轰击转化秀丽新杆线虫的方法

专利名称：：轰击转化秀丽新杆线虫的方法
技术领域：
：本发明涉及一种将核酸导入线虫，特别是秀丽新杆线虫(Caenorhabditisclegans)的方法。目前是通过将核酸(通常是DNA)注射进入其两性体性腺(即进入Syncitium)，或者注射进入单个的卵母细胞核来制备转基因秀丽新杆线虫(C.elegans)。一般注射一个混合物，此混合物包含打算导入的DNA(此后被称为“待测DNA”)和携带有使之能将转基因后代与非转基因后代区分开的选择性标记的质粒。此选择性标记可以是一种将导致该转基因线虫(例如ro1-6)形状或运动改变的可视性表型标记，也可以是一种挽救条件性致死基因的标记，此致死基因已被导入经注射线虫的遗传背景中，或者还可以是一种质粒，它含有来自水母AequoreaVictoria的，编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸。然后，从被注射线虫的后代(F1代)筛选出表达此选择性标记的线虫。一个被注射的两性体的F1后代，一般含有平均1-10个表达此选择性标记的个体。然后对这些个体进行培养，但是，平均只有10％的个体将继续传递此选择性标记至它们的后代。通常假定，当此标记DNA被接受进入线虫基因组，并被传递至后代时，打算导入的待测DNA将会被共转化。现在的这种转化方法在实际应用中其有局限性，引导DNA进入线虫必须一个一个进行操作，并且在显微镜下注射syncitia/卵母细胞。此工作既费时间，并需要相当多的专家。对于一名精于此注射技术的人员，通常一天可能注射大约50个两性体。以可遗传的方式传递被转化DNA的转基因线虫已掺入了一个额外的小染色体，此小染色体是由以不可预见结构连接在一起的标记和待测DNA的混合物组成。这种小染色体在有丝分裂和减数分裂中不稳定，每次细胞分裂可能丧失1％-99％。本发明的目标是对秀丽新杆线虫提供一个更有效的转化系统。理想地是希望通过与秀丽新杆线虫染色体同源重组，达到对外源性待测DNA的整合。为了达到此目的，有必要发展一种技术，借助于此技术，可以将DNA同时导入大量的，即几千个线虫。最近建立的用于引导DNA进入细胞的方法包括以微小投射粒子轰击细胞，通常是大约2mm直径的金或钨粒子，此粒子已用将被导入的DNA包涂了。本领域的技术人员一般将此技术称为轰击转化法，此技术已被成功地用于传递DNA进入植物细胞(Kleim等，自然，327:70-73(1987)，Christon等，植物生理学，87:671-674(1988)；Takenthi等，植物分子生物学，18:835-839(1992))，培养的哺乳动物细胞(Zelenin等，FEBS通讯，244:65-67(1989))，鱼受精卵(Zelenin等，FEBS通讯，287:118-120(1991))，以及完整的小鼠组织和器官(Zelenin等，FEBS通讯，280:94-94(1991)；Williams等，美国国家科学院学报88:2726-2730(1991))。尽管此技术对于植物细胞和培养的哺乳动物细胞取得了成功，然而本领域的技术人员已预料，轰击技术在应用于线虫时会有困难。但是，本发明人已成功地将类似的轰击转化技术用于引导核酸进入秀丽新杆线虫(C.elegens)。应用这种技术有可能将核酸同时导入大量的线虫个体。因此，本发明的第一方面是提供了一种引导核酸(DNA和/或RNA)进入线虫的方法，包括以许多微小投射粒子轰击线虫。在本发明的一个实施方案中，是用需要导入线虫的核酸包涂微小投射粒子。应用粒子轰击枪达到以高速微小投射粒子轰击线虫的目的，轰击枪是本领域熟知的基于氦气流一类的轰击枪，参见例如Johnston，自然，346:pp776；Klein等生物技术等10:pp286-291和Takeuchi等，植物分子生物学，18:pp835-839。