专利名称：丙酸杆菌载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及丙酸杆菌属(Propionibacterium)的一种内源质粒，由其衍生的载体，和这些载体在细胞特别是丙酸杆菌中表达(异源)蛋白质的应用。被转化的细菌尤其能用来通过发酵生产维生素B12或用于干酪制造。
引言丙酸杆菌是能在多种工业方法中生产多种有用化合物的革兰氏阳性菌。例如，已知几种丙酸杆菌属的菌种能在大规模发酵过程中产生维生素B12(钴胺素)。其它菌种用于乳制品用途，如干酪制造，它们促成了干酪的特殊香味和质地，在许多情况下甚至是其主要原因。据认为许多丙酸杆菌属的菌种作为活生物掺入食物和动物饲料中是安全的。
为了能够充分开发丙酸杆菌属的生物工艺潜力，需要有效且灵活的遗传工程技术。这些技术依赖于合适质粒的可得性，以在丙酸杆菌中由异源基因表达蛋白质。
EP-A-0400931(Nippon Oil)涉及一种来源于戊糖丙酸杆菌(Propionibacterium pentosaceum)(ATCC4875)的内源质粒(pTY-1)，但未描述其序列，也未说明如何用它来表达异源基因。
JP 08-56673涉及质粒pTY-1用于生产维生素B12，但未提供关于该质粒作为一种自由复制的染色体外元件或该质粒在被转化细胞内稳定的任何证据。
因此本发明试图提供比现有技术中的那些载体更有效并能保留于染色体外和成稳定的载体。特别是本发明旨在提供一种有效的载体，用于丙酸杆菌或外源基因组片段或基因向(丙酸杆菌)宿主菌株中的克隆或表达。由此可绕开宿主特异性限制酶，从而避免宿主以外源多核苷酸处理该质粒。
发明概述因此，本发明在第一方面提供了一种多核苷酸，其包含一种能与下列序列选择性杂交的序列(a)SEQ ID NO:1或其互补序列；(b)费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)CBS 101022的3.6kb质粒的序列；(c)费氏丙酸杆菌CBS 101023的3.6kb质粒的序列；或(d)一种编码本发明的多肽的序列，如SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的(至少一部分)氨基酸序列，或其互补序列。
SEQ ID NO:1显示了发明者已发现的丙酸杆菌LMG 16545的内源质粒的DNA序列。第一种编码序列从核苷酸273到核苷酸1184，该编码序列的预测氨基酸序列示于SEQ ID NO:2中。第二种编码序列从核苷酸1181到核苷酸1483，该编码序列的预测氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中。
发明者筛查了大量丙酸杆菌分离株，并鉴定了两种均携带3.6kb大小的隐蔽性质粒的菌株。一种菌株是费氏丙酸杆菌LMG 16545，其根据布达佩斯条约的条款于1998年6月19日保藏于真菌菌种保藏中心(CBS)，Oosterstraat 1,Postbus 273,NL-3740 AG Baarn，荷兰，保藏者为Gist-brocades B.V.,Wateringseweg 1，邮政信箱1,2600 MA delft，荷兰，保藏号为CBS 101022。另一种菌株为费氏丙酸杆菌LMG 16546，也由同一保藏者根据布达佩斯条约的条款于1998年6月19日保藏于CBS，保藏号为CBS 101023。
通过对LMG 16545的核苷酸序列的全面表征和计算机辅助分析，发明者已能鉴定用于外源DNA片段插入的位点。这些位点使得能构建在丙酸杆菌中仍能自主复制的质粒。
令人惊讶地发现，放线菌红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)的红霉素抗性基因可在丙酸杆菌中高效表达，因此能用作被转化细胞的选择性标记。
也构建了在大肠杆菌和丙酸杆菌属中都可稳定保持且可选择的双功能载体。这使得大肠杆菌可用于载体构建，以及同源或异源基因在丙酸杆菌中的功能性表达。应用大肠杆菌的载体构建比较容易，且能快速完成。
本发明的多核苷酸可在细菌如丙酸杆菌属中自主复制或处于染色体外。
因此另一方面，本发明提供一种包含本发明的多核苷酸的载体。
本发明也提供一种制备多肽的方法，该方法包括在可表达该多肽的条件下培养一种用本发明的载体转化或转染的宿主细胞。
本发明还提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:2或3所示的序列，或与该序列基本同源的序列，或其中任一序列的片段，或提供本发明的多核苷酸所编码的蛋白质。发明详述多核苷酸本发明的多核苷酸能选择性地杂交SEQ ID NO:1的序列，或能选择性地与SEO ID NO:1的一部分杂交，或能选择性地与同该序列或序列的一部分互补的序列杂交。本发明的多核苷酸能选择性地杂交费氏丙酸杆菌CBS 101022或CBS 101023的3.6kb质粒的序列，或能选择性地与其中任一质粒的一部分序列杂交。通常，本发明的多核苷酸是一种连续的核苷酸序列，它能选择性地杂交SEQ ID NO:1或任一3.6kb质粒的序列，或能选择性地与其中任一序列的一部分杂交，或能选择性地与同这些序列或任一序列部分的互补序列杂交。
本发明的多核苷酸和SEQ 1D NO:1的序列，或任一3.6kb质粒，或编码一种多肽的序列，或这些序列的一部分，能以明显高于背景的水平杂交。例如，可由于制品中存在其它多核苷酸而发生背景杂交。本发明的多核苷酸与SEQ ID NO:1或任一3.6kb质粒的序列或这些序列的部分之间相互作用所产生的信号水平，比其它多核苷酸与SEQ ID NO:1或任一3.6kb质粒的编码序列或编码多肽的序列或这些序列的部分之间的相互作用一般至少强10倍，优选地至少100倍。例如，可通过用如32P放射性标记探针测定相互作用的强度。选择性杂交一般用中度严格(例如0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，大约50℃)到高度严格(相同条件，但在大约60℃)条件实现。
本发明包括的多核苷酸在至少20个，优选地至少30个，例如至少40、60或100个或更多连续核苷酸的区域内与(序列(a)-(d))一般能至少70％同源，优选地至少80％或90％，更优选地至少95％，最佳地98％同源。
上述同源性程度与最小大小的任一组合可用来限定本发明的多核苷酸，优选更严格的组合(即在更长长度上的更高同源性)。因此，例如，在25个，优选地超过30个核苷酸上至少80％或90％同源的多核苷酸构成本发明的一个实施方案，在40个核苷酸上至少90％或95％同源的多核苷酸也构成一个实施方案。
以上提及的部分可以是SEQ ID NO:1或任一3.6kb质粒的编码序列。其它优选的SEQ ID NO:1部分包括复制起点，启动子或调节序列，或能实现或辅助在宿主细胞如丙酸杆菌中自主复制的序列。
已经发现，质粒从限制位点SalⅠ到AlwNⅠ的部分似乎是质粒复制所需的区域。曾经缺失质粒的其它部分，但复制似乎未受不利影响。因此在本发明中，序列(b)和(c)可以是限制位点SalⅠ和AlwNⅠ所示的区域。其长度接近1.7kb。此外，序列(b)或(c)可被替换为对应于SEQID NO:1的核苷酸1-1800，如100-1700，合适地150-1500，有利地200-1300，最佳地250-1200的序列。
可认为分别由ORF1和ORF2编码的蛋白质(SEQ ID NO:2和3)均有助于质粒复制。质粒经已知的滚环复制法复制，其中以内链为模板辅助产生一个外链拷贝的蛋白质切割原始dsDNA质粒处。去除外环拷贝，连接末端。宿主然后用产生的外环作为模板复制一个新的内环。
本发明的编码序列可经核苷酸置换如1、2或3到10、25、50或100个置换的修饰。序列(a)-(d)的多核苷酸可替换地或另外可经一种或多种插入或缺失和成在一端或两端延伸而修饰。如以下关于本发明的多肽所述，当被修饰序列翻译时，可进行简并置换，和/或可进行将导致保守氨基酸置换的置换。
本发明的多核苷酸可包括DNA或RNA。它们也可以是其中包含合成的或修饰的核苷酸的多核苷酸。本领域中已知许多不同类型的多核苷酸修饰。包括膦酸甲基酯和硫代磷酸酯主链，吖啶或聚赖氨酸链在分子3’和/或5’端的添加。对于本发明，可以理解，此处所述的多核苷酸可用本领域中可用的任何方法修饰。可进行这些修饰来提高体内活性或寿命。
