专利名称：表达杀昆虫和杀真菌凝集素的基因工程化棉花细胞、植株和种子的制作方法
技术领域：
本发明涉及在棉花细胞、植株和种子中表达的嵌合基因，其编码实质性具备大麦、荨麻和橡胶蛋白(hevein)凝集素之昆虫毒性和真菌毒性的杀昆虫剂和杀真菌剂。
背景技术：
壳多糖结合蛋白质(凝集素)在包括单子叶和双子叶的许多种植物中存在，尽管这些植物中不含有壳多糖。认为它们与防御相关，其中许多呈现杀昆虫和/或抗真菌活性(Murdock等，1990；Lerner,D.R.和Raikhel,N.V.,1992)。凝集素表现出特异性的碳水化合物结合特性。推测植物中的凝集素是防御相关蛋白质，它们通过与易感害虫类的N-乙酰葡糖胺结合来发挥其作用(Schroeder,M.R.和Raikhel,N.V.1992)。
纯化形式的大麦、荨麻和橡胶蛋白凝集素表现出对某些已知的侵害棉花的害虫(例如实夜蛾属和镰孢属)杀昆虫和杀真菌活性。用凝集素控制害虫的方法有很多，但是这些方法都需要提供足够量和足够纯度的蛋白质方可取得控制靶害虫或病原体的效果。即使有足够量和足够纯度的蛋白质可用，尚须将它们以有效地到达靶物种的方式应用于作物。此外，由于凝集素是蛋白质，如果局部提供给作物，在它们发挥控制作用之前已被光及蛋白酶所灭活。而根部相关的病原体不容易以这种制剂来处理。因而，凝集素还不能用于控制棉花的许多严重的害虫，尽管在足够纯度和足够高浓度时他们可能是有效的。
利用基因工程，可以将负责产生有用多肽的基因从天然含此基因的供者细胞转移至天然无此基因的宿主细胞中；Cohen和Boyer,U.S.专利号4,237,224和4,468,464。实际上这种转移没有内在限制。基因可以在病毒、细菌、植物和动物之间转移。在某些例子中被转移的基因是有功能的，或者说可以使它们在宿主细胞中有功能。当宿主细胞是植物细胞时，有时可从转移的细胞再生出整株植物。
基因一般包含带启动子和转录区的DNA序列区，转录区通常包含5′非翻译区，编码区和3′非翻译区。
启动子包含转录起始所必须的DNA序列。转录期间将转录区转变成mRNA。在真核细胞中，启动子包括RNA多聚酶的识别区和定位RNA多聚酶在DNA上起始转录的区域。后者被称为TATA盒，通常位于转录起始位点上游约30个核苷酸处。
启动子区后是可转录成mRNA但不翻译成多肽的序列。这段序列组成了所谓的5′非翻译区，认为该区域含负责转录起始的序列，如核糖体结合位点。
编码区是紧接着DNA或相应RNA的5′非翻译区的下游序列。按照遗传密码编码区被翻译成多肽，例如苏云金芽孢杆菌包含一种带可翻译成杀昆虫的晶体蛋白质氨基酸序列的编码序列的基因。
在编码区之后有一段可转录成mRNA但不能翻译成多肽的序列，该序列称为3′非翻译区，认为此区包含导致转录终止的信号和，在真核细胞的mRNA中引起转录后mRNA链聚腺苷酸化的信号。认为mRNA聚腺苷酸化具有加工处理和转运的功能。
可将整个天然基因从供者细胞转移至宿主细胞中。但通常优选地是构建以带一种启动子、和任选地带该基因中本身不存在的5′和3′非翻译区的目的编码区为编码区的基因，这种构建体就是所谓的嵌合基因。
大麦凝集素是一种液泡蛋白质，该蛋白质合成时氨基末端带有引导其进入分泌通路的信号序列，和引导其正确地靶向液泡所必需的羧基末端前肽(Bednarek,S.Y.，和Raikhel,N.V.,1991)。这个糖基化的羧基末端前肽(CTPP)在成熟、有活性的蛋白质于液泡内沉积之前或同步被切除(Bednarek等1990)。成熟的大麦凝集素是由两个分子量为18千道尔顿的相同多肽组成的二聚体蛋白质(Wilkins,T.A.,Bednarek,S.Y.和Raikhel,S.V.,1990)。大麦凝集素编码区(大麦凝集素cDNA克隆BLc3)的核苷酸序列和推导出的氨基酸序列已有报道(见Lerner和Raikhel,1989；和U.S.专利5,276,269，在此引入作为参考)。将BLc3编码区与CaMV 35S启动子融合创造嵌合基因构建体，并以根癌农杆菌介导的转化将该嵌合基因构建体导入烟草植物(U.S.专利号.5,276,269)。据报道该植物显现出杀昆虫和杀真菌的特性。
已从橡胶树(Hevea brasiliensis)的胶乳cDNA文库中分离到编码橡胶树凝集素的全长cDNA克隆(HEV1)，并测定其序列，分析其性质(见Broekaert等，1990；Lee等，1991；U.S.专利5,187,262，在此引入作为参考)。简而言之，HEV1长度为1018个核苷酸，并包含204个氨基酸的开放阅读框。推导出的氨基酸序列包含一段17个氨基酸残基组成的推定信号肽，其后接187个氨基酸的多肽。该蛋白质氨基端的43个氨基酸残基与橡胶蛋白相同，并且与几种壳多糖结合蛋白质和马铃薯及杨树创伤诱导基因的氨基端具有同源性。以HEV1 cDNA作为探针进行Northern印迹分析，结果表明该基因是受创伤、植物激素脱落酸和乙烯诱导的基因。该基因的转录产物积聚见于叶片、茎和胶乳中，而在根中未见到。将橡胶蛋白编码区与异源启动子融合而成的嵌合基因构建体未见报道。但橡胶蛋白的实验表明它具有抗木霉、须霉属、葡萄孢属、壳针孢属、梨孢属(Pyricularia)和镰孢属真菌的活性。所观察到的活性与麦芽胚凝集素的活性(另一类凝集素)不同。此外，橡胶蛋白的抗真菌活性在90℃加热后仍然稳定，而在此条件下某些壳多糖酶的活性则完全被破坏。
