分枝杆菌的突变株及其在潜在抗生素载体筛选中的应用的制作方法

专利名称：分枝杆菌的突变株及其在潜在抗生素载体筛选中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到分枝杆菌的新突变株及其在潜在抗生素载体筛选中的应用。
分枝杆菌感染导致的问题在不断地增加。一些对化疗药物具广谱抗性的菌株的出现更使这一问题加剧。因而，寻找新的活性物质和作用机制势在必行。
分枝杆菌的细胞壁对化疗药物的透过率较低是限制药物抗分枝杆菌效用的一个重要因素(Suzuki,A.E.,Inamine,J.M.:Res.Microbiol.145,1994,210-213；Jarlier,V.,Nikaido,H.:FEMSMicrobiol.Lett.123,1994,11-28)。
克服这一障碍的一个概念性的方法是将抗生素同可被病原微生物主动吸收的载体相耦联。
铁螯合试剂(铁载体)可被用于作这样的载体。在感染部位缺乏铁离子的情况下，许多病原微生物可形成铁载体并将其分泌至外环境。Fe3+-铁载体可通过特异的受体同细胞表面相结合，然后被依赖于ATP的渗透酶转运进胞内。已知革兰氏阴性菌不仅可以吸收其自身产生的铁载体，还可吸收其他种类有机体形成的铁载体(外源铁载体)。
对于分枝杆菌的摄铁系统目前所知较少(综述Wheeler,P.R.,Ratledge,C.:in Bloom,B.R.ed.:Tuberculosis,ASM Press,Washington,DC,1994)。迄今为止确认了两种类型的铁载体，即结合与膜上的亲脂的分枝菌素(Snow,G.A.:Bacteriological Reviews34,1970,99-125)以及胞外的疏脂的铁外螯合素(Macham,L.P.etal.:J.Gen.Microbiol.101,1977,41-49；Hall,R.,Ratledge,C.:J.Gen.Microbiol.133,1987,193-199)。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)(Sharman et al.:Biochem.J.305,1995,187-196),新金色分枝杆菌(M.neoaurum)(Sharman et al.:Chemistry & Biology 2,1995,553-561)和结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(Gobin et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,1995,5189-5193)所形成铁外螯合素的结构已被确认。许多种分枝菌素的结构亦已阐明(Snow,G.A.:Bacteriol.Rev.34,1970,99-125)。
从耻垢分枝杆菌，确定了第一个参与铁外螯合素的生物合成和可能涉及Fe3+-铁外螯合素的吸收的基因(Fiss,E.H.et al.:Molecular Microbiology 14,1994,557-569)。有四个开放读码框架中的三个(fxuA,fxuB,fxuC)所推测出的蛋白与大肠杆菌的一些膜蛋白具同源性，这些大肠杆菌中的膜蛋白参与肠肝菌素的吸收。因此，这些开放读码框架编码的蛋白估计为Fe3+-铁外螯合素渗透酶的亚基，但迄今为止仍无证据。第四个开放读码框架(fxbA)编码一个参与铁外螯合素的生物合成的蛋白。这已被一个生物合成突变体的互补实验所证实。
通过铁外螯合素/分枝菌素的铁转运过程的细节仍属未知。分枝杆菌对外源铁载体的吸收也同样所知较少。迄今为止仅仅表明耻垢分枝杆菌可以利用不同的外源铁载体(Matzanke,B.F.et al.:BioMetals 10,1997,193-203)。是否这些外源铁载体通过特异的摄取系统被吸收，是否它们因此是潜在的的抗生素载体，这些问题只能通过昂贵的Mssbauer光谱法来阐明(Matzanke,B.F.:HyperfineInteractions 112,1998,123-128)。由于这一方法需大量的底物和非常昂贵的设备因此而不适于检测。它只限于少数几个高度专业的实验室，且用于处理的样品只有很有限的产出。
本发明的主要目的在于提供一种非放射性的经济有效的方法用于检测对天然或外源的铁载体以及化学类似物的吸收，这些物质可能成为潜在的抗生素载体。
根据本发明，这一目的已经达到。这是由于一套分枝杆菌的突变体已被生产出，各突变体分别被去除了铁外螯合素/分枝菌素转运体系的不同组分。这套突变体构成了一个快速、经济的检测程序的基础。