本发明的多核苷酸可用作引物，例如PCR(聚合酶链反应)引物，另一种扩增反应的引物，探针，如通过使用放射性或非放射性标记的常规方法用显示性标记物标记的探针，或者可将多核苷酸掺入或克隆到载体中。
这些引物、探针和其它片段的长度至少为15个，优选地至少20个，例如至少25、30或40个核苷酸。其长度一般可达40、50、60、70、100或150个核苷酸。探针和片段可比150个核苷酸更长，如长度可达200、300、500、1000或1500个核苷酸，甚至是序列(a)-(d)中任一个中短数个核苷酸，如5个或10个核苷酸的序列。
根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和引物可重组产生、合成或经本领域技术人员可用的任何方法产生。也可用标准技术克隆。多核苷酸一般为分离的和/或纯化的形式。
通常用合成法产生引物，包括每次一个核苷酸地逐步产生希望的核酸序列。用自动化的技术实现这一点的技术在本领域中可轻易获得。
更长的多核苷酸一般用重组方法如用PCR克隆技术产生。包括制备一对针对SEQ ID NO:1或欲克隆的任一3.6kb质粒的区域的引物(例如大约15-30个核苷酸)，使该引物与从丙酸杆菌中获得的DNA接触，在可引起希望区域扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增的片段(例如通过用琼脂糖凝胶纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。可将引物设计为含有适当的限制酶识别位点，使得扩增的DNA能被克隆到一种合适的克隆载体中。这些技术可用来获得全部或部分的SEQ ID NO:1或任一3.6kb质粒。
此处提及的技术在本领域中众所周知10。
与SEQ ID NO:1或任一3.6kb质粒不是100％同源但属于本发明范围的多核苷酸能用多种方法获得。
例如，通过探查基因组DNA文库可获得SEQ ID NO:1或任一3.6kb质粒的同源多核苷酸，该基因组DNA文库由多种丙酸杆菌制备，如费氏丙酸杆菌、詹氏丙酸杆菌(P.jensenii)、特氏丙酸杆菌(P.thoenii)、产丙酸丙酸杆菌(P.acidipropionici)，或放线菌纲的其它菌株，或其它革兰氏阳性菌，或富含G:C的菌株。所有这些生物都是可用于本发明的同源或异源基因、启动子、增强子或宿主细胞的合适来源。
这些同源物及其片段通常能选择性杂交SEQ ID NO:1或其互补序列或任一3.6kb质粒的编码序列。在中度到高度严格条件下(例如0.03M氯化钠和0.3M柠檬酸钠，大约50-60℃)，用包含SEQ ID NO:1或任一3.6kb质粒的所有或部分编码序列的探针探查丙酸杆菌基因组DNA文库，可获得这些序列。
用简并PCR也能获得同源物，该方法使用针对同源物内保守序列设计的引物。将SEQ ID NO:1或任一3.6kb质粒的序列与其同源物序列对比，能预测保守序列。这些引物可包含一个或多个简并位点，并可在低于用针对已知序列的单序列引物克隆序列的严格条件时使用。
此外，也可经SEQ ID NO:1或任一3.6kb质粒或其同源物的定点诱变获得这些多核苷酸。例如，当为将表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优选密码子偏好性而需要序列的沉默密码子改变时，这可能是有用的。为了引入限制酶识别位点或改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能，其它序列改变也可能是希望的。
测定多核苷酸同源性的方法在本领域中众所周知。例如，UWGCG程序包提供了能用例如其缺省设置计算同源性的BESTFIT程序7。对于与下面所述本发明的多肽有关的氨基酸同源性，人们可使用BLAST(基本局部对比搜索工具1)，其可进行氨基酸序列(必要时核苷酸序列)的对比，来测定序列相似性。因此能用BLAST确定真实配对或鉴定同源物，特别可用于那些不合缺口(gap)的配对。BLAST技术使用基于高评分片段对(HSP)的算法。
本发明包括包含本发明的多核苷酸序列及其互补序列的双链多核苷酸。
本发明的多核苷酸(例如探针或引物)可带有一种显示性标记。合适的标记包括放射性同位素如32P或35S、酶标记或其它蛋白质标记如生物素。对这些标记的检测技术原本已知。
(标记的或未标记的)多核苷酸可在基于核酸的试验中用于检测样品中的本发明的另一种多核苷酸或测序。
本发明的多核苷酸包括SEQ ID NO:1或任一3.6kb质粒的序列变体，它们能在宿主细胞中自主复制或保持于染色体外。这些变体可稳定于细菌如丙酸杆菌中。
多核苷酸通常包含SEQ ID NO:1或任一3.6kb质粒的复制起点和/或编码区，或这些序列的同源物。在宿主细胞如丙酸杆菌或大肠杆菌中稳定的本发明的多核苷酸是在5代如15代优选地30代之内不从宿主中丢失的多核苷酸。每一代两个子细胞一般都遗传这种多核苷酸。
多核苷酸可包含一种启动子或复制起点(例如编码一种复制蛋白的任何序列的上游)。
例如通过适当的方法能将本发明的多核苷酸转化或转染到细菌如丙酸杆菌或大肠杆菌中11。它可以以5-500如10-100的拷贝数存在于细菌中。
多核苷酸能在除丙酸杆菌之外的细菌中自主复制。这样的细菌可以是大肠杆菌，或革兰氏阳性菌或富含G:C的细菌或放线菌纲的细菌之一。这种多核苷酸通常包含能使该多核苷酸在细菌中自主复制的序列。这些序列可能来源于能在该细菌中复制的质粒。
本发明的多核苷酸可以是在丙酸杆菌中复制产生的多核苷酸。此外，也可以在另一种细菌如大肠杆菌中复制产生。该多核苷酸能避开丙酸杆菌的宿主限制系统。载体本发明的第二方面涉及含有第一方面的多核苷酸的载体。该载体能在宿主细胞中复制，如一种细菌，如放线菌，如丙酸杆菌或大肠杆菌。该载体可以是一种线性多核苷酸，或者更常见地是一种环形多核苷酸。该载体可以是本发明的多核苷酸与另一种载体的杂合体。其它载体可以是大肠杆菌载体，如pBR322，或pUC家族的载体，R1、ColD或RSF 1010或由其衍生的载体。
本发明的多核苷酸或载体可以是一种质粒。这种质粒可具有与图1、2a或2b所示限制图谱相同或基本相似的限制图谱。
多核苷酸或载体可具有1kb-20kb如2-10kb最佳地3-7kb的大小。
多核苷酸或载体可含有多个功能性克隆位点。这些克隆位点一般包含限制酶的识别序列。多核苷酸或载体可包含SEQ ID NO:1所示的序列，和/或含有EcoRⅠ、SacⅠ、AlwN1、BsmⅠ、BsaBⅠ、BclⅠ、ApaⅠ、HindⅢ、SalⅠ、HpaⅠ、PstⅠ、SphⅠ、BamHⅠ、Acc65Ⅰ、EcoRⅤ和BgⅢ的限制酶识别位点。多核苷酸或载体于是可包含一个、超过一个或全部这些限制酶位点，通常为图中所示的顺序。
优选地，当存在于细菌如丙酸杆菌或大肠杆菌中时，本发明的多核苷酸或载体不整合到细菌染色体中。多核苷酸或载体在5代优选地20或30代之内一般不整合。
多核苷酸或载体可以是一种能保持于宿主细胞染色体外的自主复制的质粒，该质粒来源于一种内源丙酸杆菌质粒，当含有外源基因(对宿主而言)时，能在宿主细胞内表达该基因。术语“来源于”意思是自主复制质粒包括一种与本发明的多核苷酸相同的序列。
本发明的载体可包含一种选择性标记。选择性标记可以是提供抗生素抗性的基因，如氨苄青霉素、卡那霉素或四环素抗性基因。选择性标记可以是红霉素抗性基因。红霉素抗性基因可来源于放线菌，如红色糖多孢菌，例如来源于红色糖多孢菌NRRL2338。可存在于载体中的其它选择性标记包括提供氯霉素、硫链丝菌肽、紫霉素、新霉素、阿泊拉霉素、潮霉素、博来霉素或链霉素抗性的基因。
载体可以是一种表达载体，因此可含有一种异源基因(不天然存在于宿主细胞如丙酸杆菌中)，或宿主细胞(如丙酸杆菌)的内源或同源基因。在表达载体中，欲表达的基因通常与能引起宿主细胞中该基因表达的控制序列有效连接。
术语“有效连接”是指并列，其中所述组分的关系使它们以预期的方式起作用。以这样的方式连接与编码序列“有效连接”的控制序列，以在适合控制序列的条件下实现编码序列的表达。
可将异源或内源基因插入SEQ ID NO:1的核苷酸1-200或核苷酸1500-3555之间，或同源多核苷酸中的相当位置处。
