可在植物中诱导的启动子,含有该启动子的序列和由此获得的产物的制作方法

专利名称：可在植物中诱导的启动子,含有该启动子的序列和由此获得的产物的制作方法
的序列和由此获得的产物本发明涉及可被生物或非生物压力(stress)，特别是病原体，诱导的一套植物启动子及其用途，还涉及含有所述启动子和目标基因的表达载体和转化了所述载体的细胞和/或植物。本发明还涉及获得所述细胞或植物的方法，所述转化植物具有对所述病原体改良的抗性。
真菌、细菌或病毒引起的疾病是葡萄栽培业中的主要问题，涉及所产葡萄汁和葡萄酒的质量(例如灰葡萄孢(Botrytis cinerea)是灰霉病病因，它侵袭葡萄收获期的浆果并在葡萄酒中产生不良味道)，减产(例如叶病如葡萄霜霉病或葡萄白粉病，葡萄孢属(Botrytis)侵袭花，或与存在G.F.L.V.(葡萄扇叶病毒，Grape Fan Leaf Virus)相关的葡萄树扇叶病)，甚至葡萄园的生存(例如木质疾病如eutypiosis或esca综合症)。传统控制方法包括从简单预防到植物保护处理，迄今为止，生物控制则应用极少。
化学控制自然是应用最广的方法，虽然现在越来越控制这种处理(例如，预测葡萄霜霉病威胁的模型)。例如对于杀真菌剂，占法国耕地约10％的法国葡萄园每年使用该国所消耗杀真菌剂的接近40％。在欧洲，接近4百万公顷的葡萄园每年进行9-10次处理以控制这些疾病，用掉120，000吨杀真菌剂。
仅仅就灰霉病的问题而言，考虑1992年到1993年3.7百万公顷欧洲葡萄园的25-30％，估计分别耗费97和69百万德国马克(DM)的植物保护产品。
使用这些产品会产生环境后果(例如，用于消灭线虫的土壤熏蒸剂是葡萄扇叶病毒的传播媒介)。有时还会造成技术问题，包括在发酵中碰到的困难(使用固醇生物合成抑制剂会在发酵结束时妨碍酵母的生长)和商业上的困难(抗葡萄孢属产品腐霉剂有时会在葡萄酒中发现，因此在1990到1991年间美国人曾为此争论)。
而且，使用这些产品已经导致出现抗性株。这种现象在香槟地区特别显著，一些年来，“Comit_ Interprofessionnel des Vins de Champagne”(CIVC)(香槟地区酒类行业间委员会)已建议不要用化学药剂处理防治葡萄孢属真菌。
为了克服这些缺最，急需开发新的控制方法平衡植物保护产品的使用，以显著减少撒播在葡萄园中的这些产品数量。
目前可设想两种方法*加强预防，减少所用产品数量(栽培方法和预防控制，预测疾病危险的模型，新型撒播材料，更易降解的新分子等)。
*改良葡萄品种对疾病的抗性。
对于第二种方法，根据法国对Appellations d’Origine Contr_l_e，(A.O.C.)(初始注册名称)的立法，通过有性途径的传统遗传学改良是不可能的，因为该立法对用于一个给定称谓(名称)的葡萄树品种作了限制。此外，在技术上，作为木本植物的葡萄树需要数十年来整合一或多个新的抗性特征而同时又保持该葡萄树品种的生物化学和芳香特征，这些生物化学和芳香特征是所产葡萄酒的感官性能品质的原因。
本申请人公司的实验室研究组自1988-1990年以来已进行了葡萄树再生和遗传转化的控制，这使得可以设想采用现代细胞和分子生物学技术增强葡萄树品种对真菌疾病的耐受性。
因此，一方面可将一个或多个同源或异源基因整合至植物基因组，表达或超表达蛋白质性质的目标分子，和/或开启一个新的生物合成途径，另一方面，可再生对一种或多种疾病具有更强耐受性的植物，也就是说，对所述病原体的防卫机制增强的植物。
在植物中有几种不同的该类型防卫机制。一些机制可被认为是被动的，与植物的细胞、表皮组织和/或器官的物理化学特性相关(例如葡萄串的表皮或形态学特性)。其它机制涉及基因/基因相互作用的动力学(植物抗性基因和病原体无毒基因，宿主/病原体相互作用机制)。尽管这些相互作用会导致出现超敏反应(为阻止真菌、细菌或病毒在植物中建群，在感染位点周围植物细胞的快速死亡)，其也会导致一整套化合物的合成和积累。其中，一些是参与感染点周围“物理”屏障形成的周壁成分(愈创葡聚糖、木质素、富含羟脯氨酸的蛋白等)，而其它的化合物是具有抗微生物功能的或多或少已有描述的分子(植物抗毒素、病原体相关蛋白PR蛋白(致病相关蛋白)，等)。
这些具有抗微生物功能或参与感染位点周围“物理”屏障形成的分子的超表达可使植物具有一种对压力，尤其是微生物类型压力的“天然”的抗性。
然而，这类蛋白的组成型超表达必然对植物不利(能量消耗、生长减缓等)，这就是为什么必须设想采用可诱导的尤其是可被压力本身诱导的启动子。这正是本发明的主题。
本发明涉及一种核酸序列，其选自a)IND S1序列，和b)与IND S1序列片段相应、并在植物中具有启动子序列作用的任何序列。
