补体活化的抑制剂的制作方法

专利名称：补体活化的抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及因子D的专一抑制剂、以及使用此抑制剂来抑制补体系统活化和抑制补体旁路活化途径。
背景技术：
补体系统在清除免疫复合物及对感染物、外来抗原、病毒感染细胞及肿瘤细胞的免疫应答中扮演中心角色。然而，补体也参与病理炎症及自身免疫疾病。因此，抑制过度或失控的补体级联反应活化可为有此疾病或症状的病人提供临床益处。
补体系统包含两个不同活化途径，被称为经典途径及旁路途径(V.M.Holers,In Clinical Immunology:Principles and Practice,ed.R.R.Rich,Mosby Press;1996,363-391)。经典途径为钙/镁依赖的级联反应，该途径一般由抗原-抗体复合物的形成而活化。旁路途径为镁依赖的级联反应，该途径通过C3在特定易感表面(如酵母菌、细菌及特定生物多聚物的细胞壁多糖)沉积和活化而活化。补体途径的活化产生补体蛋白的生物活性片段，如C3a、C4a及C5a过敏毒素及C5b-9膜攻击复合物(MAC)，它们介导炎症活性，包括白细胞趋化性、巨噬细胞、中性粒细胞、血小板、肥大细胞及内皮细胞的活化、血管通透性、细胞裂解及组织伤害。
因子D为补体活化的旁路途径所需的高度专一丝氨酸蛋白酶。它可切割与C3b结合的因子B，产生C3b/Bb酶，这种酶是旁路途径C3/C5转换酶的活性成份。因子D可以是抑制的合适靶，因为它在人类中的血浆浓度非常低(1.8微克/毫升)，已经显示它是补体活化的旁路途径中的限制酶(P.H.Lesavre及H.J.Muller-Eberhard.J.Exp.Med.,1978;148:1498-1510;J.E.Volanakis等人,New Eng.J.Med.,1985;312:395-401)。
补体活化的下调已经证明在动物模型中及体外研究中可有效治疗数个疾病，如系统性红斑性狼疮症及肾小球性肾炎(Y.Wang等人，Proc.Natl.Acad.sci.;1996,93:8563-8568)、类风湿性关节炎(Y.Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci,1995;92:8955-8959)、心肺分流及溶血症(c.s.Rinder,J.clin.Invest.,1995;96:1564-1572)、器官移植超急性排斥(T.J.Kroshus等人,Transplantation,1995;60:Ⅱ 94-1202)、心血管栓塞(J.W.Homeister等人,J.Immunol,1993;150:1055-1064;H.F.Weisman等人,Science,1990;249:146-151)、再灌流损伤(E.A.Amsterdam等人,Am.J.Physiol,1995;268:H448-H457)、及成人呼吸困难综合征(R.Rabinovici等人,J.Immunol,1992;149:1744-1750)。此外，其它炎症及自身免疫/免疫复合物疾病亦与补体活化密切相关(V.M.Holers,ibid.,B.P.Morgan.Eur.J.Clin.Invest，1994:24:219-228)，这包括热损伤、严重哮喘、过敏性休克、肠炎、荨麻疹、血管水肿、脉管炎、多发性栓塞、重症肌无力症、膜增生性肾小球性肾炎、及Sjogren氏症。
发明简述本发明包括因子D的抑制剂，它与因子D结合并阻断因子D的补体活化的功能活性，包括补体活化的旁路途径。这种抑制剂包括抗体分子以及同源物、相似物及其修饰形式或衍生形式，这包括免疫球蛋白片段如Fab、F(ab’)2及Fv。小分子包括肽、寡核苷酸、肽模拟物，能结合因子D并阻断其功能活性的有机化合物也包含在本发明内。
已经制备了一种单克隆抗体，它能与因子D结合并阻碍其补体活化功能，它被命名为166-32。产生此抗体的杂交瘤保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209，保藏号码为HB-12476。
附图简述

图1显示在ELISA中抗因子D的单克隆抗体(MAbs)与纯化的人因子D结合。实心圆形标记的线代表MAb 166-11。实心三角形标记的线代表MAb166-32。实心菱形标记的线代表MAb 166-188。实心正方形标记的线代表MAb 166-222。Y-轴表示MAbs与因子D的反应性，它用450nm处的光密度(OD)表示，X-轴代表MAbs的浓度。
图2显示MAb 166-32在存在10％人血清的情况下，对未致敏的兔血红细胞(RBCs)的旁路(AP)溶血的抑制作用。实心正方形标记的线代表MAb166-32。实心圆形标记的线代表无关的同种型匹配的对照MAb G3-519，后者对HIV包膜糖蛋白gp120有专一性。如文中的进一步介绍，Y-轴表示％的溶血抑制作用。X-轴表示MAbs的浓度。
图3显示MAb 166-32在存在90％人血清的情况下，对未致敏的兔血红细胞(RBCs)的旁路(AP)溶血的抑制作用。实心正方形标记的线代表MAb166-32。实心圆形标记的线代表无关的同种型匹配的对照MAb G3-519，后者对HIV包膜糖蛋白gp120有专一性。如文中的进一步介绍，Y-轴表示％的溶血抑制作用。X-轴表示MAbs的浓度。
图4显示MAb 166-32不能抑制已致敏的鸡RBCs的经典途径(CP)溶血，但阳性对照抗人C5 MAb 137-76能够抑制。实心圆形标记的线代表MAb137-76。实心菱形及实心正方形标记的线分别代表MAb 166-32及阴性对照MAb G3-519。Y-轴表示％溶血抑制作用。X-轴表示MAbs的浓度。
图5显示MAb 166-32对旁路途径(AP)溶血的抑制作用。溶血可通过在已使用抗因子D MAb 166-222亲合性层析清除其因子D的人血清中加入不同浓度的纯化人因子D来增强。此分析在存在或无0.3微克/毫升的试验MAbs的条件下进行。实心正方形标记的线代表不加抗体。实心圆形标记的线代表MAb 166-32。实心三角形标记的线代表无关同种型匹配的对照MAb G3-519。Y-轴代表％溶血抑制作用。X-轴代表因子D的浓度。
图6显示MAb 166-32对依赖因子的EAC3b细胞裂解的抑制作用。此旁路C3转换酶通过与因子B、因子P及因子D温育装配于EAC3b细胞。在温育缓冲液中加入不同浓度的MAb 166-32以抑制因子D活性。实心正方形标记的线代表MAb 166-32。实心圆形标记的线代表MAb G3-519。Y-轴代表％溶血抑制作用。X-轴代表MAbs的浓度。
图7显示MAb 166-32可抑制C3a由酵母聚糖生成。酵母聚糖可在存在于人血清中时活化补体旁路途径。C3a的生成可使用ELISA试剂盒测量。实心正方形标记的线代表MAb 166-32。实心圆形标记的线代表无关同种型匹配的对照MAb G3-519。Y-轴代表C3a产生的％抑制作用。X-轴代表MAbs的浓度。
图8显示MAb 166-32可抑制sC5b-9由酵母聚糖生成。酵母聚糖可在存在于人血清中时活化补体旁路途径。sC5b-9的生成可使用ELISA试剂盒测量。实心正方形标记的线代表MAb 166-32。实心圆形标记线代表无关同种型匹配的对照MAb G3-519。Y-轴代表sC5b-9生成的％抑制作用。X-轴代表MAbs的浓度。
图9显示由MAb 166-32及其Fab对未致敏的兔RBCs的旁路途径溶血的抑制作用。实心圆形标记的线代表MAb 166-32(全IgG)。实心正方形标记的线代表Mb 166-32的Fab。Y-轴代表％溶血抑制作用。X-轴代表MAbs的浓度。
图10显示MAb 166-32对于来自不同动物种属的血清中的因子D对未致敏的兔RBCs的旁路途径溶血的抑制作用。实心正方形标记的线代表人血清。实心圆形标记的线代表黑猩猩血清。实心三角形标记的线代表恒河猴血清。实心倒三角形标记的线代表狒狒血清。实心菱形标记的线代表cynomolgus猴血清。空圆形标记的线代表羊血清。空三角形标记的线代表狗血清。Y-轴代表％溶血抑制作用。X-轴代表MAb 166-32的浓度。
图11显示MAb 166-32与不同的杆状病毒表达的因子D(″FD″)突变体及杂合体在ELISA中的反应力。实心正方形标记的线代表人因子D---FD/Hu。实心圆形标记的线代表猪因子D---FD/Pig。实心三角形标记的线代表FD/Pighu。实心倒三角形标记的线代表融合蛋白FD/Hupig。实心菱形标记的线代表突变蛋白FDNDA。空圆形标记的线代表突变蛋白FD/L。空正方形标记的线代表突变蛋白FD/RH。空菱形标记的线代表无包被抗原的空白对照。重组蛋白将在文中进一步介绍。
图12显示用于嵌合体166-32 Fab的表达载体质粒的示意图(A)pSV2dhfrFd及(B)pSV2neo。实心盒代表编码Fd或μ基因的外显子。斜线片段如下文所示代表源自HCMV的增强子及启动子元件(E-P)。空心盒如其标记代表二氢叶酸还原酶(dhfr)及neo基因。pSV2质粒含有来自以下不同来源的DNA片段pBR322 DNA(窄线)包含pBR322 DNA的复制起始区域(pBR ori)及内酰胺酶---氨苄青霉素抗性基因(Amp)；SV40 DNA用宽斜线代表及标明，包含SV40 DNA复制起始区域(SV40 ori)、早期启动子(dhfr及neo基因的5’)、及聚腺苷酸化信号(dhfr及neo基因的3’)。源自SV40的聚腺苷酸化信号(pA)也置于Fd基因的3’。
图13显示未致敏的兔RBCs的旁路途径(AP)溶血的抑制作用。实心正方形标记的线代表小鼠MAb 166-32。实心圆形标记的线代表嵌合体MAb166-32。实心三角形标记的线代表同种型匹配的的阴性对照抗体G3-519。Y-轴代表溶血抑制作用(％)。X-轴代表抗体的浓度。
图14显示未致敏的兔RBCs的旁路途径(AP)溶血的抑制作用。实心正方形标记的线代表嵌合体166-32IgG。实心圆形标记的线代表cFab/9aa。实心三角形标记的线代表cFab。Y-轴代表溶血抑制作用(％)。X-轴代表IgG及Fab的蛋白浓度。
