专利名称：逆流透析式空间细胞培养器及培养方法
技术领域：
本发明涉及空间生物技术，特别是涉及采用逆流透析方式进行组织培养的方法和培养器。
空间微重力环境下，重力沉降趋于消失，为细胞三维生长和细胞高密度培养创造了前所未有的条件和机会，为内源性药物(来源于哺乳动物和／或高等植物细胞的分泌)的开发和生产开辟了诱人的前景，故80年代以来，空间制药一直是美欧诸国空间计划的重要组织部分。但空间微重力环境下在重力对流亦趋于消失。单纯靠扩散来维持细胞生长所必需的化学微环境的稳态是不可能的。必须对传统的细胞培养方法作根本性的改变——进行动态培养(培养液流动更新，氧和二氧化碳动态交换)。另一方面，普遍应用于发酵工业(微生物培养)的搅拌方法，(包括机械搅拌、气升法，而且气升法在微重力环境里无效)所造成的机械和流动应力很容易损毁哺乳动物(或高等植物)细胞，造成局部坏死，因而不适用于空间细胞培养。因此，空间缰胞动态培养方法技术和装置的研究成了空间细胞培养的关键技术之一。
与本发明关系较为接近的技术如文献1．美国的薄膜生物反应器(Thin FilmBioreactor，Adv．Space Res．1989，P．111)，它实际上是一个双层薄膜袋，内囊为细胞培养室，壁面可透析，代谢产物进入夹层间流走。培养室内有新鲜培养液入口，可间歇性喷注新鲜培养液。该方法的主要缺陷是培养液间歇性的喷注本身破坏了空间微力环境(对所培养细胞来说)，而且培养器内流动比较紊乱，这将不可预测地影响细胞的代谢，甚至引起质变，因而这一技术对以空间制药为目标的细胞培养来说是不适宜的。
另一种可以考虑的技术是中空纤维细胞培养器，这在地面上也已广为使用。在这种培养器里，气体或培养液从中孔纤细管中流过，管间间隙为细胞培养空间。该方法的根本缺陷是营养液和O2的供给(相应的CO2和代谢产物的排出)在空间内很不均匀，在终端附近很容易造成传质‘死区’并导致细胞坏死。合理地选择中孔纤维直径与长度比(λ=d／1)，情况会有所改善。但实际上，合理的λ不仅因培养细胞而异，而且在细胞培养过程中是随时间变化的。此外，(i)氧和营养的供给不仅沿纵向(顺中空纤维管轴)很不均匀，而且在培养空间横断面(凹弧三角形和／或凹弧菱形)上也很不均匀，易于形成‘死区’；(ii)中空纤维管内的流动阻力与管(内)径平方成反比。为了提高传质效率，在一定的总容积下，希望增加中空纤维数量，这必然导致流动阻力剧增。由于空间飞行成本高昂，要求空间细胞培养器有效载荷高，而功耗低。显然，中空纤维式细胞器不适宜于空间实验。
本发明目的在于克服上述问题，为了降低整个系统流动阻力和功耗，以符合空间使用需要，来提高在空间细胞培养的产率；从而提供一种培养区内细胞能够得到比较均匀(空间上)的营养和氧供应，并能及时带走代谢产物，以维持细胞化学微环境的稳态；以及培养液的流动不干扰空间微重力环境，且培养细胞所受的机械力保持低水平的逆流透析式空间细胞培养器及培养方法。
本发明的目的是这样实现的本发明基于鱼类鳃呼吸气(溶于水)——血交换的生物力学原理。如附
图1．所示，鳃内溶氧水流动方向和血管内血液流动方向相反，这样，右端水含氧量低，但相应的血液含氧量亦低；左端血液含氧量高，而相应的水的氧量亦高。因而，沿着流动方向，毛细血管壁(半透膜)两侧氧浓度差趋于均匀，所以，鱼类能充分利用水中的溶氧，气／血交换效率高。这是自然选择的结果。