本发明还涉及植物中的启动子，其选自a)与IND S1序列相应的PMs PR10-1启动子，b)与根据本发明的序列相应的PMs PR10-1类型的启动子。
所述PMs PR10-1型启动子优选与IND S1序列有至少80％同源性。该启动子尤其优选与所述序列有至少90％或95％同源性。包含至少一个与上述启动子序列相同的序列的植物启动子序列也包括在本发明之内。
最特别地，本发明的主题涉及本发明的启动子，以可在植物中被生物或非生物压力诱导的方式，进行基因的组织特异性或非组织特异性表达的应用。
在本发明的所述生物压力中，尤其优选由寄生物如病毒、细菌、酵母或真菌侵袭造成的生物压力。
在本发明的所述非生物压力中，尤其优选由机械损伤例如特别是昆虫或物理现象如风或霜引起的损伤造成的非生物压力。
本发明的启动子或启动子序列可用于制备植物表达系统，根据转化的植物组织或器官不同，该系统可是诱导型和/或组成型的(参见实施例2、3和4)。
这些启动子获自苜蓿PR蛋白的调节序列。利用苜蓿(紫苜蓿，MedicagoSativa)和丁香假单胞菌豌豆致病变种(Pseudomonas syringae pv pisi)之间的宿主/寄生物关系产生的不相容反应(超敏反应，HR)，可研究负责该反应的启动子。
假单胞杆菌属(Pseudomonas)侵袭苜蓿时，在细菌感染区域观察到植物反应的出现。
因此，取细菌侵袭后的植物材料以构建坏死邻近的感染区域产生的信使RNA的cDNA文库。采用豆科植物的PR蛋白基因保守基序相应的合成寡核苷酸，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，可产生放射性探针，然后将该探针用于在cDNA文库中筛选转录本。其中一个转录本因测序后表现出与已知其它植物来源的相应PR蛋白编码基因有良好的同源性而被采用(参见图1和1a，显示分离该启动子的一般方案)。
分析显示，根据van Loon(1994)分类，其相应于编码第10类PR蛋白的基因。因此该基因命名为Ms PR10-1(紫苜蓿第10类PR蛋白，克隆1)。
本发明的另一个主题是在植物中表达基因的系统，其特征在于其至少包含处于本发明的启动子或序列的控制之下的所述基因的序列。在本发明的表达系统中，优选表达载体，尤其是质粒型表达载体。优选的是，所述表达载体具有可转移至农杆菌(Agrobaterium)株系的特征。
本发明的另一个主题是本发明的在植物中表达基因的系统或载体，其特征在于它可被生物或非生物压力诱导，所述压力优选以上描述的生物或非生物压力。
本发明还涉及根据本发明的系统或载体，其特征在于所述基因是目标基因。
目标基因可是可在任何产业(包括农业)中使用或希望进行修饰的基因。除了已提到的农业外，所述产业还包括例如农业食品工业、化妆品工业、医药工业、化学工业等。当然这些例子不是限制性的。
因此，所述基因可是例如农学上感兴趣的基因或能使植物产生具有人类或动物营养或健康价值的物质的基因。在农学上感兴趣的基因中，请注意例如其表达可改变植物的生理例如特别是抑制、减缓、加速或触发植物生命中一定时期涉及的步骤或现象，的任何基因，或其表达可改善或降低植物对物理、化学或生物侵袭抗性的任何基因。能使植物产生具有人类或动物营养或健康价值的物质的目标基因，是指例如编码药物或酶化合物(可用于有机化合物的生物合成或生物降解)或具有营养价值的化合物的基因，或可修饰或抑制药物、营养物质或有毒化合物或芳香化合物表达的基因。
本发明尤其包括根据本发明的系统或载体，其特征在于所述目标基因是参与对生物或非生物压力优选诱导性生物或非生物压力反应的基因。
优选地，本发明涉及根据本发明的系统或载体，其特征在于生物或非生物压力是寄生物侵袭，而且目标基因是所述寄生物的抗性基因。
更优选地，本发明包括根据本发明的系统或载体，其特征在于寄生物是病毒、细菌、酵母或真菌，并且目标基因是参与合成具有抗病原体功能的分子的基因，优选参与合成植物抗毒素或PRs的基因。
使这些基因获得表达的构建体除了包含目标基因外，自然还包含尤其是编码链3’端的聚腺苷酸化序列和所述基因或其它基因的增强子序列。
很自然地，有必要修饰所述构建体以确保所述基因与启动子以正确阅读框阅读，并且很明显，可以设想，如果有必要可使用相同类型的若干启动子和若干增强子序列。
还可采用根据本发明的启动子表达几个串联的或位于不同表达系统上的基因。
在可用根据本发明的构建体表达的目标基因中，应提及的是，这些基因可置于PMs PR10-1启动子控制下，以便激活植物对类病毒、病毒、植物原生质(phytoplasmas)、细菌和真菌等植物病原体的抗性机制，甚至是对昆虫或害虫的抗性机制(启动子还可被创伤诱导，特别是在烟草中如此)。
