专利名称:生产唾液酸化寡糖的方法
本申请是1998年9月3日提出的美国申请系列No.09/146,285(它的全文并入本文作参考)的部分继续申请。
本申请涉及酶促合成α-唾液酸化寡糖的方法。具体地说,在本发明的方法中,应用α2,3-唾液酸转移酶将唾液酸或其类似物(作为它的CMP-核苷酸应用的)转移到寡糖的非还原末端,所述寡糖在相对于该寡糖的非还原糖末端的次末端位置具有一个岩藻糖基。
在本申请中引用了下列文献(在本申请相关部分以上标数字形式表示),它们的全文并入本文作参考。1.Horowitz,糖缀合物(The Glycoconjugates),Vols.Ⅰ~Ⅴ,Pigman编辑,New York Academic Press(1977,1978,1982,1983)2.Hakomori,癌研究进展(Adv.Cancer Res.),52:257~331(1989)3.Venot等,美国专利No.5,352,6704.Schengrund等,生物化学杂志[美](J.Biol.Chem.),264:13233~13237(1989)5.Paulson,“动物病毒与细胞表面受体的相互作用”,受体(“Interaction of Animal Viruses with Cell SurfaceReceptors”in The Receptors),Conn编辑,N.Y.Acad.Press,pp.131~219(1985)6.Feizi,TIBS,16:84~86(1991)7.Brandley等,细胞(Cell),63:861~863(1990)8.Houghton等,关于神经节苷脂和癌的会议论文集(Symposium onGangliosides and Cancer),pp.233~237,VCH Publishers(1988)9. Irie等,关于神经节苷脂和癌的会议论文集,pp.247~257,VCHPublishers(1988)10.Howard,“关于更好的碳水化合物疫苗”;世界卫生组织组织的会议会报(in“Towards Better Carbohydrate Vaccines”;Proceedings of a meeting organized by the World HealthOrganization),R.Bell,G.Torrigani编辑,pp.212~236,Wiley,Chichester,(1987)。11.Henningsson等,癌免疫学和免疫疗法(Cancer Immunol.Immunother.),25:231~241(1987)12.Fung等,癌研究(Cancer Res.),50:4308~4314(1990)13.Livingston等,美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)),84:2911~2915(1987)14.Naor等,变态反应进展(Prog.Allergy),22:107~146(1977)15.Orskov等,实验医学杂志(J.Exp.Med.),149:669~685(1979)16.Barsoum等,分子免疫学(Mol.Immunol.),18:495~550(1981)17.Jennings等,美国专利No.4,727,136(1985)18.Honda等,生物化学杂志[日](J.Biochem.),(东京)95:1323~1329(1984)19.Nakamura等,生物化学杂志[日],(东京)99:219~226(1986)20.Reuter等,糖缀合物杂志(Glycoconjugate J.),5:133~135(1988)21.Weinstein等,生物化学杂志[美],257:13835~13844(1982)22.Paulsen等,生物化学杂志[美],252:2356~2362(1977)23.Evans-Sadler等,生物化学杂志[美],254:4434~4443(1979)24.Conradt等,日本-德国会议论文集(Japanese-GermanSymp.),pp.104~105,柏林(1988)25.Joziasse等,生物化学杂志[美],260:4941~4951(1985)26.Evans-Sadler,生物化学杂志[美],254:5934~5941(1979)27.Bergh等,欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.),136:113~118(1983)28.Higa等,生物化学杂志[美],260:8838~8849(1985)29.Paulsen等,欧洲生物化学杂志,140:523~530(1984)30.de Heij等,碳水化合物研究(Carbohydr.Res.),149:85~99(1986)31.“细胞生物学专论”中的唾液酸(Sialic Acids in“Cell BiologyMonographs”),Schauer编辑,Vol.10(1982)32.Okamoto等,四面体(Tetrahedron),46,No.17,pp.5835~5837(1990)。33.Ratcliffe等,美国专利No.5,079,353(1987)。34.Abbas等,日本-德国学术会议会报(Proc.Japanese-GermanSymp.),柏林,pp.20~21(1988)。35.Paulsen,应用化学[英](Angew.Chem.Int.Ed.Eng.),21:155~173(1982)。36.Schmidt,应用化学[英],25:212~235(1986)。