本发明的逆流透析式空间细胞培养器包括以下几部分n个细胞培养器和n+1个培养液流动室组成，其中每个细胞培养室与培养液流动室之间用气／液半透膜隔开，并且连接成一层状整体，要求每层高(H)与宽(W)之比为H／W＜＜1；当第一层培养液流动室的培养液进口开在右侧，流动出口端开在左侧，反之也可以；第二层培养液流动室的培养液出口开在右侧，进口开在左侧，而与第一层相反，当培养器有多层时依次类推。要求培养液流动室进口和出口截面形成均为矩形(H×W)；还可以把细胞培养室、培养液流动室作成多层同心圆筒套装成一体，细胞培养室的内外同心圆筒为供给培养液的培养液流动室，两圆筒之间均用液／液半透膜固定在一镂空支架上的复合结构隔开；也可以在细胞培养室内、外层同心圆筒中分别流过新鲜培养液和气体，相邻圆筒间分别用液／液半透膜和气／液交换膜隔开。
培养液输运部分结构如下分流阀与培养液流动室的进口连通，分流阀另一出口通过气／液分离器连接气／液交换器气／液交换器的两出口分别与稳压调压阀和余气收集器连通；稳压调压阀再与气源。汇流器通过两根管道分别与阻尼器连通到培养液流动室的进口；汇流器另一出口通过管道连通透析分离器和代谢物收集器；透析分离器与培养液储存器和恒流泵连通再与气／液交换器相连通。
本发明的逆流透析式空间细胞培养方法的原理如图2和图3所示。图-2为人和哺乳动物微循环流动中，血液和周围组织进行物质交换的三种类型。(a)类称为流量限止，O2、CO2等物质的输运属于此类，在图中用——表示；(c)类称为扩散限止，大分子输运大多属此，图中用-×-×-表示；(b)类为理想情况，用-·-·-表示(图中Cα／Cα0为α组元的相对浓度，Cα0为进口浓度；x为离进口的距离，1为流道总长)。不论哪种类型，流动出口端(末端)细胞培养室——培养液培养液流动室之间物质交换的状况均不佳，(a)类尤其如此，形成了死区。
本发明采用逆流式双向灌流，如图-3所示，图中2、3为培养液流动区，二者流动方向相反，流量相等，故称为逆流式。1为细胞培养区，它和2、3之间均用半透膜隔开；氧、CO2、小分子、蛋白质分子等能透膜输运，但细胞不能通过。相对于细胞培养室来说，培养液培养液流动室Ⅰ的进口与培养液流动室Ⅱ的出口处于同一空间位置，而Ⅰ的出口与Ⅱ的进口处于培养室另一末端同一空间位置。这样，如图-3所示(以均衡状态(b)为例)，培养室内O2和营养的供应沿纵向趋于均匀，避免了死区的发生(对于(a)类，即流量限定型，只要调节培养液流动室内培养液的流量，就可以使它趋于(b)类，乃至(c)类，如果需要的话)。至于培养室内CO2和代谢产物的排出，情况亦然。这样，使得培养金内细胞生长所必需要氧和营养供应得到了根本的改善，在空间分布上趋于均匀，避免了‘死区’。
本发明的方法按以下步骤进行，按常规灭菌消毒后，装配成型。(1)让细胞培养室和两侧培养液流动室均充满新鲜培养液。排除其中的气泡后，接种细胞，并密封培养室；(2)启动供液系统，两侧培养室内新鲜培养液(氧饱和)以相同的流量，作逆向灌流。流量的大小则因所培养细胞的氧耗率，生长速率而异；(3)根据具体培养的细胞的种类，在培养过程中，调节培养液流动室的流量和压力分布。(3)培养室流量和压力分布由图5所示，培养液流动系统中的恒流泵(12)和阻尼器(16)、(17)调控。(4)培养液组分因细胞而异(常规)，只是强调要让新鲜培养液的溶氧量达到饱和程度；本发明的优点和效果1逆流供液(含供气)使得细胞培养区内的细胞能得到比较均匀(空间上)的营养和氧供应，并能及时带走代谢产物，以利于维持细胞生长所需的化学微环境的稳态。与已有技术相比，培养区传质情况有质的改善。
2培养区内流动缓慢流体应力比培养液流动室低3个量级左右，不干扰微重力环境，且不损坏细胞。
3整个系统流动阻力低，在培养空间容相同的条件下，比中空纤维培养器功耗低2～3个数量级。