可能的策略可参考如下综述LAMB等，1992；VAN LOON等，1994；BROOGLE和BROOGLE，1993；CHET，1993和PAPPINEN等，1994。
作为例子，可提及编码如下蛋白的基因，无论它们是同源的亦或异源的- 水解酶如壳多糖酶(BROOGLE等，1991)或β1-3葡聚糖酶(KAUFFMAN等，1987)，或编码这两个酶的基因的组合，- PR蛋白(VAN LOON等，1994)如渗透蛋白(LIU等，1994；ZHU等，1995)，奇异果甜蛋白样PR蛋白(VIGERS等，1992)或第1类PR蛋白(CUTT等，1989；HAHN K.和STRITTMATTER G.，1994)，- 植物(LOGEMANN J.等，1992)或其它生物或微生物的RIP蛋白(核糖体失活蛋白)，- 对真菌侵袭酶有抑制作用的蛋白蛋白酶抑制剂(MASOUD等，1993)，多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(TOUBART等，1992)或其它抑制蛋白，- 凝集素或壳多糖结合蛋白(BROEKAERT等，1989；LERNER和RAIKHEL，1992)，- 蛋白质如(T4)噬菌体或哺乳动物溶菌酶(DURING等，1992)，- 参与植物抗毒素生物合成途径的蛋白(HAIN等，1993)，- 抗微生物肽如防卫素(BROEKAERT等，1995；VIGERS等，1991；TERRAS等，1995)，- 参与或触发超敏反应(STRITTMATTER等，1995)的病原体抗性蛋白(DEWIT，1992)，或导致产生过氧化氢的酶(WU等，1995)，- 导致产生抗真菌、抗细菌或抗昆虫毒素的蛋白质(KINAL等，1995)，- 具有可干预木质素聚合反应(LAGRIMINI等，1987)或其它氧化反应(BRADLEY等，1992)的过氧化物酶功能的蛋白质，- 来源于病毒的蛋白质，如处于正义或反义位置(见BEJARANO和LICHTENSTEIN，1992)的病毒衣壳蛋白，- 参与合成触发应激机制(stress mechanisms)信号转导链的分子(茉莉酮酸，水杨酸)的蛋白质，或本身作为压力信号或介入该信号转导链的蛋白质(系统素，GTP结合蛋白)(见SCHEEL等，1991；VERMA等，1994；VERA-ESTRELLA等，1994)，- 昆虫毒性蛋白(VAECK等，1987)。
上述列表是非限制性的。
本发明的另一个主题是采用本发明的系统或载体转化的植物细胞。优选所述细胞是葡萄树细胞，而且目标基因是赋予寄生物抗性的基因。
本发明还涉及获得细胞的方法，其特征在于植物细胞采用微生物学技术包括根据本发明的表达系统或载体转化。
可提及的最常用转化方法尤其是那些使用农杆菌(Agrobacterium)的方法，所述农杆菌是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。
这些技术是已知的，这里不再详述。
利用质粒系统的技术首先是实施质粒向感受态菌株(通常是大肠杆菌)的转化，以控制质粒结构，然后，使用该菌株将重组质粒转移至农杆菌菌株，再用农杆菌株转化植物细胞。
本发明还涉及通过该方法获得的转化植物细胞。
本发明还包括获得表达目标基因的植物的方法，其特征在于采用本发明的系统或载体转化所述植物的植物细胞，筛选表达所述基因的细胞，和从这些细胞再生植株。
本发明还包括含有本发明的系统或载体和/或本发明的细胞的植物，优选通过实施本发明的方法获得的植物。
特别应当注意的是，采用诱导型启动子的本发明构建体可转化各种不同植物，特别是烟草(Nicotiana benthamiana)、苜蓿(百脉根(Lotuscorniculatus))和葡萄树(Vitis sp.)。
而且，还可在从细胞再生植株的过程中展示本发明启动子的优点。具体地，采用组成性启动子的相应结构的启动子从没有获得再生植株，可能因为防卫蛋白的产生非常迅速地导致细胞坏死，从而阻止了再生。这是本发明的构建体在一些植物转化和再生系统中的另一个优势。
本发明的构建体和方法的其它特性和优点将通过以下实施例来说明。


图1和1a表示分离与IND S1序列相当的可诱导启动子PMs PR10-1的方法各步骤的一般方案。
图2表示与DNA-PR7中检测到的内部Bam HⅠ位点(B)划分的该cDNA5’-和3’-部分发生Southern杂交的各种分离克隆。
限制性位点E=EcoRⅠ，B=Bam HⅠ图中所示值以kb(千碱基)表示。
图3相应于IND S1序列的DNA序列，其是苜蓿可诱导启动子PMsPR10-1的分离的基因组序列。