这些基因可括同源或内源基因，如延伸因子、启动子调节序列或元件和复制蛋白。其它基因(对于宿主可能是异源的)包括那些编码或参与生产营养因子、免疫调节剂、激素、蛋白质和酶(如蛋白酶、淀粉酶、肽酶、脂肪酶)、结构改进剂、调味剂(例如双乙酰、丙酮)、基因簇、抗微生物剂(如乳链菌肽)、用于食品(如香肠、干酪)的物质、代谢酶、维生素(如B12)、尿卟啉原(Ⅲ)甲基转移酶(UP Ⅲ MT)、cobA、抗原和(例如用于疫苗)治疗剂的基因。可以看出，宿主能产生多种物质，不只是多肽，它们可以是希望的产物或可用来产生希望的产物。
异源基因可对人或动物有治疗作用。这种基因可包含例如来源于致病生物的抗原。包含含这种异源基因的多核苷酸的宿主如丙酸杆菌可用作或用于疫苗，并可提供针对病原体的保护。
异源抗原可以是一种完全蛋白质或含有一种表位的部分蛋白质。抗原可来源于细菌、病毒、酵母或真菌。宿主细胞与表达宿主细胞构成了本发明的第三方面，其包含第一或第二方面的多核苷酸或载体。宿主细胞可以是如放线菌纲的细菌。细菌可以是丙酸杆菌或大肠杆菌。丙酸杆菌可以是费氏丙酸杆菌、詹氏丙酸杆菌、特氏丙酸杆菌或产丙酸丙酸杆菌。
本发明的第四方面提供了一种生产第三方面的宿主细胞的方法，该方法包括例如用公知的转化技术11用第一或第二方面的多核苷酸或载体转化或转染宿主细胞。
本发明的第五方面提供了一种制备多肽的方法，该多肽由本发明的宿主细胞中存在的本发明的多核苷酸或载体编码，该方法包括将宿主细胞置于或培养于该多肽可表达的条件下。
因此本发明此方面提供了一种制备特定基因编码的多肽的方法，该方法包括在可引起该多肽表达的条件下培养一种用含有该基因的表达载体转化或转染的宿主细胞，并任选地回收表达的多肽。宿主细胞可属于放线菌纲，或是革兰氏阳性菌如丙酸杆菌或大肠杆菌。
多核苷酸或载体中存在的启动子、翻译起始物、翻译终止子、延伸因子基因、核糖体RNA、抗生素抗性基因、合成启动子(例如针对共有序列设计的)及其它表达调节信号可以是适于在宿主细胞中表达的那些。这样的启动子包括宿主细胞内源基因的启动子。
培养条件可以是需氧或厌氧条件，这取决于宿主。对于发酵法，宿主细胞可置于厌氧条件中然后可能是需氧条件。然后例如从宿主细胞或发酵培养基中回收产生的化合物如表达的多肽。表达的多肽可由宿主细胞分泌。此外，多肽也可不由宿主细胞分泌。在这种情况中，多肽可在宿主细胞表面表达。例如，如果多肽包含在人或动物中希望对其产生免疫应答的一种抗原，则这样的表达是希望的。
可存在于本发明的载体中的同源基因可以是cobA。因此含有该载体的宿主细胞能由一种底物产生一种化合物如维生素B12，或者该化合物可以是一种酶的产物。本发明特别提供了一种制备维生素B12的方法，包括在可表达UP(Ⅲ)MT基因的条件下培养或发酵这种宿主细胞。表达的酶能在底物被转化为维生素B12的条件下与适当底物接触。这可导致维生素B12产量的提高。治疗如上所述，本发明的多核苷酸可包含一种是治疗基因的异源基因。因此本发明包括一种含有本发明的载体的宿主细胞，该载体含有一种用于治疗人体或动物身体的方法的治疗基因。这种宿主细胞可以是丙酸杆菌。宿主细胞可以是活的或死的。
通过与一种药学可接受的载体或释稀剂混合能配制宿主细胞用于临床施用。例如，能用于局部、肠胃外、静脉内、肌内、皮下、经口或穿皮施用。宿主细胞可与药学可接受的并适用于希望的施用途径的任一载体混合。药学可接受的注射用载体或释稀剂可以是，例如无菌或等渗溶液，如注射用水或生理盐水。
宿主细胞的剂量可根据多种参数调节，特别是根据所用宿主细胞的类型，欲治疗的患者的年龄、体重和病情；所用的施用模式；欲治疗的疾病；和需要的临床方案。通常，例如口服施用的宿主细胞的数量为70kg成人每次107-1011个宿主细胞。
此处所述的施用途径和剂量只是作为指导，因为技术人员能容易地确定任何特定患者和疾病的最佳施用途径和剂量。多肽本发明的第六方面提供一种本发明的多肽，其包含SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列，或基本上同源的序列，或这些序列中任一个的片段的氨基酸序列之一。该多肽可以是由第一方面的多核苷酸编码的多肽。通常优选SEQ ID NO:2或3所示的天然存在的氨基酸序列。然而，本发明的多肽包括天然序列的同源物，和天然序列的片段及其同源物，它们具有天然存在的多肽的活性。一种这样的活性可实现本发明的多核苷酸的复制。本发明的多肽特别可包括(a)SEQ ID NO:2或3的蛋白质；或(b)其同源物，来源于放线菌，如费氏丙酸杆菌或其它丙酸杆菌菌株；或(c)一种与(a)或(b)至少70％同源的蛋白质。
一种同源物可天然存在于丙酸杆菌中，并可以以与SEQ ID NO:2或3的多肽基本类似的方式起作用。这类同源物可存在于放线菌或革兰氏阳性菌中。
一种与SEQ ID NO:2或3的蛋白质至少70％同源的蛋白质或其同源物在至少20个优选地至少30个如至少40、60或100个或更多连续氨基酸的区域中与之优选地至少80％同源，或90％更优选地至少95％、97％或99％同源。测定蛋白质同源性的方法在本领域中众所周知，本领域的技术人员根据本说明书应当理解，以氨基酸同一性(有时称作“硬同源性”)为基础计算同源性。
因此能修饰SEQ ID NO:2和3的蛋白质及同源物的序列，产生本发明的其它多肽。
可进行氨基酸置换，例如从1、2或3个到10、20或30个氨基酸的置换。修饰的多肽通常保留其天然活性。例如可根据下表进行保守置换。第二列同一格中的氨基酸，优选地第三列中同一行中的氨基酸可以互相替换
本发明的多肽也包括上述全长多肽及其变体的片段，包括SEQ IDNO:2或3所示序列的片段。这些片段可保留全长多肽的天然活性。
合适的片段大小至少为约5个，例如10、12、15或20个氨基酸。SEQID NO:2和3的多肽片段及其同源物可包含一个或多个(例如2、3、5或10个)置换、缺失或插入，包括保守置换。
本发明的多肽可以是基本上分离的形式。本发明的多肽也可以是基本纯化的形式，在此情况中该多肽一般包含于一种制品中，其中该制品中超过90％，例如95％、98％或99％的多肽是本发明的多肽。
本发明的多肽可以用显示性标记物标记。显示性标记可以是使多肽能被检测到的任一合适的标记。合适的标记包括放射性同位素，如125I、35S、酶、抗体、多核苷酸和连接物如生物素。工业用途从叙述中应当明白，第三方面的宿主细胞不仅能用来生产重组蛋白质，而且能生产其它目的化合物，包括非蛋白质，如无机化学品，特别是维生素。因此本发明的第七方面涉及生产化合物的方法，该方法包括在生产希望的化合物的条件下培养或发酵第三方面的宿主细胞。尽管该化合物可以是多肽，例如第六方面的多肽，但也可以是前面关于欲表达的基因的叙述中所提及的化合物之一。显然无机化合物不是由基因表达的，但它们可由一种酶产生，或者多肽或酶可帮助宿主细胞产生希望的化合物。这些化合物可以在细胞内产生，然后，例如在宿主细胞裂解后分离，或者可通过宿主细胞壁进入周围的培养基中，该培养基可以是一种发酵培养基，如一种水性溶液。这样，能在含有细胞和细胞所需养分如可同化碳源和成氮源的水性培养基中培养宿主细胞。
这样产生的多肽可具有治疗用途。它们可能是药物或其它药理活性化合物，或者可能有抗原性或免疫原性，在此情况中它们可在疫苗方面得到应用。
本发明还包括利用该方法生产的化合物，无论它是否为重组多肽。特别希望的化合物是维生素如维生素B12(钴胺素)。
有时化合物不需要从发酵培养基或宿主细胞中分离。宿主细胞本身可用于特定用途，例如用于食品如香肠或其制造，或用于干酪制造，或者例如宿主细胞可包含于动物饲料中，如当宿主细胞含有所述动物可摄取的化合物时。因此本发明扩展到这些化合物或宿主细胞在食品如干酪和香肠生产中的用途。本发明也构思了含有宿主细胞或本发明生产的化合物的食品或动物饲料。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，宿主细胞可用于干酪制造方法中，因此本发明还包括一种制造干酪的方法，其中所使用的微生物是本发明的宿主细胞。这些宿主细胞可代替其它细菌如乳酸菌或与之一起使用。丙酸菌目前常用于干酪制造方法中，例如嗜温培养(Maasdam型干酪)和嗜热培养(瑞士干酪(Emmental))。嗜温和嗜热生物都能引起牛奶或干酪的酸化。这样本发明的宿主细胞不仅能用于干酪而且能用于其它发酵乳制品(例如酸牛乳)的生产。丙酸菌可用于干酪制造，因为它们具有将乳酸盐(酯)和碳水化合物转化为丙酸、乙酸和二氧化碳的能力。特别是当其为丙酸杆菌时，能使用本发明的宿主细胞，因为它们对硝酸盐和盐较不敏感，这可减少或省略牛奶的离心除菌(通常用来降低梭状芽孢杆菌(Clostridia)的水平)。