因此，本发明涉及到一种检测分枝杆菌潜在的抗生素载体的方法。本方法的特征在于突变体中编码铁载体相关的铁摄取系统的基因被去除活性，这些突变体被用于适当的检测程序而检出在转运过程中不依赖铁外螯合素/分枝菌素转运体系的铁载体。
一个适于本发明的检测程序是固体培养基上的生长刺激实验。为这个目的，突变体在缺乏铁的培养基上培养，待测的铁载体被加在培养基上界定的区域内。在该区域内突变体生长变活跃表明是否所加物质中的铁可被突变体利用。
令人惊奇的是，通过这一快速简单高产出的检测方法可以确认出转运入胞过程中不依赖铁外螯合素/分枝菌素转运系统的铁载体。使用不同的突变体，本方法可以用于检测不与铁外螯合素或分枝菌素进行配体交换的铁载体。只有这样的铁载体才可能成为抗生素载体，因为其他的铁载体将不能被转运入细胞。根据本发明的检测方法并不限于固体培养基上的生长刺激实验。该实验也可在液体培养基上进行。
在本方法中，利用铁外螯合素/分枝菌素转运系统中特定单个组分被阻断所形成的不同突变体，还可以获得在转运体系中各组分参与外源铁载体吸收的程度的信息。迄今为止，通过以前的Mossbauer光谱法(用Fe57)或用以检测细菌细胞的铁吸收的Fe55放射转运法还不能获得这种信息。本发明进一步的优点是不需要放射性的或富集的稳定同位素。
本发明的检测方法所用的分枝杆菌突变体是通过使编码铁载体依赖的摄铁体系组分的基因失活而产生的。突变的产生使用了本领域的几种方法之一a)通过化学或物理突变原产生突变，b)通过基因替换，即以一标记基因，如抗生素抗性基因替换整个或部分基因，c)通过插入失活(插入一标记基因，如抗生素抗性基因，使之失活)或删除失活(删除整个或部分基因使之失活)，d)综合使用以上方法。
为了使产生的突变体尽可能地包括铁外螯合素/分枝菌素转运体系的各重要组分，了解整个Fe+-铁外螯合素摄取基因簇是十分有益的。因此，Mycobacterium smegmatis菌株mc2155(Snapper et al.:Mol Microbiol 4,1990,1911-1919)上与fxuC相邻的染色体片断已被克隆出来，在本发明范围内的一个新的开放读码框架(fxuD)已被确认，它很有可能属于Fe3+-铁外螯合素摄取基因簇。图一显示的是由四个Fe3+-铁外螯合素摄取基因组成的基因簇的限制性内切图谱，这些基因已被确认。图二显示的是与fxuC毗邻的染色体片断的核苷酸序列以及依此推导出的FxuD氨基酸序列。
本发明的检测方法以耻垢分枝杆菌的突变体为例说明。除此之外，其他快速生长的分枝杆菌如草分枝杆菌(Mycobacteriumphlei)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、金色分枝杆菌(M.aurum)、偶发分枝杆菌(M.for tuitum)或龟分枝杆菌(M.chelonae)，其相对应突变体可类似地使用。而且，使用快速生长的分枝杆菌如牛分枝杆菌(M.bovis)、鸟分枝杆菌(M.avium)或结核分枝杆菌(M.tuberculosis)也是可能的。
下文的耻垢分枝杆菌菌株于1998年2月4日保存于DeutscheSammlung von Mikroorgnismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1B,D-38124 Braunschweig(DSMZ)保藏号耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)M24(DSM 12084),耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)B1(DSM 12085)and大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10F’pGS4(DSM 12083)。
本发明还进一步涉及到一些分枝杆菌的突变体，其特征在于参与分枝菌素生物合成的基因失活，或/和编码铁外螯合素依赖的摄铁体系中的组分的基因被以基因替换、删除或插入的方法去除。
在一个优选的方案中，本发明涉及到一些分枝杆菌的突变体，其参与分枝菌素生物合成的一些基因已被失活。
在一个更优选的方案中，本发明涉及到的分枝杆菌突变体有一个或更多选自fxbA、fxuA、fxuc和fxuD编码铁外螯合素依赖的摄铁体系中组分的基因被除去。还可视需要除去参与分枝菌素合成的基因。
本发明特别涉及到实施例中讲述的分枝杆菌的突变体，尤其是耻垢分杆杆菌的突变体。
联系随后的例子本发明将被非常详细的解释，以下的图用于对例子进一步的说明