实施例1含有苜蓿PR蛋白基因调控序列的基因组克隆的产生产生用于寻找启动子的探针(参见图1和1a)利用苜蓿(紫苜蓿)和丁香假单胞菌豌豆致病变种的宿主/寄生物关系中的不相容反应(超敏反应，HR)，可构建cDNA文库。从细菌感染引起的坏死邻近区域抽提并纯化信使RNA，再由此制备cDNA文库。植物材料取自细菌悬液浸润后6小时。
已知豆科植物的PR蛋白具有保守基序；这些保守基序根据已完成的豌豆和大豆PR蛋白测序来确定，因此，可合成相应于这些基序的寡核苷酸。可用PCR扩增获取放射性探针，然后用于在上述cDNA文库中筛选转录本。采用其中一个测序后显示与豌豆和大豆PR蛋白编码基因有87％同源性的克隆cDNA-PR7。分析显示该克隆实际上相应于根据VAN LOON等(1994)分类法的第10类PR蛋白的编码基因。将该克隆命名为Ms PR10-1(紫苜蓿PR第10类蛋白，克隆1)。
通过Northern印迹法对苜蓿进行的对照实验显示，不相容反应中相应转录本在感染后3小时内开始积累，在24至48小时间达到最大，72小时后缓慢减少。
该片段的特征是存在一个内部BamHⅠ位点(图2中标示为B)，它将该片段划分为两个部分- 5’端部分，约340个碱基，包括ATG上游区(转录但不翻译)和304个碱基的下游序列。- 3’端部分，包括编码部分的末端即165个碱基，和非翻译3’区即从终止密码子至多聚A开始的186个核苷酸。分离含有PR蛋白启动子的基因组克隆*基因组克隆的分离本实验采用了用EMBL4(滴度7×108p.f.u.(噬斑形成单位)/ml)制备的苜蓿基因组文库，以6×105p.f.u.铺平板。以Ms PR10-1(cDNAPR7)的5’片段作为探针筛选该文库，45个克隆出现信号，其中13个克隆有强信号。限制性作图和采用Ms PR10-1的5’和3’片段进行的杂交表明有7个不同的克隆(参见图2)。比较筛选该文库获得的这7个克隆的大小(9.3；6.5；6.1；5.8；4.8；4.2；2.2kb)与苜蓿基因组DNA印迹检测到的条带的大小，显示出这两组实验数据间很好的一致性(参见图2)。因此，由此可推断PR7蛋白编码基因属于一个小的多基因家族。
然后，将这些克隆(除了克隆C12)的(EcoRⅠ/EcoRⅠ位点)片段的整体或部分亚克隆，并进行测序。
*测序首先选择了一个克隆即克隆C15(参见图1a)用于测序。
最初的测序工作显示在PR蛋白编码基因的开放阅读框中存在一个约315个核苷酸的内含子。BamHⅠ消化该克隆后，对其进行了研究(参见图1a)。克隆C156.1kb用EcoRⅠ和BamHⅠ分析该克隆，可获得两个片段，即E-B(约2.4kbp)和B-E(约3.7kbp)。测序并比较(被600个核苷酸的内含子中断的)该编码序列和Ms PR10-1(cDNA PR7)的序列，结果表明该基因组克隆与该参考cDNA完全相同。
*在苜蓿-假单孢杆菌属系统中分析分离克隆的表达这些实验涉及克隆C15，采用5’延伸技术以确定在防卫反应诱导过程中实际转录的信使分子。该技术的另一个优点是可定位转录起始位点。结果说明，实际上在苜蓿/假单孢杆菌属相互作用中，克隆C15在叶子的防卫反应诱导过程中表达。实施例2为验证分离克隆的启动子活性进行遗传转化所用启动子区用于验证性转化的两个启动子是对照启动子和分离自苜蓿基因组、源于C15的PR启动子(即PMs PR10-1启动子)。
*CaMV-35S启动子该启动子是所谓的组成型启动子，按常规方式使用。它相应于调控花椰菜镶嵌病毒(CaMV)35S RNA亚基基因转录的序列。用于构建gus报告基因结构的启动子区实际上是该启动子的一部分，该部分以EcoRⅠ/BamHⅠ片段的形式从质粒pDH51(PETRZAK等，1986)中重新分离。
*PR启动子对C15基因组克隆的启动子区域进行研究。以下称该启动子为PMsPR10-1。
PMs PR10-1它来源于克隆C15的2.4kb的gcoRⅠ/BamHⅠ(E/B)片段(图1a)。由于克隆C15的TATA盒(转录起始)和ATG(翻译起始)间没有限制性位点，所以将该片段整合至二元质粒的报告基因上游(见下)是困难的。因此进行缺失实验，直到获得一个约1.5kb的片段(序列IND S1)。然后通过平端连接在所获片段上添加一个BamHⅠ位点，以便将其插入下面使用的不同编码序列的上游。因此，参照用于克隆该片段的cDNA，除上游启动子区域外，该片段包括Ms PR10-1基因的5’UTR(非翻译区)的39个末端核苷酸(其距离起始ATG密码子10bp)，Ms PR10-1基因的ATG，以及紧密位于整合的BamHⅠ位点上游的一小段该基因编码区片段(10bp)。考虑到克隆位点，以此方法构建的该启动子具有一个潜在的ATG，因此在构建嵌合基因时会存在相距很近的两个ATG密码子。这样就会有改变所用基因(报告基因或农业上感兴趣的基因)编码框的危险。