宿主细胞的发酵可具有一个或两个阶段或时期。例如，可能是生长和/或生产期，或厌氧和/或需氧期。优选地是生长和/或厌氧期，适当地也(例如之后)是生产和/或需氧期。
碳源和成氮源都可以是复合来源或单个化合物。对于碳源，优选的是葡萄糖。对于氮源，合适的来源包括酵母提取物或氨或铵离子。
本发明一个方面的优选特征加以必要的改变后适合于另一方面。
附图以
本发明，其中图1是本发明的一种载体-从费氏丙酸杆菌LMG 16545(CBS101022)中获得的p545-的限制图谱；和图2a和图2b每个均包括两种载体的两个图谱，所有4种载体都属于本发明。
现在参照下列实施例以实施例的形式描述本发明，不应把这些实施例看作是限制性的。
然后用一种最初为大肠杆菌建立并作了某些改进的质粒DNA分离法4从细菌中纯化质粒用25％蔗糖、50mM Tris-HCl pH8溶液洗涤5ml培养物的细胞，将其重悬浮于含10mg/ml溶菌酶(BoehringerMannheim)的250μl TENS(25％蔗糖+50mM NaCl+50mMTris-HCl+5mM EDTA pH8)中，37℃温育20-30分钟。然后用500μl 0.2NNaOH/1％SDS裂解细菌细胞(在冰上温育2-5分钟)。在加入400μl 3MNaAc pH4.8(冰上5分钟)随后用酚/氯仿抽提后，加入异丙醇沉淀DNA。
经1％琼脂糖凝胶电泳分析DNA，并用溴化乙锭显示。大多数菌株是阴性的，即在该分析中不显示存在固有质粒，而大多数证明为阳性的菌株含有大(≥20kb)质粒。在6个菌株中发现有较小的质粒。其中，詹氏丙酸杆菌LMG 16453、产丙酸丙酸杆菌ATCC4875、产丙酸丙酸杆菌LMG16447和非特异的丙酸杆菌株(LMG16550)含有一种大小为6-10kb的质粒。两种菌株(费氏丙酸杆菌LMG16545和费氏丙酸杆菌LMG16546)显示2种质粒的相同质粒分布。一种质粒是大质粒(未测定大小)而其它的较小，更多地存在且具有3.6kb的大小。选择来源于LMG16545和LMG16546的这些3.6kb质粒用于进一步分析。
放射性标记LMG16545株的3.6kb质粒(此处称为p545)，用于Southern印迹杂交实验。杂交条件是0.2×SSC,65℃。它与LMG16545和LMG16546质粒DNA提取物有同样的反应，支持了这些菌株的密切相关性，而产丙酸丙酸杆菌ATCC4875的质粒DNA提取物——其携带被称作pTY1或pRG01的6.6kb质粒8——不能与之反应。
用Applied Biosystems 373A自动测序仪以荧光染料标记的双脱氧核苷酸测定质粒p545的DNA序列，其作为SEQ ID NO:1包括于序列表中。对已用EcoRⅠ线性化并插入EcoRⅠ消化的pBluescript SKⅡ+DNA(Stratagene,La Jolla,Ca.，美国)中的质粒DNA进行序列分析。用BLAST搜索1获得的序列计算机辅助分析表明了与参与几种富含GC生物的质粒复制的蛋白质的同源性(例如，偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)的pAL5000编码的repA和repB8,14显示与质粒p545的各自的推断复制蛋白有28-30％的同一性和34-38％的相似性；谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)[PIR保藏号S32701]的pXZ10142是编码与p545推断复制蛋白同源的复制蛋白的质粒的另一个实例)。实施例7和8详述了与同源序列数据库对比的结果。
将该合成DNA与大片段连接，并将连接混合物转移回大肠杆菌(使用T4连接酶)。获得具有预期组成的质粒(pBR322ΔⅠ)。多克隆位点能用来引入选择性标记及质粒p545 DNA。
作为一个实例，如此处所述进行提供红霉素抗性的大肠杆菌/丙酸杆菌穿梭质粒的构建。
将来源于红色糖多孢菌NRRL2338红霉素生物合成簇并含有红霉素抗性基因的1.7kb Acc65Ⅰ片段15,2插入Acc65Ⅰ线性化的pBR322ΔⅠ中。然后用EcoRV线性化新产生的被命名为pBRES的构建体，并与BsaBⅠ消化的p545 DNA连接。发现大肠杆菌转化子携带含两个方向正确插入片段的载体。得到的质粒载体被命名为pBRESP36B1和pBRESP36B2(图2a和图2b)。
也用在位于推断复制区之外的另一个限制位点即AlwNⅠ处线性化的p545 DNA获得质粒载体构建体。为进行该构建，pBRES载体应具有一个合适的克隆位点。设计了一种接头，其由下列组成的两种互补寡核苷酸(SEQ.ID.NO 6和7)组成5′GTACCGGCCGCTGCGGCCAAGCTT 3′5′GATCAAGCTTGGCCGCAGCGGCCG 3′这些oligo的退火产生一个双链DNA片段，其分别具有Acc65Ⅰ和BglⅡ粘端，而且还含有一个内部SfiⅠ限制位点，该位点使末端可匹配AlwNⅠ消化的p545质粒。将该接头克隆于pBRES的BglⅡ和近端Acc65Ⅰ位点之间。随后用SfiⅠ消化这样获得的pBRES-Sfi载体，并与AlwNⅠ消化的p545连接。经限制酶分析证实，大肠杆菌的转化产生含有正确载体的转化子。获得的载体被命名为pBRESP36A(图2)。
在SLB(乳酸钠培养液17)中30℃培养细菌细胞至稳定生长期，随后用新鲜SLB 1∶50稀释。30℃温育约20小时后，收集细胞(现在处于指数生长期)并用冷0.5M蔗糖充分洗涤。随后用由0.5M蔗糖组成的、1mM乙酸钾pH5.5缓冲的电穿孔缓冲液洗涤细胞一次，最后以初始培养体积的大约1/100将其重悬浮于该电穿孔缓冲液中。在整个过程中细胞均置于冰上。
为进行电穿孔(BIORAD的装置)，在预冷的1mm或2mm电穿孔杯中将80-100μl细胞悬液与±1μg DNA(或更小的量)混合，并释放电脉冲。发现最佳脉冲条件是25kV/cm,200Ω电阻，25μF电容。然而，更低和更高的电压(也在100Ω)也可产生转化子。
脉冲后立即向脉冲细胞悬液中加入900μl含0.5M蔗糖的冷SLB，随后30℃温育2.5-3小时，之后将适量稀释液平板接种于含0.5M蔗糖和10μg/ml红霉素的SLB/琼脂平板上。在厌氧条件下30℃温育5-7天后，检测转化子。
从大肠杆菌DH5α(Promega)中分离的DNA产生每μg DNA 20-30个转化子的转化率。当从大肠杆菌JM110(dam-,dcm-株)中分离DNA时，达到高10-100倍的转化率。大肠杆菌转化按照BIORAD说明书进行。
转化子含有无法与用于ATCC6207转化的原始质粒DNA区分的可靠载体。用前述小规模质粒DNA分离法从转化子中分离的质粒DNA的限制酶分析证明了这一点。
载体作为自主复制质粒独自存在。与总DNA分离物的Southern印迹杂交13显示，染色体DNA不能与用作探针的载体DNA杂交，表明未发生质粒DNA的染色体整合。
应用载体pBRESP36B2和pBRESP36A也成功进行了转化，表明载体的功能性不依赖于p545的方向或所用的克隆位点。在此情况中也证实了载体的可靠性。
此外，与使用从大肠杆菌DH5α中分离的DNA相比，用从丙酸杆菌转化子中分离的DNA转化费氏丙酸杆菌ATCC6207株导致使转化效率提高105-106倍。
另一种费氏丙酸杆菌株LMG16545(可从中获得p545质粒的相同菌株)的转化产生与ATCC株相当的转化效率。
转化结果和对维生素B12产量的影响显示于下表中。
10个转化子中的8个具有比对照株高可达50％的维生素B12含量。
实施例5含cobA基因的质粒载体的构建下面将描述一种质粒载体的构建及其提高费氏丙酸杆菌ATCC6207株中维生素B12(钴胺素)合成水平的应用。
用下列引物(SEQ.ID.NO 8和9)经PCR产生在红色糖多孢菌中提供红霉素抗性的基因的启动区正向引物(5′-3′)AAACTGCAGCTGCTGGCTTGCGCCCGATGCTAGTC反向引物(5′-3′)AAACTGCAGCAGCTGGGCAGGCCGCTGGACGGCCTGCCCTCGAGCTCGTCTAGAATGTGCTGCCGATCCTGGTTGC这样产生的PCR片段在5’端含有一个AlwNⅠ位点，随后是可靠启动区和红霉素抗性基因编码区的前19个氨基酸，用于确保适当的转录和翻译起始。在3’端具有XbaⅠ和XhoⅠ位点(用于在晚期插入cobA基因)，存在于红霉素抗性基因下游的终止序列，和一个AlwNⅠ位点。