已分离到编码荨麻凝集素(Urtica dioica凝集素)的全长cDNA，并测定了其序列和分析其性质(Lerner和Raikhel,1992)。该蛋白质由374个氨基酸组成，其中21个氨基酸是推定的信号肽序列，84个氨基酸编码荨麻凝集素的两个壳多糖结合区，它们与由19个氨基酸组成的“间隔”区和与壳多糖酶催化域部分相同的244个氨基酸组成的羧基端延伸区相融合。该基因代表另一种凝集素，迄今未被用作一种抗棉花害虫和真菌病原体的资源。
上述研究低估了植物凝集素的生物化学复杂性。这类蛋白质必须经过适当地加工，并被转运到适当的亚细胞区室，液泡通常是这类蛋白质的贮存场所。为了利用这些蛋白质消灭棉花害虫，一种有生命力的方法是用不同的凝集素基因产生嵌合基因构建体，并用有效的转化系统(如见方法Rangan等，U.S.专利5,244,802)将这些构建体转移至棉花内。在异源系统内不一定能够获得高效的表达水平。不能保证这些蛋白质对棉花作物本身不具有未预料到的毒性作用，或这些蛋白质将显现预测的活性。甚至如上所述，一些靶害虫可攻击生产凝集素的植物中正常不表达某些凝集素的组织(如根)。在局部提供给植物组织之后的饲养试验中(见Cavalier等，U.S.专利5,407,454)表现出抗某种害虫的活性的凝集素，当它们在体内表达时可能不展现相同的活性。
Cavalieri等人提供了稍有启发性的证据，即很多种植物凝集素具有一定的抗某些谷物害虫的能力。但不幸的是这些研究是以分离的生物化学性质未确定的凝集素制剂来进行的。而一些凝集素是由商家提供的，因而它们的组成也因不同的制剂而变。商家的产品含批号，故以批号为线索，问题可追溯到批号。Cavalier没有探讨制剂的纯度，他们也没有提供如何获得凝集素的资料，或探讨特定的制剂中可能存在的不同凝集素的实际种数。任何种类的植物都可产生几种不同的凝集素，蛋白质制剂中容易污染多种不同种类的蛋白质，尽管这些蛋白质是痕量的，但它们可能对所观察到的活性具有明显的阴性或阳性影响，因而所试用的制剂实际上可能是多种凝集素的混合物，甚至含有来自所讨论植物的其它蛋白质。没有提供有关所试用凝集素制剂之来源、纯度或所观察到的实际活性是基于特定植物的哪一种凝聚素基因的资料。这种制剂的杀昆虫活性和杀真菌活性可能明显区别于自单个凝集素基因在植物中表达所提供的纯化形式的凝集素之活性。
提供一种纯化形式的蛋白质并确定其抗特定害虫活性的最佳方法是，分离该蛋白质的基因并在体外系统中表达该蛋白。由于Cavalier等人研究中引用的多数凝集素基因迄今还没有被克隆，在Cavalier等人报道其资料的当时，在体外表达单个纯化的凝集素进行试验是不可能的。尽管就某些谷物害虫而论他们的资料有启发意义，但是Cavalier等人没有提供一个具抗严重棉花害虫之活性的例子。因此，Cavalier等人的工作虽然有启发性，但是没有揭示人们可用纯化形式的单种凝集素控制严重的棉花害虫。
相反地，在局部提供给植物组织之后的饲养试验中没有活性的蛋白质，当在体内表达时也可能有活性。在棉花中尤其可能，棉花植株中通常表达一种称为棉酚的化合物，已知它可抑制某些昆虫的摄食。因此，棉酚和凝集素可能具有协同作用，从而可以加强特定凝集素抗重要棉花害虫的杀昆虫活性。或者，棉酚表达可以抑制害虫摄食，足以使害虫不能消耗潜在致死剂量的凝集素，因此，只有在创造出这种棉花细胞、植株和种子之后，人们才有可能了解一种转化到棉花中的凝集素基因之杀昆虫或杀真菌效果。
Raikhel(U.S.专利5,276,269)表明在CaMV 35S启动子控制下的嵌合大麦凝集素基因可以转化到烟草植株中，并产生被正确地转运的单一种类的凝集素蛋白质，从而产生一种具有新的杀昆虫和杀真菌特性的植株。随着更具实用性的橡胶蛋白(Raikhel,U.S.专利5,187,262)和荨麻基因的克隆(Lerner和Raikhel,1992)，现在已经有可能创造出可表达高纯度的每种凝集素的棉花，并有可能检测这些细胞、植物和种子中存在的新的杀昆虫和杀真菌活性。
本发明的目的本发明的目的是提供一种可表达一定量的嵌合大麦、荨麻和橡胶蛋白凝集素基因的棉花细胞、植株和种子，在一定的条件下它们足以实质性地赋予所述棉花细胞、植株和种子如同大麦、荨麻和橡胶蛋白凝集素的杀昆虫和杀真菌特性的杀虫特性。
本发明更进一步的目的是提供一种以含嵌合基因的棉花细胞、植株和种子饲养昆虫害虫和病原体的杀死棉花昆虫害虫和病原体的方法，其中该嵌合基因可表达杀害虫(如杀昆虫和杀真菌)量的实质性具有大麦、荨麻和橡胶蛋白凝集素的昆虫毒性和真菌毒性的毒素。
本发明的另一个目的是提供与上述方法相关的棉花细胞、植株和种子中的基因和其它DNA片段。
发明概述通过提供可以在棉花细胞、植株和种子中表达一种多肽的嵌合基因，该多肽在培养的植物细胞和活植株的植物细胞和种子中实质性具有大麦、荨麻和橡胶蛋白凝集素的杀害虫毒性(如杀昆虫毒性)和杀真菌毒性；以及生产在棉花细胞、植株和种子中实质性具有大麦、橡胶蛋白和荨麻凝集素的杀昆虫特性(如害虫毒性和真菌毒性)的毒素的方法；和以包含表达这些毒素的基因的棉花细胞、植株和种子饲养害虫如昆虫而杀死棉花害虫的方法，实现了本发明的这些和其它目的。
附图简述