图15显示抗因子D MAb 166-32在治疗人血浆灌输的分离兔心脏的血动态功能中的效果。左心室终舒张压(LVEDP)用实心圆形(MAb 166-32)及实心正方形(MAb G3-519)表示。左心室压(LVDP)用空圆形(MAb 166-32)及空方形(MAb G3-519)表示。MAb G3-519为无关的同种型匹配的对照。
图16是2个抗体群在分离的兔心脏研究中产生的左心室压(LVDP)的典型代表。上图代表用阴性对照抗体MAb G3-519处理的心脏，而下图代表用MAb 166-32处理的心脏。用MAb G3-519处理的心脏在用4％人血浆处理后，不能维持LVDP，而用MAb 166-32处理的心脏在灌以4％人血浆60分钟后仍维持近基线的LVDP。
图17显示在用4％人血浆灌输分离的兔心脏的过程中，在选择的各时间点淋巴管流出液中的Bb浓度。MAb 166-32处理的心脏样品(空圆形)含有的Bb明显比MAb G3-519处理的心脏(实心正方形)要低，p＜0.05。
图18显示血浆样品的旁路途径溶血活性，它们于不同时间点由MAb166-32(实心正方形)或MAb G3-519(实心圆形)处理的体外循环系统收集。
图19显示血浆样品的C3a浓度，它们于不同时间点由MAb 166-32(实心正方形)或MAb G3-519(实心圆形)处理的体外循环系统收集。
图20显示血浆样品的sC5b-9浓度，它们于不同时间点由MAb 166-32(实心正方形)或MAb G3-519(实心圆形)处理的体外循环系统收集。
图21显示血浆样品的Bb浓度，它们于不同时间点由MAb 166-32(实心正方形)或MAb G3-519(实心圆形)处理的体外循环系统收集。
图22显示血浆样品的C4d浓度，它们于不同时间点由MAb 166-32(实心正方形)或MAb G3-519(实心圆形)处理的体外循环系统收集。
图23显示CD11b在中性粒细胞表面的表达水平，这些粒细胞于不同时间点由MAb 166-32(实心正方形)或MAG3-519(实心圆形)处理的体外循环系统收集。CD11b的表达量以由免疫细胞计数器分析测得的平均荧光强度(MFI)而表示。
图24显示血小板表面的CD62P的表达水平，它们于不同时间点由MAb166-32(实心正方形)或MAb G3-519(实心圆形)处理的体外循环系统收集。CD62P的表达量以由免疫细胞计数器分析测得的平均荧光强度(MFI)而表示。
图25显示血浆样品中中性粒细胞特异的髓过氧化物酶(MPO)浓度，它们于不同时间点由MAb 166-32(实心正方形)或Mb G3-519(实心圆形)处理的体外循环系统收集。
序列表说明SEQ ID NO1为人因子D的核苷酸序列。SEO ID NO2为人因子D的氨基酸序列。SEQ ID NO3为猪因子D的核苷酸序列。SEQ ID NO4为猪因子D的氨基酸序列。SEQ ID NO5为用以克隆MAb 166-32VK基因的引物。SEQ ID NO6为如下述用以克隆MAb 166-32VK基因的退火接头(adaptor)，并用作引物。SEO ID NO7为如下述用以克隆MAb 166-32VK基因的退火接头。SEQ ID NO8为如下述用以克隆MAb 166-32VH基因的3'引物。SEQ ID NO9为用以克隆MAb 166-32VH基因的引物。SEQ ID NO10为用以克隆MAb 166-32VH基因的引物。SEQ ID NO11为用以PCR扩增MAb 166-32Fd基因的5'引物。SEQ ID NO12为用以PCR扩增MAb 166-32Fd基因的3'引物。SEQ ID NO13为用以PCR扩增MAb 166-32Fd基因的5'引物。SEQ ID NO14为用以PCR扩增MAb 166-32Fd基因的3'引物。
本发明的完成及其用途A．抗人因子D的单克隆抗体(MAbs)的制备在本发明的一个具体实施方案中，抗-因子D的MAbs可通过用纯化自人血浆或尿的天然因子D免疫鼠类(例如小鼠，大鼠，仓鼠及豚鼠)或用真核或原核系统表达重组因子D或其片段来制备。亦可使用其它动物进行免疫，例如非人灵长类、表达人免疫球蛋白的转基因小鼠及移植了人B淋巴细胞的严重结合免疫缺陷(SCID)小鼠。杂交瘤可用传统方法制备，通过来自已免疫动物的B淋巴细胞与黑瘤细胞(例如Sp2/0及NSO)的融合而获得，如G.Kohler及C.Milstein(Nature，1975256495-497)所述。此外，抗因子D抗体亦可以通过在噬菌体展示系统中从人B淋巴细胞筛选重组单链Fv或Fab文库来获得。MAbs对人因子D的专一性可由ELISA、Western印迹、或其它免疫化学技术进行检测。抗体对补体活化的抑制活性，对于旁路途径可使用未致敏的兔或豚鼠红血球细胞(RBCs)的溶血分析进行评价，对于经典途径可使用未致敏的鸡或羊RBCs进行评价。阳性对照孔中的杂交瘤用限制稀释进行克隆。纯化抗体用于上面介绍的试验以分析对人因子D的专一性。
如果用于治疗人的炎症或自身免疫，抗因子D抗体优选以嵌合体、去免疫化、人源化或人抗体的形式使用。这样的抗体可降低免疫性，因而避免人抗鼠抗体(HAMA)反应。抗体优选为IgG4、IgG2、或其它遗传突变的IgG或IgM，它们不会增强依赖抗体的细胞毒性(S.M.Canfield及S.L.Morrison,J.Exp.Med.,1991:173:1483-1491)及补体介导的细胞裂解(Y.Xu等人，J.BioL Chem.,1994:269:3468-3474;V.L.Pulito等人，J.Immunol.,1996；156:2840-2850)。
嵌合抗体由本领域熟知的重组技术制备，它含有动物可变区及人恒定区。人源化抗体比嵌合抗体具有更高程度的人肽序列。在人源化抗体中，只有负责抗原结合及专一性的补体决定区域(CDRs)源自动物并含有动物抗体相应的氨基酸序列，而基本上分子的所有剩余部份(除在某些例子中可变区内框架区的小部份)源自人并相当于人抗体的氨基酸序列。参见L.Riechmann等人，Nature,1988;332:323-327;G.Winter，美国专利5225539;C.Queen等人，美国专利5530101。
去免疫化抗体为已除去T及B细胞表位的抗体，如国际专利申请PCT/GB98/01473所述。当其应用于体内时，没有或具有降低的免疫性。
人抗体可由数种方法制备，包括使用人免疫球蛋白表达文库(Stratagene Corp.,La Jo11a,California)产生人抗体的片段(VH、VL、Fv、Fd、Fab或(Fab’)2，并使用类似产生嵌合抗体的技术用这些片段构建完整的人抗体。人抗体亦可在携带了人免疫球蛋白基因组的转基因小鼠中制备。此小鼠可从Abgenix,Inc.,Fremont,California,及Medarex,Inc.,Annandale,New Jersey获得。
亦可构建单肽链结合分子，其中重及轻链Fv区域相连。单链抗体(″ScFv″)及其构建方法述于美国专利4946778。此外，Fab亦可以相似方法构建及表达(M.J.Evans等人,J.ImmunoL Meth.,1995;184:123-138)。所有完整及部份的人抗体都比完整的小鼠MAbs免疫性低，而且片段及单链抗体也具有较低的免疫性。因此所有这些类型的抗体相比较而言不会引发免疫或过敏反应。同时，它们比完整的动物抗体都更适于对人进行体内给药，尤其在需要重复或长期给药时。此外，抗体片段的较小的大小亦可促进组织的生物利用，这对于急性病中的较佳剂量累积可能非常重要。
基于抗因子D抗体可变区的分子结构，可使用分子模型及合理分子设计来制备和筛选能模拟抗体结合区域的分子结构并抑制因子D活性的小分子。这些小分子可以是肽、肽模拟物、寡核苷酸或有机化合物。这种模拟分子可以在炎症及自身免疫疾病中用作补体活化的抑制剂。此外，亦可使用本领域常用的大规模筛选方法来从组合化合物文库中分离适当的小分子。
本发明的一个优选实施方案中，使用一具有动物(小鼠)可变区及人恒定区的嵌合体Fab来治疗疾病，Fab之所以优选是因为1.它比完整的免疫球蛋白小，并且可提供更好的组织穿透性；2.作为单价分子，它具有较小的形成免疫复合物和聚合物的可能性；3.它可在微生物系统中制备，微生物系统比真核系统更容易规模化。B.抗因子D分子的运用抗因子D结合分子、抗体、及本发明片段可以适当制剂通过各种途径给药至病人，包括但不限于静脉灌注、静脉大量注射、及腹膜、皮肤、肌肉、皮下、鼻内、支气管、椎管内、颅内及经口给药。这种给药可使它们结合至内源性因子D，并因而抑制C3b、C3a及C5a过敏毒素以及C5b-9的生成。
这种抗体及分子的估计优选剂量为10及500微克/毫升血清之间。实际剂量可依临床常用的测量最佳剂量的方法测得，即给予各种剂量并确定最有效的剂量。
抗因子D分子可抑制体内补体活化及/或补体旁路途径以及伴随的炎症，如巨噬细胞、中性粒细胞、血小板以及肥大细胞的吸引及活化、水肿及组织损伤。可使用这些抑制剂来治疗因补体系统过度或不加控制地活化而介导的疾病或情况。它们包括但不限于(1)因心血管栓塞后缺血再灌流的组织伤害、动脉瘤、中风、出血休克、撞击伤害、多处器官衰竭、血容积不足休克及肠缺血；(2)炎症性失调如烧伤、内毒素血症及败血性休克、成人呼吸困难症、心肺分流、血液透析、过敏性休克、严重哮喘、血管水肿、局限性回肠炎、镰刀性细胞贫血、后链球菌肾小球肾炎及胰炎；(3)移植排斥如超急性移植排斥；及(4)不良药物反应如药物过敏、IL-2引发的血管渗漏症及放射性造影介质过敏。自身免疫异常包括但不限于系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、早老性痴呆及多发性硬化，它们也可用本发明的抑制剂进行治疗。
抗因子D分子亦可用于诊断以确定因子D在组织或体液样品如血清、血浆、尿或骨髓中的存在或进行定量。此申请书中，可使用熟知分析形式分别如免疫组织化学或ELISA。这种诊断试验可用于确定特定的个体是否缺乏或过度产生因子D。C.因子D抑制剂的治疗有效性的动物模型上面介绍的因子D抑制剂在各种疾病中的治疗活性可使用能够得到的患有各种炎症及自身免疫的各种动物进行证明。下面实施例中介绍的体外试验足以阐明其有效性。