对于用报告基因进行的转化实验，采用的是已克隆在STRATAGENEBluescript pSK+/-质粒中的非修饰形式的PMs-PR10-1(PRI)。它可以以约1.5kb的EcoRⅠ/BamHⅠ片段的形式再分离。
*所用质粒a)p35S-gus intron(VANCANNEYT等，1990)该质粒是pBin19(BEVAN，1984)的衍生物，同样具有二元质粒的左右边界，使用农杆菌可将位于这两个边界之间的片段插入植物中。
gus-intron(源于马铃薯LSI基因的内含子)报告基因的开发可消除由农杆菌污染引起的假阳性(尤其是瞬时表达过程中)。这些细菌不能拼接内含子。
按常规方式，该基因编码β-葡糖醛酸酶，在使用特定底物(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸)时会产生蓝色反应。该蓝色说明所分析的植物已被转化，从而说明该酶基因的编码序列获得了转录，因此也说明控制该基因的启动子获得了诱导。
b)pBR97该质粒由参加测试启动子效率课题的其中一个实验室构建(P.RATET，ISV，参见SZABADOS等，1995)。该质粒特别的优点是具有一个多克隆位点，从而可实现与含有LSI内含子的gus基因(大肠杆菌uid A)编码框的转录融合。该质粒还具有以前质粒p35S-gus-intron的一些特征(用于整合入植物基因组的边界，赋予新霉素类抗生素抗性的筛选基因nptⅡ基因)。
该启动子的活性可通过组织化学和酶学实验如GUS来观察和测定。
*pPR97的衍生物制备两个主要的构建体，用于转化模型植物。
a)pR97-35S以EcoRⅠ/BamHⅠ片段的形式切下克隆在质粒pDH51(参见下面关于农杆菌菌株的段落)中的35S启动子，将其插入pPR97中报告基因上游的多克隆位点。该质粒既可作为阳性对照显示该构建体有效，也可作为参照，因为35S启动子和从PR蛋白克隆分离的启动子处于相同环境。
b)pPR97-PMs PR10-1将1.5kb片段也以EcooRⅠ/BamHⅠ片段的形式插入如上所述的相同多克隆位点。
c)pG3-3通过克隆两个反向串联35S启动子获得该质粒，可作为组化和酶学检测的强阳性对照。这样，这两个启动子的激活子序列可协同作用。然后将gus-intron基因的编码框置于这两个35S启动子之一的控制之下。
*制备农杆菌菌株通过在氯化钙介质中热激用各种质粒转化感受态大肠杆菌DH5α菌株。在含有抗生素(卡那霉素)的培养基上筛选转化细菌，并小量制备检查其是否为重组子，然后采用这些转化细菌和含有可自转移质粒pRK2013(DITITA等，1985)的大肠杆菌HB101，通过三亲结合法将重组质粒转移至农杆菌菌株中。
所用的两个农杆菌菌株是可再生转化植物(稳定转化)的除毒根癌农杆菌EHA105，和用于获得毛根反应和复合植物的根毛农杆菌A4TC24，该复合植物的根被转化，但该植物其余部分的表型与原来的表型一致。
*模型植物的遗传转化用三种模型植物，即Nicotiana benthamiana，Medicago truncatula和百脉根(Lotus corniculatus)，进行两种类型的转化(瞬时转化和稳定转化)。
所给结果主要来自用N.benthamiana进行的实验。
*瞬时转化首先进行一系列实验以快速验证用gus基因制备的构建体在真核细胞中起作用。
因此，切下N.benthamiana的叶子，在琼脂培养基上与EHA105的不同衍生株共培养。然后在转化后48小时进行组织化学实验，随后在孵育过夜(12小时)后进行检查。
对照质粒，p35S-gus-intron和pPR97-35S，均给出阳性GUS显色反应，尽管第二个质粒只有弱反应。
这种弱反应活性无疑是由于结构问题引起的，因为在转录起始位点和gus基因ATG的附近必须保留部分多聚接头。因为该多聚接头含有一个重复序列，从而干扰了基因的转录。
pPR97-PMs PR10-1构建体的gus基因活性与35S gus-intron阳性对照的活性相似。因此，该被期望是可诱导型的启动子表现出组成型启动子类似的效果。
该结果可解释为是在采样或培养过程中叶片遭受了细菌感染或创伤。由于第一个假说不能被验证，所以修改了实验方法以减少对外植体造成的压力(采用10-30g/l的蔗糖浓度以增加共培养基的渗透压，使用较高的真空范围10-80mm水银相对真空，并通过对表皮的强度或中度挤压以产生或多或少的严重损伤)。
结果说明随着压力的增加转化细胞的数量也增加。然而，为了实现稳定转化，应寻找一个折中，因为在这种情况下获得的许多瞬时转化结果常常证明是对细胞致死的。它们并不能产生愈伤组织并由此再生芽和植物。
无论如何，该启动子的可诱导特性已被部分证实，因为35S-gus-intron构建体引起的显色可在共培养后长达5天的时间内检测到，而用pPR97-PMs PR10-1-gus-intron获得的显色更快，在第48小时出现，但之后很快减弱了。