图1表示二元植物表达载体pGA643(An等，1988描述)的基因图谱和35S启动子区，该载体在植物中表达凝集素是有用的(Wilkins等，1990；Raikhel,U.S.专利号5,276,269，在此引入作为参考)。
图2表示大麦凝集素cDNA克隆BLc3的核苷酸序列(Lerner和Raikhel,1989；Raikhel,U.S.专利号5,276,269)。
图3表示橡胶蛋白cDNA克隆“HEV1” 的核苷酸序列(Broekaert等，1990；Raikhel,U.S.专利号5,187,262，在此引入作为参考)图4表示荨麻凝集素cDNA克隆MK209的核苷酸序列(Urticadioica凝集素；Lerner,D.R.和Raikhel,N.V.,1992，在此引入作为参考)。
发明详述本发明涉及可在棉花细胞、植株和种子中表达的嵌合基因，其编码实质性具有大麦、荨麻和橡胶蛋白凝集素之昆虫毒性和真菌毒性的杀虫剂如杀昆虫剂和杀真菌剂。
涉及的棉花植物细胞包括外源基因可以被导入、复制和表达的任何和所有棉花植物的细胞。一些合适的棉花植物种类的例子包括陆地棉、树棉和海岛棉。
术语“植物细胞”指来自棉花植物的任何细胞。本发明包含的细胞的一些例子包括作为一种活植物部分的分化细胞；在培养中的未分化细胞，诸如愈伤组织或肿瘤；种子；胚；无性芽和花粉等未分化组织的细胞。
本发明的嵌合基因包含一种在棉花植物中能够有效发挥功能的启动子区域，和pBLc3编码的大麦凝集素的编码区，cDNA克隆HEV1中编码的橡胶蛋白凝集素的编码区和/或cDNA克隆MK209中编码荨麻凝集素的编码区。嵌合基因的编码区序列在天然基因中与所述启动子是不相关联的。
5′和/或3′非翻译区可以独立地与启动子或编码区天然相关联，或者与两者都不相关联。优选5′或3′非编码区与天然基因中的启动子相关联，最优选地，5′和3′区都与天然基因中的启动子相关联。
基于本发明产生时的技术状况，尚无法预见到嵌合的大麦、橡胶蛋白或凝集素基因能够功能性地导入棉花细胞，更未预见到这样的细胞可表达足以赋予细胞杀虫(杀昆虫或杀真菌)特性的凝集素。
所谓具杀虫性(如杀昆虫或真菌)是指，植物细胞必须含有杀昆虫或杀真菌量的实质性具有自大麦、荨麻、橡胶中纯化的凝集素之杀昆虫和杀真菌活性的凝集素。“实质性具有纯化凝集素的杀昆虫和杀真菌活性”是指显示出与自天然宿主中纯化的相应凝集素基本相同范围的抗昆虫或真菌活性。杀昆虫或杀真菌量指植物细胞中存在的能够杀死昆虫或真菌，或至少能够显著地抑制害虫的一种生长所必需之功能(如摄食)的剂量，与对照相比这种抑制作用在统计学上应该有显著性差异。因此，与不含有可产生大麦凝集素、橡胶蛋白或荨麻凝集素之基因的植物细胞、植株或种子相比较，在不应用或少应用纯化的大麦凝集素、橡胶蛋白、荨麻凝集素或其它的杀昆虫或杀真菌剂的条件下，本发明的植物细胞、植株或种子可以经受棉花害虫如昆虫、线虫或真菌的攻击。
以下的实施例是对本发明主题的某些实施方案的举例说明。这些实施例是例证性的，不能理解为以任何方式限制本发明。实施例1基因本研究评估了三种不同的嵌合植物凝集素基因(大麦、橡胶蛋白和荨麻)。每种嵌合基因包含由在棉花中有活性的启动子驱动的特定凝集素之cDNA。为方便起见，应用CaMV 35S启动子，但是任何被证明在棉花中有活性的启动子，如根癌农杆菌T-DNA启动子，发根农杆菌T-DNA启动子或棉花叶绿素A/B结合蛋白基因启动子(Anderson等，1993)都有用。该列举仅是示范性的，并非有意包含所有的启动子。本领域的技术人员可用其它有用的启动子在适当的棉花细胞、植株和种子中表达大麦、橡胶蛋白和荨麻凝集素以控制成问题的棉花害虫，如昆虫和真菌。
按如下方法构建包含有效地连接在CaMV 35S启动子上的大麦凝集素编码区的表达盒利用pBLc3和pGA643中的Xbal限制性内切酶位点，将pBLc3 cDNA序列(图2)连接入植物克隆载体pGA643(图1；An等，1988)，如Raikhel,U.S.专利号5,276,269中描述的，此处引入作为参考。将该质粒转化入大肠杆菌菌株DH5α。利用限制性内切酶酶切图谱和DNA序列分析以确定相对启动子区的插入片段编码区正确取向。包含在pGA643中的大麦凝集素编码区cDNA pBLc3的克隆可得自N.Raikhel博士，密歇根州立大学，MSU-DOE植物研究实验室，东兰辛，MI,48824。
按如下方法构建包含有效地连接在CaMV 35S启动子上的橡胶蛋白(橡胶树凝集素)编码区的表达盒先以XbaⅠ和BglⅡ限制性内切酶从HEV1切下插入片段，切开pGA643的多接头区，后将橡胶蛋白的cDNA序列HEV1(图3；Broekaert,1990；Raikhel,U.S.专利号5,187,262)连入植物克隆载体pGA643(图1；An等，1988)中。将该质粒转化大肠杆菌菌株DH5α。利用限制性内切酶酶切图谱和DNA序列分析以确定相对启动子的插入片段编码区正确取向。包含插入pGA643中的HEV1 cDNA的克隆可得自N.Raikhel博士，密歇根州立大学MSU-DOE植物研究实验室，东兰辛，MI,48824。