与人的各种补体相关临床疾病相当的动物模型亦可用于证明因子D抑制剂的体内有效性。它们包括但不限于心血管缺血再灌流损伤(H.F.Weisman等人，Science,1990;249:146-151)、心血管栓塞(J.W.Homeister等人，J.ImmunoL 1993;150:1055-1064)、系统性红斑狼疮及肾小球肾炎(S.K.Datta.Meth.EnzymoL,1988；162:385-442;D.J.Salvant及A.V.Cvbulsky,Meth.EnzymoL,1988;162:421-461)、类风湿性关节炎(Y.Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,1995;92:8955-8959)、成人呼吸困难症(R.Rabinovici等人，J.ImmunoL,1992;149:1744-1750)、超急性器官移植排斥(T.J.Kroshus等人，Transplantation,1995;60:1194-1202)、灼伤(M.S.Mulligan等人，J.ImmunoL,1992;148:1479-1485)、以及心肺分流(C.S.Rinder等人，J.Clin.Invest,1995;96:1564-1572)。
下面介绍如何完成和使用本发明，以及证实其用途。
实施例1抗因子D MAbs的制备将8-12周龄的雄AIJ小鼠(Harlan,Houston,TX)皮下注射以25克纯化自人血清(Advanced Research Technologies,San Diego,CA)的因子D，该因子D溶于Freund氏完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Michigan)并溶于200微升磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.4中。此因子D制备物用+二硫烷基苯磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测为纯度＞95％。此因子D按下面的介绍进行试验并发现其在溶血中具有生物活性。按2周的间隔对小鼠皮下注射以Freund氏不完全佐剂中的25微克人因子D两次。然后在2周后和杀死前3天，对小鼠再由腹膜注射以PBS中的25微克相同抗原。在每次融合中，从每只免疫小鼠的脾脏制备单细胞悬液，并用来与Sp2/0黑瘤细胞融合。在含50％聚乙二醇(M.W.1450)(Kodak,Rochester,NY)及5％二甲基亚砜(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)的培养液中将5×108的Sp2/0及5×108脾细胞融合。然后在补充了10％小牛血清、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、0.1毫摩尔次黄嘌呤、0.4摩尔氨基喋呤以及16摩尔胸腺嘧啶的lscove培养液中(Gibco,Grand Island,NY)将细胞调至1.5×105脾细胞/200微升悬浮液的浓度。将200毫升细胞悬浮液加至约20个96孔微培养平板的孔中。约10天后取出培养上清液，用于在ELISA中筛选能与纯化的因子D反应者。
将Immulon 2(Dynatech Laboratories,Chantilly,VA)微测试平板的孔通过加入50微升纯化的人因子(50微毫克/毫升)在室温下过夜进行包被。低浓度的包被用因子D可筛选具高亲合性的抗体。拍打平板除去包被溶液后，加入200微升PBS中的BLOTTO(脱脂奶粉)至各孔中1小时以封闭非专一性位点。1小时后，用缓冲液PBST(含0.05％Tween 20的PBS)清洗孔。从各融合孔收集50微升的培养上清液，与50微升BLOTTO混合，再加至微测试平板各孔中。温育1小时后，用PBST清洗孔。然后通过与用BLOTTO按1∶2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)偶连的羊抗小鼠IgG(Fc专一性)(Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,PA)反应来检测结合的鼠抗体。将含0.1％的3,3,5,5四甲基联苯胺(Sigma,St.Louis，MO)和0.0003％过氧化氢(sigma)的过氧化物酶底物溶液加至各孔中显色30分钟。加入50微升的2M H2SO4至各孔中以中止反应。使用BioTekELISA计数器(BioTek Instruments,Winooski,VM)在450 nm处读取反应液OD。
然后将阳性对照孔的培养上清液用2个试验进行检测ⅰ)按下面介绍的方法，检测其在预测定浓度的人血清对未致敏的兔RBC的旁路途径溶血中的抑制作用；及ⅱ)按下面的方法，检测其在用人血清处理的酵母聚糖诱导的C3a生成中的抑制作用。将阳性孔中的细胞通过限制稀释进行克隆。再次检测MLAbs在ELISA中与因子D的反应性。将所选杂交瘤在转瓶中培养，收集培养上清液，用蛋白A亲合性柱层析纯化抗体。用ELISA试验得到4个对人因子D具强烈反应的MAbs。这些MAbs分别被命名为166-11、166-32、166-188、及166-222(图D。其中，MAb 166-32(IgG1)按下面的介绍可强烈抑制未致敏的兔RBCs旁路途径溶血。实施例2用表面细胞质基因组共振方法测定抗因子D MAbs的动力常数MAbs 166-11、166-32、166-188、及166-22结合至人因子D的动力常数可用基于表面细胞质基因组共振的测量方法，使用BIAcore仪器(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden)测得。所有结合测量方法都在HEPES-缓冲盐水(HBs)(10毫摩尔HEPES、pH7.4、150毫摩尔NaCl、3.4毫摩尔EDTA，0.005％表面活化剂P20)中在25℃进行。为测量因子D结合至MAbs的结合率常数，将兔抗小鼠IgG(H+L)固定至CM5侦测板(sensorchip)，固定使用N-羟基琥珀酰亚胺及N-乙基-N'-(3-二乙胺丙基)碳二亚胺通过胺偶联来进行。然后将每种MAb先捕捉至已包被的侦测板，再注射以不同浓度的因子D。为测量缔合率常数(Kassoc)，按厂商指示的浓度制备因子D的5个稀释浓度(2.5纳摩尔，5纳摩尔，10纳摩尔，15纳摩尔及20纳摩尔)，以5微升/分的速率注射至孔中。为测量解离率常数(kdissoc)，以5微升/分的速率注射100纳摩尔因子D至孔中。感测图形式的数据可使用BIAcore系统中数据嵌合程序分析。因为MAb 166-32有极快的Kassoc，由于大量输入效应的限制，它已超出该试验程序的置信度限制，因此可使用另一结合程序来测量其动力速率常数。将因子D按上面的介绍通过胺偶联固定至侦测板，同时将不同稀释浓度的MAb 166-32(5纳摩尔，10纳摩尔，15纳摩尔，20纳摩尔及25纳摩尔用于测量Kassoc及200纳摩尔用于测量Kdissoc)以5微升/分的速率流至侦测板。感测图形式的数据可按上面的介绍进行分析。BIAcore上因子D结合至MAbs的动力常数列于如下表1。MAbs 166-32及166-222对因子D具极高亲合性，其平衡解离常数(K0)小于0.1纳摩尔。表1 BIAcore上因子D结合至MAbs的动力常数
a在测定过程中，使用因子D为分析物，将其流至包被了抗因子D MAb的侦测板，抗因子D MAb用兔抗小鼠IgG俘获。b使用MAb 166-32为分析物，因子D通过胺偶联方法交联至侦测板。cKD，平衡解离常数，=kdissoc/kassoc实施例3补体活化的溶血作用的抑制为研究抗因子D MAbs在体外抑制补体活化的功能活性，使用了2个溶血试验。
对于旁路途径，将未致敏的兔RBCs用明胶/巴比妥钠缓冲盐水(GVB/Mg-EGTA)清洗3次，该缓冲盐水中含2毫摩尔MgCl2及1.6毫摩尔EGTA。10毫摩尔的EGTA被用来抑制经典途径(K.Whaley等人，于A.W.Podds(Ed.),Complement.A Practical Approach.Oxford UniversityPress,Oxford,1997，pp.19-47)。将清洗细胞按1.7×108细胞/毫升再悬浮于相同缓冲液。在圆底96孔微测试平板的各孔中，将50微升正常人血清(20％)与50微升GVB/Mg-EGTA或系列稀释的试验MAb混合，然后将30微升已清洗的兔RBCs悬浮液加至含有混合物的孔中。将50毫升正常人血清(20％)与80微升GVB/Mg-EGTA混合，以得到血清显色背景。阴性对照可使用同种型匹配的抗HIV-1 gp120 MAb---G3-519。最终混合物在37℃温育30分钟。然后将平板在微测试平板摇晃器上摇晃15秒。然后将平板以300xg离心3分钟。收集上清液(80微升)，移至平底96孔微测试平板的孔中以测量405nm处的OD。溶血的抑制百分比定义为100x[(无MAb的OD-血清显色背景OD)-(有MAb的OD-血清显色背景OD)]/(无MAb的OD-血清显色背景OD)。
图2显示了如下数据，MAb 166-32以依赖剂量方式，强烈抑制未致敏的兔RBCs在存在10％人血清时的旁路途径溶血，而无关的同种型匹配对照(MAb G3-519)无此抑制作用。MAb G3-519对HIV包膜糖蛋白gp120有专一性。
在检测MAb 166-32在90％人血清中的抑制活性的试验中，将冷冻人血清融化，以终浓度为10毫摩尔的EGTA预处理。将10毫升系列稀释的MAb 166-32或G3-519加至90微升用EGTA处理的人血清，并在96孔微测试平板中进行两个重复的孔，在室温下放置15分钟。将30毫升已清洗的兔RBCs加至各孔。将平板在37℃温育30分钟。然后将平板在平板摇晃器上摇晃15秒，在300xg下离心3分钟。收集上清液(80微升)，移至平底96孔微测试平板以测量405nm处的OD。各平板均有2个含100微升的90％人血清及30微升缓冲液作为血清显色背景的孔，以及2个含有用100微升90％人血清在不存在单克隆抗体时裂解RBCs以代表完全裂解的孔。图3显示了如下数据，MAb 166-32可以依赖剂量方式强烈抑制未致敏的兔RBCs在存在90％人血清时的旁路途径溶血。
对于经典途径，将含有0.5毫摩尔MgCl2及0.15毫摩尔CaCl2的明胶/巴比妥钠缓冲盐水(GVB++)中的鸡RBCs(5×107细胞/毫升)用8微克/毫升的纯化兔抗鸡RBC免疫球蛋白(Inter-Cell Technologies,Hopewell,NJ)在4℃下致敏15分钟。然后用GVB++清洗细胞。所用人血清的终浓度为2％。