此轰击枪利用氦气气流加速DNA包涂的粒子，冲向将被转化的靶样品。在此提供的实施例中将描述应用核酸包涂的微小投射粒子轰击转化秀丽新杆线虫(C.elegans)的详细方案。简单地说，先将线虫的小沉淀块分散在一小块线虫培养琼脂板上。然后将此培养板置于“枪”内，并用核酸包涂的微小投射粒子(例如金粒子)轰击这些线虫。在短时间的恢复期之后，将此培养板切成许多小块，并被置于大的琼脂板上对线虫进行培养，用于选择转基因线虫。此转化步骤仅需几分钟，并且技术非常简单，以致在非常短的时间内可进行多次实验。在本发明方法的另一个实施方案中，也可以通过首先将含有此核酸的溶液直接施加于线虫上，然后以未包涂核酸的‘裸露’微小投射粒子轰击此线虫而实现轰击转化作用。应用这种技术不必用核酸包涂微小投射粒子。当应用常规的轰击技术(即使用被包涂的微小投射粒子)时，是由于包涂的微粒被射入线虫的性腺细胞而产生转化的后代。应用另一种方法时，其中是首先用核酸的浓溶液包涂线虫，然后用‘裸露的’微小投射粒子轰击此线虫，微粒可能牵引DNA沿其路径通过线虫，因此，微粒没有必要停留在性腺细胞内。如果微粒在它通过线虫时仅仅穿过性腺细胞，那末它可能遗留下足够量牵引携带的核酸，导致对性腺细胞的转化作用。为了便于选择通过本发明的方法已成功地导入了DNA的转化体，优选地是应用双重选择方案，例如使用显性表型标记如ro1-6或自激性(autonomous)荧光蛋白(AFP)与一种挽救条件性致死基因的标记相结合，此条件性致死基因已被导入注射线虫的遗传背景中。在此使用的名词“自激性荧光蛋白”包括绿色荧光蛋白(GFP)和蓝色荧光蛋白(BFP)以及这种类型的任何其它自激性荧光蛋白。下面提供的实施例是关于携带pha-1基因温度敏感性突变的遗传背景的秀丽新杆线虫的转化，其中编码野生型pha-1基因的DNA已被导入作为共-选择性标记。但是，其它的条件性致死突变也可同样使用，并且应该理解，本发明将不受为了便于鉴别转化的线虫所使用的选择性标记性质的限制。参照下面的实施例以及附图，将会更进一步理解本发明。图1显示已用金微粒轰击的秀丽新杆线虫的Normarski显微照片。上面的箭头指示位于性腺内的金微粒，下面的箭头指示一个位于幼小两性体肠内的金微粒。实施例1-轰击转化法的基本方案(A)同步线虫的培养1．在标准的大NGM-培养板上培养秀丽新杆线虫(pha-1株(e2123ts))至饥饿状态，以便促进L1期幼虫累积。2．切取含有‘L1-岛’的琼脂片，用于接种新的大NGM-培养板。3．取决于特定秀丽新杆线虫株的需要，在清洁的假无菌环境中15-20℃将此线虫培养达到成虫初期。4．用蒸馏水或卵-缓冲液从培养板中洗出线虫集中至50ml的Falcon试管中，使之借助于应力形成沉淀。5．使用装有蓝色吸头的Gilson移液器吸取大约500-800μl等分量线虫沉淀，一滴一滴地滴加于小NGM-培养板的中心。6．将此培养板置于冰上，并使其液体能渗入遗留在已不均匀线虫“垫”的背面。用铂金刮片使此线虫垫形成直径大约10mm的圆形，并留在冰上待用。(B)用投射粒子轰击1．将含有冰冷线虫的NGM培养板置于轰击枪真空室内的瞄准台上，距发射室开口的距离为120mm。移开NGM培养板上的罩子，然后立即关闭真空室的门。在发射室内的钢制栅格内装入DNA包涂的金微粒悬液(在乙醇内)。此金微粒包涂了待测DNA和标记DNA(含有ro1-6的质粒pRF4和含有野生型pha-1的pBX)的混合物。2．设定预置阀的氦气压力为8-10巴(bar)。然后对真空室抽真空，当达到局部真空压力-50至-100mbar时，加压气体被释放出。3．然后打开真空室的门，并且为了保护无菌状态立即更换NGM培养板的罩子。然后将此培养板置于15℃，使线虫从轰击程序中恢复。4．将此NGM琼脂板切成4-8块，每块各置于加富新鲜的大NGM培养板上(双倍胰蛋白胨)。然后在15-20℃温育此大培养板。