用AlwNⅠ消化PCR产物，与用AlwNⅠ部分消化的pBRESP36B2连接。在pBRESP36B2中存在的两个AlwNⅠ位点中，只有存在于载体的p545特异部分的一个位点容纳该片段。获得携带预期构建体的大肠杆菌转化子，该构建体被命名为pBRES36pEt。如下所述该载体用于进一步构建。
使用下列引物(SEQ.ID.NO 10和11)，经PCR从费氏丙酸杆菌ATCC6207株中产生编码尿卟啉原Ⅲ甲基转移酶的基因——cobA的编码序列正向(5′-3′)CTAGTCTAGACACGGATGAGGAAACCCGATGA反向(5′-3′)CCCAAGCTTCTCGAGTCAGTGGTCGCTGGGCGCGCG这样扩增的cobA基因在N端编码区有一个XbaⅠ位点，在C端编码区有HindⅢ和XhoⅠ位点。
通过将PCR产物作为XbaⅠ-HindⅢ片段克隆于pUC18中，及随后大肠杆菌JM109株的转化，证实了该cobA基因的功能性。当用紫外线照射时，含有功能性cobA基因的转化子显示亮红色荧光。用XbaⅠ和XhoⅠ消化从这种转化子中分离的质粒DNA，与同样消化的pBRESP36B2连接。经限制酶消化和凝胶电泳分析DNA和来自几个转化子的用于大肠杆菌转化的DNA。发现转化子在表达载体中携带正确的插入片段。这种新的载体被命名为pBRES36COB。随后按照前面所述的方法将该载体转移到费氏丙酸杆菌ATCC6207中。分析获得的10个转化子，发现它们携带pBRES36COB载体，限制酶消化分析显示，该载体无法与用于转化的原始载体相区分。如下测定这10个转化子中的维生素B12合成水平。
在含50ml BHI(脑心浸液)培养基(Difco)的100ml摇瓶中接种1-10号丙酸杆菌转化子的冷冻培养物及只含载体质粒pBRESP36B2的对照株，并在不摇动的情况下28℃温育72小时。将4ml该预培养液转移到500ml摇瓶内的由15g/l Difco酵母提取物、30g/l Nalactate、0.5g/lKH2PO4、0.01g/l MnSO4和0.005g/l CoCl2组成的200ml生产培养基中，并在不摇动的情况下28℃温育56小时，然后在New Brunswick旋转振荡器中200转/分培养48小时。
用公知的HPLC法5测定维生素B12效价。10个转化子中的9个显示比对照株大约高25％的维生素B12产量。
与来源于偶发分枝杆菌质粒pAL5000(JS0052)的蛋白质比较，在194个氨基酸中发现37.1％的匹配(INIT 167,292)。与来源于谷氨酸棒杆菌(S32701)的蛋白质比较，在125个氨基酸中发现32.0％的匹配(INIT125,116)。与来源于大肠杆菌(SO4455)的ColE2蛋白比较，在221个氨基酸中发现29.9％的匹配(INIT 86,259)。对于同样来源于大肠杆菌(SO4456)的ColE3蛋白，在相同数量氨基酸中发现完全相同的匹配。
将ORF2序列与来源于偶发分枝杆菌(S32702)的蛋白质比较，在75个氨基酸中发现53.3％的匹配(INIT 207,207)。
为此用SstⅡ和BclⅠ消化载体pBRESP36A(图2)，产生一个1.7kb片段和一个6.5kb片段。将1.7kb片段(实际上是质粒p545的1.6kbAlwNⅠ-BclⅠ片段)替换为一种合成双链DNA，该DNA包含SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13，具有SstⅡ和BclⅠ匹配末端和许多单一限制酶识别位点。SEQ.ID.No.125′GGAGATCTAGATCGATATCTCGAG 3′SEQ.ID.No.135′GATCCTCGAGATATCGATCTAGATCTCCGC3′这样提供下列限制酶识别位点SstⅡ(恢复的)、BglⅡ、XbaⅠ、ClaⅠ、EcoRV、XhoⅠ(BclⅠ未恢复)。将连接混合物转移给大肠杆菌，筛选含有预期组成的载体的转化子。该载体被命名为pBRESAΔS-B。随后用该载体对费氏丙酸杆菌ATCC6207株的成功转化表明，p545中位于AlwNⅠ和BclⅠ之间的1.6kb区不是质粒复制所必需的。
通过去除质粒p545中对应于SalⅠ和BclⅠ之间区域的240bp进行另一种缺失。实现方法是分别用SalⅠ-SstⅠ和SstⅠ-XhoⅠ消化pBRESAΔS-B，并分离1.3kb SalⅠ-SstⅠ片段和6.6kb SstⅠ-XhoⅠ片段。连接这些片段，将连接混合物转移给费氏丙酸杆菌ATCC6207，产生许多转化子。分离新产生的构建体，命名为pBRESAΔS-S，经限制酶切作图证实其结构。
这样，关于质粒p545复制的所有必需信息都被定位于限制位点SalⅠ和AlwNⅠ所限定的1.7kb片段上，该片段包含ORF1和ORF2所编码的预测的复制蛋白，并且能在不明显妨碍质粒复制或稳定性的情况下删除1.8kb。
通过PvuⅡ和HindⅢ消化获得含cml基因(包括其自身启动子)的片段，并分离含该基因的3.3kb片段。连接两种载体特异片段和cml片段PvuⅡ和HpaⅠ末端为平端，从而插入cml基因并恢复亲代载体的ermE基因。将连接混合物转移给大肠杆菌，筛选载体含有正确cml插入片段的转化子。该载体被命名为pBRESBCM。
用该载体对费氏丙酸杆菌ATCC6207的转化，在含10μg/ml红霉素或5μg/ml氯霉素的平板上的筛选，分别产生红霉素和氯霉素抗性菌落，表明除红霉素抗性基因外(丙酸杆菌-大肠杆菌穿梭载体在先显示)，在丙酸杆菌中也表达氯霉素抗性基因。转化子能在含有高达20μg/ml氯霉素的液体培养基中培养。
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(B)街道Wateringseweg 1(C)城市Delft(E)国家荷兰(F)邮政编码2611 XT(ⅱ)发明名称丙酸杆菌载体(ⅲ)序列数目13(ⅳ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ.ID.NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度3555个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构环状(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假设否(ⅲ)反义非(ⅵ)初始来源(A)生物费氏丙酸杆菌(B)单独分离物CBS 101022 LMG16545(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS
(B)位置273..1184(D)其它信息/基因=“ORF1”(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1181..1438(D)其它信息/基因=“ORF2”(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.1的序列描述GTCGACCCTG ACAGCCGGCG AGCAGTTCAG GCGAAGATCG CACAGCTGCG CGAGGAACTA60GCCGCAATGC CCGAACACGC CCCAGCCATC CCTTGGAGCA GGTGGCAGCG TCAGGGGAGT120CGGGGGATGT TTGGCAGGGG ATGTGGAAAG AGAGTTCGCT TTGCTCACAT GGCTCAACCG180GGTAACTAAC TGATATGGGG TCTTCGTCGC CCACTTTGAA CACGCCGAGG AATGGACCAC240GCTGAACGTG ACTCGCATGC TTCACTGCAT GT ATG GAT TCG TTC GAG ACG TTG293Met Asp Ser Phe Glu Thr Leu1 5TTC CCT GAG AGC TGG CTG CCA CGC AAG CCG CTG GCG TCA GCC GAG AAG341Phe Pro Glu Ser Trp Leu Pro Arg Lys Pro Leu Ala Ser Ala Glu Lys10 