图4显示了以下数据，MAb 166-32及无关同种型匹配的对照(G3-519)不会抑制致敏鸡RBCs的经典途径溶血，但阳性对照抗人C5 MAb 137-76会抑制。图2、3及4的数据指出，MAb 166-32可专一地抑制补体活化的旁路途径。
实施例4MAb 166-32对因子D的专一性按下面的介绍，使用2个溶血试验来证明MAb 166-32对人因子D的专一性。(1)使用未致敏兔RBCs的因子D依赖的溶血试验抑制首先将人血清样品去除因子D，这通过将其通过填充了偶联有抗因子DMAb 166-222的3M Emphaze Biosupport Medium(Pierce,Rockford,IL)的亲合性柱来完成。流经的血清经检测因完全去除因子D而无法活化旁路途径溶血。此试验的过程类似上面实施例3中介绍的方法，除了将各浓度的纯化因子D加至除去了因子D的血清以重组其溶血活性。在此情况下，兔RBCs的溶血依赖于因子D。重组溶血活性显示对补充的因子D浓度呈线性比例(由0.01微克/毫升至2微克/毫升)(图5)。图5数据亦显示，0.3微克/毫升的MAb 166-32可在存在0.1微克/毫升补充的因子D情况下完全抑制未致敏兔RBCs的溶血，而阴性对照MAb G3-519对依赖因子D的溶血无影响。这些数据说明，在摩尔比率为1∶2时(MAb 166-32对因子D)，MAb 166-32可有效抑制人因子D的生物活性。因此MAb 166-32对因子D来说是强效的高亲合性抗体。这种抗体具有用于临床治疗由补体旁路途径引起的疾病或情况的潜力。(2)EAC3b细胞上旁路C3转化酶形成的抑制EAC3b细胞为包被了人C3b(购自National Jewish Center ofImmunology and Respiratory Medicine，Denver，CO)的绵羊RBCs。在本试验中，通过加入因子B、因子P(备解素)及因子D，旁路C3转换酶装配于EAC3b细胞表面。然后EAC3b细胞(5×108)用DGVB++液(50％巴比妥钠缓冲盐水、pH7.2，包含0.075毫摩尔CaCl2、0.25毫摩尔MgCl2、0.1％明胶、2.5％(w/v)葡聚糖，及0.01％叠氮钠)清洗3次。将清洗后的细胞悬浮于1.5毫升的DGVB++、因子P(30微克)及因子B(20微克)中。因子P及因子B浓度预先测定为过量。将50毫升细胞悬浮液加至圆底96孔微测试平板各孔中。然后将50微升因子D(1.2微毫克/毫升)与系列稀释的MAb166-32或MAb G3-519的混合物加至含细胞的孔中，在30℃温育15分钟。因子D的浓度(1.2微毫克/毫升)在此情况下预测能够产生高于90％的溶血。温育后，将细胞在GVB-EDTA培养液(含10毫摩尔EDTA的明胶/巴比妥钠缓冲盐水)中清洗2次。然后将细胞悬浮于30微升的GVB-EDTA培养液。为起始溶血，将100微升豚鼠血清(Sigma)(1∶10稀释于GVB-EDTA)加至各孔中。然后将混合物在37℃温育30分钟。然后将微测试平板于300xg离心3分钟。收集上清液，测量405nm处的OD。
图6显示了MAb 166-32抑制EAC3b细胞裂解的实验结果，而无关的MAb G3-519不产生抑制。MAb 166-32抑制因子D对因子B的切割，因而避免C3转换酶在EAC3b细胞表面的形成。
实施例5MAb 166-32对通过补体活化的酵母聚糖生成C3a的抑制为进一步确定MAb 166-32对因子D的功能专一性，检测了MAb对酵母聚糖(活化的酵母颗粒)上的补体旁路活化作用的影响。将酵母聚糖A(来自啤酒酵母，Sigma)(1毫克/毫升)在GVB/Mg-EGTA中清洗3次，然后按1毫克/毫升悬浮于相同培养液。将25微升不同浓度的MAb 166-32或G3-519与25微升人血清(1∶5稀释于GVB/Mg-EGTA)在微试管中混合，在室温下温育15分钟。对照组不含抗体，但含培养液及血清。温育后，将50微升清洗的酵母聚糖悬浮液加至各管中，在37℃温育30分钟。将微管于2000xg离心5分钟，收集上清液，与等量的样品稳定液(Quidel,San Diego,CA)混合。将样品冷冻于-25℃直至分析。样品中C3a及sC5b-9的浓度可用定量型ELISA试剂盒(Quidel)依厂商说明书进行测定。
图7显示，MAb 166-32可抑制C3a自补体活化酵母聚糖的产生，而无关的MAb G3-519则无此效果。这些数据表明，MAb 166-32可抑制因子D的C3转换酶生成。MAb 166-32对因子D的完全抑制可有效的阻碍C3转换酶的产生，这可通过其不能产生C3a来显示。这将导致补体级联反应随后步骤中的C5转换酶的抑制，这可由sC5b-9(MAC)形成的抑制证明(图8)。
实施例6MAb 166-32的Fab对补体活化的溶血的抑制为检测MAb 166-32单价形式可否如亲本双价体MAb 166-32一样有效抑制补体旁路途径，MAb 166-32的Fab使用商品化的试剂盒(Pierce)通过木瓜蛋白酶消化进行制备。然后按上面的介绍使用未致敏的兔RBCs来检测Fab对旁路途径溶血的抑制活性。
图9显示了实验的数据，全IgG及Fab都显示相似的阻断旁路补体活化的能力。这些结果表明，MAb 166-32的单价形式具有活性，它保留了与其亲本双价抗体相似的拮抗因子D的能力。此性质对于考虑使用Fab或单链Fv作为替代产品来说非常重要。使用后一单价形式的一个优点是，因为其形体小而具有更好的组织渗透性。鉴于MAb 166-32的Fab有活性，该MAb在因子D上识别的结合表位可能是其重要功能部份。实施例7MAb 166-32对不同种类动物血清的旁路途径溶血的影响为研究MAb 166-32与来自不同种类动物的因子D的交叉反应，使用不同种类动物的血清进行旁路途径溶血分析。首先使用不同种类动物的新鲜血清(人、恒河猴、黑猩猩、狒狒、cynomolgus猴、羊、狗、小鼠、田鼠、大鼠、兔、豚鼠及猪)检测其CH50值，CH50值定义为能使未致敏的兔RBCs达到50％溶血的血清稀释倍数。然后检测并比较MAb 166-32对每种血清的相同溶血活性(CH50)的抑制活性。
图10显示MAb 166-32对人、恒河猴及黑猩猩的血清具有强烈抑制活性，并对cynomlgus猴、狒狒、羊及狗的血清具有中度抑制活性。该抗体不能抑制小鼠、田鼠、大鼠、兔、豚鼠及猪的血清。这些数据表明，MAb 166-32可结合人、恒河猴、黑猩猩、狒狒、cynomolgus猴、羊及狗的因子D的一个共有表位。
实施例8构建人因子D突变体对MAb 166-32进行表位作图为描绘MAb 166-32所识别的人因子D的结合表位，首先检测抗体与人因子D在Western印迹上的反应性。MAb 166-32不与固定在硝纤维素膜上的SDS变性的人因子D(还原或不还原)反应。这个结果表明MAb 166-32结合天然的而不是变性的因子D。
因为MAb 166-32如实施例7所示不抑制小鼠及猪因子D的溶血活性，因此MAb 166-32极可能结合于人因子D中与小鼠及猪因子D具有高氨基酸序列差异的位点。根据这一点，按照下面的介绍，通过用猪的因子D的相应氨基酸残基取代人因子D中的氨基酸残基制备各种因子D突变体及杂合体，用来进行MAb 166-32结合表位作图。(1)构建因子D突变体及杂合体人因子D基因片段通过聚合酶链反应(PCR)使用人脂细胞cDNA(Clontech,San Francisco,CA)为模板和适当的寡核苷酸引物获得。扩增的DNA片段用BamHⅠ及EcoRⅠ限制性切割，并将切割产物插入杆状病毒转移载体pVL1393(Pharmingen,San Diego,CA)的BamHⅠ及EcoRⅠ位点，得到野生型pVL1393-因子D/Hu。人因子D命名为因子D/Hu。成熟的人因子D蛋白的核苷酸序列及推导的氨基酸序列示于SEQ ID NOS1及2(R.T.White等人，J.Biol.Chem.,1992:267:9210-9213;GenBank读取号码M84526)。
猪因子D的cDNA克隆pMon24909由内布拉斯加大学J.L.Miner赠送(GenBank读取号码U29948)。将pMon24909的BamHI-EcoRI片段克隆至PVL1393，得到pVL1393-因子D/pig。猪因子D命名为因子D/pig。成熟的猪因子D蛋白的核苷酸序列及推导的氨基酸序列示于SEQ ID NOS:3及4。
三个人因子D的突变体使用适当引物和重叠PCR进行构建。氨基酸突变被设计为用猪序列中的相应氨基酸残基取代人序列中的氨基酸基残基，这种相应是指人和猪的因子D的氨基酸序列对应排列进行同源比较时。第一个突变体为因子D/VDA，它具有三个氨基酸突变V113E、D116E及A118P。(这是命名突变的一种简写方法，例如其中V113E指人因子D第113位氨基酸基的缬氨酸变为猪因子D的谷氨酸)。第二个突变体为因子D/RH，它具有两个氨基酸突变R156L及H159Y。第三个突变体为因子D/L，它具有单一一个氨基酸突变L168M。编码这些突变体的DNA序列用DNA测序进行确认。用适当的酶切割后，将DNA片段嵌入杆状病毒转移载体pVL1393的BamHⅠ及EcoRⅠ位点，分别得到pVL1393-因子D/VDA、pVL1393-因子D/RH及PVL1393-因子D/L。
两个嵌合的人-猪因子D杂合体也由适当引物以重叠PCR构建得。第一个杂合体为因子D/Hupig，它含有位于于N-端的52个来源于人因子D的氨基酸，其余氨基酸来源于猪因子D。另一个杂合体为因子D/Pighu，它含有位于N-端的52个来源于猪因子D的氨基酸，其余氨基酸来源于人因子D。将BamHⅠ及EcoRⅠ消化的DNA片段嵌入杆状病毒转移载体pVL1393的BamHⅠ及EcoRⅠ位点，得到PVL 1393-因子D/Hupig及PVL 1393-因子D/Pighu。(2)因子D突变体及杂合体的表达质粒转染、重组杆状病毒制备以及重组因子D蛋白在昆虫细胞Sf9中制备的步骤都依厂商说明书施行(杆状病毒表达载体系统，Pharmingen)。(3)因子D突变体及杂合体的纯化来自感染的Sf9细胞培养上清的因子D突变体和杂合体蛋白，使用纯化的羊抗人因子D多克隆抗体(The Binding Site Limited,San Diego,CA)以亲合性柱层析进行纯化。将3毫升羊抗人因子D抗体(13.2毫克/毫升)在偶联缓冲液(0.1M硼酸盐及0.75M Na2SO4，pH 9.0)中平衡，并与4毫升Ultralink Biosupport Medium(Pierce)在室温下偶联2小时。胶粒先用50毫摩尔二乙胺(pH 11.5)清洗用以将所有残余的未反应部位饱和，再以含10毫摩尔Tris、0.15M NaCl、5毫摩尔EDTA、1％Triton X-100及0.02％NaN3(pH 8.0)的缓冲液清洗。将胶粒在缓冲液中于4℃下保存。