37.Fugedi等,糖缀合物杂志(Glycoconj.J.),4:97~108(1987)。38.Kameyama等,碳水化合物研究,209:C.sub.1~C.sub.4(1991)。39.Brossmer等,生物化学与生物物理学学报(Biochem.Biophys,Acta.),96:1282~1289(1980)40.Gross等,欧洲生物化学杂志,168:595~602(1987)41.Zbiral等,化学和其它有关科学部门月刊[奥](Monatsh.Chem.),119:127~141(1988)42.Sharma等,碳水化合物研究,175:25~34(1989)43.Hasegawa等,碳水化合物化学杂志(J.Carbohydr.Chem.),8:579~588(1989)44.Zbiral等,化学和其它有关科学部门月刊[奥],116:87~98(1985)45.Salunkhe等,李必希化学纪事(Liebigs Ann.Chem.),pp.187~189(1988)46.Hasegawa等,碳水化合物化学杂志,8:135~144(1989)47.Gross等,生物化学(Biochemistry),27:4279~4283(1989)48.Zbiral等,碳水化合物研究,194:C15~C18(1989)49.Gross等,FEBS通讯(FEBS Lett.),232:145~147(1988)50.Paulsen等,李必希化学纪事,pp.277~279(1988)51.Nakajima等,农业与生物化学[日](Agric.Biol.Chem.),52:1209~1215(1988)52.Baumberger等,瑞士化学学报(Helv.Chem.Acta),69:1535~1541(1986)53.Beau等,欧洲生物化学杂志,160:531~540(1980)54.Mack等,四面体通讯(Tetrahedron Lett.),28:191~194(1987)55.Gross等,欧洲生物化学杂志,177:583~589(1988)56.Christian等,碳水化合物研究,194:49~61(1989)57.Conradt等,FEBS通讯,170:295~300(1984)58.Christian等,碳水化合物研究,162:1~11(1987)59.Haverkamp等,Hoppe-Seyler生理化学杂志(Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.),360:159~166(1979)60.Gross等,糖缀合物杂志,4:145~156(1987)61.Hagedorn等,第八次碳水化合物会议(ⅩⅢth Carbohydr.Symp.),伊萨卡镇(1986)A462.Toone等,四面体,No.17,45:5365~5422(1989)63.Palcic,酶学中的方法(Methods in Enzymology),230:300(1994)64.Beyer等,酶学进展(Adv.Enzymol.),52:24~158(1981)65.国际专利申请公开No.WO 97/1830266.Le等,色谱学杂志(J.Chromatography),781:515~522(1997)67.Kashem等,美国专利No.5,374,65568.Gokhale等,加拿大化学杂志(Can J.Chem.),68:1063(1990)69.Srivastava等,生物化学杂志[美],267:22356~22361(1992)70.Stangier等,碳水化合物研究,305:511~515(1998)71.Baisch等,生物器官和医疗化学通讯(Bioorganic and MedicinalChemistry Letters),6:2953~2956(1996)
碳水化合物和/或寡糖存在于多种天然糖缀合物和病理糖缀合物中1。特别有意义的是尤其在非还原糖末端含有唾液酸残基的碳水化合物和寡糖31。这类唾液酸封端的碳水化合物和寡糖存在于许多与广泛的生物现象相关的产品中,所述生物现象部分地基于通过碳水化合物结构和通过它们与特异性配体的结合而携带的识别信号这一概念。
具体地说,这类唾液酸封端的碳水化合物和寡糖被认为是毒素4、病原剂(例如病毒)5的结合的受体,而且被认为是各种凝集素(特别是细胞粘连中涉及的那些)5,6等的识别位点。
类似地,某些寡糖(包括唾液酸封端的寡糖)已被鉴定为能抑制细胞介导的对抗原的免疫应答。Venot等3描述了这类寡糖抑制细胞介导的对抗原的免疫应答的能力。
此外,现有技术中有文献记录了在肿瘤相关的抗原中存在某些唾液酸封端的寡糖1,通常,以某种与正常寡糖不同的方式修饰了这类抗原上存在的寡糖的结构从而导致肿瘤相关的抗原的表达2。在黑素瘤患者中用针对某些唾液酸化肿瘤相关的抗原(例如神经节苷脂GD2、GD3和GM2)的单克隆抗体研究了被动免疫疗法的前景8,9。
这类寡糖的合成经常涉及复杂的化学反应(相应地产率低)。因此,人们对于应用糖基转移酶来合成这些分子的至少一部分很感兴趣。
糖基转移酶是一类高度多形性的、内质网和高尔基体的膜结合酶,它们在糖蛋白和糖脂的N-聚糖(Asn-GlcNAc N-糖苷键;GlcNAc,N-乙酰葡糖胺)和O-聚糖(Ser/Thr-GalNAc,O-糖苷键;GalNAc,N-乙酰半乳糖胺)部分的生物合成中催化单一的单糖单元从核苷酸供体至受体糖的羟基的转移。
真核生物的唾液酸转移酶包括一族糖基转移酶,它们催化N-乙酰神经氨糖酸(NeuAc)即一种唾液酸(SA)从GMP-SA转移到糖缀合物的寡糖链的非还原末端。唾液酸的添加通常终止寡糖链延长,但神经细胞粘着分子和神经节苷脂上见到的聚唾液酸链除外。