15 20TCT GGG GCG TAC CGG CAC GTG ACT CGG CAG AGG GCG CTG GAG CTG CCT389Ser Gly Ala Tyr Arg His Val Thr Arg Gln Arg Ala Leu Glu Leu Pro25 30 35TAC ATC GAA GCG AAC CCG TTG GTC ATG CAG TCC TTG GTC ATC ACC GAT437Tyr Ile Glu Ala Asn Pro Leu Val Met Gln Ser Leu Val Ile Thr Asp40 45 50 55CGA GAT GCT TCG GAT GCT GAC TGG GCC GCA GAC CTC GCT GGG CTG CCT485Arg Asp Ala Ser Asp Ala Asp Trp Ala Ala Asp Leu Ala Gly Leu Pro60 65 70TCA CCG TCC TAC GTG TCC ATG AAC CGT GTC ACG ACC ACC GGA CAC ATC533Ser Pro Ser Tyr Val Ser Met Asn Arg Val Thr Thr Thr Gly His Ile75 80 85GTC TAT GCC TTG AAG AAC CCT GTG TGT CTG ACC GAT GCC GCG CGG CGA581Val Tyr Ala Leu Lys Asn Pro Val Cys Leu Thr Asp Ala Ala Arg Arg90 95 100CGG CCT ATC AAC CTG CTC GCC CGC GTC GAG CAG GGC CTA TGC GAC GTT629Arg Pro Ile Asn Leu Leu Ala Arg Val Glu Gln Gly Leu Cys Asp Val105 110 115CTC GGC GGC GAT GCA TCC TAC GGG CAC CGG ATC ACA AAG AAC CCG CTC677Leu Gly Gly Asp Ala Ser Tyr Gly His Arg Ile Thr Lys Asn Pro Leu120 125 130 135AGC ACC GCC CAT GCG ACC CTC TGG GGC CCC GCA GAC GCG CTC TAC GAG725Ser Thr Ala His Ala Thr Leu Trp Gly Pro Ala Asp Ala Leu Tyr Glu140 145 150CTG CGC GCC CTC GCA CAC ACC CTC GAC GAG ATC CAC GCA CTG CCG GAG773Leu Arg Ala Leu Ala His Thr Leu Asp Glu Ile His Ala Leu Pro Glu155 160 165GCA GGG AAC CCG CGT CGC AAC GTC ACC CGA TCA ACG GTC GGC CGC AAC821Ala Gly Asn Pro Arg Arg Asn Val Thr Arg Ser Thr Val Gly Arg Asn170 175 180GTC ACC CTG TTC GAC ACC ACC CGC ATG TGG GCA TAC CGG GCC GTC CGG869Val Thr Leu Phe Asp Thr Thr Arg Met Trp Ala Tyr Arg Ala Val Arg185 190 195CAC TCC TGG GGC GGC CCG GTC GCC GAA TGG GAG CAC ACC GTA TTC GAG917His Ser Trp Gly Gly Pro Val Ala Glu Trp Glu His Thr Val Phe Glu200 205 210 215CAC ATC CAC CTA CTG AAC GAG ACG ATC ATC GCC GAC GAA TTC GCC ACA965His Ile His Leu Leu Asn Glu Thr Ile Ile Ala Asp Glu Phe Ala Thr220 225 230GGC CCC CTC GGC TTG AAC GAA CTT AAG CAC TTA TCT CGA TCC ATT TCC1013Gly Pro Leu Gly Leu Asn Glu Leu Lys His Leu Ser Arg Ser Ile Ser235 240 245CGA TGG GTC TGG CGC AAC TTC ACC CCC GAA ACC TTC CGC GCA CGC CAG1061Arg Trp Val Trp Arg Asn Phe Thr Pro Glu Thr Phe Arg Ala Arg Gln250 255 260AAA GCG ATC AGC CTC CGT GGA GCA TCC AAA GGC GGC AAA GAA GGC GGC1109Lys Ala Ile Ser Leu Arg Gly Ala Ser Lys G1y GIy Lys Glu Gly Gly265 270 275CAC AAA GGC GGC ATT GCC AGT GGC GCA TCA CGG CGC GCC CAT ACC CGT1157His Lys Gly Gly Ile Ala Ser Gly Ala Ser Arg Arg Ala His Thr Arg280 285 290 295CAA CAG TTC TTG GAG GGT CTC TCA TGACCACACG TGAACGTCTC CCCCGCAACG1211Gln Gln Phe Leu Glu Gly Leu Ser300GCTACAGCAT CGCCGCTGCT GCGAAAAAGC TCGGTGTCTC CGAGTCCACC GTCAAGCGGT1271GGACTTCCGA GCCACGCGAG GAGTTCGTGG CCCGCGTTGC CGCACGCCAC GCGCGGATTC1331GTGAGCTCCG CTCGGAGGGT CAGAGCATGC GTGCGATTGC TGCCGAGGTC GGGGTTTCCG1391TGGGCACCGT GCACTACGCG CTGAACAAGA ATCGAACTGA CGCATGACCG TAACGCCGCA1451CGATGAGCAT TTTCTTGATC GTGCACCGCT TGGCACTACG TTCGCGTGCG GTTGCACAGT1511GCGCGCCACG TTCTTATCCT GCGGCCATTG TGGCTACAGC CAATGGGGGG CATCAGCAAC1571GGACGTTGAA CCCGGTGGGC AAGTGTTACT CAGGGGGACA TGCCCAGTCT GCGGCGCTCG1631GATTGACGGT ATGGCAGTCG TGCATGCGGC CCCACCGTCA AACTCATTCA GGTATCAGTG1691AGAACCCTCA TGGCACCCCC TCGTGACACG TTCTCGTTGC GATCAGCTGC TGTGCGTGCG1751GGCGTGAGCG TTTCTACGCT GCGGCGCAGG AAATCAGAGC TTGAGGCTGC CGGAGCGACG1811GTAGACCCGT CCGGTTGGGT GGTGCCACTG CGTGCACTCA AGGTCGTTTT TGGGGTGTCA1871GATGAGACCT CGAATGCGCC CGGTCATGAC GCTGAGTTAG TGGCGCAGCT GCGCTCTGAG1931AACGAGTTTT TACGGCGTCA GGTCGAGCAG CAGGCGCGCA CGATCGAACG GCAGGCTGAG1991GCACACGCGG TGGTCTCAGC GCAGCTCACA CGGGTTGGCC AGCTTGAGGC CGGCGACGCA2051GCAGCACCGA CACTGGCACC CGTTGAAAGG CCGGCTCCGC GACGGCGGTG GTGGCAGCGT2111CGGTAGCGGT CAGGATCGCT CTGGCGTGAC GAGTGTGTCT