将收集自100毫升旋转培养的各杆状病毒突变株感染的Sf9细胞的培养上清液，通过羊抗因子D亲合性柱，其中羊抗因子D亲合性柱事先已用PBS预平衡以去除保存缓冲液。结合的因子D蛋白用50毫摩尔二乙胺，pH11.5洗脱。收集的级份立即用1M Hepes缓冲液中和至pH 7.0。残留的盐使用Millipore膜超滤(M.W.cut-off:3,000)(Millipore Corp.,Bedford,MA)用PBS进行缓冲液置换来去除。蛋白浓度由BCA法(Pierce)测定。(4)因子D的ELISAMAb 166-32与不同因子D突变体及杂合体的反应活性可用ELISA试验进行检测。将96孔微测试平板的不同孔用蛋白(因子D/Hu、因子D/pig、因子D/Hupig、因子D/Pighu、因子D/VDH、因子D/RH、及因子D/L)包被，包被通过加入100微升的PBS溶液中的各种蛋白(0.5微克/毫升)来完成。室温温育过夜后，将孔用PBSTB(PBST含2％BSA)处理，以饱和残留的结合位点。将孔用PBST清洗。将100毫升系列稀释的MAb 166-32(1微克/毫升～0.5微毫克/毫升)加至孔中，置于室温1小时。然后将孔用PBST清洗。结合抗体通过与稀释的HRP-羊抗小鼠IgG(Fc)(JacksonImmunoresearch)在室温温育1小时进行检测。然后按上面的介绍将过氧化物酶受体溶液加入进行显色反应。使用ELISA读取仪测定450nm处的OD。
图11显示，MAb 166-32与因子D/Hu、因子D/Pighu及因子D/VDA反应，但不与因子D/pig、因子D/Hupig、因子D/RH及因子D/L反应。ELISA结果显示，人因子D的氨基酸残基Arg156、His159及Leu168为MAb 166-32结合所必需。这与MAb 166-32在人因子D的C-端为猪的相应部位取代时不与因子D/Hupig结合的事实相一致。氨基酸残基Arg156、His159及Leu168位于所谓″甲硫氨酸环″，该环由Cys154及Cys170之间的二硫键以及位于169位的甲硫氨酸组成(J.E.Volanakis等人，于The HumanComplement System in Health and Disease,J.E.Volanakis及M.M.Franks,eds.,Marcel Dekker,1998，pp.49-81)。就结构言，″甲硫氨酸环″为一种紧密的1型β转角。根据X光晶体衍射图谱研究的数据，人们发现它暴露于因子D分子表面(S.V.L.Narayana等人，J.Mol.Biol.,1994，235:695-708)。但″甲硫氨酸环″对受体专一性及因子D催化活性的贡献则尚未有研究(J.E.Volanakis等人，Protein Sci.,1996:5:553-564)。此数据首次证明，″甲硫氨酸环″在因子D功能活性中扮演重要角色。MAb166-32及其Fab在结合至因子D的该区域时，可有效地抑制因子B的催化活性。实施例9抗因子D MAb 166-32可变区基因的克隆以及嵌合体166-32 IgG及其Fab的构建及表达为减低在人体中使用时MAb 166-32的免疫原性，通过用人IgG1的恒定区取代小鼠恒定区制备了MAb 166-32的嵌合体。抗体的两种Fab嵌合体形式也用人的相应区域取代小鼠恒定区进行制备。MAb 166-32可变区基因的克隆以及嵌合型166-32抗体及其Fab的构建及表达详述于后。(1)抗因子D的MAb可变区基因的克隆从分泌抗因子D的MAb 166-32的杂交瘤细胞分离总RNA，使用RNAzol按厂商说明书进行分离(Biotech,Houston,TX)。cDNA的第一链以寡聚dT为引物从总RNA合成。PCR使用免疫球蛋白恒定(C)区衍生的3'引物以及衍生自前导肽或鼠Vн或VΚ基因第一架构区域的简并(degenerated)引物组作为5'引物来进行。虽然扩增的DNA标明为Vн，但对VΚ来说，没有扩增预期长度的DNA片段。Vн及VΚ基因都通过锚定PCR进行克隆。
嵌合锚定PCR可按Chen及Platsucas(Scand.J.Immunol.,1992;35:539-549)的介绍进行。在克隆VΚ基因时，将双链cDNA使用NotⅠ-MAKⅠ引物(5’-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3’SEQ ID NO:5)进行制备。将退火接头AD1(5’-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3’SEQ ID NO:6)及AD2(5’-TCCGAGAATAACGAGTG-3’SEQ ID NO:7)连接至双链cDNA的5’及3’端。3’端的接头用NotⅠ消化除去。消化产物作为模板用于PCR中，以AD1寡核苷酸为5’引物，以MAK2(5’-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3’SEQ IDNO:8)为3’引物。将约500 bp的DNA片段克隆至pUC19。挑选12个克隆用于进一步分析。有7个克隆被发现含有对Sp2/0V信号有专一性的CDR3序列，并且很可能来自166-32杂交瘤细胞系融合部份的畸形k轻链信号。NotⅠ-MAKⅠ及MAK2寡核苷酸衍生自鼠CK区域，并分别在CK基因第一个bp下游的182及84 bp。用DNA测序对3个克隆进行分析，得到的序列包括鼠CK的一部分、全部VK以及前导肽。
为克隆VH基因，使用NotⅠ-MAG1引物(5’-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3’SEQID NO:9)制备双链cDNA。将退火接头AD1及AD2连接至双链cDNA的5’及3’端。接头的3’端用NotⅠ消化除去。将消化产物在PCR中用作模板，以AD1寡核苷酸及MAG2(5’-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-31 SEQ IDNO:10)为引物。将长度为500～600bp的DNA片段克隆至pUC19。NotⅠ-MAG1及MAG2寡核苷酸源自鼠Cγ1区域，并且分别在Cγ1基因第一个bp下游的180及93bp。用DNA测序对3个克隆进行分析，得到的序列包含鼠的Cγ1的一部分、全部的VH以及前导肽。(2)构建嵌合型166-32 IgG及Fab的表达载体在PCR中使用Vн及VΚ基因为模板，以在5’端加入Kozak序列和在3’端加入剪接供体。在分析序列确定无PCR错误后，将VH及VK基因插入分别含有人Cγ1及C的表达载体盒(cassette)，得到pSV2neoVH-huCγ1及pSV2neoV-huCΚ。将CsCl梯度-纯化的重链及轻链载体的质粒DNAs用电穿孔法感染COS细胞。48小时后，ELISA检测培养上清液中含有约200微毫克/毫升的嵌合体IgG。收集细胞，制备总RNA。使用寡聚dT为引物从总RNA合成第一链cDNA。在PCR中将此cDNA用作模板，制备Fd及KDNA片段。对于Fd基因，使用(5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3’SEQ ID NO:11)为5’端引物及源自CH1的3’端引物(5’-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3’SEQ ID NO:12)进行PCR。DNA序列被证明含有完整的VH及人IgG1的CH1结构域。用适当酶消化后，将Fd DNA片段嵌入表达载体盒pSV2dhfr-TUS的HindⅢ及BamH1限制酶切位点，得到pSV2dhfrFd(图12A)。
对于Κ基因，PCR使用(5-AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3’SEQ ID NO:13)为5’端引物及源自CΚ的3’端引物(5’-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3’SEQ ID NO:14)来进行。DNA序列被证明含有完整的VK及人CK区域.。用适当的限制酶消化后，将KDNA片段嵌入表达载体盒pSV2neo-TUS的HindⅢ及BamHⅠ限制酶切位点，得到pSV2neoκ(图126)。Fd及Κ基因的表达可由源自HCMV的增强子及启动子驱动。因Fd基因不含参与链间二硫键的色氨酸残基，此重组嵌合体Fab含有非共价连接的重链及轻键。此嵌合体Fab名为cFab。
为获得带有重链及轻键间二硫键的重组Fab，扩展上述Fd基因，使其包含编码另外9个来源于人IgG1铰链区域的氨基酸的序列(EPKSCDKTH SEQID NO:12)。将Fd基因3’端编码30个氨基酸的BstEⅡ-BamHⅠ DNA片段用编码扩展Fd的DNA片段进行取代。含有额外9个来源于人IgG1铰链区氨基酸的扩展Fd用DNA测序进行证实。将此Fd/9aa基因插入表达载体盒pSV2dhfr-TUS，得到pSV2dhfrFd/9aa。此嵌合体Fab命名为cFab/9aa。(3)嵌合体166-32 IgG及Fab的表达为获得分泌嵌合体166-32 IgG的细胞系，将NSO细胞用pSV2neoVH-huCγ1及pSV2neoV-huCK的纯化质粒DNAs通过电穿孔法进行转染。在存在0.7毫克/毫升G418下筛选转感染细胞。使用含血清培养液将细胞培养于250-毫升旋转瓶。
