过亲和层析分离纯化，提纯目的抗体。根据甲状腺素脱碘酶的催化中心的结构，将得到的具有甲状腺素结合力的抗体通过化学修饰，以苯甲基磺酰氟将抗体甲状腺素结合部位的丝氨酸的羟基活化，与硒氢化钠反应，将IT45’D的催化中心一SeH引入抗体的甲状腺素结合部位，赋予抗体IT45’D的活力。本发明的制备具体步骤如下A．全抗原的制备将T4与牛血清白蛋白以30-50∶1(摩尔比)的比例溶解于pH8-11的Tris-HCl缓冲液中，其中，T4浓度为1-5mg／ml搅拌，逐渐滴加戊二醛，反应10-24小时，加入甘氨酸终止反应，除盐，冻干。
B．单克隆抗体的制备a．免疫小鼠将抗原1-3mg／ml与福氏完全佐剂1∶1混合，摇匀，每只Bab／c小鼠注射100-300μl，两周后进行二次免疫，第四到十周每隔两周以福氏不完全佐剂免疫，用ELISA检测抗体。
b．融合及抗体制备拉颈法处死小鼠，取脾脏，无菌条件下在预先放置培养液的平皿中去除脂肪组织，压碎，吸取细胞悬液，离心，弃上清。用完全培养液反复洗涤，得到0．5-1．5×108个脾细胞。加入0．1-0．5倍数量的骨髓瘤细胞，混合，离心。弃去上清的培养液，吸取1ml聚乙二醇(PEG)／二甲亚砜(DMSO)加入细胞中，混合1分钟。
将含有PEG的细胞悬液反复洗涤，加入选择培养基，在培养板上37度、5％二氧化碳浓度下培养。一周后镜检，对明显的细胞集落孔进行ELISA，取阳性孔梯度稀释，扩大培养，进行初次克隆化。反复克隆化3-5次，即可获得单细胞克隆。
将0．5-1．5×106的杂交瘤细胞注入Bab／C小鼠腹腔或采用体外培养法，在培养瓶中，得到腹水或培养上清。
c．分离提纯抗体将腹水或体外细胞培养液离心，取上清采用亲和层析或离子交换柱提纯抗体，冻干。
C．抗体酶的制备将提纯的抗体冻干粉5-10mg溶解在1ml除氧的pH6-8的磷酸缓冲液中，加入10-30μl 20mg／ml的苯甲基磺酰氟的乙腈溶液， 室温振荡0．5-1小时，以氮气为载体通入H2Se气体10分钟或加入50-200μl预先除氧的1MNaHSe溶液，30-40度在氮气保护下反应20-40小时。将反应液离心，除盐后冻干。即制得抗体酶冻干粉。
人们过去一直认为硒蛋白在体内只是起到清除自由基和过氧化物的功能，IT45’D的发现又为硒蛋白和硒在人体内的功能研究提供了新的研究领域。天然IT45’D由于具有亲脂性、含量低等特点，使得其分离提纯困难，大大限制了其研究和应用，直到目前，人们对其机理的认识还只是一个假说。IT45’D的人工模拟酶的出现，对硒在该酶中所起到的作用及机理的假说提供了重要的证据。临床上的亚急性克汀病的症状之一就是体内T4含量高，而T3含量低，从而对整个机体的代谢产生影响。少数地方性甲状腺肿的患者在补充了碘之后，症状仍得不到缓解，这些都被认为与甲状腺素5’脱碘酶相关。天然酶不仅很难得到，而且稳定性差，使其临床应用和研究受到了限制。抗体酶具有稳定性好，易大规模制备等特点，为相关疾病治疗提供了一种可行的途径。
本发明提供的实施例如下实施例1(1)全抗原的合成将T41mg与牛血清白蛋白以50∶1(摩尔比)的比例溶解于pH9．020mmol／L的Tris-HCl的缓冲液中，搅拌，逐渐滴加等摩尔比的1ml戊二醛溶液，反应12小时，加入1ml10mmol／L甘氨酸终止反应，用20mmol／L pH 7．4磷酸缓冲液透析过夜，用紫外光谱测定半抗原连接量，每个牛血清白蛋白连接30个半抗原分子，冻干保存。
(2)单克隆抗体的制备a．免疫将全抗原2mg／ml与福氏完全佐剂以1∶1的比例混合，摇匀，每只Bab／c小鼠注射200μl，两周后进行二次免疫，每隔两周以福氏不完全佐剂免疫一次，融合前三天加强免疫。
b．抗体的检测将酶标板每孔加入100μl5％戊二醛溶液，37度保温15min，洗涤，拍干。加入100μl 1mg／ml的T4溶液，保温1小时。每孔加入200μl的0．1mg／ml的牛血清白蛋白溶液，保温1小时。加入待测血清或腹水，保温1小时。每孔加入一个活力单位的酶标二抗，保温1小时。加入底物反应液100μl，37度反应半小时，每孔加入50μl 2mmol／L硫酸溶液终止反应，用酶标仪检测。