图1是铁外螯合素基因簇的限制性内切2显示包括有侧翼序列的fxuD基因的核苷酸序列图3显示fxbA的删除的构建物图4显示fxuA的删除的构建物图5是质粒pGS52的限制性内切6显示pGS41和pGS56的插入图8是质粒pGS57的限制性内切图例一耻垢分枝杆菌M24突变体的产生为产生分枝菌素生物合成的重要功能封阻的突变体，用N-nitrosomethyl-N-硝基-胍对Mycobacterium smegmatis mc2155(Snapper et al.:Mol Microbiol 4,1990,1911-1919)进行化学诱变。突变体Mycobacterium smegmatis M24(DSM 12084)由于其缺乏紫外荧光而从存活细胞中被分离出。可以通过高压液相色谱和电喷射质谱学方法获得其缺乏分枝菌素积累的证据。铁外螯合素的生物合成不受产生突变的影响。
例二耻垢分枝杆菌B1和B2突变体的产生FxbA基因以基因替换的方法删除。该过程中全基因被来自pUC4K的卡那霉素抗性基因(Pharmacia Biotech Europe GmbH)所取代。为达到这一目的，质粒pGS31(图3)是必需的，其构建如下通过PCR方法获得了染色体上紧邻M24中被删除基因的片断，即长507bp的片断B7/8和758bp的片断B5/6。以下的寡聚核苷酸被用作PCR的引物片断B7/8:CAGGATCCATTGGTAAGCCTTACC 序列号No.1GATCTAGAGCTGGTTCAGGGCGATG 序列号No.2片段B5/6:ACGAATTCACACGCCAGAGAACGC 序列号No.3CAGGATCCTGATCTGGCAATTCCAG 序列号No.4在这一步人工引入了限制性内切位点，这些位点可使两片断以与其在染色体上相同的方向引入载体pUC118(Boehringer IngelheimBioproducts)上卡那霉素抗性基因的相邻处。这样便构建完成质粒pGS31(图3)。
以质粒pGS31转化菌株Mycobacterium smegmatis mc2155和M24，并使用含卡那霉素的培养基选出卡那霉素抗性转化子。这些克隆被用以检测其铁外螯合素的生物合成能力。克隆耻垢分枝杆菌B1(DSM12985)由mc2155菌株分离出，克隆耻垢分枝杆菌B3从M24分离出，这些克隆均不分泌铁外螯合素。通过PCR的方法获得的证据表明其铁外螯合素阴性表现型是基于fxbA被卡那霉素抗性基因替换而成。这一替换是由克隆入pGS31上的染色体片断和其在染色体上的同源序列发生同源重组而造成。
克隆B1不同于Fiss等人发表的fxbA突变体，后者是通过非特征化的化学诱变而获得，同时，一个特定的基因替换确保了B1突变的稳定。
例三耻垢分枝杆菌U1突变体的产生与例二相似，fxuA的删除是通过“基因替换”完成的。为此目的而必需的质粒pGS22的构建如下通过PCR方法获得了M24中染色体上紧邻的fxuA基因的片断，即长768bp的片断U1/5和755bp的片断U6/7。以下的寡聚核苷酸被用作PCR的引物片断U1/5:ACGAATTCGAGATCCTCGGCATCAAC序列号No.5CAGGATCCTGGCGCTTCCCGAAATC 序列号No.6片断U6/7:GAGGATCCTGAAAGAACATATGACTC序列号No.7TATCTAGACAAGATCGGCCGACATC 序列号No.8在这一步人工引入了限制性内切位点，这些位点可使两片断以与其在染色体上相同的方向引入载体pUC118(Boehringer IngelheimBioproducts)上卡那霉素抗性基因的相邻处。这样便构建完成质粒pGS22(图4)。以质粒pGS22转化菌株Mycobacterium smegmatisM24，并使用相应的营养基选出卡那霉素抗性转化子。根据它的表现型，删除突变体Mycobacterium smegmatis U1被从克隆中选出。为此目的，用所述检测方法检测卡那霉素抗性转化子以检出生长不为铁外螯合素所刺激的克隆。突变体U1中fuxA的删除导致其不能吸收Fe3+-铁外螯合素。通过PCR方法，确认了造成所检出表型的原因是卡那霉素抗性基因通过同源重组替换了fuxA。