*稳定转化a)烟草N．benthamiana用pPR97-35S、pPR97-PMs PR10-1和pG3-3进行一系列转化。由这一系列转化获得相当数量的小植株。试图对于所采用的每一个质粒，获得至少7株驯化植物。但对p35S-gus-intron这是不可能的，因为它仅有5株植物再生和驯化。所获结果编辑于表1。表1以根癌农杆菌菌株EHA 105及其衍生物转化N.benthamiana所获得的稳定转化。

表1说明结果以所获量表示。
每个外植体的芽数对于第一个系列括弧内的数为一个月所获的芽数。对于该系列(包含35S gus-intron构建体)，为获得最大数目的芽数以及因此产生的可驯化植物数，愈伤组织在培养基上培养了更长时间。对于第二个系列，一个月后已获得足够数量的芽，故之后停止了实验。
遗传转化这些实验均按标准方法在1cm2的叶片上进行，这些叶片在农杆菌悬液中浸泡30秒，之后共培养48小时，再继代培养于细胞分裂和生茎(caulogenesis)用的琼脂培养基上M.S.(MURASHIGE和SKOOG，1992)，0.1mg/l NAA(萘乙酸)、1mg/l BAP(苄氨基嘌呤)，400mg/l头孢噻肟(清除农杆菌)和70mg/l卡那霉素(用于筛选转化细胞的试剂)。一旦出现第一个芽(大约共培养后一个月)，将培养物移植于生根培养基，该培养基除了不含植物激素外，与上述培养基相同。
gus-intron基因的表达(其取决于位于该基因编码框上游的启动子的性质)分析结果显示，在所有测试启动子中PMs PR10-1启动子的结果最好。更为详细的分析见下。
*启动子PMs PR10-1的特性质粒pPR97-PMs PR10-1-gus-intron该启动子给出的结果最好，而且不同的测试器官有不同的gus基因组成型表达。
a)在愈伤组织中的活性发现强组成型表达。孵育几分钟足以产生阳性组织化学测试结果。因此，在这种类型的材料中该启动子被强烈诱导，与VAN LOON(1985)所获结果一致。体外培养的愈伤组织处于应激状态中，而在这些情况下PR蛋白获得表达。
b)在驯化的全株植物中的活性根在孵育2小时后(在使用35S启动子时需5小时)该启动子被诱导，组织化学测试表现为阳性。在烟草根中gus基因活性并不一致；仅在陈年部位的表皮和顶端分生组织出现该测试特征性的蓝色。根据文献，在常规情况下也可在根中观察到防卫基因活性。
花在该结构转化的所有烟草植物的花中，更具体地，是花药和花粉中均发现强组成型表达。萼片的毛状体(trichome)中也可检测到gus基因活性，而花瓣中的gus基因活性则较弱。这些结果也与VAN LOON的结果一致(1985)，说明在花的各部分中防卫基因获得表达。
叶在成熟植物新叶的毛状体中观察到弱组成型gus基因活性。对于烟草，具有大叶的丛生期是幼年期，种子形成期是老年期。这种弱活性主要出现在多细胞的毛状体中。就我们所知，PR蛋白在这类结构中的表达还从未被描述过。
因此，尽管在烟草(7株植物中3株)叶的毛状体中，分离的PMs PR10-1启动子可能具有组成型诱导活性，但该活性看来受发育阶段的影响。
因此，在无病原体诱导的情况下，烟草中该启动子的活性局限于根、花的一些部分(花药和花粉)和气生部分的一些细胞(基本上是毛状体)。实施例3转化的其它植物物种*Medicago truncatula对于该物种，我们尝试产生复合植物，即该植物同时具有(非遗传转化的)野生型气生部分和转化的根。
采用新萌芽的植物。主根发育后，切下下胚轴，将其浸泡在携带质粒p35S-gus-intron或质粒pPR97-PMs PR10-1-gus-intron的根癌农杆菌EHA105悬液中，以便之后获得新形成的转化根。一周后，获得根并进行组织化学GUS实验。该实验的对照是采用前批材料同样的方法(切下下胚轴，但不将其浸泡在根癌农杆菌EHA105悬液中)处理的新萌芽植物。
所有对照组的外植体在一周内形成新根，相反，农杆菌处理组仅有50％外植体起反应。无论何种处理，所有根对GUS实验均没有阳性反应。另一方面，即使坏死，处理组下胚轴的底部也常常发生反应，显现蓝色(存在转化细胞)。然后，切下外植体的坏死部分，使它们再生根。之后50％发育新生根，其中一些证明在少数区域对该实验呈阳性。
由此得到嵌合根(兼有转化细胞和未转化细胞的根)，其转化部分相应于在基底干细胞中整合了所述构建体的细胞系。
两个测试构建体，即p35S-gus-intron和pPR97-PMs PR10-1 gus-intron，分别在每批用于实验的6个外植体的3个和2个中产生了这些转化根细胞系。