为获得分泌嵌合体166-32Fab的细胞系，将CHO细胞用pSV2dhfrFd(或pSV2dhfrFd/9aa)及pSV2neoκ的纯化质粒DNAs通过电穿孔法进行转染。在存在G418及氨甲喋呤下筛选转感染细胞。将所筛选细胞系在增加氨甲喋呤的条件下进行扩增。通过限制稀释对细胞进行单细胞亚克隆。然后使用含血清培养液将高产的单细胞亚克隆细胞系培养于100-毫升旋转培养液。(4)嵌合体166-32 IgG的纯化将100毫升旋转培养上清液上样至10毫升PROSEP-A柱(Bioprocessing,Inc.,Princeton,NJ)。将柱用10倍床体积的PBS清洗。结合的抗体用50毫摩尔柠檬酸盐缓冲液、pH 3.0进行洗脱。将等量的1M Hepes、pH 8.0加至含纯化抗体的级份以将pH调至7.0。残留的盐通过用PBS进行缓冲液置换并使用Millipore膜超滤(M.W.cut-off3000)来去除。纯化抗体的蛋白浓度用BCA法(Pierce)测定。(5)嵌合体166-32 Fab的纯化嵌合体166-32 Fab可通过亲合性层析使用小鼠抗MAb 166-32的抗独特型MAb进行纯化。此抗独特型MAb被命名为MAb 172-25-3。它通过用与匙孔蓝蛋白(KLH)偶联的MAb 166-32免疫小鼠，并筛选能与因子D竞争性结合MAb 166-32的特异性抗体来制备。
亲合性层析基质的制备按如下方法进行将25毫克MAb 172-25-3与5毫升干燥的aziactone胶粒(UltraLink Biosupport Medium,Pierce)在缓冲液(0.1M硼酸盐及0.75M Na2SO4、pH9.0)中及室温下混合2小时。然后将残余的未反应位点用1M乙醇胺(pH9.0)在室温下封闭2.5小时。然后将胶粒在含10毫摩尔Tris、0.15M NaCl、5毫摩尔EDTA、1％TritonX-100及0.02％NaN3、pH8.0)的缓冲液中清洗，并在4℃下保存。
为进行纯化，将产cFab或cFab/9aa CHO细胞的旋转培养物的100毫升上清液上样至偶联了MAb 172-25-3的亲合柱。将柱用PBS彻底清洗，然后用50毫摩尔二乙胺、pH11.5洗脱结合的Fab。残留的盐按上面的介绍通过缓冲液置换去除。纯化Fab的蛋白质浓度用BCA法(Pierce)测定。(6)SDS-PAGE嵌合体166-32 IgG、cFab及cFab/9aa的SDS-PAGE纯化的嵌合体166-32 IgG、cFab及cFab/9aa用SDS-PAGE分析其纯度及分子量。将蛋白质用含或不含巯基乙醇的样品缓冲液处理。然后将样品与预先染色的分子量标准(低分子量范围)(BIO-RAD Laboratories，Hercules,CA)一起于预注胶(12.5％)(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)中电泳，电泳使用PhastSystem (Amersham PharmaciaBiotech)。然后将胶在考马斯亮蓝液(BIO-RAD)中染色5分钟，再在含40％甲醇及10％乙酸的水溶液中脱色。
CFab、cFab/9aa及嵌合体IgG在非还原及还原条件下的SDS-PAGE结果显示，嵌合体IgG具有150kD的蛋白质条带以及两个分别约为50kD及29kD的重链(HC)及轻链(LC)蛋白质条带。与预期的一样，cFab/9aa在非还原条件下仅有1个约为40kD的蛋白质条带，这表明重链及轻链通过链间二硫键相连。另一方面，cFab在非还原条件下有2个蛋白质条带，这表明重链及轻链不通过链间二硫键相连。(7)测定嵌合体166-32 IgG、cFab及cFab/9aa的活性嵌合体166-32 IgG、cFab及cFab/9aa的活性可按上面的介绍使用补体旁路溶血试验进行测定。图13显示，鼠及嵌合体形式的MAb 166-32具有相同的抑制因子D的效力。图14显示，cFab及cFab/9aa具有基本上相同的抑制因子D的效力。更重要地是，两种形式的嵌合体Fab的效力与嵌合体IgG相同，虽然每个IgG分子有两个结合位点。总而言之，这些结果证明，嵌合体IgG、cFab及cFab/9aa保留了亲本鼠MAb 166-32的效力。实施例10在用人血浆灌注的兔心脏体外模型中，MAb 166-32对由补体介导的组织损伤的保护作用补体系统的活化可造成超急性移植排斥。这可能是如下过程的结果能够固定补体的抗体的结合、补体在外源细胞表面经由旁路途径直接活化、和/或外源器官不能调节补体(J.L.Platt等人，Transplantation，1991；52:937-947)。根据特殊的种与种之间的相互作用，补体活化可经由占优势的经典或旁路途径，虽然有时这两个途径可同时运作(T.Takahashi等人，ImmunoL Res.,1997；16:273-297)。先前的研究显示，超急性排斥可在不存在抗供体抗体的情况下经由旁路活化途径发生(P.S.Johnston等人，Transplant.Proc.,1991；23:877-879)。
为证明旁路补体途径对组织伤害的重要性，使用一个体外模型来对抗因子D的MAb 166-32进行检测，在该模型中分离的兔心脏用稀释的人血浆灌注。此模型在先前的研究显示可因补体旁路活化途径对兔心肌造成伤害。(M.R.Gralinski等人，Immunopharmacology,199634:79-88)。(1)由Langendorff灌注的兔心脏将雄性新西兰白兔(2.2-2.4公斤)用断颈椎法致死。快速取出心脏，插管以通过主动脉灌注。灌注培养液含有循环体积(250毫升)的修饰Krebs-Henseleit(K-H)缓冲液(pH 7.4、37℃)，以20-25毫升/分的恒定速率给予。缓冲液培养液的组成(毫摩尔/L)为NaCl，117；KCl，4.0；CaCl2.H2O，2.4；MgCl2.6H2O，1.2；NaHCO3，25；KH2PO4，1.1；葡萄糖，5.0；L-谷氨酸单钠，5.0；丙酮酸钠，2.0；及BSA，0.25％(w/v)。此K-H缓冲液通过一个气孔状″肺″，该“肺”由SilasticTM Laboratory GradeTubing(Dow Corning,Midland,MI)组成，长度为55.49米，内径为1.47毫米及外径为1.96毫米。将膜状″肺″持续暴露在95％O2/5％CO2下，使灌注培养液中氧分压为500毫米米汞柱。在整个试验中，心脏通过连于右肺动脉的电极进行搏动。由一台实验室方形波发生器(Grass SD-5,Quincy,MA)传送搏动刺激(3Hz,4 msec持续时间)。将肺动脉用聚乙烯管插管以便于肺动脉输出液的收集，后者代表冠状静脉回流。将腔静脉的外腔和内腔以及肺静脉结扎以防灌注液从被割断的管流出。通过左动脉插入一个左心室管、热敏电阻探针以及橡胶球，并且定位于左心室。将充满液体的橡胶球用硬管连接至压力传导器，以测量左心室的收缩压及终舒张压。左心室developed压定义为左心室收缩压及终舒张压之间的差异。心室间球用蒸馏水扩张，以达到5毫米汞柱的起始基线的左心终舒张压。冠状灌注压力用与心导管的侧臂连接的压力传导器进行测量。使用多频道计数器(Grass Polygraph 79D,Quincy,MA)连续监测所有的血动态变化。在整个试验过程中，使分离的心脏维持在37℃，这通过将心脏置于调温的双层玻璃室，并通过加热器及传送器灌注培养液来实现。(2)抗体处理使用两个治疗组来测定抗因子D MAb 166-32在以人血浆灌注的分离兔心脏中抑制补体活化的能力。第1组同种型匹配的阴性对照，由在存在0.3微克/毫升对HIV-1 gp120有专一性的MAb G3-519的情况下用4％的人血浆灌注的心脏组成(n=6)。第2组治疗组，由在存在0.3微克/毫升MAb 166-32的情况下用4％的人血浆灌注的心脏组成(n=6)。人血浆可由新鲜收集的全血中分离，并贮存于-80℃直到使用。使用此百分比的人血浆是因为它可在合理长度的时间内严重破坏心肌功能，并允许对治疗有效性进行评估。此系统中的高浓度人血浆可使心脏快速收缩，而低浓度下药物的效用难以分析。初步研究已经测定，0.3微克/毫升为能够从补体活化的影响保护分离心脏的最低有效浓度。在将任何一种抗体加入灌注培养液之前，所有心脏在Langendorff器中平衡10-15分钟。加入抗体10分钟后，将4％人血浆加入至灌注培养液(250毫升，再循环)。血动态变化包括冠状动脉灌注压(CPP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室终舒张压(LVEDP)以及左心室压(LVDP)在加入抗体前记录(基线)，在加入4％人血浆前记录，此后每10分记录1次，共记录60分钟。
在接触4％人血浆时，与用MAb G3-519(0.3微克/毫升)处理的心脏相比，MAb 166-32(0.3微克/毫升)可减少冠状灌注压(CPP)的增加。CPP的增加显示冠状血管抗性，该抗性通常与心肌组织伤害相关。用MAb 166-32灌注的分离兔心脏可维持左心室终舒张压(LVEDP)，这与用MAb G3-519获得的结果相反(图15)。后一组心脏在接触4％人血浆时可使LVEDP增加，这显示心室在舒张时无法舒缓(图15)。与用MAb G3-519处理的心脏相比，在接触稀释的人血浆后，MAb 166-32亦可减少左心室压(LVDP)的增加(图15)。
图16描述了在存在4％人血浆时的灌注之前及10、30及60分钟后心功能的代表性记录。10分钟后，用MAb G3-519处理的兔心脏有明显的进程性的LVEDP增加及LVDP降低，并且在随后的50分内，心室功能进程性地恶化。另一方面，用MAb 166-32处理的心脏在60分钟后仍能保持心室功能。
总而言之，血动态数据表明，抗因子D MAb 166-32能保护分离的兔心脏，使之不受人补体-介导的损伤，这可用人血浆攻击后仍能维持完全的心肌功能来说明。(3)补体Bb的ELISA因子D催化结合状态的因子B的切割，产生Ba及Bb片段。Bb存在的浓度可作为因子D活性的指标。从分离兔心脏收集的淋巴液中的活化成份Bb的浓度可使用商业化的ELISA试剂盒(Quidel)测量。此分析使用针对人补体Bb的MAb在存在人血浆的条件下灌注兔心脏的过程中测量人补体系统的活化。淋巴管流出淋巴液可从心脏尖收集，速冻于液态氮，并贮于-70℃直到分析。记录和说明淋巴管流出液的流速，以将Bb浓度正常化。