糖蛋白和糖脂的N-和O-聚糖衍生物的合成中涉及的已知真核生物唾液酸转移酶被归纳于表1中,摘自Palcic63。表中,R表示受体糖蛋白、糖脂或寡糖链的残余部分。
表1 α2,3-唾液酸转移酶是如下方面有用的真核生物酶糖蛋白的N-连接的和O-连接的唾液酸衍生物的体外合成,受体的测定,以及糖蛋白的其它定性和定量研究。然而,以前报导了2,3-唾液酸转移酶不能合成糖蛋白或糖脂的N-连接的和O-连接的唾液酸衍生物(其中,受体糖蛋白或糖脂在相对于寡糖的非还原糖末端的次末端位置具有一个岩藻糖基衍生物)(美国专利No.5,374,65567)。这需要在某些岩藻糖基化寡糖和唾液酸化寡糖的合成中精心设计以及在某些情况下需要应用化学合成法而不是酶促合成法来完成一些步骤。
鉴于上述情况,特别有利的是开发轻易从寡糖制备α-唾液酸化寡糖的方法,所述寡糖指在相对于寡糖的非还原糖末端的次末端位置具有一个岩藻糖基衍生物的寡糖。本发明通过如下方法实现了这个设想应用α2,3-唾液酸转移酶将作为它的CMP-核苷酸衍生物活化的唾液酸(供体糖)与在糖部分的非还原末端的倒数第二位具有一个岩藻糖基衍生物的糖或寡糖(受体寡糖)有效地偶联。
本发明涉及通过N-乙酰神经氨糖酸的类似物合成在非还原糖末端封端的寡糖、糖蛋白和糖脂的方法。具体地说,本发明的方法应用α2,3-唾液酸转移酶将唾液酸或其类似物(作为它们的CMP-核苷酸衍生物活化的)转移到寡糖受体的非还原末端。
因此,在它的方法方面之一中,本发明涉及一种酶促合成含唾液酸或其类似物的α-唾液酸化和岩藻糖基化寡糖的方法,该方法包括如下步骤a)选择与在非还原次末端糖位置具有一个岩藻糖基的岩藻糖基化寡糖相容的唾液酸转移酶;b)选择与步骤(a)中选定的唾液酸转移酶相容的CMP-唾液酸或其类似物;c)在如上步骤(a)中选定的唾液酸转移酶存在下,在使唾液酸或其类似物从CMP-唾液酸或其类似物转移到岩藻糖基化寡糖的非还原糖末端的条件下,将所述CMP-唾液酸或其类似物与下式的岩藻糖基化寡糖接触 其中,R1表示糖残基,R2表示糖残基,并且,R1和R2一起表示选定的唾液酸转移酶的受体;n是0~约10,Y选自O、NH和S,R3选自H、蛋白质、脂质或具有至少一个碳原子的苷元部分;从而形成含唾液酸或其类似物的α-唾液酸化岩藻糖基化寡糖。
本发明还涉及一种酶促合成岩藻糖基化和α-唾液酸化寡糖的方法,该方法包括如下步骤a)选择一种能使在非还原次末端糖位置具有一个岩藻糖基的寡糖唾液酸化的唾液酸转移酶;b)选择一种岩藻糖基转移酶;c)选择与步骤(a)中选定的唾液酸转移酶相容的CMP-唾液酸或其类似物;
d)选择与步骤(b)中选定的岩藻糖基转移酶相容的GDP-岩藻糖或其类似物;e)在如上步骤(a)和步骤(b)中选定的所述唾液酸转移酶和所述岩藻糖基转移酶存在下,在使唾液酸或其类似物以及岩藻糖或其类似物分别从CMP-唾液酸或其类似物以及GDP-岩藻糖或其类似物转移到所述寡糖的非还原糖末端的条件下,将所述CMP-唾液酸或其类似物以及所述GDP-岩藻糖或其类似物与下式的寡糖接触R1-R2-(糖)n-Y-R3其中,R1表示糖残基,R2表示糖残基,并且,R1和R2一起表示选定的唾液酸转移酶和选定的岩藻糖基转移酶的受体;n是0~约10,Y选自O、NH和S,R3选自H、蛋白质、脂质或具有至少一个碳原子的苷元部分;从而形成α-唾液酸化岩藻糖基化寡糖。
本发明还涉及一种测定未知寡糖受体的非还原末端结构的方法,该方法包括如下步骤a)将所述寡糖受体与不能使在非还原次末端糖位置具有一个岩藻糖基的寡糖的非还原末端唾液酸化的唾液酸转移酶接触,测定所述寡糖是否被唾液酸化了;b)将所述寡糖与能使在非还原次末端糖位置具有一个岩藻糖基的寡糖的非还原末端唾液酸化的唾液酸转移酶接触,测定所述寡糖是否被唾液酸化了;以及c)比较所得结果,确定所述非还原末端是否被岩藻糖基化了。如果在步骤(a)中,未知受体的第一份等分样未被唾液酸化,而在步骤(b)中,受体的第二份等分样被唾液酸化了,那么,所述受体在非还原次末端糖位置被岩藻糖基化了。
本发明涉及这一发现某些α-2,3唾液酸转移酶将唾液酸的相容性类似物转移到某些在相对于糖的非还原末端的次末端位置具有一个岩藻糖基的寡糖、糖蛋白和糖脂。这一发现使得有可能从在相对于糖的非还原末端的次末端位置具有一个岩藻糖基的寡糖合成在非还原末端α-唾液酸化的寡糖。该方法还使得有可能将唾液酸的相容性类似物转移到岩藻糖基化寡糖。本发明还使得有可能测定受体的结构以及其它的定性和定量研究糖蛋白和糖脂。
不过,在更详细讨论本发明之前,先定义下列术语。A.定义本文应用的下列术语具有如下给定的定义术语“唾液酸”表示所有的唾液酸天然结构,包括5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-甘油基-D-半乳糖-nonulopyranosylonicacid(5-acetoamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-nonulopyranosylonic acid)(“Neu5Ac”)和Neu5Ac的天然类似物,包括N-乙醇酰神经氨糖酸(Neu5Gc)和9-O-乙酰神经氨糖酸(Neu5,9Ac2),它们与选定的唾液酸转移酶是相容的。Schauer31提供了迄今已知的天然唾液酸完整的一览表。
据说,被特定的α2,3-唾液酸转移酶识别以便结合该酶然后适合转移到适当的受体寡糖结构上的天然唾液酸与唾液酸转移酶是相容的,在本文有时被称为“相容的天然唾液酸”。
术语“唾液酸的类似物”表示唾液酸的天然结构的类似物,包括其中唾液酸单元已被化学修饰以便从这样的结构引入、修饰和/或除去一个或多个官能度的那些。例如,这样的修饰能导致OH官能度的除去、胺官能度的引入、卤官能度的引入等。至于和唾液酸转移酶相容的唾液酸类似物,它们在本文有时被称为“相容性唾液酸类似物”。