尽管该实验模型并不适合该研究课题(研究与根瘤菌引起的生瘤现象有关的PR蛋白表达)，但其说明了PMs PR10-1启动子在该植物中与在原先的植物(紫苜蓿)中一样是起作用的。
百脉根在该例中，实验的目的还在于研究在共生菌苜蓿中华根瘤菌Rhizobium meliloti NZP 2037(PETIT等，1987)引起的结瘤作用中所述启动子的诱导。因此，为了获得毛根现象(毛根表型)，采用毛根农杆菌株A4TC24转化Lotier新萌芽植物的下胚轴细胞以制备复合植物。一旦出现该现象，切下主根并将小植株移至液体培养基以增加该现象的发展。植物驯化后，将这些小植株置于生瘤条件下(BLONDON，1964)以研究启动子的诱导。用于该研究的两个启动子与用于M.trunculata实验的启动子一样35S和PMs PR10-1。采用这两个结构，在具有毛根现象的根中不到10％出现GUS实验阳性。一般来说，具有该表型的根比对照根产生更少的根瘤。
就含有35S启动子的结构所获得的结果而言，仅有根瘤出现了GUS实验阳性反应；而对于另一个结构(PMs PR10-1启动子)，除了次生根的起始点，根的所有部分均出现颜色反应。除此之外，这后一种结构不能使毛根来源的根与苜蓿中华根瘤菌相互作用获得根瘤。实施例4用含有苜蓿PR基因启动子和gus-intron基因的构建体转化烟草以研究超敏反应转化了连接有苜蓿PR基因启动子和gus-intron基因的构建体的N.
benthamiana的超敏反应*超敏反应(HR)实验本研究采用由N.benthamiana/丁香假单胞菌豌豆致病变种相互作用产生的超敏反应。驯化在其基因组中整合了质粒p35S gus-intron和pPR97-PMs PR10-1-gus-intron的不同插入片段的转化烟草植物，然后用丁香假单胞菌(ESNAULT等，1993)悬液以每毫升109个细菌的浓度浸润该烟草。用皮下注射器将该溶液注射至叶片中。采用这种模型，HR反应被认为在48小时后会很好地产生。在接种后第24、48和96小时采取细菌悬液浸润的叶，以便用GUS组化实验评价所研究的不同启动子的诱导。对浸润叶下方的叶也进行同样的组织化学实验以评价可能的系统反应。
*HR型反应条件下启动子诱导的研究a)35S组成型启动子对于35S组成型启动子(例如，质粒pG3-3)，丁香假单胞菌的接种并不改变对所述实验的反应，即在孵育几分钟后出现明显反应。因此，细菌的浸润并不改变用35S启动子获得的组成型葡糖醛酸酶活性。
b)PR蛋白基因启动子启动子Ms PR10-1正如表2所示，该启动子易于被病原体侵袭所诱导。在第24小时HR型反应还未完全形成(第48小时完全出现)，但GUS实验已是阳性。对于获得的转化烟草植物幼株，颜色反应弱且主要位于浸润叶的叶片中。
关于系统反应，即感染叶下部的叶的反应，显色仅在叶片中存在。成熟(已有成熟茎但仍未开花)和幼年(丛生)烟草植物具有相同的反应，即组织化学实验测定的弱gus基因活性。
对于有花或种子的更老的烟草植物，该实验获得的显色更强，尤其是在感染叶的叶脉和毛状体中，而对于系统反应显色，仅存在于上述这些组织。
因此，这些观察说明报告基因的不同表达取决于植物的年龄。这种依赖于植物发育阶段的反应在大多数对植物PR蛋白进行的研究中均有发现。由于接种细菌后96小时报告基因的表达不再可见，故启动子PMsPR10-1的诱导是一个短暂的现象。
该诱导也不局限于植物/细菌相互作用产生的HR型反应。采用PMsPR10-1-gus-intron构建体在真菌感染植物时获得了同样类型的反应。除了坏死的污染区外整个感染叶均可见类似的gus基因表达。表2在N．benthamiana和丁香假单胞菌间的HR型反应过程中，所研究的不同启动子的诱导

表2说明结果表示为GUS组织化学实验阳性反应的植物数与所分析的植物数之比。不同启动子控制的gus-intron基因的定量表达该方法以酶学实验为基础。该方法采用a)转化烟草植物中获得的gus基因所编码酶的粗提物，和b)底物对硝基苯基葡糖苷酸。底物的水解速度用分光光度计检测，并与抽提物中的蛋白总量相关。由于该方法并不十分敏感，故需要在gus基因上游存在一个强启动子。
因此，不能使用与组织化学实验用底物(X gluc5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸)孵育12或更多小时的方法。
在这样的实验条件下，位于质粒pG3-3中的35S启动子产生的底物水解速度(以任意单位表示)比采用位于质粒pPR97中的PMs PR10-1启动子所获得的速度高5倍。另一方面，PMs PR10-1启动子比位于质粒p35S-gus-intron中的35S启动子产生更强的gus基因表达。实际上，在后一种情况中未检测到底物的水解。