c．融合及抗体的制备将血清检测为阳性的小鼠用拉颈法处死，取脾脏，无菌条件下在预先放置培养液的平皿中去除脂肪组织，压碎，吸取细胞悬液，离心，弃上清。用完全培养液反复洗涤，得到1．2×108个脾细胞。加入0．1倍数量的骨髓瘤细胞，混合，离心。弃去上清的培养液，吸取1ml PEG／DMSO加入细胞中，混合1分钟。
将含有PEG的细胞悬液反复洗涤，加入选择培养基，在培养板上37度、5％二氧化碳浓度下培养。一周后镜检，对明显的细胞集落孔进行ELISA，取阳性孔梯度稀释，扩大培养，进行初次克隆化。反复克隆化3次，获得单细胞克隆。
将1×106的杂交瘤细胞注入Bab／C小鼠腹腔，得到腹水。
d．抗体的分离提纯将小鼠腹腔内的腹水6000rpm／min离心15分钟，取上清，用60％硫酸胺沉淀，6000rpm／min离心20分钟，弃上清，将沉淀用pH7．0的PBS溶解，过G-25柱除盐。将洗脱液经γ-Protein A亲和层析柱分离提纯，冻干得到精制抗体。
(3)抗体酶的制备及活力测定a．抗体酶的制备将提纯的抗体冻干粉5mg溶解在1ml除氧的pH7．0的PBS中，加入20μl 20mg／ml的苯甲基磺酰氟的乙腈溶液，室温振荡0．5小时，加入100μl预先除氧的1MNaHSe溶液，30度在氮气保护下反应40小时。将反应液8000rpm／min离心，经G-25除盐后冻干。制得抗体酶冻干粉。
b．抗体酶活力测定采用放射免疫分析(RIA)法测活将抗体酶溶解在pH 7．4的700μlPBS中，加入100μl 10mM的DTT，加入10μM T4100μl，加入1f／100ml的BSA溶液100μl，37度反应半小时，加入二倍体积的预冷乙醇，6000g离心10min，取上清，将反应液稀释至1-30／100ml T4，将反应稀释液加入预先包被有T4或T3的试管中，温浴0．5小时，再加入带有放射性I125标记的T4或T3溶液，温浴0．5-1小时，测定每管的放射剂量。相同条件下以不同浓度的T4和T3制作标准曲线，在标准曲线中找出相应的T4、T3浓度。
采用放射免疫法测得抗体酶活力为275U／mgPr(U-每分钟转化底物的pmol数)实施例2(1)全抗原的合成将T4与牛血清白蛋白以30∶1(摩尔比)的比例混合于pH10的Tris-HCl 20mmol／L缓冲液中，搅拌，逐渐滴加戊二醛，反应15小时，其它反应条件同实施例1中(1)。
(2)单克隆抗体的制备a．将全抗原3mg／ml与福氏完全佐剂以1∶1的比例混合，摇匀，每只Bab／c小鼠注射200μl，两周后进行二次免疫，每隔两周以福氏不完全佐剂免疫一次，融合前三天加强免疫。
b．抗体的检测同实施例1中(2)b。
c．融合及抗体的制备将血清检测为阳性的小鼠用拉颈法处死，取脾脏，无菌条件下在预先放置培养液的平皿中去除脂肪组织，压碎，吸取细胞悬液，离心，弃上清。用完全培养液反复洗涤，得到1．5×108个脾细胞。加入0．3倍数量的骨髓瘤细胞，混合，离心。弃去上清的培养液，吸取1mlPEG／DMSO加入细胞中，混合1分钟。
将含有PEG的细胞悬液反复洗涤，加入选择培养基，在培养板上37度、5％二氧化碳浓度下培养。一周后镜检，对明显的细胞集落孔进行ELISA，取阳性孔梯度稀释，扩大培养，进行初次克隆化。反复克隆化4次，获得单细胞克隆。
将1．5×106的杂交瘤细胞注入Bab／C小鼠腹腔，得到腹水。
d．抗体的分离提纯同实施例1中(2)d。
(3)抗体酶的制备及活力测定a．抗体酶的制备将10mg提纯的抗体冻干粉溶解在1ml除氧的pH8的PBS中，加入30μl20mg／ml的苯甲基磺酰氟的乙腈溶液，室温振荡50分钟。加入200μl预先除氧的1mol／L NaSeH，40度在氮气保护下反应30小时，将反应液8000转每分钟离心后，经G-25柱除盐，冻干，制得抗体酶冻干粉。
b．抗体酶活力测定采用放射免疫法测得抗体酶活力为290U／mgPr实施例3(1)全抗原的制备将T4与牛血清白蛋白以40∶1(摩尔比)的比例混合于pH11的Tris-HCl 20mmol／L缓冲液中，逐渐滴加戊二醛，搅拌24小时，其它反应条件同实施例1中(1)。