包含有效地连接在CaMV 35S启动子上的荨麻凝集素编码区的表达盒是通过将荨麻cDNA序列(图4)连入植物克隆载体pGA643(图1；An等，1988)构建而成。具体方法是以Xbal限制性内切酶从荨麻cDNA克隆MK209中切下插入片段，并将该片段连入pGA643多接头区内的Xbal限制性内切酶位点之中。将该质粒转化大肠杆菌菌株DH5α。利用限制性内切酶酶切图谱和DNA序列分析以确定相对启动子的插入片段编码区正确取向。荨麻cDNA克隆MK209和包含插入pGA643中的荨麻编码区的克隆可得自N.Raikhel博士，密歇根州立大学MSU-DOE植物研究实验室，东兰辛，MI,48824。
利用携有具宽广宿主范围的转移质粒pRK2013(Clonetech,PaloAlto,California)的大肠杆菌菌株HB101通过三亲株接合(Hooykaas,P.J.J,1988)将以上三个二元载体构建体从大肠杆菌菌株DH5α转移至根癌农杆菌LBA4404。在含卡那霉素(5μg/ml)和四环素(12.5μg/ml)的基本营养平板上(An等，1988)选择转结合子。用嵌合凝集素基因转化棉花先用70％乙醇处理种子3分钟，然后用含0.01％表面活性剂TWEEN-20的20％CLOROX溶液(1％可用氯)处理种子20分钟，进行表面灭菌。在26±2℃、16小时光照(40-60μE m-2s-1)和8小时黑暗条件下，在含1mg/l激动素的琼脂固化的(TC琼脂，Hazleton Biologics,Lenexa,KS)White′s培养基(Singh和Krikorian,1981)上培养幼苗。先按Rangan(U.S.专利号5,244,802)的方法从幼苗外植体建立胚性愈伤组织培养物。简而言之，将来源于7到10日龄幼苗的子叶和下胚轴外植体放置在添加了0.4mg/l盐酸硫胺素、30g/l葡萄糖、2.0mg/l α-萘乙酸(NAA)、1.0mg/l激动素、100mg/l肌醇和0.8％(w/v)琼脂的愈伤组织诱导培养基(MS,Murashige和Skoog,1962)上，该培养物在内环境调控的培养箱(Percival,Boone,IA)中在16小时光照和8小时黑暗，光强度为60μE m-2s-1、27±2℃的条件下培养。三到四周内在这些外植体上形成愈伤组织，每三到四周，在以蔗糖(20g/l)替代葡萄糖作为碳源的上述相同培养基上选择性的传代培养愈伤组织块以富集易碎的、微黄绿色的愈伤组织。基于品种不同，在起始后经1-4次传代培养出现能形成小球状体细胞胚的胚性愈伤组织。每三到四周在含有100mg/l肌醇、20g/l蔗糖、2.0mg/l NAA和0.8％(w/v)琼脂的MS培养基(维持培养基)上以常规传代培养维持和扩增胚性愈伤组织。
将分散良好的胚性愈伤组织培养物在以旋转振荡器(NewBrunswich G-10,Edison,NJ)搅动(120rpm,27±2℃)的液体维持培养基上开始细胞悬浮培养。
每周定期地去除游离的漂浮细胞和大团块(≥840μm)以富集小体积、等直径、细胞质致密和高度胚性化的悬浮培养物。在使用前两天，将这些培养物在含40ml维持培养基的250ml Erlenmeyer瓶中传代培养。在我们实验中使用的细胞悬浮培养物是快速生长的胚性细胞，在4-6天(在传代培养二天后进入对数生长期)内，净重加倍。用于biolistic转化实验的所有细胞悬浮培养物累计年龄为3-4个月。实施例3胚胎发生棉花培养物的Biolistic转化用三种质粒(在pGA643中的大麦凝集素编码区，在pGA643中的橡胶蛋白编码区，在pGA643中的荨麻凝集素编码区)包被1.0μM金微粒，然后用一种改良的氦气驱动的biolistic装置(PDS,1000/He；BioRad)注射到胚胎发生棉花悬浮细胞培养物中。简单地说，用50μl金微载体悬浮物(1μ金微粒)的水溶液。在一1.5ml微量离心管中，在持续涡旋的条件下，依次加入5μl DNA(1μg/μl),50μl 2.5M的CaCl2和20μl 0.1M的亚精胺(游离碱，组织培养纯)，继续涡旋3分钟，在10,000转/分钟下离心10秒以沉淀微载体，尽可能地弃去上清。以250μl 100％乙醇(HPLC或光谱级)轻轻旋转洗涤微载体，接着离心、弃上清。用60μl 100％乙醇重悬微载体。每个大载体板加入7.5μl DNA包被的微载体混合物。
按Hamilton等(8)描述的方法，用1550psi的膜穿透压和其它参数设置进行轰击。将提前两天传代培养的如上所述建立的细胞悬液(＜840μm组分)，呈一薄层真空沉淀在灭菌Petri皿内(直径5.5cm)的湿润试纸(Whatman No.1；3.5cm直径)上。每个培养皿中加入1ml悬浮细胞(1×106个细胞)。在悬浮液表面上放一400目的尼龙网作为隔板。最适的轰击条件包括应用10Mpa的穿孔盘，细胞悬液和隔离网间距为7.5cm，大载体运行间距为10mm。在轰击时，样品室的真空压为95Kpa，以2天的间隔重复轰击细胞3-5次以使转化效率达到最大。