(C)选择转化体转化后6-7天之后，筛选出F1线虫(ⅰ)目视观察表达ro1-6表型的线虫以及被分离出的表达ro1-6表型的线虫，随后对其稳定的转化进行测定，和/或(ⅱ)通过改变至25℃和继续培养3-4天，以便筛选pha-1挽救作用，和/或按照上面的任何一种方法，(ⅲ)然后，用本领域熟知的技术，对在25℃既表达ro1-6表型又显示pha-1挽救作用的单一转基因线虫系，单独检测其是否存在待测DNA。实施例2轰击转化的详细方案以流程的形式描述了所使用的方法。所有步骤均在无菌条件下进行。在Wood,W.B(1988)，‘秀丽新杆线虫’，冷泉港实验室，纽约中描述了秀丽新杆线虫的一般方法。(A)线虫的制备在标准的大NGM-培养板(直径90mm)上培养目标线虫株(在此是pha-1(e2123ts))至饥饿状态，使培养板上被许多L1幼虫的小岛所覆盖。根据“L1-岛”的大小，切成5-10mm2的琼脂片，每10次射击接种大约8块新鲜的大NGM培养板。在线虫达到成虫期之前不应该饥饿它们。可以喂给线虫细菌，如大肠杆菌。当大约50％的线虫含有新卵时，培养板已准备就绪。用蒸馏水从培养板上洗出线虫，集中于50ml的试管内。借助于重力使线虫沉淀下来(在室温下放置约15分钟)。将大约100μl线虫沉淀置于小NGM-培养板(35mm)的中央。这些培养板已干燥了几天，并且在前一天接种了一薄层大肠杆菌(op50株)，直径大约10mm(在室温下培养)。将这些培养板的背面放在冰上，以便使线虫停止来回运动，并让液体向上渗入遗留在不均匀线虫“垫”的背面。用铂金刮片，使之形成直径约10mm，近似均匀的圆形线虫“垫”。置于冰上待用，不能超过1-2小时。(B)以轰击微粒轰击通过对置于射击距离(见下面)的滤纸射击而校准轰击装置(枪)，并随之画出通过靶区域中心的交叉瞄准标线。应该经常重复校准。用于校准和转化时氦气压力预置阀都置于8-10巴。在轰击枪真空室内的瞄准台上放置和调整冰冷的线虫培养小板，使对滤器支架的距离为120mm，在刚要关闭真空室之前移开培养板上的罩子。将在乙醇内的DNA包涂的金微粒悬液装入射击室内的钢制栅格。开始对真空室抽真空，当局部真空达到50-100毫巴值时引发轰击枪(脉冲时间大约10ms，压力波不应该打开该装置中用于压力释放的盖子)。我们不能确定将对轰击压力或局部真空给出显著最好结果的设定。对单个仪器进行这种系统分析可能是有用的。即使在更强的局部真空下线虫也能生存，并且以小于8巴的压力也可能转化。释放真空，并立即再封闭线虫培养板。使线虫在15℃恢复大约30分钟。线虫将被温暖，并开始再运动。将此琼脂培养板切成4块或更多的扇形体，把每块放在一块新鲜的90mm加富的NGM培养板(双倍胰蛋白脂)上。按照转基因选择方案，使培养板保留在15-20℃。(C)筛选程序此程序根据用于转基因线虫筛选的实际系统可能有改变。在使用ro1-6(Mello.c.c等(1991)EMBO.J.10:3959-3970)和/或pha-1(Granato.M.等(1994)核酸研究，22:1762-1763)的情况下6-7天(15℃)之后，在F1代中寻找ro1-6线虫。将ro1线虫置于单独的培养板上，随后测定其稳定的转化作用。稳定的转基因系按照非孟德尔比率产生ro1-6子代。将其余的F1代转变至25℃，再过3-4天之后测定pha-1挽救。通过F2幼虫在培养板上的表现可指示挽救基因(Rescue)。3-4天之后再次检查培养板。如果发现存活的线虫，根据死亡卵和存在线虫的非孟德尔分离作用，对此F2或F3的10-20条线虫单独测定其稳定的转化作用。应该注意的是，pha-1偶尔可通过获得自发的次级位点抑制因子而回复(Schnabel,H.等(1991)，遗传学，129:69-77)。因此，对于pha-1株应该定期地通过将一些线虫转变至25℃来检查其完整性，在此温度下pha-1只产生死亡的卵。可在荧光显微镜下通过观察来自转基因两性体的胚，直接检查是否存在ceh-13GFP报导构建物。