专利名称：水不溶性α－1,4－萄聚糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种在无缓冲剂系统中制备水不溶性α-1,4-葡聚糖的体外方法。
人们对用于制备多糖的生物工程方法有巨大的工业兴趣，特别是通过经典的有机合成方法不容易得到的，或者克服极大困难才能得到的水不溶性α-1,4-葡聚糖。然而，由于费用的原因，迄今为止这些方法中只有少数得到商业利用。生物工程方法比经典的有机化学合成方法有优势。因而，酶催化反应通常以更高的专一性(区域专一性、立体专一性)和更高的反应速率，在温和的反应条件下进行，并获得更高的收率。这些因素在新多糖的制备中格外重要。
生物转化，换言之，通过纯化或者部分纯化的酶进行的物质体外转化，与生物工程体内方法相比，能够提供更多的优点。与体内方法相比，它们的特点是改善的可控制性和更大的可再现性，由于体外反应条件相对于活生物体中的条件可以以一种确定的方式设定。这使得制备具有高均匀性和纯度，从而具备高质量的稳定产品成为可能，这对进一步的工业利用非常重要。该稳定质量的产品的加工导致成本的降低，因为加工所需的工艺参数无需为了每个加工批次而重新优化。体外方法的进一步的优点是该产品，相对于体内的方法，本身不含生物体。在某些食品工业和制药工业应用中这是绝对必需的。为了能够在工业规模上利用水不溶性α-1,4-葡聚糖的有利性能，迫切需要廉价地提供它们。在工业规模上，迄今为止，只有水溶性α-1,4-葡聚糖，例如直链淀粉，可得到。为了制备水不溶性α-1,4-葡聚糖，迄今，在专利申请WO 95/31553和Remaud-Simon等人(Remaud-Simon,inPetersen,Svenson and Pedersen(Eds.)碳水化合物生物工程；E1sevier Science B.V.,Amsterdam,荷兰(1995),313-320页)中描述了采用来自多糖奈瑟氏菌(Neisseria polysaccharea)的淀粉蔗糖酶的一种方法。这种体外方法基于采用部分纯化的淀粉蔗糖酶的蔗糖至α-1,4-葡聚糖和果糖的转化，并在柠檬酸钠缓冲液(pH6.5)或马来酸钠缓冲液(pH6.4)中进行。下列的反应机理在WO 95/31553中假定蔗糖+(α-1,4-葡聚糖)n→果糖+(α-1,4-葡聚糖)n+1根据该反应图示，线性低聚的或聚合的α-1,4-葡聚糖充当扩链反应的接受体，该反应生成水不溶性α-1,4-葡聚糖聚合物。与WO95/31553相比，Remaud-Simon等人(上述)另外使用了0.1g/l的糖原作为一种外源的多糖接受体。与缺少外源多糖接受体的生物转化相比，该支化多糖接受体导致反应速度的提高。
迄今描述的采用淀粉蔗糖酶制备多葡聚糖的系统在缓冲水溶液中进行。并非所有这些方法能产生水不溶性α-1,4-葡聚糖。缓冲化学品的使用和确立所需缓冲条件所需要的操作时间产生可观的工艺成本，并且因此使得这些系统的商业应用更加困难。清除生物转化产品(α-1,4-葡聚糖和果糖)中残留的缓冲盐所需的纯化步骤会产生额外的成本。这些产品用于食品和药物工业时，它显得特别重要。因此，需要适于有效制备水不溶性α-1,4-葡聚糖的方法，该方法有商业利用价值，并能产生高纯度的产品。
因而，本发明的基本目的是提供一种方法，该方法适合工业上制备水不溶性α-1,4-葡聚糖，该方法也可产生高纯度的产品。
通过实施表征在专利权利要求书中的实施方案可达到该目的。
本发明因而涉及一种制备水不溶性α-1,4-葡聚糖的方法，该方法中蔗糖通过具有淀粉蔗糖酶的酶活性的酶转化成水不溶性α-1,4-葡聚糖和果糖，该方法包括在一种无缓冲剂的含水系统中实施该转化。