微粒轰击之后，细胞悬浮培养物在不含任何选择性的维持培养基上生长一周。二元载体pGA643带有新霉素磷酸转移酶Ⅱ基因可用来筛选转化的细胞(图1)。因此，可用抗生素G418(10μg/μl)筛选细胞悬液。以抗生素G418筛选时，每周逐渐提高浓度。G418的筛选浓度从10μg/ml起，每隔5-7天提高10μg/ml，三到四周后终浓度达到50μg/ml。可选择地，在有些实验中，在筛选伊始时细胞直接暴露在一种高浓度的抗生素中(G418,50μg/ml)。在选择性试剂的存在下，独立的转化事件产生单独生长的集落。单独培养每个克隆，并以NPTIIELISA(Firoozabady等，1987)验证真正的转化子。按Rangan等，U.S.专利号5,593,036(此处引入作为参考)描述的方法，从胚性悬浮培养物再生棉花植物。实施例4用凝集素基因转化农杆菌通过如前所述的三亲株接合将三种二元载体质粒(含大麦凝集素编码区的pGA643，含橡胶蛋白编码区的pGA643，含荨麻凝集素编码区的pGA643)转移至二元根癌农杆菌宿主菌株LBA4404中。有很多种方法(Firoozabady等，1987；Umbeck等，1987；Rangan等，U.S.专利号5,244,802)可用来实现棉花原代外植体的转化。为了方便起见，简单地描述经Rajasekaran等，1996改良的Rangan等，U.S.专利号5,244,802的方法。
在50ml YEB液体培养基中接种冷冻的甘油贮存菌液(500μl)开始培养用于转化实验的农杆菌培养物。该培养物在26±2℃，旋转摇床上生长过夜，约18小时。在使用前用液体MS培养基调节光密度(A600)值至0.6-0.8。
以5-7日龄的幼苗制备农杆菌转化的子叶(1cm2)外植体。用如上制备的农杆菌悬浮液处理外植体15-30分钟，吸干，然后铺于放置在装在直径为15cm的Petri培养皿内含60ml新鲜配制的琼脂固化愈伤组织诱导培养基(Rangan U.S.专利号5,244,802)上直径为12cm的滤纸(Whatman No.1)上。26±2℃,60-90μE m-2s-1，光照16h的条件下，在Percival培养箱内共培养48小时。共培养后，以含200mg/l氨噻肟头孢霉素(Cal-Biochem)和200mg/l羧苄青霉素(Sigma)的MS液体培养基彻底洗外植体，吸干，然后置于新鲜配制的愈伤组织诱导培养基上，该培养基中含有抗生素G418(10mg/l；Gibco BRL,LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)为筛选试剂，并加入如上相同浓度的氨噻肟头孢霉素和羧苄青霉素以控制细菌的生长。每个含25ml愈伤组织诱导培养基的Petri平皿上(直径9cm)种植7个子叶段。经第一次传代培养后，将该外植体移入新鲜配制的愈伤组织诱导培养基中，在选择压的存在下促进更多的愈伤组织生成。转化后3-8周转化(抗生素抗性)的愈伤组织形成，将单个的愈伤组织集落进行分别传代培养以保持每个整合事件的一致性。按照Firoozabady等，1987的方法进行NPTⅡ ELISA实验，验证抗生素抗性愈伤组织集落确已转化。依照已报道的方法(Rangan等，U.S.专利号5,244,802)从转化的集落再生植株。结果实施例5鉴定凝集素基因转化的棉花细胞如上所述，以pGA643中的大麦、荨麻或橡胶蛋白凝集素基因转化的棉花细胞系(胚性集落)在培养中保持独立的克隆并以NPTⅡ ELISA证实已被转化。为证实在所使用的转化系统中适宜的凝集素基因与选择性标记的共转化，以大体上与Raikhel等，1984相似的双结合ELISA，但改良后更适用于转化了的棉花细胞，检测了数个以BLc3转化的NPTⅡ ELISA阳性集落。
商业上有售的小麦胚芽凝集素抗体，与大麦凝集素有交叉反应(Wilkins等，1990)，因此，能够用在以WGA ELISA法检测BLc3蛋白质在转化的棉花细胞中的表达。在WGA ELISA检测转化时，在最初以转化的棉花细胞的研究中已观察到棉花的抽提物可产生高背景。发展了以下方案以克服这种背景问题，从而可应用本发明方法确定凝集素基因和抗生素标记基因的共转移。
兔抗小麦胚芽凝集素(6mg/ml)和生物素化的兔抗WGA(3.5mg/ml)购自E.Y Laboratories。以11ml碳酸盐结合缓冲液(Na2CO31.59g,NaHCO32.93g，加水至1升，pH9.6)稀释1.8μl兔抗WGA抗体储存液制备一抗溶液(1μg/ml)并保存在冰上。向96孔ELISA板(Corning#25805-96)的每孔加入100μl抗体，密封后4℃保持过夜。预吸附抗体按如下方法制备。将4g对照愈伤组织(未转化的)在由含1％PVP40000的50X的浓缩液(Agdia,Elckhart,Indiana)制备的6ml PBSTween缓冲液中匀浆，8000转/分钟离心10分钟沉淀细胞碎片，将5.5ml上清与5.5ml含0.1％BSA和4％PEG 8000的PBS Tween混合，向其中加入9.4μl生物素化兔抗WGA抗体(E.Y.Laboratories,3.5mg/ml)至终浓度3μg/ml。其后在冰上孵育3小时以预吸附抗体。
取出孵育过夜的ELISA板并以PBS Tween充分洗涤(4X)，每孔中加入无Tween的PBS中的i％BSA溶液进行封闭。无Tween的PBS溶液由5ml 10％(w/v)的牛血清白蛋白贮存液(Fraction V,ICNPharmaceuticals #81-066，水溶液)与5ml PBS(NaCl 8.0g,Na2HPO4.2H2O 1.44g,KH2PO40.2g,KCL 0.2g,加水至1升，调至pH7.4)混合而成。室温下(22-24℃)孵育平板1小时，然后以PBS Tween洗涤4X。