为了测定母体效应胚胎致死基因sud-1非条件性等位基因t1237的挽救作用，使此转基因系列杂交进入sud-1遗传背景(vab-9sud-1(t1237)/mncl,lon-2)，并筛选此纯合Vab两性体(vab-9sud-1)子代的生存能力。(D)制备金微粒用于投射轰击其流程是基于Takench等(1992)，植物分子生物学，18:835-839中的方法，将5mg金粉(Au，粉末，球形，1.5-3μm；Aldrich)置于1.5ml的Eppendorf试管中，先用500μl蒸馏水洗此微粒，搅拌后应显示为均匀的悬液。让金微粒沉淀，小心地弃除水层。加入少量蒸馏水和每种质粒DNA20μg。用水调整体积至180μl，并加入20μl3M乙酸钠溶液。搅拌，用2.5倍体积乙醇沉淀DNA。在-20℃放置30分钟。在此期间搅拌几次。借助于重力使金微粒沉淀并吸出上清液。不需离心。再将此微粒悬浮于200μl冰冷的无水乙醇中。搅拌，现在可将微粒贮存于-20℃。为用于转化作用，在Swinny-滤器支架(微孔)的滤纸中装入20μl(每次射击大约2-6μgDNA)用于轰击的这种悬液。立即安装并射击。制备金微粒的另一种方法如下将20ng质粒DNA加到10mg金粉(Au，粉末，球形，φ1.5-3μm,Aldrich)中。加蒸馏水至总体积200μl，然后加入20μl3M乙酸钠和550μl乙醇，置于-20℃至少3小时，同时每30分钟剧烈搅拌一次以便沉淀DNA。3小时之后让金微粒沉淀，吸出上清液，将此金微粒再溶于200μl冰冷的乙醇中。每次实验用20μl这种溶液。(E)制备玻璃微粒用于投射轰击作为对金微粒的另一种选择，还可以用玻璃投射微粒实现轰击转化。制备方法如下将20μg质粒DNA加入10μl“玻璃乳”活化的玻璃悬液(Jetsorb)中，并加入300μl缓冲液A1(制备商提供的玻璃乳悬液)。在53℃使DNA与玻璃乳结合15分钟，离心之后用300μl缓冲液A1洗沉淀。通过离心使形成的悬液再沉淀，然后用缓冲液A2(也是制造商提供的玻璃乳悬液)洗2次。洗过之后使沉淀干燥，并再悬浮于200μl乙醇中。按照上述用于金微粒的投射轰击程序将20μl等分量悬液用于每次转化实验。来自其它制造商的另一些活化的玻璃悬液也可以用于此程序。虽然已知活化的玻璃悬液可结合DNA，甚至可能比金微粒更好，但是用玻璃微粒的轰击转化实验并没有提高培养转化效果。尽管可能使较多的DNA结合于这种微珠，但是玻璃比金具有较低的密度，这可能使穿透线虫的效率较低。尽管如此，用玻璃微粒有可能以用金微粒大致相同的效果转化秀丽新杆线虫，这表明导入DNA的量和微粒的密度都不是重要的因素。结果下面概括了若干应用金微粒，按照上述方案进行的独立的轰击转化实验结果。在每种情况下都给出了待测DNA和标记DNA的性质。对于每种待测DNA/标记的组合，按照上面(B)部分给定的方法实施了若干不同的轰击程序。然后给转化子评分，评价其对ro1-6表型的表达和对pha-1条件性致死突变的挽救。一般来说，通过对在大培养板上，每次射击((B)部分的步骤4)产生的滚动线虫计数来计数F1，应用ro1-6选择平均每次射击获得了二个转化子。当应用微投射方案时，在下一个世代过程中这些转化子只有10％是稳定的(6次射击中一个品系)。这些品系还常常表达二个其它的共转化质粒(与ceh-13的GFP-报告构建物(Wittmann.C等(1997)发育，124:P4193-4200)或包含sud-1基因的质粒结合的pha-1)，见概括在表10A中的结果。通过使培养板改变至对F2世代中的挽救作用非允许的温度，应用pha-1选择系统，每二次射击获得了大约一个稳定的品系。因此，对于选择转化的线虫，pha-1选择系统比ro1-6系统效率高3倍。pha-1转基因线虫还共表达了第二标记，但是，与在第一世代之后对稳定滚动线虫所选择的，来自相同射击的线虫中相比较，共转化作用以稍微较低的频率(70％)发生(表10B)。