令人惊奇地发现，为了由得自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶体外制备水不溶性α-1,4-葡聚糖，可采用一种无缓冲剂的含水系统。可基于果糖的释放或蔗糖的消耗而测定的该方法的效率相当于缓冲系统的效率。这是令人惊奇的，因为所用酶的功能度以前仅能在缓冲溶液中检测到(MacKenzie等人，Can.J.Microbiol,23(1977),1303-1307；Okada和Hehre,J.Biol.Chem.249(1974),126-135；Tao等人，Carbohydrate Res.182(1988)，163-174；Büttcher等人，J.Bacteriol.179(1997),3324-3330；WO 95/31553)。
本发明的方法现在使得体外制备不溶性α-1,4-葡聚糖的成本的大幅减少成为可能。尤其下列可以避免与缓冲溶液的制备以及设置和如果适当的话保持pH值有关的操作步骤和仪器。本发明方法的另一个决定性的优点是提高了产品的纯度，这对于在食品部门并在食品、化妆品和药品工业中的应用特别重要。该无缓冲剂系统也提供一种优点，即所得产品不含残留的缓冲盐。因此不需要用于清除这些盐的复杂的纯化步骤，这些盐会干扰在食品和药品工业中的某些应用。这引起成本进一步的减少。除了水不溶性α-1,4-葡聚糖外，本发明的方法中也形成了果糖。它可用于廉价生产“高果糖糖浆”(HFS)。本发明的方法由于无缓冲剂的反应条件而产生高纯度的产品。不同于由玉米淀粉制备HFS的、包含通过离子交换清除缓冲盐的高费用工艺步骤的常规方法(Crabb and Mitchinson,TIBTECH 15(1997),349-352)，本发明的方法因此无需果糖复杂的纯化。
适用于本发明目的的“体外转化”是这样一种转化，换言之是一种反应，它在活生物体外进行。“体外”特别指本发明的方法发生在反应器中。
具有淀粉蔗糖酶(E.C.2.4.1.4.)的酶活性的酶指一种能催化下列反应的酶蔗糖+(α-1,4-葡聚糖)n→果糖+(α-1,4-葡聚糖)n+1可以检测淀粉蔗糖酶的酶活性，例如，如本申请实施例中描述的。
在本发明的上下文中，淀粉蔗糖酶也指一种酶，它由蔗糖和支化多糖接受体，例如糖原、支链淀粉或糊精开始，催化蔗糖和在这些多糖接受体上的α-1,4-葡聚糖直链的合成。换言之，淀粉蔗糖酶还催化α-1,4-葡聚糖链在这些支化接受体上延伸。所得的产品，与所用的支化起始材料相比，具有较低的支化度。在本发明的上下文中，这些产品也称为水不溶性α-1,4-葡聚糖。
原则上，本发明的方法中，可采用任何淀粉蔗糖酶。优选地，采用原核生物来源的淀粉蔗糖酶。已知此类型的酶是，例如，得自深黄奈瑟氏球菌(Okada和Hehre,J.Biol.Chem.249(1974),126-135；MacKenzie等人,Can.J.Microbiol.23(1977),1303-1307)或者狗奈瑟氏球菌、灰色奈瑟氏球菌、反硝化奈瑟氏球菌、干燥奈瑟氏球菌和微黄奈瑟氏球菌(MacKenzie等人,Can.J.Microbiol.24(1978),357-362)。此外，WO 95/31553描述了来自的多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶。特别优选地，采用一种由原核生物天然分泌的淀粉蔗糖酶。
在本发明方法的一项优选的实施方案中，采用一种得自奈瑟氏球菌属细菌的淀粉蔗糖酶，特别优选一种得自多糖奈瑟氏球菌种的淀粉蔗糖酶。
为了本发明的目的，水不溶性α-1,4-葡聚糖是通过上述的采用淀粉蔗糖酶的蔗糖的转化制备的多糖。采用的术语“水不溶性葡聚糖”，按照德国药典的定义(DAB=Deutsches Arzneimittelbuch,Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH,Stuttgart,Govi-Verlag GmbH,Frankfurt，第九版，1987)，归入“少量溶解”化合物、“很少量溶解”或“实质上不溶”化合物类别，特别指由上述采用淀粉蔗糖酶的蔗糖的转化制备的多糖。