唾液酸的某些类似物是本领域已知的,例如包括9-叠氮基-Neu5Ac、9-氨基-Neu5Ac、9-脱氧-Neu5Ac、9-氟-Neu5Ac、9-溴-Neu5Ac、8-脱氧-Neu5Ac、8-表-Neu5Ac、7-脱氧-Neu5Ac、7-表-Neu5Ac、7,8-双表-Neu5Ac、4-O-甲基-Neu5Ac、4-N-乙酰-Neu5Ac、4,7-二脱氧-Neu5Ac、4-氧代-Neu5Ac、3-羟基-Neu5Ac、3-氟-Neu5Ac酸以及Neu5Ac的6-硫代类似物。本文用来描述唾液酸的类似物的命名是Reuter等20规定的。
既然唾液酸转移酶被用来转移或贡献出相容性的天然唾液酸,所以Neu5Ac的类似物在本文有时被称为“人工供体而相容性的天然唾液酸则在本文有时被称为“天然供体”。
术语“唾液酸转移酶”指那些酶它们将相容性的天然唾液酸[作为它的胞苷一磷酸(CMP)衍生物活化的]转移到糖脂或糖蛋白(总称为糖缀合物)的末端寡糖结构上,包括从基因修饰的微生物生产的酶,所述基因修饰为的是掺入和表达从另一来源(包括哺乳动物来源)获得的唾液酸转移酶基因的全部或部分。文献中已鉴定了很多唾液酸转移酶,不同的唾液酸转移酶一般是通过接受该转移酶的糖缀合物上末端糖单元而彼此区别的64。例如,已表征了构建下列糖缀合物上的末端寡糖结构的唾液酸转移酶αNeu5Ac(2-3)βGal(1→3/4)βGlcNAc-21αNeu5Ac(2-6)βGal(1-4)βGlcNAc-21,22αNeu5Ac(2-3)βGal(1-3)αGalNAc-23~25αNeu5Ac(2-6)αGalNAc-26~28αNeu5Ac(2-6)βGlcNAc-29,30。从各种来源分离了具有种种特异性的其它唾液酸转移酶。
“与在非还原次末端糖位置具有一个岩藻糖基的岩藻糖基化寡糖相容的唾液酸转移酶”指能将在非还原次末端糖位置具有一个岩藻糖基或其类似物的寡糖唾液酸化的唾液酸转移酶。发现了国际专利申请公开No.WO97/1830265公开的粘液瘤病毒α2,3-唾液酸转移酶具有此能力。
预计,还被脊椎动物痘病毒亚科、昆虫痘病毒亚科的其它属和痘病毒科未分类的病毒编码的相关唾液酸转移酶将与岩藻糖基化寡糖相容。
据说,作为它们的胞苷一磷酸衍生物活化的唾液酸的类似物(它们被特定的唾液酸转移酶识别以便与该酶结合,然后适合转移到适当的受体寡糖结构)与唾液酸转移酶是相容的,所以在本文有时被称为“唾液酸的相容性类似物”。由于转移反应应用了唾液酸转移酶,所以不用说,在这种反应中应用的唾液酸的类似物必定是唾液酸的相容性类似物。
Neu5Ac的CMP-核苷酸衍生物表示如下化合物唾液酸的类似物的CMP-衍生物指具有与上述化合物类似结构的那些化合物,不同的是,Neu5Ac残基被唾液酸的类似物替代了。
术语“岩藻糖基转移酶”指那些酶它们将相容性的天然岩藻糖[作为它的鸟苷二磷酸(GDP)衍生物活化的]转移到糖脂或糖蛋白(总称为糖缀合物)的末端寡糖结构上,包括从基因修饰的微生物生产的酶,所述基因修饰为的是掺入和表达从另一来源(包括哺乳动物来源)获得的岩藻糖基转移酶基因的全部或部分。文献中已鉴定了很多岩藻糖基转移酶。
术语“岩藻糖的类似物”表示岩藻糖的天然结构类似物,包括那些物质,即,其中,岩藻糖单元已被化学修饰以便从这样的结构引入、修饰和/或除去一个或多个官能度。例如,这样的修饰能导致OH官能度的除去、胺官能度的引入、卤官能度的引入、硫酸根或磷酸根部分的引入等。某些岩藻糖的类似物是本领域已知的,例如包括3-脱氧岩藻糖68、阿拉伯糖、C-6修饰的岩藻糖69(即,6-O-丙基岩藻糖)和3,6-二脱氧-L-半乳糖70。
还预计,岩藻糖或岩藻糖的类似物可从其它嘌呤二磷酸(包括腺苷-5′-二磷酸岩藻糖、黄苷-5′-二磷酸岩藻糖、肌苷-5′-二磷酸岩藻糖等)被转移71。
据说,作为它们的二磷酸衍生物活化的岩藻糖的类似物(它们被特定的岩藻糖基转移酶识别以便与该酶结合,然后适合转移到适当的受体寡糖结构)与岩藻糖基转移酶是相容的。至于岩藻糖类似物与岩藻糖基转移酶是相容的,它们在本文有时被称为“相容性岩藻糖类似物术语“寡糖”指下式的化合物R1-R2-(糖)n-Y-R3其中,R1表示糖残基,R2表示糖残基,并且,R1和R2一起表示选定的唾液酸转移酶和选定的岩藻糖基转移酶的受体;n是0~约10,Y选自O、NH和S,R3选自H、蛋白质、脂质或具有至少一个碳原子的苷元部分。
术语“岩藻糖基化寡糖”指下式的化合物 其中,R1表示糖残基,R2表示糖残基,并且,R1和R2一起表示选定的唾液酸转移酶和选定的岩藻糖基转移酶的受体;n是0~约10,Y选自O、NH和S,R3选自H、蛋白质、脂质或具有至少一个碳原子的苷元部分。
由于天然寡糖和岩藻糖基化寡糖都是某些α2,3-唾液酸转移酶的受体,所以被认为是体内某些唾液酸转移酶的受体,这些寡糖和岩藻糖基化寡糖在本文有时被称为“天然受体”。反之,由于应用于本发明的寡糖和岩藻糖基化寡糖有时不同于这样的“天然受体所以,时被称为“人工受体”。也就是说,人工受体是那些寡糖和岩藻糖基化寡糖它们在还原糖的异头碳原子上含有一个取代基,该取代基不是羟基、蛋白质或者能形成微团或其它大分子量聚集体的脂质。因此,通过它的苷元部分连接到寡糖或岩藻糖基化寡糖的还原糖异头碳原子上的蛋白质应当是人工受体,因为该受体包含“人造的”单元(即,苷元连接基)。
本发明的岩藻糖基化寡糖可借助于对该寡糖的一个或多个糖单元的化学修饰而进一步与天然受体区别。这样的化学修饰可包括一个或多个糖单元中一个或多个官能度的引入和/或除去。例如,这样的修饰可导致OH官能度的除去、糖单元的除去、胺官能度的引入、卤官能度的引入、一个或多个糖单元的引入等。