在用4％人血浆灌注10分后以及在各时间点，用MAb 166-32处理的心脏与用MAb G3-519处理的心脏相比，淋巴管流出液存在明显(p＜0.05)浓度低的Bb(图17)。在用MAb 166-32处理的兔心脏中补体活化产物Bb的产生减少，证明了该抗体对因子D的抑制剂活性。(4)C5b-9沉积物的免疫组化定位完成上述步骤后，从Langendorff装置移出心脏，切成横向切片，冷冻于液态氮。丢弃心尖及动脉组织。将切片包埋于O.C.T.化合物包埋培养液(Miles,Inc.,Ekhart,IN)，切为3米，置于聚-L-缬氨酸包被的载玻片。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗后，将切片在室温下与PBS中的4％多聚甲醛温育。将心脏切片用PBS清洗并与1％BSA温育15分钟以降低非专一染色。用PBS清洗后，将切片与1∶1000稀释的鼠抗人C5b-9 MAb(Quidel)一起在室温下温育1小时。将切片再用PBS清洗，在室温下与羊抗鼠FITC偶联抗体(Sigma，1∶320稀释)温育1小时。最后用PBS清洗后，将切片用Fluoromount-G(Electron Microscopy Sciences,ort Washington,PA)固定，盖以盖玻片。对照包括不使用第一抗体处理的切片以及用同种型匹配的鼠抗体IgG1(Sigma)取代抗C5b-9 MAb的切片。
使用免疫荧光染色检测用MAb 166-32及MAb G3-519处理的心脏的心脏切片中的人MAC(或C5b-9)沉积。用MAb 166-32处理的心脏与MAb G3-519处理的心脏相比，显示MAC沉积减少。
总而言之，兔心脏体外研究的数据证明了MAb 166-32通过抑制旁路补体途径在预防心组织损伤的效果。抑制补体活化已显示可延长移植存活率(S.C.Makrides,Pharmacologicai Rev.,1998，50:59-87)。因此，MAb166-32有用作治疗药剂来保护移植物不受人血浆破坏的潜力。实施例11在心肺分流的体外循环模型中，MAb166-32对补体活化及炎症反应的抑制效应进行心肺分流(CPB)的病人经常表现出系统性炎症应答症。在临床上，这些反应可表现为术后白细胞增多、发热、及血管外液体累积，这可导致恢复期延长，并偶而会造成严重的器官功能破坏(J.K.Kirklin等人，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.,1983;86:845-857;L.Nilsson等人，Scand.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.,1988;22:51-53;P.W.Weerwind等人，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.,1995;110:1633-1641)。这种炎症反应包括体液及细胞的变化，而造成组织损伤及止血功能被破坏。补体活化已被认为是系统性炎症反应的重要原因(P.Haslam等人，Anaesthesia,1980;25:22-26;A.Salama等人,N.Eng.J.Med.,1980;318:408-414;J.Steinberg等人,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.,1993;106:1008-1016)。补体活化是引起血液与CPB体外循环机器的表面相互作用的原因(D.Royston,J.Cardiothorac.Vasc.Anesth.,1997;11:341-354)。原炎症物质在补体系统活化后生成，它们包括过敏毒素C3a及C5a、调理素C3b、及膜攻击复合物C5b-9。C5a已显示可在体外在多形核细胞PMN(主要含中性粒细胞)中上调MAC-1复合物中的CDllb(整合素)及CD18(整合素)(M.P.Fletcher等人，Am.J.Physiol.,1993;265:H1750-H1761)，并诱导PMN释放溶酶体酶。C5b-9可诱导血小板上P-选择素(CD62P)的表达(T.VViedmer等人，Blood,1991;78:2880-2886)，而且C5a及C5b-9都诱导P-选择素在内皮细胞的表面表达(K.E.Foreman等人，J.Clin.Invest.,1994;94:1147-1155)。C3a及C5a可刺激人肥大细胞的趋化性(K.Hartmann等人，Blood,1997;89:2868-2870)，并引发组织胺的释放(Y.Kubota,J.Dermatol.,1992;19:19-26)，后者可诱导血管通透性(T.J.Williams,Agents ActiohS,1983;13:451-455)。
全血在体外分流循环系统中的体外再循环已被广泛用作在CPB中激活白细胞(J.Kappelamyer等人，Circ.Res.,1993;72:1075-1081;N.Moat等人，Ann.Thorac.Surg.,1993;56:1509-1514;C.S.Rinder等人，J.Clin.Invest.,1995:96:1564-1572)和血小板(V.L.Jr.Hennesy等人，Am.J.Physiol.,1977;2132:H622-H628;Y.Wachtfogel等人，J.Lab.Clin.Med.,1985;105:601-607;C.S.Rinder等人，ibid)变化以及补体活化(P.G.Loubser,Perfusion,1987;2:219-222;C.S.Rinder等人，ibid;S.T.Baksaas等人，Perfusion,1998;13:429-436)的模型。使用此CPB体外循环模型对抗因子D的MAb 166-32在人全血中抑制细胞及补体活化的有效性进行了研究。(1)体外循环系统的制备体外循环系统使用如下部件进行装配带有一个嵌入式热交换器的中空纤维儿科膜氧生成器(D 901 LILLPUT 1；DIDECO,Mirandola(MO)，Italy)、带有一个嵌入式开心术滤器的儿科静脉贮器(D752Venomidicard;DIDECO)、一个灌注管道装置(Sodrin Biomedical,Inc.,Irvine,CA)以及多流旋转泵(Stockert Instruments GmbH,Munich,Germany)。将血浆-Lyte A液(Baxter Healthcare Corp.,Deerfield,IL)注入氧生成器及循环器进行启动。将此启动液用冷热器回温至32℃(Sarns;3M Health Care,Ann Arbor,MI)，并按500毫升/分钟进行循环，将通气流用100％氧维持于0.25升/分钟。当加入血至循环系后，将通气流换成氧(95％)及CO2(5％)的混合气体。在整个再循环期间连续监测pH、PCO2、PO2以及灌注液温度。在需要时加入碳酸氢钠以将pH维持于7.25-7.40。(2)体外循环系统的操作及取样从健康无服药的自愿者在5-10分钟内抽450毫升血至转移袋中(Haemo-Pak;Chartermed,Inc.,Lakewood,NJ)，转移袋中含猪肝素(5单位/毫升，终浓度；Elkins-Sinn,Cherry Hill,NJ)及抗因子D的MAb166-32或同种型匹配的阴性对照MAb G3-519(18微克/ml；终浓度)。抗体的这个浓度相当于血中因子D摩尔浓度的约1.5倍。在将血加入体外循环系统前，从袋中取一个血样品作为″循环前″样品，命名为″-10分钟样品″。然后将血经由已启动的通道加入贮器。同时将启动液抽至氧生成器远端出口，产生600毫升的最终循环体积以及25-28％的最终血细胞比容。将血与启动液一起循环，在3分钟内完成完全混合；抽出基线样品，命名为0时间。为模拟体温过低下外科手术的一般过程，将循环液冷却至27℃70分钟，再回温至37℃50分钟(总共再循环120分)。
在再循环过程中，还在10、25、40、55、70、80及120分钟抽取血液样品。立即在2000xg及4℃下离心制备血浆样品。分装以用于旁路途径溶血分析及中性粒细胞一专一的髓过氧化物酶分析，将分装样品冷冻于干冰，贮于-80℃。立即将用于ELISA测量补体C3a、C4d、sC5b-9、及Bb的分装样品与等体积的样品稳定培养基(Quidel)混合，冷冻于干冰，贮于-80℃。还收集全血样品用于对中性粒细胞及血小板上活化的细胞表面标记CD11b及CD62P进行免疫染色。为防止染色过程中全血样品的随后的补体活化，将10微升的1M EDTA加入每毫升全血，使其终浓度为10毫摩尔。(3)旁路途径溶血分析如上所述使用兔红血球细胞检测MAb 166-32处理的及MAb G3-519处理的循环在不同时间点时血浆样品中的旁路补体活性。将50微升的每种样品(20％)在加入30微升兔红血球细胞(1.7×108细胞/毫升)之前与50微升GVB/Mg-EGTA缓冲液混合。在37℃下温育30分钟后，收集上清液。使用ELISA平板计数器读取405nm处的OD。
图18显示，用MAb 166-32处理的循环系统中旁路补体活性可完全被该抗体抑制，而MAb G3-519在用于相当的循环系统时对补体活性无影响。这些结果表明，MAb 166-32为旁路补体途径的强力抑制剂。即使在摩尔比率仅为1.5∶1(MAb因子D)时，MAb 166-32也可完全抑制旁路补体活性。(4)补体活化产物的分析除了上面介绍的溶血分析，还可检测来自两个体外循环系统的血浆样品中的C3a、sC5b-9、Bb以及C4d的水平。这些物质可使用商业化的ELISA试剂盒(Quidel)按厂商说明书进行定量。与C5a一样，sC5b-9是补体级联反应中C5转换酶活性的另一个标记。C5a及sC5b-9皆为C5被C5转换酶切割的产物。补体Bb为补体旁路活化途径的专一标记，而C4d为经典活化途径的专一标记。
图19及20显示，MAb 166-32可分别有效地抑制C3a及sC5b-9产生，但同种型匹配的阴性对照MAb G3-519则不能抑制它们的产生。MAb 166-32的专一性及效力进一步在图21及22中阐明。由补体旁路途径产生的Bb可完全被MAb 166-32抑制，而G3-519循环中的Bb水平在再循环过程中随时间增加而增加。有趣地是，MAb 166-32及G3-519循环中C4d的水平随时间不会显著变化。后面的有关Bb及C4d水平的结果强烈显示，体外循环系统中的补体活化主要由旁路途径介导。