可能是此共转化作用起初决定了DNA的临界量，以致使不同的DNA被可靠地共连接形成连环序列(Mello.C.C.等(1991).EMBOJ.10:P3959-3970)。通过以较低灵敏度的ro1-6表型进行选择，可能正好遗漏低于某一阈值的线虫，而因此选择具有较高共连接机会的线虫。表11显示出对一系列射击的详细分析结果。观察到转化作用的某种群集过程。在F2选择时，14块具有pha-1转化品系的培养板中，在F1选择时9块携带有Ro1线虫。并且，在Ro1选择(F1)中发现的对二种标记稳定的品系已聚集成簇。在F2选择中，这些培养板经常携带了另一些双重转化的品系。但是，这可能是由于在F1选择中未能发现所有的滚动线虫。还不清楚在F2选择中隐藏了多少独立的事件。在此给出的实施例中，对于所有的射击都采用了120mm的有效距离和8-10巴的压力。观察到压力(6-10巴)和距离的改变对转化效率仅有非常小的影响。射击之后在显微镜下观察培养板时，发现在培养板中心许多线虫被杀死，此区域周围的线虫含有金微粒(图1)，而更远区域中的线虫不含有金微粒。因此似乎速度梯度非常陡峭，并且在此所采用的实施例条件下，存在一个狭窄的转化区，取决于压力和距离，此区域可能位于线虫沉淀内的不同位置。一个重要的因素是将线虫置于一层薄的并相当干燥的菌苔中，否则线虫会被吹掉。关于每次射击线虫的用量，只要足够量的线虫用于覆盖投射区，但不要太多的线虫，因为对于Ro1选择难以处理太多的F1线虫，或者对于pha-1选择还要处理更大量的F2线虫。即使在对方案未作任何修改的重复实验中，也就是说，使用相同量的DNA，轰击枪作相同的设置，以及对线虫给予相同的培养条件，也观察到转化操作的效率会发生改变。严密的观察显示，在轰击之后线虫仍然在培养板中央的轰击实验，比线虫被吹离培养板中央的实验产生了较高的转化效率。并且，被轰击枪高压力吹开的线虫经受不住这种轰击过程。通过使用非常干的琼脂板，含有高浓度琼脂的琼脂板，以及尚未接种大肠杆菌的琼脂板，可以提高轰击转化操作的可再现性，和较小程度地改善其效率。而且，使线虫固定化在琼脂板上也可导致提高轰击转化的效率和可再现性。总之已证明，通过投射轰击可以转化秀丽新杆线虫。目前此方法具有与微注射技术大致相同的效率，但是，微注射技术更多地依赖于实验操作人员的训练和技术，以及更加昂贵的设备。对于微注射法，使线虫脱水有助于降低线虫内部的压力，因此了避免针头穿入时发生胀裂，不同于微注射法，用脱水的线虫不能实现轰击转化作用。射击实验1秀丽新杆线虫株pha-1(e2123)标记-DNA1．以pRF4(ro1-6)选择；单独的F1在15℃2．以pBX(pha-1)选择；F2/F3在一起，在25℃待测DNA加入的核酸状态结束表1射击实验1的结果射击实验4秀丽新杆线虫株pha-1(e2123)标记DNA1．以pRF4(rol-6)选择；单独的F1在15℃2．以pBX(pha-1)选择；F2/F3在一起，在25℃待测DNApHl-FM6．9(sud-1)在与vab-9sud-1杂交之后加入的核酸状态结束表2-射击实验4的结果射击实验6秀丽新杆线虫株pha-1(e2123)标记DNA1．以pRF4(rol-6)选择；单独的F1在15℃2．以pBx(pha-1)选择；F2/F3在一起，在25℃待测DNApH1-FM6.9(sud-1)与vab-9sud-1杂交之后加入的核酸状态结束表3-射击实验6的结果射击实验7秀丽新杆线虫株pha-1(e2123)标记DNA1．以pRF4(ro1-6)选择；单独的F1在15℃2．以pBx(pha-1)选择；F2/F3在一起，在25℃待测DNApH1-FM6.9(sud-1)与vab-9sud-1杂交之后加入的核酸状态结束表4-射击实验7的结果射击实验8秀丽新杆线虫株pha-1(e2123)标记DNA1．