在一个优选的实施方案中,所述苷元部分具有1~20个碳原子,更优选选自-(A)-Z′,其中,A表示一个键,2~10个碳原子的亚烷基,以及式-(CH2CR4R5G)n(CH2CR4R5)-这样的一个部分,其中,n是等于0~5的整数;R4和R5独立地选自氢,苯基,被1~3个选自胺、羟基、卤素、1~4个碳原子的烷基和1~4个碳原子的烷氧基的取代基取代的苯基,甲基或者乙基;G选自一个键,氧,硫,NH;Z′选自氢、甲基、-OH、-SH、-NH2、-NHR6、-N(R6)2、-C(O)OH、-C(O)OR6、-C(O)NHNH2、-C(O)NH2、-C(O)NHR6、-C(O)N(R6)2和-OR7,其中,每个R6独立地是1~4个碳原子的烷基,R7是3~10个碳原子的烯基。优选地,-(A)-Z′基定义一个能被连接到载体的基或者一个可被衍生成一个能被连接到载体的基的基。
优选地,所述苷元基是至少2个碳原子、更优选至少4个碳原子的疏水基。最优选的所述苷元基是-(CH2)8COOMe。
当所述苷元基是一个能被连接到载体(例如抗原载体)的基时,本发明的方法适用于制备人工缀合物,例如具有一个或多个α-唾液酸化寡糖基(包含唾液酸的类似物)的人工抗原,所述寡糖基悬挂于抗原上。
所述载体是低分子量或高分子量的、非免疫原性的或抗原性的载体,包括荧光标记、放射性标记、生物素的接头,或者不耐光的连接臂,或者靶向的一个部分。优选地,所述载体是抗原载体,所以,所述人工缀合物是人工抗原。在某些情况下,可能有利的是应用非免疫原性载体。
另一方面,所述载体可以是低分子量载体,例如乙二胺、六亚甲基二胺、三(2-氨乙基)胺、L赖氨酰赖氨酸(L-lysilysine)、聚(L-赖氨酸)以及各种分子量的聚合物。
适用于上述寡糖的糖单元(即,糖)例如包括下列物质的所有天然的和合成的衍生物葡萄糖、半乳糖、N-乙酰-葡糖胺、N-乙酰-半乳糖胺、岩藻糖、唾液酸、3-脱氧-D,L-辛酮糖酸等。除了呈它们的吡喃糖形式之外,所述寡糖中的全部糖单元还呈它们的D型,但岩藻糖例外(它呈它的L型)。
如上所示,适用于本文公开的方法中的寡糖包含末端单元(它们与选定的唾液酸转移酶是相容的)。也就是说,这样的相容性末端单元能使寡糖被特定的唾液酸转移酶识别(以致该唾液酸转移酶与所述寡糖结合)而且进一步能使唾液酸的相容性类似物转移到所述寡糖上。B.合成和操作法寡糖的制备唾液酸类似物将被酶促与之偶联的寡糖容易这样制备或者通过完全的化学合成,或者通过化学/酶促合成[其中,应用糖基转移酶(而不是唾液酸转移酶)实现将一个或多个糖单元相继添加到糖或寡糖上]。这类方法是本领域熟知的。例如,化学合成是用于下列目的的简便方法制备完全寡糖糖苷;用于化学修饰糖单元,接着就可将该糖单元化学偶联或酶促偶联到寡糖糖苷上;或者用于化学制备寡糖糖苷(可在其上酶促偶联一个或多个糖单元)。
糖单元的化学修饰是本领域熟知的,通常采用这些方法并针对每个需要合成的单个结构最优化。一般说来,全部或部分寡糖的化学合成首先涉及还原糖的异头碳原子上糖苷键的形成。具体地说,在还原单元的端基异构中心选择性地修饰天然的或化学修饰的糖结构(糖基供体)的适当保护形式以便引入一个离去基(包括卤化物、三氯乙酰亚胺酸酯(trichloroacetimidate)、硫糖苷等)。然后,在催化条件[例如可溶性银盐,例如三氟甲磺酸银;路易斯酸,例如三氟化硼醚合物或三甲代甲硅烷基三氟甲磺酸酯;或者硫糖苷启动子,例如三氟甲磺酸甲酯或二甲基(甲硫基)锍三氟甲磺酸酯]下将所述供体与苷元或碳水化合物受体的适当形式(它在要形成糖苷键的位置具有一个游离羟基)反应。多种苷元部分是本领域已知的,并且可呈合适的构型被连接到所述还原单元的端基异构中心。适当应用相容性的保护基团(碳水化合物合成的技术中熟知的)将允许选择性修饰合成的结构或者进一步将另外的糖单元或糖部分连接到受体结构。
在形成糖苷键之后,所述寡糖可被用于偶联另外的糖单元或在选定的位置进行化学修饰,或者,在常规去保护后用于酶促合成。通常,天然的或化学修饰的糖单元与糖苷的化学偶联是通过应用文献中充分记载的既定的化学性质进行的。例如,参见Okamoto等32、Ratcliffe等33、Abbas等34、Paulsen35、Schmidt36、Fugedi等37和Kameyama等38。这些文献每篇的公开内容都以它们的全文并入本文作参考。
另一方面,酶促偶联是通过应用糖基转移酶进行的,糖基转移酶将作为它们的适当核苷酸供体活化的糖单元转移到特定的糖或寡糖受体(通常在所述糖或寡糖的非还原糖部分处)。例如,参见Toone等62和美国专利No.5,374,65567。此外,有可能对糖或寡糖受体、糖供体或酶促反应产物进行选择性化学修饰以便引入修饰或在结构内进一步修饰。唾液酸的类似物的制备唾液酸的某些类似物是本领域熟知的,是应用本领域充分记载的方法通过唾液酸的化学修饰制备的。例如,文献中报导了化学修饰的Neu5Ac衍生物,它们包括9-叠氮基-Neu5Ac39、各种9-氨基-Neu5Ac衍生物40、9-脱氧-Neu5Ac41、9-氟-Neu5Ac42、9-溴-Neu5Ac43、8-脱氧-Neu5Ac41、8-表-Neu5Ac44、7-脱氧-Neu5Ac47、-表-Neu5Ac45、7,8-二表-Neu5Ac45、4-O-甲基-Neu5Ac53、4-N-乙酰-Neu5Ac48、4-表-Neu5Ac47、4,7-二脱氧-Neu5Ac41、4-氧代-Neu5Ac49、4-脱氧-Neu5Ac52、3-羟基-Neu5Ac50、3-氟-Neu5Ac51酸、在C-8或C-7处侧链的解离产物46以及Neu5Ac的6-硫代类似物54。