为了本发明的目的，术语“无缓冲剂的系统”是一种基本不含缓冲盐的含水系统。上下文中采用的术语“缓冲盐”指无机和有机盐，特别是弱酸和碱的盐。上下文中采用的术语“基本不”指缓冲盐的最大浓度为25mM，在优选的实施方案中最大浓度是10mM，在进一步优选的实施方案中最大浓度是5mM，在特别优选的实施方案中最大浓度是1mM。
在本发明方法的一个进一步特别优选的实施方案中，采用一种仅含有作为杂质的痕量(＜1mM)无机和有机盐的含水系统。非常特别优选的无缓冲剂含水系统是纯水。
在本发明方法的一个特别优选的实施方案中，采用一种纯化的淀粉蔗糖酶。这里采用的术语“纯化的淀粉蔗糖酶”指一种基本上不含合成蛋白质的细胞的细胞组分的酶。优选地，术语“纯化的淀粉蔗糖酶”指一种纯度至少为80％，优选至少为90％，特别优选至少为95％的淀粉蔗糖酶。
采用纯化的蛋白质制备α-1,4-葡聚糖提供了种种优点。与采用部分纯化的蛋白质提取物进行操作的方法相比，本发明方法的反应介质不含有生产菌株(微生物)的残留物，这种菌株用于纯化或生物工程生产蛋白质。
此外，通过采用纯化的蛋白质，从食品和药品工业的应用上可看出它们的优点。由于确定的反应介质组成，它不含一切不需要的组分，产品的组分也更加明确。这导致适于食品和药品工业中通过生物工程制备的这些产品的认可程序显著地减少，特别由于这些产品应该不含痕量的转基因微生物。
在本发明的一项优选的实施方案中，淀粉蔗糖酶是一种以重组体的形式生产的蛋白质。在本发明的上下文中，它指这样一种蛋白质，该蛋白质通过将编码该蛋白质的DNA序列引入宿主细胞中并在那里表达而制备。然后该蛋白质自宿主细胞和/或从培养基中分离。这种情况下宿主细胞优选细菌或原生生物(例如真菌，特别是酵母，藻类)，例如Schlegel“Allgemeine Mikrobiologie”[普通微生物学](GeorgThieme Verlag,1985,1-2)中定义的。特别优选地，由宿主细胞分泌该淀粉蔗糖酶。此类型的适于重组淀粉蔗糖酶的生产的宿主细胞可以通过本领域熟练技术人员公知的方法制备。
可找到对各种表达系统的综述，例如，酶学方法153(1987),385-516和Bitter等人的方法(酶学方法153(1987),516-544)。在该文献中很大程度上描述了表达载体。除选择标记基因和确保在选择的宿主中复制的复制起点之外，它们通常包含细菌或病毒启动子，还往往包含转录终止信号。使至少一个限制位点或允许编码的DNA序列插入的多接头处于启动子和终止信号之间。采用的启动子序列，如果它在选择的宿主生物中有活性，可以是天然控制相应基因转录的DNA序列。然而，该序列也可被其它的启动子序列代替。可以采用引起基因组成型表达的启动子，或者可以采用允许专一性调节随后基因表达的诱导型启动子。文献中广泛描述了具有这些性能的细菌和病毒启动子序列。文献中也充分描述了用于微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母)中的表达的调节序列。允许随后的基因特别高的表达的启动子是，例如，T7启动子(Studier等人，Methods in Enzymology 185(1990),60-89)、lacuv5、trp、trp-1ac UV5(DeBoer等人，Rodriguez和Chamberlin(Eds)，启动子，结构和功能；Praeger，纽约，(1982),462-481；DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983),21-25)、1p1、rac(Boros等人，Gene 42(1986),97-100)。通常，蛋白质的量自中期至微生物生长循环的对数生长期结束到达它们的最大量。因此，为了蛋白质的合成，优选采用诱导型启动子。这些常常导致蛋白质收率高于组成型启动子。