以pRF4(ro1-6)选择；单独的F1在15℃2．以pBx(pha-1)选择；F2/F3在一起，在25℃待测DNA:pH1-FM6-9(sud-1)与vab-9sud-1杂交之后加入的核酸状态结束表5-射击实验8的结果射击实验9秀丽新杆线虫株pha-1(e2123)标记DNA1．以pRF4(ro1-6)选择；单独的F1在15℃2．以pBx(pha-1)选择；25℃F2/F3在一起待测DNApFM(ceh-13∷1acz)在F2/F3中的荧光加入的核酸状态结束表6-射击实验9的结果射击实验10秀丽新杆线虫株pha-1(e2123)标记DNA1．以pRF4(ro1-6)选择；单独的F1在15℃2．以pBX(pha-1)选择；25℃F2/F3在一起待测DNA:pFM(ceh-13∷1acz)在F2/F3中的荧光加入的核酸tNRA状态结束表7-射击实验10的结果射击实验11秀丽新杆线虫株pha-1(e2123)标记DNA1．以pRF4(ro1-6)选择；单独的F1在15℃2．以pBX(pha-1)选择；25℃F2/F3在一起待测DNA:pFM(ceh-13∷1acz)在F2/F3中的荧光加入的核酸状态中断表8-射击实验11的结果射击实验12秀丽新杆线虫株pha-1(e2123)标记DNA1．以pRF4(ro1-6)选择；单独的F1在15℃2．以pBX(pha-1)选择；25℃F2/F3在一起待测DNA:pFM(ceh-13∷1acz)在F2/F3中的荧光加入的核酸状态中断表9-射击实验12的结果表格注释对相同的次级培养板1-4进行了第1次选择(Ro1-6)和第2次选择(pha-1)，但是，二个选择程序是彼此无关的。没有评价或实施的选择途径射击No.2在4块次级培养板中的1块上，鉴定出2个F1线虫为表型ro1-6，并被分离出；它们不产生Ro1-6后代(F2-F4)；暂时转化作用射击No.3在4块次级培养板中的2块上，鉴定出3个和2个F1线虫为表型Ro1-6，并被分离出；在实验3/2中它们产生了Ro1-6后代，但在实验3/4中不产生Ro1-6后代(F2-F4)；稳定的和暂时的转化射击No.6在4块次级培养板中的1块上，鉴定出2个F1线虫为表型Ro1-6，并被分离出，它们不产生Ro1-6后代(F2-F4)，但呈现出pha-1的表型挽救作用；对于Ro1-6暂时转化，但对于pha-1稳定转化射击No.5在4块次级培养板中的1块上，在选择条件(=25℃)下，在F2和F3线虫中观察到pha-1的表型挽救作用；几代之后是稳定的；稳定的转化作用射击No.8在4块次级培养板中的2块上，鉴定出4个和3个F1线虫为表型Ro1-6，并被分离出；在实验8/2中它们不产生Ro1-6后代，但在实验8/3中它们产生了Ro1-6后代(F2-F4)；而且，对于pha-1也实现了共转化作用；稳定的和暂时的转化作用。在4块次级培养板中的2块上，在选择条件(=25℃)下，在F2和F3线虫中观察到pha-1的表型挽救作用；在一次射击中(8/3)，对于Ro1-6的稳定共转化作用是明显的；对于pha-1和Ro1-6的稳定共转化作用在实验8/2中，暂时转化的Ro1-6后代与对pha-1的共转化作用有关；在实验8/3中，对于二种选择途径都可证明对Ro1-6的稳定转化作用。射击No.3关于对特定待测DNA种类的共转化作用，进一步研究了稳定转化的品系；在ceh-13∷gfp(pFM)中是通过外表荧光，在sud-1(pH1-FM6.9)是通过与vab-9sud-1(t-1237)杂交；在每次实验中通过外表荧光测定出5个Ro1-6阳性线虫(pFM)，但在sud-1(pH1-FM6.9)中是通过与vab-9sud-1(t-1237)杂交；在这方面，每次实验测定出5个Ro1-6阳性动物；对待测DNA阳性表10表10显示通过微粒轰击使秀丽新杆线虫转化的实验结果。在全部实验中使用了Pha-1(e2123)两性体。