其它唾液酸类似物被公开于美国专利No.5,352,6703中。导致其它唾液酸类似物的化学修饰应当按这些既定的方法。唾液酸的类似物至它们的CMP-核苷酸衍生物的活化唾液酸的类似物的酶促转移需要先合成(即,活化)它们的核苷酸(CMP)衍生物。唾液酸的类似物的活化通常是通过应用酶CMP-唾液酸合酶(它容易获得)进行的,文献提供了各种唾液酸的类似物的活化实例,例如9-取代的Neu5Ac28,39,40,55-57、7-表Neu5Ac58、7,8-二表-Neu5Ac58、4-O-甲基-Neu5Ac59、4-脱氧-Neu5Ac60、4-乙酰氨基-Neu5Ac48、7-脱氧-Neu5Ac56、4,7-二脱氧-Neu5Ac56、Neu5Ac的6-硫代衍生物61和Neu5OH(KDN)。还有其它活化的唾液酸类似物的实例被公开于美国专利No.5,352,6703。唾液酸的类似物至寡糖受体的转移在与岩藻糖基化寡糖相容的选定的唾液酸转移酶存在下,在一定的条件(其中,唾液酸或其类似物被转移到受体)下,唾液酸的相容性类似物的核苷酸衍生物和相容性受体[即,岩藻糖基化寡糖或在非还原末端具有末端糖单元的寡糖(它们被选定的唾液酸转移酶识别)]彼此结合。显然,应用的糖或寡糖受体必须是这样的物质它起应用的特定唾液酸转移酶的底物的作用。
在这方面,技术上认识到人工受体在某些情况下为唾液酸转移酶(尤其当在所述结构的苷元部分中修饰时)所耐受。
同样,当唾液酸的类似物(即,人工供体)被酶促转移时,要求所述类似物的CMP衍生物也被唾液酸转移酶识别。在这方面,技术上认识到某些唾液酸转移酶能耐天然唾液酸的一些修饰,所以,仍将这些唾液酸的类似物转移到具有合适的末端受体结构的糖蛋白或糖脂上。
发现了,唾液酸转移酶具有足够的识别灵活性以致将人工供体转移到人工受体3。这样的灵活性使得容易合成一批寡糖,该寡糖在其非还原糖末端含有不同的唾液酸类似物。
如上所示,在唾液酸转移酶存在下,在一定的条件(其中,唾液酸或其类似物被转移到受体)下,相容性唾液酸的核苷酸衍生物或其相容性类似物与相容性受体[即,一种糖或在非还原末端具有末端糖单元的寡糖(它们被选定的唾液酸转移酶识别)]彼此结合。本领域已知的合适的条件包括在适当的pH和温度条件(例如6.5~7.5的pH和25℃~45℃、优选35℃~40℃的温度)下,将适当的唾液酸转移酶添加到相容性受体和相容性唾液酸类似物的CMP-衍生物在适当缓冲剂(例如0.1M卡可酸钠)的混合物中达12小时~4天。生成的寡糖可应用常规方法(包括HPLC、离子交换色谱法、凝胶色谱法、反相色谱法和吸附色谱法)分离和纯化。
一旦形成,α-唾液酸化寡糖糖苷就可通过化学方法和/或酶促方法被进一步修饰而进一步衍生化该化合物。例如,可应用其它糖基转移酶来将糖基加到被所述转移酶识别的α-唾液酸化寡糖上。后一方面是重要的,因为对寡糖进行的修饰必须与期望的酶促转移一致。
另外,α唾液酸化寡糖可被化学修饰而将这些化合物进一步衍生化。这样的化学修饰包括将唾液酸类似物上的9-叠氮基还原成氨基,它还可被进一步官能化成另一衍生物(例如9-乙酰氨基衍生物)。类似地,见于唾液酸类似物上的羧基可在α唾液酸化寡糖糖苷上通过内酯化、还原或变换而被选择性地转化成酰胺。
在上文叙述的一步或多步酶促步骤中,可将酶与固体载体结合而便于试剂的反应和从酶回收产品。C.应用本发明的方法适用于制备含有唾液酸或其类似物的寡糖(所述唾液酸或其类似物通过α键被连接到寡糖的非还原糖末端)。这样的寡糖在本领域中被公认适用作药物,以及在这些结构的抗体生成中被公认,所述抗体适用于诊断分析。
另外,本发明的方法适用于制备含有唾液酸的类似物的寡糖(所述唾液酸的类似物通过α键被连接到寡糖的非还原糖末端),该寡糖可被偶联到抗原性载体从而产生人工抗原。所以,这样的寡糖在人工抗原的制备中起中间体的作用。
此外,本发明的方法适用于测定未知寡糖的非还原末端。具体地说,可将未知寡糖受体的第一份等分样与一种唾液酸转移酶(它不能使在非还原次末端糖位置具有一个岩藻糖基的寡糖的非还原末端唾液酸化)接触,测定所述寡糖是否被唾液酸化了;还将所述未知寡糖的第二份等分样与α-2,3唾液酸转移酶(它能使在非还原次末端糖位置具有一个岩藻糖基的寡糖的非还原末端唾液酸化)接触,测定所述寡糖是否被唾液酸化了;将结果进行比较从而确定所述非还原末端是否被岩藻糖基化了。如果所述未知受体的第一份等分样未被唾液酸化,而受体的第二份等分样被唾液酸化了,那么,所述受体在非还原次末端糖位置被岩藻糖基化了。
实施例提供了如下实施例来阐述本发明,但不能认为以任何方式限制本在这些实施例中,除非下文另外定义,应用的缩写具有它们的通常被认可的含义PBS=磷酸盐缓冲盐水MES=吗啉乙磺酸PMSF =α-甲苯磺酰氟Lex-gr=8-甲氧基羰基辛基α-L-岩藻糖基-(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)]-β-D-2-乙酰胺-2-脱氧-吡喃葡萄糖苷Lea-gr =8-甲氧基羰基辛基β-D-吡喃半乳糖基-(1→3)[α-L-岩藻糖基-(1→4)]-β-D-2-乙酰胺-2-脱氧-吡喃葡萄糖苷CMP-NANA=胞苷5′-一磷酸-N-乙酰神经氨糖酸CMP-3H-NANA=胞苷5′-一磷酸-N-乙酰神经氨糖酸[唾液酸-9-3H]BSA =牛血清白蛋白d =双峰dd =一对双峰s =单峰t =三峰GDP-Fuc =鸟苷-5′二磷酸-L-岩藻糖UDP-半乳糖 =尿苷-5′-二磷酸-半乳糖TMR =四甲基罗丹明可商购的组分是生产商列出的。一些叙述的生产商如下Millipore=Millipore Corp.,Bedford Mass。Waters=Waters Corp.,Milford,Mass。Boehringer Mannheim=Boehringer Mannheim,Laval,Quebec,Canada实施例1.病毒α2,3-唾液酸转移酶细胞溶胞产物的制备粘液瘤病毒α2,3-唾液酸转移酶细胞溶胞产物是通过与国际专利申请公开No.WO97/1830265(将它并入本文作参考)陈述的相似方法制备的。