下面结合附图和实施例对本发明进行详细地说明图1为鱼类鳃呼吸气／血交换生物力学模型；图中■表示血流动路径，□表示气流动路径。
图2为微循环传质三种类型；图中a--表示流量限止；b-·-·-表示均衡；c--X--X-表示扩散限止。
图3a、b为逆流透析式细胞培养器原理4为二维逆流透析式细胞培养器示意5为逆流透析式细胞培养器的培养液输运部分路径6为二维逆流透析式细胞培养器结构示意7(a)为双室三通道片层式逆流透析式细胞培养器结构示意图(b)双室三通道层式逆流透析式细胞培养器培养液流动示意8(a)为轴对称逆流透析式细胞培养器结构示意图(b)表示图8(a)中半径为R1、R2、R3的三个同心园筒示意图逆流式细胞培养器原理可以通过多种方案实施，下述三种方案尤为简单、实用。
本实施例的培养液输运部分路径图如5所示，在图中包括(12)恒流泵；(13)气／液交换器；(14)气／液分离器(15)分流阀； (16)(17)阻尼器；
(18)汇流器； (19)透析分离器；(20)培养液储存器；(21)气源；(22)稳压调压阀； (23)余气收集器；(24)代谢物收集器；连接路径如图5所示。
其中分流阀(15)与培养液流动室的进口(6)、(7)连通，分流阀(15)另一出口通过气／液分离器(14)连接气／液交换器(13)，气／液交换器(13)的两出口分别与稳压调压阀(22)和余气收集器(23)连通；稳压调压阀(22)再与气源(21)。汇流器(18)通过两根管道分别与阻尼器(16)、(17)连通到培养液流动室的进口(8)、(9)；汇流器(18)另一出口通过管道连通透析分离器(19)和代谢物收集器(24)；透析分离器(19)与培养液储存器(20)和恒流泵(12)连通再与气／液交换器(13)相连通。
由于在同样培养空间下，流动空间隙宽度H＞＞di(中孔纤维管内径)，故在同样粘度，同样流量下，片层透析式细胞培养器的流动阻力远远小于同样培养容积下中孔纤维细胞培养器的流动阻力小2-3个量级即，在同样条件下，后者的功耗约比前者高2～3个数量级。故片层透析式细胞培养器能满足空间培养低功耗的要求。细胞培养区内的流动是通过半透膜流体渗滤引起的，按Starling定律，单位面积上通过半透膜的渗滤流量m为m=k[(p(x)-pc(x))-(π-πc)]这里k是膜渗滤系数，决定于膜材料特性和微孔孔径。p(x)是培养液流动室压力，pc(x)是培养室压力，π和πc为培养液流动室和培养室渗透压。m(x)的存在将以极低的速度在培养室内形成流动(渗流)，由于其速度极低，速度梯度亦很小，故培养区内流体应力很小，但却有利于培养室内的物质输运，有利于细胞培养。
实施例2按图-7制作一双室三通道片层细胞培养器。即n=2的培养器。它实际上是由两个片层细胞培养器和三个培养液流动室连接而成，示意如图-7。图中(1)、(25)为细胞培养室；(2)、(3)、(26)为培养液流动室。(29)为盖板；(6)、(7)、(30)为培养液进口；(8)、(9)、(31)为培养液出口；其中培养液流动室(3)的两侧壁亦均为液／液半透膜(5)(4)和(28)(27)，通过它们同时为第一个细胞培养室(1)和第二个细胞培养室(25)供气、供营养。其培养液供液输运部分与实施例相同。
实施例3按图8制作一轴对称逆流透析式细胞培养器由三个同心园筒R1、R2、R3构成，三个同心园筒R1、R2、之间用液／液半透膜固定在镂空支架上的复合结构隔开，即细胞培养室内、外壁均为液／液半透膜或液／气交换膜-镂空支架复合结构，如图--8(a)，(b)所表示的。R1空间(3)和(R3--R2)空间(2)为培养液流动室，二者流动方向相反。(R2-R1)空间(1)为细胞培养室。(6)、(7)分别为培养液流动室(2)和(3)的进口；(8)、(9)分别为培养液流动室(2)和(3)的出口，(10)为细胞接种口，(11)是培养室培液溢流出口。其培养液供液输运部分与实施例相同。