按以下方法制备以BLc3转化的胚性细胞系抽提物。在1.5ml微量离心管中以130μl含1％PVP40000的PBS Tween溶液匀浆约0.5g愈伤组织，10000转/分钟离心沉淀细胞碎片，并放置在冰上。向ELISA板每孔中加入100μl上清，接着按上述步骤封闭1小时，洗涤板。在室温下孵育板3小时，并以PBS Tween洗涤板4X。向板的每一孔中加入100μl预吸附的生物素化抗体，4℃孵育平板过夜，并以PBS Tween洗涤4X。
于含1％BSA的PBS(无Tween)中配制11ml 1∶3000稀释的链霉抗生物素蛋白/碱性磷酸酶偶联物(5′到3′)。向ELISA板的每孔中加入100μl，在室温下孵育板1小时，以PBS Tween洗涤平板4X，每孔加入200μl溶于pH9.8,10％乙二醇胺+0.5mM MgCl2的PNP(对硝基苯磷酸盐；Sigma104磷酸盐底物#104-0)(使用前制备)，在室温下显色反应20分钟。加入50μl 3N NaOH终止反应，在微滴板读数仪上读取波长410λ处的吸光值。几种转化的胚性细胞系的分析结果列于下表中。
表1用pGA643中的BLc3转化了的棉花细胞进行的WGA ELISA中免疫测定的结果样品#集落#凝集素DNAELISA结果1 对照 无 -2 对照 无 -3 对照 无 -4 对照 无 -5 对照 无 -6 75BLC-7 95BLC-8 105 BLC-9 138 BLC-10 158 BLC-11 171 BLC-12 173 BLC-13 175 BLC-14 176 BLC++15 177 BLC+16 178 BLC+++17 180 BLC-18 181 BLC-19 183 BLC-20 184 BLC+21 185 BLC-22 186 BLC+23 187 BLC-24 188 BLC+++25 189 BLC-26 190 BLC++27 191 BLC-28 192 BLC-29 194 BLC+30 195 BLC+++31 197 BLC+++32 198 BLC+33 200 BLC+++35 203 BLC-36 205 BLC+++37 207 BLC-38 209 BLC-39 211 BLC+++40 216 BLC+41 25μg/ml WGA+++-=为监测到信号；+,++,+++表示检测到的信号和相对强度，+++表示信号最强。
表1数据证实了凝集素基因与NPTⅡ选择性标记的共转移。在本试验中约50％转化的胚性细胞系表达的凝集素蛋白质足以被检测到。但在本试验中，显然BLc3蛋白质的可检测性水平是可变化的，这可能由所分析的不同细胞系代表的独立转化事件中凝集素蛋白质表达水平的差异所致。实施例6BLc3转化的棉花细胞是杀昆虫的为确定转化了BLc3的棉花细胞的杀昆虫特性，以实夜蛾属的幼虫进行饲养试验。实夜蛾是在经济学上重要的棉花害虫，选择NPTⅡELISA和WGA ELISA双阳性的转化胚性愈伤组织培养物进行实验。将这些集落分为两组，一半继续培养以再生成植物，另外一半用以饲养试验。实验中，将大于1克的组织在液氮中冷冻，冻干并贮存在-75℃，以待饲养试验之用。
由于棉铃虫(corn ear worm)是一种主要的棉花害虫，本实施例中使用其饲料。假如他想检定转化的组织对其它昆虫的抗昆虫活性，本领域技术人员懂得如何选择适宜昆虫饲料。昆虫饲料按下述方法制备，将2.6g琼脂溶解在157ml水中，煮沸1分钟，后加入40.6g棉铃虫饲料(Bioserv产品#9394)充分搅拌。向16孔昆虫饲养盘每孔中加入1.5ml上述混合液。再向每孔中加入25ml冻干的愈伤组织或对照(未转化)样品。以截短型苏云金芽孢杆菌(B.t)晶体内毒素(CrylAb)基因(pPHY3)转化的愈伤组织为阳性对照。这种愈伤组织表达低水平的Bt蛋白质，对实夜蛾幼虫有毒性。以转化NPTⅡ基因(pUC/NEO)，但无凝集素基因的愈伤组织作为阴性对照。
烟芽夜蛾幼虫，一种严重的棉花害虫在本实施例使用。使卵孵化，新生的幼虫用于试验，饲养盘每孔加入一个幼虫。6天后，称其重以确定生长程度。数据总结在下表2中。
表2实夜蛾幼虫在含以BLc3转化的棉花组织的饲料上的生长结果
BLC编号与表1中样品编号一致。用8只实夜蛾幼虫检验如上文制备的每一种愈伤组织样品。表中所示的生长体重增加百分数是在所示检测样品混合物上饲养6天后8只幼虫的平均值。以仅NPTⅡ标记基因(无凝集素基因)转化的愈伤组织制备阴性对照样品。阳性对照来自以pPHY3转化的组织。
表2中的数据表明以BLc3转化的棉花胚性愈伤组织能够抑制实夜蛾幼虫的生长，并且确实能够杀死一些幼虫，即使在这些研究中以相对少量的(25mg)冻干转化愈伤组织混合到人工饲料中也能如此。实施例7以HEVI(橡胶蛋白)和MK209(大麦凝集素)转染的棉花细胞是杀昆虫的添加冻干愈伤组织的棉铃虫饲料按实施例6所述的方法制备，只是愈伤组织样品来自以HEVI转化的和MK209转化的愈伤组织。将新孵化的幼虫(每饲养孔一只)放置到测试培养基上，室温下孵育，7天后计分，数据总结在下表3中。
表3实夜蛾幼虫在添加了以HEVI(橡胶蛋白)或MK209(荨麻凝集素)转化的棉花组织的饲料上的生长结果