例四耻垢分枝杆菌U5突变体的产生通过在基因内部整合卡那霉素抗性使fxuC基因失活。在这一步中，通过选择使卡那霉素基因的的转录方向与fxuC相反，这样可尽可能地避免fxuA和fxuB的极性影响。为这一目的，725bp的KpnⅠ-PstⅠ片断(图1，片断1)被亚克隆入pUC118。片断1产自pGS4，pGS4可从E.coli TOP10F’pGS4(DSM 12083)中获得。pGS4使pUC118的一个衍生质粒，包括有片断1和2的插入片段，见图1。卡那霉素抗性基因以相应方向克隆入BamHⅠ限制性切点内。这就形成了pGS52(图5)。以质粒pGS52转化菌株耻垢分枝杆菌M24，并使用相应的营养基选出卡那霉素抗性转化子。根据它的表现型，删除突变体耻垢分枝杆菌U5被从克隆中选出。为此目的，用所述检测方法检测卡那霉素抗性转化子以检出生长不为铁外螯合素所刺激的克隆。在这一突变体中，染色体上的fxuC基因通过同源重组而被克隆入pGS52且被卡那霉素抗性基因插入失活的fxuC所取代。卡那霉素抗性基因的插入导致了突变体U5不再吸收Fe3+-外铁螯合素。整合造成该表现型的推测为PCR所证实。
例五耻垢分枝杆菌U7突变体的产生为尽可能地避免fxuA、fxuB和fxuC的极性影响并免于影响fxuD-fxuA簇的表达调控，fxuD通过删除距基因5’端69bp处的一个325bp的片断而失活。
为这一目的，来自pGS4的一个1737bp(图1，片断2)的片断被亚克隆入pUC118，这便形成了pGS41(图6)。用BspMⅡ切开pGS41并重新连接而形成pGS56(图7)。将卡那霉素抗性基因克隆入pGS56的BglⅡ位点形成了pGS57(图8)。用pGS57转化菌株M24并用相应培养基选择出卡那霉素抗性转化子。以PCR方法选择出Mycobacterium smegmatis插入突变体U7，其fxuD已通过同源重组被经删除过的拷贝替换。在该突变体中，卡那霉素抗性基因被整合入fxuD-fxuB簇启动子之前的位置。因此可排除fxu簇的表达的极性影响。
例六用来检测可能的抗生素载体的方法本发明中的突变体于35～37℃下在营养琼脂(12g Oxoid No.1培养基/升)上培养48小时，随后以极限培养基(50ml甘油、8.5gNacl/升，pH7.2)悬浮。悬浮的细胞密度约3×108/ml。用1.5ml的悬浮液加入99ml的生物测试琼脂(20ml甘油、5gL-天冬酰胺/升，用双蒸水配制；pH7.5；加入2％的alumina后，在121℃下灭菌15分钟；随后过滤并调pH至6.8；加入12克琼脂No.1(Oxiod)，在121℃下灭菌；接种前加入0.46μg/ml Zn2+,0.1μg/ml Mn2+,0.05mg/mlMg2+,1μg/ml CaCl2×2H2O,0.2μg/ml Na2MoO4×2H2O,0.2μg/ml CuSO4×5H2O,0.4μg/ml CoCl2×2H2O,0.2μg/ml和10μM ethylenediamine-di-(o-hydroxyphenyl-acetic acid))。将悬浮液加入培养皿。琼脂凝固后，用一个被待侧底物浸透的圆形滤纸(直径5mm)置于琼脂表面。接种后35～37℃培养两天，测量滤纸周围的生长区域。
突变体U1至U7的生长区域表明受测的外源铁载体的吸收不依赖于任何外铁螯合素/分枝菌素转运体系中的已知组分。突变体B1的生长区域表明了同分枝菌素的配基交换，同时突变体M24的生长区域显示了在缺乏突变体U1的供给下同外铁螯合素的配基交换。
序列表<110> Grnenthal GmbH<120>分枝杆菌的突变株及其在潜在抗生素载体筛选中的应用<130>Grnenthal HKI 2806<140><141><160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>24<212>DNA<213>耻垢分枝杆菌<400>1caggatccat tggtaagcct tacc 24<210>2<211>25<212>DNA<2l3>耻垢分枝杆菌<400>2gatctagagc tggttcaggg cgatg 25<210>3<211>24<212>DNA<213>耻垢分枝杆菌<400>3acgaattcac acgccagaga acgc24<210>4<211>25<212>DNA<213>耻垢分枝杆菌<400>4caggatcctg atctggcaat tccag 25<210>5<211>26<212>DNA<213>耻垢分枝杆菌<400>5acgaattcga gatcctcggc atcaac 26<210>6<211>25<212>DNA<213>耻垢分枝杆菌<400>6caggatcctg gcgcttcccg aaatc 25<210>7<211>26<212>DNA<213>耻垢分枝杆菌<400>7gaggatcctg aaagaacata tgactc 26<210>8<211>25<212>DNA<213>耻垢分枝杆菌<400>8tatctagaca agatcggccg acatc 25<210>9<211>1482<212>DNA<213>耻垢分枝杆菌<220><221>CDS<222>(446)..