用巴西粘液瘤病毒株Lausanne(Lu)(ATCC VR-115)(Campinas,巴西,1949分离的)和Uriarra(Ur)(澳大利亚首都地区,1953分离的)[Moses株(ATCC VR-116)的衍生物]感染十个T180瓶中的欧洲兔肾细胞(RK13)铺满层。将所述细胞保持在37℃达24小时。感染二十四小时后,通过刮除分离细胞,用PBS洗涤。通过在4℃下悬浮于20mL萃取缓冲液(50 mM MES,pH6.1,0.5%Triton-X100,100 mM NaCl,1.5 mM MgCl2,0.1 mM PMSF,10 mg/ml抑酶肽)中达45分钟制备了细胞溶胞产物。通过在4℃下2,000g下离心15分钟澄清溶胞产物。
回收上清液,溶于加样缓冲液(50 mM MES,pH6.1,0.1%Triton-CF54,100 mM NaCl,25%甘油)而加到5 mL HiTrap Blue亲和层析柱(Pharmacia,Piscataway NJ)上。用分步NaCl洗脱液(0.5M、1.0 M、1.5 M和2.0 M NaCl)从柱上洗脱α2,3-唾液酸转移酶。把洗脱液通过于柱缓冲液(50 mMES,pH6.1,0.1%Triton-CF54,25%甘油)中的PD-10柱(BioRad,Hercules,CA)而使α2,3-唾液酸转移酶脱盐。
应用Bradford Bio-Rad按生产商的指示(用IgG作为蛋白质标准物)测定了总蛋白质浓度。实施例2.唾液酸至Lewisa和Lewisx寡糖受体的转移将受体(54 nmol)、CMP-NANA(40 nmol)和CMP-3H-NANA(150,000~180,000 dpm)添加到0.5 mL微量离心管(microfuge tube)内细胞溶胞产物(16μL)、水(3μL)和1μL分析缓冲液(250 mM MES,0.5%TrionCF54,pH7.0)的混合物中。将反应混合物在37℃下保温,用水稀释到200μL,装填到已用20 mL MeOH和20 mL水预平衡过的C18Sep-Pak反相柱体上。用50 mL水洗涤该柱体,用4 mL MeOH将产品洗脱入闪烁小管。通过在Beckman液体闪烁计数器(LS 1801)内10 mL EcoLite(+)闪烁混合物(ICN,Montreal,Quebec,Canada)中的液体闪烁定量分析了MeOH洗脱液中的放射性活度。
重复试验中转移到不同受体的放射性结果如下
实施例3.唾液酸至各种寡糖受体的转移测试了分离的病毒α2,3-唾液酸转移酶转移唾液酸至各种受体的能力。
将受体(54 nmol)、CMP-NANA(40 hmol)和CMP-3H-NANA(150,000~180,000 dpm)添加到0.5 mL微量离心管内细胞溶胞产物(16μL)、水(3μL)和分析缓冲液(250 mM MES,0.5%Triton CF54,pH6.1)的混合物中。将反应混合物在37℃下保温,用水稀释,通过如上实施例2中给出的方法进行测定而获得转移的相对速度。用模拟法通过将受体浓度从约0.2×Km变到3×Km进行了动力学分析。
gr=(CH2)8COOMeCMP-NANA=胞苷5′-一磷酸-N-乙酰-神经氨糖酸1这些化合物起病毒α-2,3唾液酸转移酶的受体的作用,但不是以前已知的哺乳动物α-2,3唾液酸转移酶的受体。
这表明了,病毒α2,3-唾液酸转移酶能利用一些不同的寡糖结构作为唾液酸的转移的受体。实施例4.唾液酸与Lewisa和Lewisx寡糖受体的2,3-键的证实将Lea-TMR(35 nmol)和CMP-NANA(200 nmol)与病毒细胞溶胞产物(4.9μL)和碱性磷酸酶溶液(0.1μL)[5μL碱性磷酸酶(BoehringerMannheim)1000U/ml和1μL BSA溶液(100 mg/mL)]保温。在室温(25℃)下缓慢旋转42小时后,往该混合物中添加追加的碱性磷酸酶溶液(0.2μL)和CMP-NANA溶液(100 mM,0.2μL),使之在室温下又反应2天。将反应混合物升温并保持在37℃达48小时,然后,将混合物装填到已用10 mL MeOH和10 mL水预平衡的C18-Sep-Pak柱体(Waters)上。用5 mL水洗涤柱体,再用5 mL MeOH洗脱TMR-标记的化合物。真空干燥该溶液,流过一个滤器(Milliex-GV滤器,0.22μm,MilliporeCorp.),冻干。往于物质中添加水配成100μMTMR浓度。将该溶液(0.5μL)与毛细管电泳流动缓冲液(10 mM磷酸盐、10 mM硼酸钠、10 mM十二烷基硫酸钠、10 mM苯基硼酸pH9.0,499.5μL)混合。将该溶液用于分离和分析,即,应用Le等66提出的方法,采用激光诱导的荧光检测通过毛细管电泳分离和分析。酶反应中产生的新产物峰具有与真正的唾液酸化Lex-TMR相同的迁移时间,通过用神经氨酸酶处理又将所述新产物峰转回到Lex-TMR。实施例5.唾液酸Lex-gr的制备性合成将细胞溶胞产物(14 mL)与BSA溶液(5μL,100 mg/mL)混合。在Slide-A lyzer(Pierce Chemical Company,Rockford,Illilnois)中浓缩该溶液至1.8 mL。