GGCAGTGCGA ACAGTTGCTC2171GACCAGTGGC AGCAGAAGCG AGATCGCTGC GTGGTGCTGT TCCTCGGTCA GTTCGTCGAG2231GACTGGCGGG TCTTGCTGCG TCCAGCCGAT CGCCTCGGCG GCCAAGGTCA GTTCCAAGCT2291GTGCCAACGC ACACGCCCCT CGGCTGACAG CTGAGTCTCG AACTGTGCAA CTGGACCGGC2351CGGAAGATGC ACGTTGCCGA GGTCGTGAGT GGCCAAGCGC ACGTCAAAGA GTGCTGCTTC2411GTAGCCGCGC AGAAATGGCA GTGCTCGGTC GATTCGGATC GGCCTGCCCA GGTACATTCC2471GGGCCGCTTG ATGAACGCCT CCGCGTAGAA GCGCACCGTT CTCGGCCCGG CCTCGTGATC2531TGTCACTGTG CACGCTCCTC TCGATGGTTC TCGACGCTAC CGGAGACCAC CGACGTTCAT2591GCCCAGCGCA GCGACCTGAA AGGACCAAGC CGAGTTAGCC GTGCTAACCG TATAGCTTGC2651TCCGTCGCCT CTGAGGGCAA CCACCTGCGC AGCAGGTGGG CGGCAGCCCG CGCGCAAGCG2711CCTACCGGGT TTGGGCACAG CCCATAAATC AACGCCTCCG GTGTTGAAGC GATCGTGTGT2771CACGATTGCT ATGCTTGCTA CCCCTTCAGG GTTTTCGTAT ACACAAATCA AGTTTTTTCG2831TATACGCTAA TGCCATGAGT GAGCATCTAC TGCACGGCAA GCCCGTCACC AACGAGCAGA2891TTCAGGCATG GGCAGACGAG GCCGAGGCCG GATACGACCT GCCCAAACTC CCCAAGCCAC2951GGCGCGGACG CCCGCCCGTA GGAGACGGTC CGGGCACCGT CGTACCCGTG CGTCTCGACG3011CGGCCACCGT TGCCGCTCTC ACAGAACGAG CAACAGCCGA GGGCATCACG AACCGTTCAG3071ACGCGATCCG AGCCGCAGTC CACGAGTGGA CACGGGTTGC CTGACCTCCA CGACTCAGCA3131CGCAAGCACT ACCAACGAGA CCGGCTCGAC GACACGGCCG TGCTCTACGC GGCCACCCAC3191GTTCTCAACT CCCGGCCACT CGACGACGAA GACGACCCGC GCCGCTGGCT CATGATCGGGA3251ACCGACCCAG CAGGCCGCCT ACTCGAACTC GTCGCACTGA TCTACGACGA CGGCTACGAA3311CTGATCATCC ACGCAATGAA AGCCCGCACC CAATACCTCG ACCAGCTCTA ACCAAGAAAG3371GAACCTGATG AGCGACCAGC TAGACAGCGA CCGCAACTAC GACCCGATGA TCTTCGACGT3431GATGCGCGAG ACCGCGAACC GCGTCGTCGC CACGTACGTT GCATGGGAAG ATGAAGCCGC3491TGATCCCCGC GAGGCTGCGC ACTGGCAGGC CGAGCGATTC CGCACCCGGC ACGAGGTGCG3551CGCC3555(2)SEQ.ID.NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度303个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.2的序列描述Met Asp Ser Phe Glu Thr Leu Phe Pro Glu Ser Trp Leu Pro Arg Lys1 5 10 15Pro Leu Ala Ser Ala Glu Lys Ser Gly Ala Tyr Arg His Val Thr Arg20 25 30Gln Arg Ala Leu Glu Leu Pro Tyr Ile Glu Ala Asn Pro Leu Val Met35 40 45Gln Ser Leu Val Ile Thr Asp Arg Asp Ala Ser Asp Ala Asp Trp Ala50 55 60Ala Asp Leu Ala Gly Leu Pro Ser Pro Ser Tyr Val Ser Met Asn Arg65 70 75 80Val Thr Thr Thr Gly His Ile Val Tyr Ala Leu Lys Asn Pro Val Cys85 90 95Leu Thr Asp Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ile Asn Leu Leu Ala Arg Val100 105 110Glu Gln Gly Leu Cys Asp Val Leu Gly Gly Asp Ala Ser Tyr Gly His115 120 125Arg Ile Thr Lys Asn Pro Leu Ser Thr Ala His Ala Thr Leu Trp Gly130 135 140Pro Ala Asp Ala Leu Tyr Glu Leu Arg Ala Leu Ala His Thr Leu Asp145 150 155 160Glu Ile His Ala Leu Pro Glu Ala Gly Asn Pro Arg Arg Asn Val Thr165 170 175Arg Ser Thr Val Gly Arg Asn Val Thr Leu Phe Asp Thr Thr Arg Met180 185 190Trp Ala Tyr Arg Ala Val Arg His Ser Trp Gly Gly Pro Val Ala Glu195 200 205Trp Glu His Thr Val Phe Glu His Ile His Leu Leu Asn Glu Thr Ile210 215 220Ile Ala Asp Glu Phe Ala Thr Gly Pro Leu Gly Leu Asn Glu Leu Lys225 230 235 240His Leu Ser Arg Ser Ile Ser Arg Trp Val Trp Arg Asn Phe Thr Pro245 250 255Glu Thr Phe Arg Ala Arg Gln Lys Ala Ile Ser Leu Arg Gly Ala Ser260 265 270Lys Gly Gly Lys Glu Gly Gly His Lys Gly Gly Ile Ala Ser Gly Ala275 280 285Ser Arg Arg Ala His Thr Arg Gln Gln Phe Leu Glu Gly Leu Ser290 295 300(2)SEQ.ID.NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度85个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.3的序列描述Met Thr Thr Arg Glu Arg Leu Pro Arg Asn Gly Tyr Ser Ile Ala Ala1 5 10 15Ala Ala Lys Lys Leu Gly Val Ser Glu Ser Thr Val Lys Arg Trp Thr20 25 30Ser Glu Pro Arg Glu Glu Phe Val Ala Arg Val Ala Ala Arg His Ala35 40 45Arg Ile Arg Glu Leu Arg Ser Glu Gly Gln Ser Met Arg Ala Ile