(A)以质粒pRF4(ro1-6)和pBX(pha-1)转化了线虫。此外，以第三种DNA测定了对它的共表达作用。如通过荧光显微镜所显示的，在转基因胚胎中，ceh-13∷GFP构建物已被适当地表达(见Wittman等，如上面所述)。在如通过杂交试验揭示，在转基因中，通过共转化的质粒pH1-FM6.9(上面所述的)，还补充了sud-1(t1237)的母体效应突变作用。目前大约有半数的射击不显示出任何转化体。可能是由于单独转化的两性体，转化作用被聚集(表Y)。(转化体)指示所有Ro1线虫的数目；(独立的转化体)指示来自被击的初始培养板中不同切片的Ro1线虫；以及独立产生的这种线虫。对于有关ro1-6选择的更多数据也可参见(B)。(B)在此实验系列中，也以pha-1系统在F2中选择出转化体。在大约半数射击中分离出稳定共转化的品系。因为以rol-6观察到聚集现象，所以尚不清楚是否这些品系代表单独的事件。因此，为了确立等基因系，应将一些品系克隆出。表11<tablesid="table5"num="005"><table>射击号rol-6选择pha-1选择12341234121R31RP454RPRpPRPR62R72R2RPRPR82RPPR9PR102R112R121RPR131R1R1412R15167RPPR171R10RFPRPRPR181R</table></tables>表11显示系列#6射击实验的分析结果，如在此所显示的，对所有的实验进行了评价。为了如在实施例2C部分中所述选择转基因线虫，将相应于一次射击的线虫分配到4块培养板中。(R)为滚动的转化体。(P)为pha-1转化体。正常的字体表示rol标记的暂时表达．指示了在Rol选择中发现的线虫数目。为了试验对Rol标记的稳定表达，将来自一块切片的线虫在一起培养。然后以pha-1测定这些品系的共转化作用。黑体字表示对这些标记的稳定表达。实施例3-轰击转化的另一种方法按照实施例2的(A)部分制备线虫用于轰击转化。将一滴高浓度的核酸溶液(1mg／ml或更多)置于线虫垫层上并使其干燥。然后用微投射粒子轰击此线虫，此微投射粒子没有按照实施例2(B)部分给出的方案用任何核酸包涂，并对转化体进行选择。权利要求1．一种将核酸导入线虫的方法，该方法包括用许多微投射粒子轰击此线虫。2．根据权利要求1的方法，其中用所述核酸包涂了此微投射粒子。3．根据权利要求1的方法，其中在以许多微投射粒子轰击之前，先用所述核酸包涂此线虫。4．根据权利要求1-3中任何之一的方法，其中该线虫携带有条件性致死突变基因，并且所述核酸包括含有此条件性致死突变基因野生型等价物的质粒。5．根据权利要求1-4中任何之一的方法，其中的核酸编码一种显性表型标记。6．根据权利要求5的方法，其中显性表型标记是Ro1-6或自激性荧光蛋白。7．根据权利要求1-6中任何之一的方法，此方法进一步包括在用许多微投射粒子轰击线虫之前将此线虫置于一薄层干菌苔上。8．根据权利要求1-6中任何之一的方法，此方法还进一步包括在用许多微投射粒子轰击线虫之前，将此线虫置于干的聚合物培养板上。9．根据权利要求8的方法，其中的聚合物是琼脂。10．根据前述权利要求中任何之一的方法，其中在用许多微投射粒子轰击之前首先使线虫固定化。11．根据前述权利要求中任何之一的方法，其中的微投射粒子是金微粒或活化的玻璃微粒。12．根据前述权利要求中任何之一的方法，其中的线虫是秀丽新杆线虫。13．一种线虫，它包含按照权利要求1-12中任何之一的方法导入的核酸。全文摘要描述了一种将核酸导入线虫的轰击方法,此方法包括用许多微投射粒子轰击此线虫。并提供了按照本发明方法转化的线虫。文档编号C12N15/89GK1302335SQ99806532公开日2001年7月4日申请日期1999年3月22日优先权日1998年3月23日发明者拉尔夫·施纳贝尔申请人:拉尔夫·施纳贝尔