同样，采用其它构建体也不可能获得分光光度法可检测的值。结论从紫苜蓿(苜蓿)分离的启动子PMs PR10-1完全满足其用作调控农业上感兴趣的基因的序列所必须具有的特征，所述基因能在植物对病原体侵袭的防卫中起作用。该启动子是可被病原体(细菌和真菌)诱导的，该过程可在包括异源系统烟草在内的系统中发生。该启动子在包括其它异源系统(M.truncatula和L.corniculata)在内的系统中也具有弱组成型活性，该活性主要存在于根中。
还未得到解释的是，在苜蓿胚形成性愈伤组织中也观察到另一组成型活性。
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权利要求
1．一种核酸序列，其选自a)IND S1序列，和b)相应于IND S1序列片段、并在植物中具有启动子序列作用的任何序列。
2．植物启动子，其选自a)与IND S1序列相应的PMs PR10-1启动子，b)与权利要求1b)的序列相应的PMs PR10-1类型启动子。
3．根据权利要求2的启动子，其特征在于PMs PR10-1类型启动子显示与IND S1序列至少80％同源性。
4．根据权利要求2的启动子，其特征在于PMs PR10-1类型启动子显示与IND S1序列至少90％同源性。
5．根据权利要求2的启动子，其特征在于PMs PR10-1类型启动子显示与IND S1序列至少95％同源性。
6．植物启动子序列，其特征在于它包含与根据权利要求2-5之一的启动子的序列相同的序列。
7．根据权利要求2-5之一的启动子在以可在植物中被生物或非生物压力诱导的方式进行的组织特异性或非组织特异性基因表达中的用途。
8．根据权利要求7的启动子的用途，其特征在于所述生物压力是寄生物侵袭。
9．根据权利要求8的启动子的用途，其特征在于所述寄生物是病毒、细菌、酵母或真菌。
10．根据权利要求7的启动子的用途，其特征在于所述非生物压力是机械损伤。
11．根据权利要求10的启动子的用途，其特征在于所述机械损伤是昆虫造成的。
12．根据权利要求10的启动子的用途，其特征在于所述机械损伤是由物理现象如风或霜造成的。
13．植物的基因表达系统，其特征在于它至少包含处于根据权利要求1-6之一的启动子或序列控制之下的所述基因的序列。
14．基因表达载体，其特征在于它至少包含处于根据权利要求1-6之一的启动子或序列控制之下的所述基因的序列。
15．根据权利要求14的表达载体，其特征在于该载体是质粒。
16．根据权利要求14和15之一的表达载体，其特征在于它可转入农杆菌菌株。
17．根据权利要求13-16之一的系统或载体，其特征在于它可在植物中被生物或非生物压力诱导。
18．根据权利要求17的系统或载体，其特征在于所述基因是目标基因。
19．根据权利要求18的系统或载体，其特征在于所述目标基因是参与对生物或非生物压力反应的基因。
20．根据权利要求19的系统或载体，其特征在于所述目标基因是参与对诱导型生物或非生物压力反应的基因。
21．根据权利要求20的系统或载体，其特征在于所述生物压力是寄生物侵袭，并且所述目标基因是所述寄生物的抗性基因。
22．根据权利要求21的系统或载体，其特征在于所述寄生物是病毒、细菌、酵母或真菌，并且所述目标基因参与具有抗病原体作用的分子的合成。
23．根据权利要求22的系统或载体，其特征在于具有抗病原体作用的分子选自植物抗毒素或PR蛋白。
24．用根据权利要求13-23之一的系统或载体转化的植物细胞。
25．根据权利要求24的细胞，其特征在于它是葡萄树细胞。
26．根据权利要求24和25之一的细胞，其特征在于所述目标基因是寄生物抗性基因。
27．获得植物细胞的方法，其特征在于植物细胞采用包括根据权利要求13-23之一的系统或载体在内的微生物学方法转化。
28．获得表达目标基因的植物的方法，其特征在于采用根据权利要求13-23之一的系统或载体转化所述植物的细胞，筛选表达所述基因的细胞和从这些细胞再生植物。
29．包含根据权利要求13-23之一的系统或载体的植物。
30．包含根据权利要求24和26之一的细胞的植物。
31．通过实施根据权利要求28的方法获得的植物。
全文摘要
本发明涉及可被生物或非生物压力,特别是病原体,诱导的一套植物启动子及其用途,还涉及含有所述启动子和目标基因的表达载体和转化了所述载体的细胞和/或植物。本发明还涉及获得所述细胞和植物的方法,所述转化植物具有对所述病原体改良的抗性。
文档编号C12N5/10GK1295622SQ99804670
公开日2001年5月16日 申请日期1999年2月12日 优先权日1998年2月13日
发明者R·埃斯诺特, D·布法德, C·布瑞达, P·库托斯－希维诺特, M·保雷 申请人:莫特和尚东香帕尼公司