(2)单克隆抗体的制备a．将全抗原(1mg／ml)与福氏完全佐剂以1∶1的比例混合，摇匀，每只Bab／c小鼠注射300μl，两周后进行二次免疫，每隔两周以福氏不完全佐剂免疫一次，融合前三天加强免疫。共免疫六周。
b．抗体的检测同实施例1中(2)b。
c．融合及抗体的制备将血清检测为阳性的小鼠用拉颈法处死，取脾脏，无菌条件下在预先放置培养液的平皿中去除脂肪组织，压碎，吸取细胞悬液，离心，弃上清。用完全培养液反复洗涤，得到0．5×108个脾细胞。加入0．5倍数量的骨髓瘤细胞，混合，离心。弃去上清的培养液，吸取1ml PEG／DMSO加入细胞中，混合1分钟。
将含有PEG的细胞悬液反复洗涤，加入选择培养基，在培养板上37度、5％二氧化碳浓度下培养。一周后镜检，对明显的细胞集落孔进行ELISA，取阳性孔梯度稀释，扩大培养，进行初次克隆化。反复克隆化3次，获得单细胞克隆。
将0．5×106的杂交瘤细胞注入Bab／C小鼠腹腔，得到腹水。
d．抗体的分离提纯同实施例1中(2)d。
(3)抗体酶的制备及活力测定a．抗体酶的制备将5mg提纯的抗体冻干粉溶解在1ml除氧的pH6的PBS中，加入10μl 20mg／ml的苯甲基磺酰氟的乙腈溶液，室温振荡1小时。加入50μl预先除氧的1mol／L NaSeH，40度在氮气保护下反应20小时，将反应液8000转每分钟离心后，经G-25柱除盐，冻干，制得抗体酶冻干粉。
b．抗体酶活力测定采用放射免疫法测得抗体酶活力为230U／mgPr
权利要求
1．一种具有甲状腺素5’脱碘酶活力抗体酶的制备方法，其特征在于采用以下步骤完成A．全抗原的制备将T4与牛血清白蛋白以30-50∶1(摩尔比)的比例溶解于pH8-11的Tris-HCl缓冲液中，其中，T4浓度为1-5mg／ml搅拌，逐渐滴加戊二醛，反应10-24小时，加入甘氨酸终止反应，除盐，冻干；B．单克隆抗体的制备a．免疫小鼠将抗原1-3mg／ml与福氏完全佐剂1∶1混合，摇匀，每只Bab／c小鼠注射100-300μl，两周后进行二次免疫，第四到十周每隔两周以福氏不完全佐剂免疫，用ELISA检测抗体；b．融合及抗体制备拉颈法处死小鼠，取脾脏，无菌条件下在预先放置培养液的平皿中去除脂肪组织，压碎，吸取细胞悬液，离心，弃上清，用完全培养液反复洗涤，得到0．5-1．5×108个脾细胞，加入0．1-0．5倍数量的骨髓瘤细胞，混合，离心，弃去上清的培养液，吸取1ml聚乙二醇(PEG)／二甲亚砜(DMSO)加入细胞中，混合1分钟；将含有PEG的细胞悬液反复洗涤，加入选择培养基，在培养板上37度、5％二氧化碳浓度下培养，一周后镜检，对明显的细胞集落孔进行ELISA，取阳性孔梯度稀释，扩大培养，进行初次克隆化，反复克隆化3-5次，获得单细胞克隆，将0．5-1．5×106的杂交瘤细胞注入Bab／C小鼠腹腔或采用体外培养法，在培养瓶中，得到腹水或培养上清；c．分离提纯抗体将腹水或体外细胞培养液离心，取上清采用亲和层析或离子交换柱提纯抗体，冻干；C．抗体酶的制备将提纯的抗体冻干粉5-10mg溶解在1ml除氧的pH6-8的磷酸缓冲液中，加入10-30μl 20mg／ml的苯甲基磺酰氟的乙腈溶液， 室温振荡0．5-1小时，加入50-200μl预先除氧的1MNaHSe溶液，30-40度，在氮气保护下反应20-40小时，将反应液离心，除盐后冻干，制得抗体酶冻干粉。
全文摘要
本发明属于具有甲状腺素5’脱碘酶活力抗体酶的制备方法。该方法以甲状腺素为半抗原,通过共价交联的方法,与牛血清白蛋白连接,制备成全抗原,采用单克隆抗体技术,制备具有甲状腺素结合能力的抗体,通过化学修饰,将甲状腺素脱碘酶的催化中心－SeH引入到抗体的抗原结合部位,赋予其甲状腺素脱碘酶的活性。制得的抗体酶稳定性好,活力达290U/mgPr。
文档编号C12P21/08GK1294192SQ99121250
公开日2001年5月9日 申请日期1999年10月22日 优先权日1999年10月22日
发明者赵大庆, 陈默, 廉革伟, 林凤, 丁兰, 刘仔, 倪嘉缵 申请人:中国科学院长春应用化学研究所