总而言之，这些结果表明，MAb 166-32为补体旁路途径的强力抑制剂。因子D的抑制可终止级联反应的后续步骤的补体活化，这可由C3a及sC5b-9形成的减少来表现。(5)中性粒细胞及血小板活化的分析中性粒细胞及血小板的活化可分别通过测量中性粒细胞及血小板上CD11b及CD62P的细胞表面表达水平来定量。对于中性粒细胞的CDllb标记，将100微升收集自循环系统的血立即在微量离心管中在室温下与20微升的红藻素(PE)-抗CDllb抗体(克隆D12,Becton Dickinson,San Jose,CA)温育10分钟。在室温下加入1.4毫升的FACS裂解液(BectonDickinson)10分钟以裂解红细胞和固定白细胞。将微量离心管在300xg离心5分钟。吸出上清液，将细胞悬浮于PBS进行清洗。将微量离心管再离心一次，吸出上清液，在使用EPIC-XL流式细胞仪(Coulter Corp.,Miami,FL)进行分析前，将细胞悬浮于0.5毫升的1％多聚甲醛过夜。为进行双标记以同时鉴定中性粒细胞群，加入5微升的异硫氰酸荧光素(FITC)-抗CD15抗体(克隆MMA,Becton Dickinson)以与PE-抗CDllb抗体一起温育。
对于血小板的CD62P标记，将40微升收集自循环系统的血立即在微量离心管中在室温下与20微升PE-抗CD62P抗体(克隆ACI.2,BectonDickinson)温育10分钟。将混合物按上面的介绍用FACS裂解液处理。将微量离心管在2000xg离心5分钟。将血小板用PBS清洗，用1％多聚甲醛固定，再按上面的介绍进行分析。为进行双标记以同时鉴定血小板群，加入5微升的FITC-抗CD42a抗体以与PE-抗CD62P抗体一起温育。
为进行流式细胞测量，PMN(主要含中性粒细胞)及血小板群分别用基于前对侧散布参数的活动门以及用FITC-抗CD15抗体及FITC-抗CD42a抗体专一染色进行鉴定。背景染色使用同种型匹配的标记抗体设定门。CDllb及CD62P的表达强度用平均荧光强度(MFI)表示。
图23显示，来自MAb 166-32处理的体外循环系统的中性粒细胞，与来自MAb G3-519处理循环系统的中性粒细胞相比，显示明显低的CDllb表达。这些数据连同上述其他数据表明，MAb 166-32对补体旁路活化的抑制可阻止中性粒细胞的活化。
与此类似，图24显示，来自MAb 166-32处理的体外循环系统的血小板，与来自MAb G3-519处理的循环系统的血小板相比，显示明显低的CD62P表达。同样，这些数据连同上述其他数据显示，MAb 166-32对补体旁路活化的抑制可阻止血小板的活化。(6)中性粒细胞-专一的髓过氧化物酶(MPO)的分析中性粒细胞的活化程度亦可使用商业化的ELISA试剂盒(R&DSvstems,Inc.,Minneapolis,MN)进行测量以测定来自体外循环系统的血浆样品中的中性粒细胞专一的髓过氧化物酶(MPO)的数量。MPO主要贮于中性粒细胞的原粒(嗜苯胺蓝细胞)中。它在中性粒细胞因活化而脱粒时释放。因此MPO为中性粒细胞活化的可溶性标记。分析可按厂商说明书施行。简而言之，将样品于微平板的孔中温育，这些孔已用抗MPO的第一MAb包被。将此MPO-MAB复合物用从羊MPO-抗血清中制备的一种与生物素偶联的多克隆抗体标记。此分析最后步骤基于生物素-亲和素偶联，其中亲和素已与碱性磷酸酶共价连接。在加入底物4-硝苯基-磷酸盐(pNPP)后，通过读取405处的OD，以酶学的方法测得各样品中MPO的量。
图25显示，MAb166-32处理的循环系统中的MPO水平比MAbG3-519循环系统中的水平明显要低。这些结果与上面介绍的免疫荧光计数研究中的CDllb表达相吻合。
总而言之，有关补体、中性粒细胞及血小板的数据支持如下论点，抗因子D MAb 166-32对体外循环系统中补体旁路活化的有效抑制，可阻止炎症物质C3a、C5a及sC5b-9的形成，并因而降低中性粒细胞及血小板的活化。可以预测，MAb 166-32及其片段、同源物、相似物及其小分子部份可有效预防或降低因CPB所致的临床炎症反应。例12研究MAb 166-32在患有缺血及灌注损伤的狗模型中的效果设计一研究以检测MAb 166-32是否可保护患有缺血及灌注狗的心肌组织不受伤害，虽然从一开始我们就认识到，狗可能不是研究MAb 166-32效用的理想动物模型。在溶血试验中，MAb 166-32中和狗因子D的能力比中和人因子D的能力至少低10倍(参见例7)。因为那时仅有有限量的MAb166-32，所以将MAb 166-32经由冠状血管给药至心脏。我们希望可在冠状血中累积至少60微克/毫升的抗体浓度以完全抑制心脏中的狗因子D。计算剂量为3.15毫克/公斤/灌注，总共6次灌注。MAb G3-519用作同种型匹配的对照。
简而言之，将实验用猎犬麻醉。在第四肋间左位进行胸廓切开术以露出心脏。分离近左围旋冠状动脉，结扎90分钟以诱导缺血，再灌注6小时。分别在缺血前30分钟、灌注前10分钟及灌注期间的75、150、225、300分钟给药抗体6次。在不同的时间点注入放射性微球以测量区域血流。在实验结束时，将心脏用伊凡蓝染料及三苯四锉灌注以分别测量危险面积及梗塞大小。在缺血前及实验结束时从颈静脉收集冠状淋巴液及血。使用这些样品来测量注射抗体的浓度以及旁路途径溶血活性。
结果显示，冠状淋巴液中MAb 166-32可达到的最高浓度约为30微克/毫升，这远低于在冠状循环中完全抑制狗因子D所需的浓度。在系统循环中也检测到抗体，这表明注射的抗体扩散到心脏之外。溶血分析数据显示，补体旁路活性没有降低；这与抗体浓度较低的事实吻合。因此，由在狗中所作的这些实验无法对MAb 166-32在灌注实验中的效应下结论。
上面的描述、术语、表达及例子仅为举例而不是限制。本发明包括前面实施方案的所有等价物，不管是已知的还是未知的。本发明仅受后面专利要求的限制，并不受本文任何其他部分中的任何陈述或任何其他来源的限制。
序列表<110> Michael S.C. FungBill N.C. SunCecily R.Y. Sun<120>补体活化的抑制剂<130>98-2<140>09/253,689<141>1999-02-20<150>60/075,328<151>1998-02-20<160>15<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>699<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(4)…(687)<400>1cgg atc ctg ggc ggc aga gag gcc gag gcg cac gcg cgg ccc tac atg 48
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1．一种补体活化的抑制剂，它结合因子D，并且在摩尔比约为1.5∶1(抑制剂∶因子D)时能抑制补体活化。
2．一种补体活化的抑制剂，它结合因子D，并且在摩尔比低于80∶1(抑制剂∶因子D)时能抑制补体活化。
3．一种补体活化的抑制剂，它结合因子D，并且在适于治疗使用的抑制剂∶因子D摩尔比时能抑制补体活化。
4．权利要求1、2或3的抑制剂，其中补体活化的抑制作用在体外测定。
5．权利要求4的抑制剂，其中补体活化的抑制在体外用体外分析进行测定。
6．一种补体活化抑制剂，它结合人因子D中氨基酸残基号码Cys154及Cys170之间(且含)的区域。
7．权利要求6的抑制剂，它在无氨基酸残基Arg156、His159及Leu168时不结合人因子D。
8．权利要求1～3、6或7中任一项的抑制剂，它是一种抗体或同源物、相似物或其片段、肽、寡核苷酸、肽模拟物或有机化合物。
9．权利要求8的抑制剂，其中抗体片段为Fab、(Fab’)2、Fv或单链Fv。
10．权利要求9的抑制剂，其中抗体是一种嵌合的、去免疫的、人源化的、去免疫化的或人抗体。
11．单克隆抗体166-32。
12．产生单克隆抗体166-32的杂交瘤，它保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号码为HB-12476。
13．一种单克隆抗体或片段、相似物或其同源物、或肽、寡核苷酸、肽模拟物或有机化合物，它与抗体166-32结合至因子D的相同表位。
14．权利要求13的片段，它是一种Fab、(Fab’)2、Fv或单链Fv。
15．一种嵌合体形式，它含有权利要求14的Fab片段的小鼠可变区及人恒定区。
16．产生单克隆抗体或其片段的细胞系，其中该抗体与抗体166-32结合至因子D相同表位。
17．产生权利要求14的片段的细胞系。
18．产生权利要求15的嵌合体Fab片段的细胞系。
19．一种嵌合体形式，它含有单克隆抗体166-32的小鼠可变区及人恒定区。
20．一种嵌合体形式，它含有单克隆抗体166-32的Fab片段的小鼠可变区及人恒定区。
21．一种治疗由补体系统过度或失控活化介导的疾病或症状的方法，包括在体内或体外给药一种权利要求1～3、6及7中任一项的抑制剂。
22．一种治疗由补体系统过度或失控活化介导的疾病或症状的方法，包括在体内或体外给药一种权利要求8的抑制剂。
23．一种治疗由补体系统过度或失控活化介导的疾病或症状的方法，包括在体内或体外给药一种权利要求9～11、13～15或19及20中任一项的抑制剂。
24．一种治疗与心肺分流相关的补体-介导的症状的方法，包括在体内或体外给药一种权利要求1～3、6及7中任一项的抑制剂。
25．一种治疗与心肺分流相关的补体-介导的症状的方法，包括在体内或体外给药一种权利要求8的抑制剂。
26．一种治疗与心肺分流相关的补体-介导的症状的方法，包括在体内或体外给药一种权利要求9～11、13～15或19及20中任一项的抑制剂。
全文摘要
本发明涉及因子D的抑制剂,它结合因子D并阻断因子D在补体活化中的功能活性。此抑制剂包括抗体分子,以及同源物、相似物及它们的修饰形式或衍生形式,包括免疫球蛋白片段如Fab、(Fab’)
文档编号C12N5/10GK1298308SQ99805256
公开日2001年6月6日 申请日期1999年2月19日 优先权日1998年2月20日
发明者M·S·C·冯, C·R·Y·孙, B·N·C·孙 申请人:泰诺士公司