本实验使用的昆虫饲料制剂中包含极低重量百分比的待测试愈伤组织，因此，比较其与阳性对照的相对活性，可以认为观察到的杀昆虫活性是很显著的。尽管所有测试的凝集素基因都表现出抗实夜蛾的显著活性，在本研究中，荨麻凝集素MK209相对B.t内毒素的活性最高。
本领域的技术人员懂得利用这些方法检测本研究所示范的或其他凝集素基因转化的棉花组织抗在棉花生产上有经济学重要意义的其他昆虫和害虫的杀虫活性。这类昆虫和害虫的例子包括切根虫[地夜蛾(Agrotis spp.),Paridroma ssp.，切夜蛾(Euxoa spp.)，脏切夜蛾(Feltia spp)]，缨翅目昆虫[花蓟马(Franklinialla spp.)]，蚜虫[棉蚜(Aphis gossypii)]，棉铃虫[实夜蛾(Heliothis spp.),Pectinophora spp.,Helicoverpa spp.]，芽夜蛾(budworm)[实夜蛾(Heliothis spp.)]，盲蝽[草盲蝽(Lygus spp.),Euschistusspp.)]，棉铃象(Anthonomus grandis)，粘虫[贪夜蛾(Spodopteraspp)]，夜蛾(looper)(Alabama spp.)，毛虫(Estigmene spp.),cotton leaf perforator(Bacculatrix spp)，叶螨(Tetranychusspp.)，粉虱(Bemisia spp.,Trialeurodes spp)，线虫[根结线虫(Meloidogyne spp.)，小盘旋线虫(Rotylenchulus spp.)，纽带线虫(Hoploaimus spp.)]，和真菌病原体[轮枝孢(Verticillium spp.),镰孢(Fusarium spp.)，腐霉(Pythium spp.)，丝核菌(Rhizoetoniaspp.)，根串珠霉(Thielaviopsis spp.)，疫霉(Phytophthoraspp.)]。由上述实施例看来，熟练的技术人员可以预见以其他凝集素基因的测试也可能是成功的。因此，显而易见本发明包含的实施方案不仅仅是那些在例证性的实施例中提到的实施方案，将通过附加的权利要求书诠释本发明。
参考文献An G.,Ebert,P.R.,Mitra,A.,和Ha,S.B.(1988)双元载体，植物分子生物学手册(Binary vectors,Plant Mol.Bilo.Manual)A321-19.Anderson,D.M.,Hudspeth,R.L.,Hobbs,S.L.,和Grula,J.W.(1993)植物生理学(Plant Physiol.)102:1047-1048.Blake,M.S.,Johnston,K.H.,Russel-Jones,G.J.，和Gotschlich,E.C.(1984)分析生物化学(Anal.Biochem.)136:175-179.Broekaert,W.,Lee,H.-i.,Kush,A.,Chua,N-H.，和Raikhel,N.(1990)美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87:7633-7637.Firoozabady,E.,DeBoer,D.,Merlo,D.,Halk,E.Amerson,L.,Rashka,K.，和E.Murray(1987)植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)10:105-116.Hooykaas,P.J.J.(1988)植物分子生物学手册(Plant Molec.Biol.Manual)A4:1-13.Lee,Hyung-il,Broekaert,W F.，和Raikhel,N.V.(1991)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)266:15944-15948Lerner,D.R.，和Raikhel,N.V.(1992)植物生理学91:124-129Lerner,D.R.，和Raikhel,N.V.(1992)生物化学杂志.267:22694.Murashige,T.和Skoog,F.(1962)生理植物(Physiol.Plant)15:4730497Murdock等(1990)植物化学(Phytochemistry)29:85-89Raikhel,N.V.,Mishkind,M.L.和Palevitz,B.A.(1984)植物(Planta)162:55-61Rajasekaran,K.Grula,J.W.,Hudspeth,R.L.,Pofelis,S.，和Anderson,D.M.(1996)分子育种(MolecularBreeding)2:307-319Schroeder,M.R.和Raikhel,N.V.(1992)蛋白质表达和纯化(Protein Expr.Purif.)3:508-511Singh,M.和Krikorian,A.D.(1981)植物学年鉴(Ann.Bot.)47:133-139Umbeck,P.,Johnson,G.,Barton,K.,和W.Swain(1987)生物工程学(Bio/technology)5:263-266Wilkins,T.A.,Bednarek,S.Y.，和Raikhel,N.V.(1990)植物细胞(The Plant Cell)2:301-31权利要求