从传质效果来说，轴对称逆流透析式细胞培养器和二维逆流透析式细胞培养器等效的。对空间培养来说，后者空间利用效率高于前者，且有利于温控；但前者(轴对称型)在地基模拟方面优于前者，而且可流动式(2)、(3)可以有多种安排，既可二者同时供液，亦可内筒为培养液流动室，外筒为气体培养液流动室。
权利要求
1. 一种逆流透析式空间细胞培养器，包括培养器主体、供液输运部分，其特征在于培养器主体由n个细胞培养室和n+1个培养液流动室组成，其中每个细胞培养室与培养液流动室之间用气／液半透膜隔开，并且连接成一层状整体，当第一层培养液流动室的培养液进口开在右侧，流动出口端开在左侧，反之也可以；第二层培养液流动室的培养液出口开在右侧，进口开在左侧，而与第一层相反，当培养器有多层时依次类推；培养液输运部分结构的分流阀与培养液流动室的进口连通，分流阀另一出口通过气／液分离器连接气／液交换器气／液交换器的两出口分别与稳压调压阀和余气收集器连通；稳压调压阀再与气源。汇流器通过两根管道分别与阻尼器连通到培养液流动室的进口；汇流器另一出口通过管道连通透析分离器和代谢物收集器；透析分离器与培养液储存器和恒流泵连通再与气／液交换器相连通。
2. 按权利要求1所述的一种逆流透析式空间细胞培养器其特征在于所说的n个细胞培养室和n+1个培养液流动室的n为整数。
3. 按权利要求1所述的一种逆流透析式空间细胞培养器，其特征在于培养器主体每层高与宽之比为＜＜1。
4. 按权利要求1所述的一种逆流透析式空间细胞培养器，其特征在于培养液流动室进口和出口截面形成均为矩形。
5. 按权利要求1所述的一种逆流透析式空间细胞培养器，其特征在于还包括把培养器主体的细胞培养室、培养液流动室作成多层同心圆筒套装成一体，细胞培养室的内外同心圆筒为供给培养液的培养液流动室，两圆筒之间均用液／液半透膜固定在一镂空支架上的复合结构隔开。
6. 一种应用权利要求1所述的逆流透析式空间细胞培养器进行空间细胞培养的方法，其特征在于按常规灭菌消毒后，装配成型后依以下步骤进行(1)让细胞培养室和两侧培养液流动室均充满新鲜培养液。排除其中的气泡后，接种细胞，并密封培养室；(2)启动培养液输运部分流动路径，两侧培养室内新鲜氧饱和培养液以相同的流量，作逆向灌流；流量的大小则因所培养细胞的氧耗率，生长速率而异；(3)根据具体培养的细胞的种类，在培养过程中，由恒流泵和阻尼器调控调节培养液流动室的流量和压力分布。
全文摘要
本发明涉及空间生物技术中采用逆流透析方式进行组织培养的培养器和方法。培养器包括n个细胞培养器和n+1个培养液流动室组成,其中每个细胞培养室与培养液流动室之间用气/液半透膜隔开,并且连接成一层状整体,当第一层培养液流动室的培养液进口开在右侧,流动出口端开在左侧,反之也可以;第二层培养液流动室的培养液出口开在右侧,进口开在左侧,而与第一层相反。培养方法其特征在于:按常规接种后启动供液系统,两侧培养室内新鲜培养液(氧饱和)以相同的流量,作逆向灌流。流量的大小则因所培养细胞的氧耗率,生长速率而异。
文档编号C12M3/06GK1290744SQ9912591
公开日2001年4月11日 申请日期1999年12月9日 优先权日1999年12月9日
发明者陶祖莱, 高克家, 唐泽眉, 王战会, 高宇欣, 王翠茹 申请人:中国科学院力学研究所