强组成型启动子的使用往往经克隆基因的恒定转录和翻译而导致用于其它必需的细胞功能的能量丧失，因而延迟细胞的生长(Bernard R.Glick/Jack J.Pasternak,MolekulareBiotechnologie(1995),Spektrum Akademischer Verlag GmbH,Heidelberg Berlin Oxford,342页)。因此，为了达到蛋白质的一种优选的量，通常采用两步法。首先，在最适宜的条件下，培养宿主细胞至一相对高的细胞密度。第二步，然后诱导取决于采用启动子类型的转录。上下文中一种特别适合的启动子是tac启动子(DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983),21-25)，它可以通过乳糖或IPTG(=异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导。文献中也描述了用于转录的终止信号。
宿主细胞通常可通过标准的方法采用编码淀粉蔗糖酶的DNA转化，例如，如Sambrook等人所述(分子克隆实验室教程手册，第二版(1989),Cold Spring Harbor Press，纽约)。在符合各自采用的宿主细胞需要的营养培养基中培养宿主细胞，特别要考虑pH、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、微量元素等。
由宿主细胞制备的酶可通过常规的纯化方法纯化，例如沉淀、离子交换色谱法、亲和色谱法、凝胶过滤、反相HPLC等。
通过修饰在宿主细胞表达并且编码淀粉蔗糖酶的DNA，在宿主细胞中可制备一种多肽，由于一定性能，它能够从培养基中更容易地分离。因而，有可能表达这种被表达为一种具有另一多肽序列的融合蛋白的蛋白质，该多肽序列的特异性结合性能使该融合蛋白能够经亲和色谱法分离(例如，Hopp等人，Bio/Technology 6(1988),1204-1210；Sassenfeld,Trends Biotechnol.8(1990),88-93)。
在本发明方法的一项优选的实施方案中，采用一种淀粉蔗糖酶，它作为一种重组体生产，并由宿主细胞分泌到营养培养基中，由于分泌出的蛋白质可以从上清液分离，以致无需细胞消化和蛋白质进一步的纯化。为了去除培养基中残留的成分，可以采用工艺过程中常规的方法，例如透析、反渗透、色谱方法等。这也适用于浓缩分泌到培养基中的蛋白质。通过微生物的蛋白质的分泌通常由氨基末端信号肽(信号序列、前导肽)介导。具有此信号序列的蛋白质可渗透过该微生物的细胞膜。通过DNA序列可获得蛋白质的分泌，该序列编码该信号肽、与相应的淀粉蔗糖酶-编码区连接。优选地，该信号肽是表达的淀粉蔗糖酶的天然信号肽，特别优选来自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶的那些。
非常特别优选地，该信号肽是来自产酸克雷伯氏菌M5A1的α-CGTase的信号肽(Fiedler等人，J.Mol.Biol.256(1996)，279-291)或者是这样一种信号肽，它由在GenBank中可按入藏号X864014获得的序列的核苷酸11529-11618所编码。
可以选择地，本发明的方法中使用的淀粉蔗糖酶也可采用一种体外转录和翻译系统生产，这种系统能引起蛋白质的表达，无需使用微生物。
在本发明的方法的一项优选的实施方案中，将一种外部的糖类接受体加入淀粉蔗糖酶催化的蔗糖转化中。为了本发明的目的，外部的糖类接受体是一种可提高淀粉蔗糖酶催化的蔗糖转化初始速率的分子。优选地，该外部糖类接受体在转化的开始加入到反应混合物中。外部接受体的使用导致处理时间的减少，因而减少了本方法的成本。糖类接受体优选是一种寡糖或多糖，优选一种线型多糖，并且特别优选一种支化多糖，例如，糊精、糖原或支链淀粉。如果α-1,4-葡聚糖链延伸发生在这些接受体上，与支化的起始材料比较，制备的产品具有相当低的支化度。这种情况下，支化度降低的程度取决于聚合程度n。与接受体相比，如果采用的蔗糖摩尔数大为过量，在产品中不再能通过甲基化分析检测到α-1,6分枝(支化度＜1％)。本发明的上下文中这些产品也称为水不溶性α-1,4-葡聚糖。