(1480)<400>9gatctcgtcg ggggtatcga agtgacgttg gcggatcggg attgaaccgt tttggagaac 60cgcccctcag tggggtaatc tcgctgctcg gttgatccac tattcgggcc tatagctcag 120gcggttagag cgcttcgctg ataacgaaga ggtcggaggt tcgagtcctc ctaggcccac 180gacgccggtc tgccggtgat caccgaaagg gtgtgccatg cggtttgtgg tgttggctgt 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1．分枝杆菌突变体，其特征在于通过基因置换、删除失活或插入失活，使参与分枝菌素的生物合成的基因被灭活或/和编码铁外螯合素依赖的摄铁体系组分的基因被除去。
2．权利要求1的分枝杆菌突变体，其特征在于参与分枝菌素生物合成的基因已被灭活。
3．权利要求2的分枝杆菌突变体，特征在于其基因的灭活通过以下方法之一完成a)利用化学或物理突变原产生突变，b)通过基因替换，c)通过插入或删除失活，d)综合以上几种方法。
4．权利要求1的分枝杆菌突变体，其特征在于一个或多个编码铁外螯合素依赖的摄铁体系组分的基因已通过基因替换，删除或插入的方法去除，另外，还视需要使参与分枝菌素生物合成的基因失活。
5．权利要求1的分枝杆菌突变体，其特征在于其在分类上属于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、草分枝杆菌(M.phlei)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、金色分枝杆菌(M.auram)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、牛分枝杆菌(M.bovis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、M.gordonae、M.flavescens、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或其他形成外铁载体的分枝杆菌菌株。
6．权利要求1的耻垢分枝杆菌突变体M24(DSM 12084)。
7．权利要求1的耻垢分枝杆菌突变体B1(DSM 12085)，其特征在于通过质粒pGS31上的插入片段同fxbA同源重组，mc2155菌株的fxbA基因被卡那霉素抗性基因替换，如图3所示。
8．权利要求1的耻垢分枝杆菌突变体B3，其特征在于通过质粒pGS31上的插入片段同fxbA同源重组，M24菌株的fxbA基因被卡那霉素抗性基因替换，如图3所示。
9．权利要求1的耻垢分枝杆菌突变体U1，其特征在于通过质粒pGS22上的插入片段同fxuA同源重组，M24菌株的fxuA被卡那霉素抗性基因替换，如图4所示。
10．权利要求1的耻垢分枝杆菌突变体U5，其特征在于通过质粒pGS52上的插入片段同fxuC同源重组，M24菌株的fxuC表达被来自pUC44的卡那霉素抗性基因的整合所打断，如图5所示。
11．权利要求1的耻垢分枝杆菌突变体U7，其特征在于通过质粒pGS56上的插入片段同基因fuxD同源重组而使其被部分删除，如图6、7所示。
12．一种检测潜在的抗生素载体的方法，其特征在于使用了权利要求1-11的突变体，可检出不依赖于铁外螯合素/分枝菌素转运系统在分枝杆菌细胞中转运的铁载体。
13．一种权利要求12的方法，其特征在于测试过程通过在固体或液体培养基上进行的生长刺激实验而完成。
全文摘要
本发明涉及到分枝杆菌的新突变株及其在潜在抗生素载体筛选中的应用。根据本发明的突变体的特征在于其编码铁载体依赖的摄铁体系的基因被灭活。灭活通过以下方法之一完成:a)通过化学或物理突变原产生突变,b)通过“基因替换”,即以一标记基因替换整个或部分基因,c)通过插入失活或删除失活,d)综合使用以上方法由此获得的突变体形成了筛选在转运入分枝杆菌细胞过程中不依赖于铁外螯合素/分枝菌素转运体系的铁载体,它们是潜在的抗生素载体。
文档编号C12N15/09GK1309703SQ99807501
公开日2001年8月22日 申请日期1999年4月10日 优先权日1998年4月17日
发明者G·苏曼, U·梅尔曼, I·海尼曼 申请人:格吕伦塔尔有限公司