1．含有一种编码凝集素的异源性编码序列的棉花细胞群，其中所述的细胞中表达该编码序列，从而赋予该细胞杀害虫能力。
2．根据权利要求1的棉花细胞，其中该细胞是杀昆虫的。
3．根据权利要求1的棉花细胞，其中该细胞是杀真菌的。
4．根据权利要求1的棉花细胞，其中该细胞是杀线虫的。
5．根据权利要求1的棉花细胞，其中所述的凝集素编码序列来自大麦。
6．根据权利要求1的棉花细胞，其中所述的凝集素编码序列来自荨麻。
7．根据权利要求1的棉花细胞，其中所述的凝集素编码序列来自橡胶蛋白。
8．一种棉花植物，其中包含根据权利要求1的棉花细胞。
9．根据权利要求8的棉花植物，其中所述细胞是杀昆虫的。
10．根据权利要求8的棉花植物，其中所述细胞是杀真菌的。
11．根据权利要求8的棉花植物，其中所述细胞是杀线虫的。
12．根据权利要求8的棉花植物，其中所述的细胞包含来自大麦的凝集素编码序列。
13．根据权利要求8的棉花植物，其中所述的细胞包含来自荨麻的凝集素编码序列。
14．根据权利要求8的棉花植物，其中所述的细胞包含来自橡胶蛋白的凝集素编码序列。
15．根据权利要求8的棉花植物种子，该种子包含具有异源性凝集素编码序列的细胞。
16．根据权利要求15的种子，其中所述的凝集素编码序列编码一种杀昆虫的凝集素。
17．根据权利要求15的种子，其中所述的凝集素编码序列编码一种杀真菌的凝集素。
18．根据权利要求15的种子，其中所述的凝集素编码序列编码一种杀线虫的凝集素。
19．根据权利要求15的种子，其中所述的凝集素编码序列来自大麦。
20．根据权利要求15的种子，其中所述的凝集素编码序列来自荨麻。
21．根据权利要求15的种子，其中所述的凝集素编码序列来自橡胶蛋白。
22．一种生产杀害虫的凝集素的方法，包括以下步骤获得编码杀害虫的凝集素的多核苷酸；用所述多核苷酸转化棉花细胞；在一定的条件下培养该细胞，从而产生包含所述多核苷酸的子代棉花细胞或包含所述子代细胞的植物；验证所述多核苷酸在所述的子代细胞中表达，从而生产一种可杀害虫的凝集素。
23．根据权利要求22的方法，其中所述的凝集素是杀昆虫的。
24．根据权利要求22的方法，其中所述的凝集素是杀真菌的。
25．根据权利要求22的方法，其中所述的凝集素是杀线虫的。
26．根据权利要求22的方法，其中所述的多核苷酸来自大麦。
27．根据权利要求22的方法，其中所述的多核苷酸来自荨麻。
28．根据权利要求22的方法，其中所述的多核苷酸来自橡胶蛋白。
29．产生具害虫抗性的棉花植物的方法，包含以下步骤获得编码杀害虫的凝集素的多核苷酸；用所述多核苷酸转化棉花细胞；在一定的条件下培养所述细胞，从而生产包含所述细胞之子代细胞的棉花植物，该子代细胞包含编码凝集素的多核苷酸；验证该多核苷酸在所述子代细胞中表达，从而生产杀害虫的凝集素。
30．根据权利要求29的方法，其中进一步包含下述步骤在一定条件下培育所述植物，从而产生棉花种子；从所述植物收获至少一粒棉花种子；由所述植物生产具害虫抗性的棉花植物的子代。
31．根据权利要求29的方法，其中所述的凝集素是杀昆虫的。
32．根据权利要求29的方法，其中所述的凝集素是真菌的。
33．根据权利要求29的方法，其中所述的凝集素是杀线虫的。
34．根据权利要求29的方法，其中所述的多核苷酸来自大麦。
35．根据权利要求29的方法，其中所述的多核苷酸来自荨麻。
36．根据权利要求29的方法，其中所述的多核苷酸来自橡胶蛋白。
37．根据权利要求30的方法，其中所述的凝集素是杀昆虫的。
38．根据权利要求30的方法，其中所述的凝集素是杀真菌的。
39．根据权利要求30的方法，其中所述的凝集素是杀线虫的。
40．根据权利要求30的方法，其中所述的多核苷酸来自大麦。
41．根据权利要求30的方法，其中所述的多核苷酸来自荨麻。
42．根据权利要求30的方法，其中所述的多核苷酸来自橡胶蛋白。
43．一种杀棉花害虫的方法，包含以下步骤获得编码杀害虫的凝集素的多核苷酸；用所述多核苷酸转化棉花细胞；在一定的条件下培养所述细胞，从而生产包含所述多核苷酸的子代细胞或包含所述子代细胞的植物；验证所述多核苷酸在所述子代细胞中表达，从而生产杀害虫的凝集素；使所述子代细胞与棉花害虫接触。
44．根据权利要求43的方法，其中所述的凝集素是杀昆虫的。
45．根据权利要求43的方法，其中所述的凝集素是杀真菌的。
46．根据权利要求43的方法，其中所述的凝集素是杀线虫的。
47．根据权利要求43的方法，其中所述的多核苷酸来自大麦。
48．根据权利要求43的方法，其中所述的多核苷酸来自荨麻。
49．根据权利要求43的方法，其中所述的多核苷酸来自橡胶蛋白。
全文摘要
本发明公开了编码呈现杀虫活性(如杀昆虫和/或杀真菌活性)的凝集素的嵌合基因,该嵌合基因可用来转化棉花以产生可表达该嵌合基因的棉花细胞、植株和种子。当被棉花害虫摄取后这种转化的棉花细胞能够杀害虫。
文档编号C12N15/29GK1303441SQ99806759
公开日2001年7月11日 申请日期1999年5月28日 优先权日1998年5月29日
发明者R·L·耶诺夫斯基, M·范恩, T·S·兰根, D·M·安德森 申请人:麦考根公司