在一项优选的实施方案中，具有淀粉蔗糖酶的酶活性的酶被固定在载体材料上。淀粉蔗糖酶的固定提供了这样的优点，作为合成反应催化剂的酶，可以从反应混合物中以一种简单的方式回收并重复使用。由于酶的纯化通常是高费用和耗时的，酶的固定化和重新使用使得节约大量费用成为可能。进一步的优点是反应产物的纯度，该产物不含蛋白质残留物。
可以获得多种适用于蛋白质固定化的载体，通过共价键或非共价键能够发生与载体的偶合(可参见综述Methods in Enzymology 135、136、137)。广泛用做载体材料的材料是，例如，琼脂糖、藻酸盐、纤维素、聚丙烯酰胺、二氧化硅或尼龙。
图1显示了一种通过多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶、采用不同的缓冲盐浓度体外制备水不溶性α-1,4-葡聚糖的效率比较。基于蔗糖量的减少测定该方法的效率。
下列实施例阐述了本发明。
实施例1淀粉蔗糖酶的纯化为了制备一种淀粉蔗糖酶，采用大肠杆菌细胞，该细胞已用得自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶转化(参见WO 9531553)。这种DNA来源于多糖奈瑟氏球菌基因组文库。
将这些大肠杆菌细胞的隔夜培养物(它们分泌来自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶)离心并再悬浮在大约1/20体积的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.5)、10mM DTT(二硫苏糖醇)、1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)中。然后采用弗氏压碎器以16000psi将这些细胞破碎两次。然后将1mM的MgCl2和Benzonase(购自Merk；100000单位；250单位μl-1)以12.5单位ml-1的最终浓度加入到细胞提取物中。然后将该溶液在37℃培养至少30分钟，并轻微搅拌。该提取物置于冰上至少1.5小时。然后将该提取物在4℃以大约40000g离心30分钟，直到上清液相对澄清。进行孔径为0.45μm的PVDF膜(微孔“Durapore”，或者类似物)预过滤。4℃该提取物放置过夜。在进行疏水性相互作用(HI)色谱法之前，将固体NaCl加入到提取物中，并得到2M NaCl浓度。接着将该提取物在4℃以大约40000mg再离心30分钟。然后通过以一种孔径为0.22μm的PVDF膜(微孔“Durapore”，或者类似物)过滤，将该提取物从最终的大肠杆菌残留物中分离出来。将这种滤过后的提取物在丁基琼脂糖凝胶-4B柱(Pharmacia)(柱体积93ml，长度17.5cm)上分离。大约50ml的具有1至5单位μl-1淀粉蔗糖酶活性的提取物加至柱上。然后以150ml的缓冲剂B(缓冲剂B50mM柠檬酸钠，pH6.5,2M NaCl)从柱上洗涤未结合的蛋白质。该淀粉蔗糖酶最终采用下降的线性NaCl梯度洗脱(433ml 50mM柠檬酸钠中NaCl浓度为2M至OM，流入速度1.5ml min-1)，该梯度是采用一种自动泵系统(FPLC,Pharmacia)产生的。在0.7M和0.1M NaCl之间洗脱出淀粉蔗糖酶。收集这些级分，经PD10 Sephadex柱(Pharmacia)脱盐，以8.7％的甘油稳定，测试淀粉蔗糖酶活性并最后冷冻于存贮缓冲液(8.7％甘油，50mM柠檬酸盐)。
实施例2淀粉蔗糖酶活性的测定