Ala50 55 60Ala Glu Val Gly Val Ser Val Gly Thr Val His Tyr Ala Leu Asn Lys65 70 75 80Asn Arg Thr Asp Ala85(2)SEQ.ID.NO.4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度59个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.4的序列描述AATTCAAGCT TGTCGACGTT AACCTGCAGG CATGCGGATC CGGTACCGAT ATCAGATCT59(2)SEQ.ID.NO.5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度59个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.5的序列描述CCGAAGATCT GATATCGGTA CCGGATCCGC ATGCCTGCAG GTTAACGTCG ACAAGCTTG59(2)SEQ.ID.NO.6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.6的序列描述GTACCGGCCG CTGCGGCCAA GCTT24(2)SEQ.ID.NO.7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.7的序列描述GATCAAGCTT GGCCGCAGCG GCCG24(2)SEQ.ID.NO.8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.8的序列描述AAACTGCAGC TGCTGGCTTG CGCCCGATGC TAGTC35(2)SEQ.ID.NO.9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度76个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.9的序列描述AAACTGCAGC AGCTGGGCAG GCCGCTGGAC GGCCTGCCCT CGAGCTCGTC TAGAATGTGC60TGCCGATCCT GGTTGC76(2)SEQ.ID.NO.10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.10的序列描述CTAGTCTAGA CACCGATGAG GAAACCCGAT GA32(2)SEQ.ID.NO.11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.11的序列描述CCCAAGCTTC TCGAGTCAGT GGTCGCTGGG CGCGCG36(2)SEQ.ID.NO.12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.12的序列描述GGAGATCTAGATCGATATCTCGAG24(2)SEQ.ID.NO.13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.13的序列描述GATCCTCGAGATATCGATCTAGATCTCCGC30
权利要求
1．一种多核苷酸，其包含能选择性地与下列序列杂交的序列(a)SEQ ID NO:1或其互补序列；(b)费氏丙酸杆菌CBS 101022的3.6kb质粒的序列；(c)费氏丙酸杆菌CBS 101023的3.6kb质粒的序列；或(d)一种编码多肽的序列，其包含SEQ ID NO:2或3，与之基本同源的氨基酸序列，或其中任一序列的片段。
2．一种多核苷酸，它是一种能保持于宿主细胞中染色体外的自主复制质粒，该质粒来源于一种内源丙酸杆菌质粒，当包含异源基因时能在宿主细胞内表达该基因。
3．根据权利要求1的多核苷酸，其在宿主细胞中自主复制。
4．根据权利要求3的多核苷酸，其中宿主细胞是丙酸杆菌。
5．根据权利要求4的多核苷酸，其中丙酸杆菌是费氏丙酸杆菌。
6．根据前述任一权利要求的多核苷酸，其能选择性地与在丙酸杆菌属中自主复制所必需的一种或多种SEQ ID No:1中的序列杂交。
7．根据权利要求1的多核苷酸，其包含限制位点SalⅠ和AlwNⅠ所限定的SEQ ID No:1的1.7kb片段或SEQ ID No:1的核苷酸1-1750。
8．一种包含根据前述任一权利要求的多核苷酸的载体。
9．根据权利要求8的载体，它是一种质粒。
10．根据权利要求8或9的载体，其另外包含一种选择性标记。
11．根据权利要求8-10中任一项的载体，其在大肠杆菌中自主复制。
12．根据权利要求8-11中任一项的载体，它是一种表达载体。
13．根据权利要求12的载体，其包含丙酸杆菌的一种内源基因或与能引起基因表达的控制序列有效连接的异源基因。
14．根据权利要求13的载体，其中该基因是cobA基因。
15．根据权利要求13的载体，其中所述异源基因编码一种在人或动物中是治疗性的多肽。
16．一种多肽，其包含序列SEQ ID NO:2或3的序列或与之基本同源的序列，或所述任一序列的片段，或为权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸所编码。
17．一种宿主细胞，其含有根据权利要求1-15中任一项的异源多核苷酸或载体，或者能用根据权利要求13-15中任一项的载体转化或转染。
18．根据权利要求17的宿主细胞，它是一种细菌。
19．根据权利要求18的宿主细胞，它是丙酸杆菌或大肠杆菌。
20．一种生产根据权利要求17-19中任一项的宿主细胞的方法，包括用根据权利要求1-15中任一项的多核苷酸或载体转化或转染宿主细胞。
21．一种制备多肽或其它化合物的方法，该方法包括在允许所述多肽或化合物表达或产生的条件下培养或发酵权利要求17-19中任一项所述的宿主细胞。
22．根据权利要求21的方法，它是一种发酵法，其中在需氧或厌氧条件下培养宿主细胞。
23．根据权利要求21或22的方法，其中从宿主细胞中回收表达的多肽或产生的化合物。
24．根据权利要求23的方法，其中所述多肽是一种蛋白酶，淀粉酶、脂肪酶或肽酶，或者所述化合物是维生素B12。
25．根据权利要求21-24中任一项的方法，其中多肽由宿主细胞分泌。
26．根据权利要求25的方法，其中多肽在宿主细胞表面表达，和/或该多肽是一种抗原或免疫原。
27．一种用根据权利要求20-26中任一项的方法制备的多肽或化合物。
28．一种生产维生素B12(钴胺素)的方法，该方法包括在生产该维生素的条件下培养根据权利要求17-19中任一项的宿主细胞，并在必要时分离该维生素。
29．用根据权利要求28的方法生产的维生素B12。
30．根据权利要求27的多肽，其用于治疗人或动物身体的方法中。
31．根据权利要求17-19中任一项的宿主细胞，其用于治疗人或动物身体的方法或用于动物饲料中。
32．根据权利要求17-19中任一项的宿主细胞或根据权利要求27的多肽或化合物在制造干酪或干酪制造业中的应用。
33．根据权利要求17-19中任一项的宿主细胞或根据权利要求27的多肽或化合物在食品制造或动物饲料中的应用。
34．一种含有根据权利要求27的多肽或化合物或根据权利要求17-19中任一项的宿主细胞的食品。
35．一种根据权利要求34的食品，用于人类(例如干酪、香肠)或动物消费。
36．一种制造干酪或其它发酵乳产品的方法，该方法包括使用根据权利要求17-19中任一项的宿主细胞。
37．根据权利要求36的方法，其中用宿主细胞代替乳酸菌或与之一起使用。
38．根据权利要求36或37的方法，其中宿主细胞是丙酸杆菌属的细胞。
全文摘要
描述了丙酸杆菌的一种内源质粒,其分离自费氏丙酸杆菌LMG16545(保藏号为CBS101022),并提供了其序列。该质粒能用来转化丙酸杆菌以表达同源或异源蛋白质,用于重组蛋白质或酶产物如维生素B
文档编号C12N15/74GK1314941SQ99809489
公开日2001年9月26日 申请日期1999年6月25日 优先权日1998年6月25日
发明者P·H·普沃尔斯, N·范鲁吉克, J·P·M·乔尔, R·G·M·路特恩 申请人:Dsm公司