37℃下在含有5％蔗糖、0.1％糖原和100mM柠檬酸盐pH6.5的1ml批料中，培养各种稀释度的纯化蛋白质或蛋白质粗提物。5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟和30分钟后，从这些溶液中每一个均取出10μl，通过立即加热至95℃灭失淀粉蔗糖酶的酶活性。在偶合的光度测定试验中，检测由淀粉蔗糖酶释放的果糖的含量。为此，将1μl至10μl的灭活的样品加入至1ml的50mM咪唑缓冲液pH6.9、2mMMgCl2、1mM ATP、0.4mM NAD和0.5 U/ml的己糖激酶中。按顺序添加葡糖-6-磷酸脱氢酶(来自肠膜明串珠菌)和葡糖磷酸异构酶之后，检测到在340nm的吸收的变化。然后，根据Lamber-Beer定律，计算释放的果糖的量。
如果获得的值与取样时间有关，可以测定单位数(1U=μmol果糖/分钟)(每μl的蛋白质提取物或每μg的纯化蛋白质)。
实施例3与缓冲系统相比，无缓冲剂系统中的反应溶液体积 50ml酶活性 5单位/ml缓冲剂 pH6.5的醋酸钠，在0mM(=水)和200mM之间变动(Merck)底物 10％蔗糖(ICN)引物 0.1％糊精，Ⅳ型马铃薯(sigma)程序各为50ml反应体积的含有10％蔗糖、0.1％糊精、250单位的淀粉蔗糖酶和不同浓度的反应缓冲剂(25mM、50mM、100mM或200mM醋酸钠，pH6.5)的溶液，于37℃下培养46小时和73.25小时。此外，配制一种不含缓冲剂的反应混合物，换言之，在软化水(pH7.0)中配制。除了缓冲物质之外，该反应溶液含有上述所有组分。
为测定蔗糖至直链淀粉和果糖的转化，自这六个反应溶液中在不同的时间点各取出1ml等分试样。通过加热至90℃达10分钟，停止取出的样品中的反应。通过采用光度计内偶合酶试验，检测生成的果糖或者检测仍存在于灭活样品中蔗糖的浓度而测定转化速率。酶测定测定体积 1ml酶得自酵母的己糖激酶、得自肠膜明串珠菌的葡糖磷酸异构酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、得自酵母的β-果糖苷酶(所有的酶Boehringer Mannheim)测定缓冲剂1mM ATP0.4mM NAD+50mM咪唑pH6.9该试验基于采用己糖激酶和葡糖磷酸异构酶的果糖至葡糖-6-磷酸的转化。葡糖-6-磷酸然后由葡糖-6-磷酸脱氢酶转化成6-磷酸葡糖酸。该反应与NAD+至NADH+H+的转化相关，它可以在340nm波长下光度法测量。根据Lamber-Beer定律，由所得的吸收度可计算出果糖的量。
为了测定蔗糖的浓度，除了上述的反应混合物之外，向待测样品中加入β-果糖苷酶。这种酶将蔗糖分解成果糖和葡萄糖。然后如上所述，采用NAD+至NADH+H+的转化，测量从该反应中得到的这两种单糖的浓度。由测定的总的单糖的量可以计算出蔗糖的浓度。
结果大约73小时后，在所有反应条件下，存在于反应溶液中的蔗糖已经近似100％的转化成直链淀粉和果糖。
权利要求
1．一种制备水不溶性α-1,4-葡聚糖的方法，其中蔗糖通过具有淀粉蔗糖酶的酶活性的酶，体外转化成水不溶性α-1,4-葡聚糖和果糖，这种方法包括在无缓冲剂的含水系统中进行该反应。
2．权利要求1的方法，其中淀粉蔗糖酶是一种来自原核生物的酶。
3．权利要求2的方法，其中的原核生物属于奈瑟氏球菌属。
4．权利要求3的方法，其中的原核生物是多糖奈瑟氏球菌。
5．权利要求1至4中任一项的方法，其中的淀粉蔗糖酶以重组体的形式制备。
6．权利要求1至5中任一项的方法，其中采用纯化的淀粉蔗糖酶。
7．权利要求1至6中任一项的方法，其中淀粉蔗糖酶与载体材料结合。
8．权利要求1至7中任一项的方法，其中加入外部糖类接受体。
全文摘要
描述了一种制备水不溶性α－1,4－葡聚糖的体外方法,其中蔗糖在采用淀粉蔗糖酶的无缓冲剂系统中反应。
文档编号C12P19/18GK1306581SQ99807620
公开日2001年8月1日 申请日期1999年6月17日 优先权日1998年6月24日
发明者M·曲安兹, N·普瓦特, R·巴纳斯阿克 申请人:阿克西瓦有限公司