将Lex-gr(4.7 mg,6.7μmol)和CMP-NANA(6.8mg,10.3μmol)添加到200μL浓缩后的细胞溶胞产物中。添加碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim,1000U/mL,10μL)。在室温下将反应混合物旋转24天。在该保温过程中,添加CMP-NANA[6次,3天、7天、11天后(每次3.0 mg);14天、18天、21天后(每次2.0 mg)]。将混合物装填到已用10 mL MeOH和10 mL水预平衡的C18-Sep-Pak柱体(Waters)上。用40 mL水洗涤柱体,再用50 mL 10%MeOH洗脱产品。真空干燥洗脱液,再次装填到已用10 mL MeOH和10 mL水预平衡的C18-Sep-Pak柱体上。先用水(10 mL)、1%MeOH(10 mL)洗涤,再用5%MeOH(10 mL)洗涤后,用10%MeOH(17 mL)洗脱所需的产品。真空干燥该溶液,流过一个滤器(Milliex-GV滤器,0.22μm,Millipore Corp.),冻干而给出唾液酸化Lex-gr(2.19 mg,33%)。通过NMR光谱和质谱证实了产品唾液酸Lex-gr的结构。NMR(300Hz,只示出了特征峰,D2O)δ 5.10(d,H,=3.9Hz,H-1(Fuc)),4.51(d,2H,J=8.0Hz,H-1(Gal,GlcNAc)),3.69(s,3H,CO2Me),2.76(dd,H,J=4.7,12.6Hz,H-3,(NANA)),2.38(t,2H,J=11.4 Hz,CH2CO2Me),2.04(s,3H,Ac),2.02(s,3H,Ac),1.79(t,H,J=12.2,1.8Hz,H-3(NANA)),1.17(d,3H,J=6.6Hz,H-6(Fuc)).关于C41H69N2O25计算的质量=989.4;实测989.0还按类似方法从Lea-gr合成了唾液酸化Lea-gr。通过NMR光谱和质谱证实了它的结构。NMR(300Hz,只示出了特征峰,D2O)δ5.00(d,H,J=3.9Hz,H-1(Fuc)),4.52(d,2H,J=7.7 Hz,H-1(Gal,GlcNAc)),3.69(s,3H,CO2Me),2.76(dd,H,J=4.7,12.5Hz,H-3,(NANA)),2.39(t,2H,J=7.3Hz,CH2CO2Me),2.02(s,6H,Ac),1.76(t,H,J=12.3,H-3(NANA)),1.16(d,3H,J=6.4Hz,H-6(Fuc)).关于C41H69N2O25计算的质量=989.4;实测989.0实施例6.从GlcNAc-TMR合成唾液酸Lex-TMR将GlcNAc-TMR(35 nmol)、UDP-半乳糖(70 nmol)、0.5μL分离的牛乳β-1,4-半乳糖基转移酶(0.3 mU)、GDP-岩藻糖(70 nmol)、0.5μL分离的人乳α1,3,4-岩藻糖基转移酶(0.03 mU)、CMP-NANA(100nmol)、0.1μL1 M MnCl2和0.1μL碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim,10 mU)与5.7μL浓缩的病毒细胞溶胞产物溶液保温。在室温下缓慢旋转24小时后,取出0.2μL等分样,在硅胶60F254薄层层析板(Merck,Darmstadt Germany)上涂成斑点。用异丙醇H2O∶NH4OH(7∶2∶1)展开层析板。Lex-TMR(Rf=0.18)和唾液酸Lex-TMR(Rf=0.30)都是可见的,这是由于存在粉红色生色团TMR的缘故。这些Rfs相应于真实物质和酶反应混合物中形成的唾液酸Lex-TMR的那些(与唾液酸Lex-TMR一起迁移的)。未检测到原料GlcNAc-TMR(Rf=0.39)和反应中间体LacNAc-TMR(Rf=0.25)。实施例7.从Lec-TMR合成唾液酸Lea-TMR将Lec-TMR(15 nmol)、GDP-岩藻糖(70 nmol)、0.5μL分离的人乳α1,3,4-岩藻糖基转移酶(0.03 mU)、CMP-NANA(100 nmol)、0.1μL1M MnCl2和0.1μL碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim,10 mU)与5.1μL浓缩的病毒细胞溶胞产物溶液保温。在室温下缓慢旋转72小时后,取出0.2μL等分样,在硅胶60F254薄层层析板(Merck,DarmstadtGermany)上涂成斑点。用异丙醇H2O∶NH4OH(7∶2∶1)展开层析板。Lea-TMR(Rf=0.18)和唾液酸Lea-TMR(Rf=0.25)都是可见的,这是由于存在粉红色生色团TMR的缘故。这些Rfs相应于真实物质和酶反应混合物中形成的唾液酸Lea-TMR的那些(与唾液酸Lea-TMR一起迁移的)。未检测到原料Lec-TMR(Rf=0.31)。
权利要求
1.一种酶促合成含唾液酸或其类似物的α-2,3唾液酸化岩藻糖基化寡糖的方法,该方法包括如下步骤a)选择与在非还原次末端糖位置具有一个岩藻糖基的岩藻糖基化寡糖相容的α-2,3唾液酸转移酶;b)选择与步骤(a)中选定的唾液酸转移酶相容的CMP-唾液酸或其类似物;c)在如上步骤(a)中选定的唾液酸转移酶存在下,在使唾液酸或其类似物从CMP-唾液酸或其类似物转移到岩藻糖基化寡糖的非还原糖末端的条件下,将所述CMP-唾液酸或其类似物与下式的岩藻糖基化寡糖接触 其中,R1表示糖残基,R2表示糖残基,并且,R1和R2一起表示选定的唾液酸转移酶的受体;n是0~约10,Y选自O、NH和S,R3选自H、蛋白质、脂质或具有至少一个碳原子的苷元部分;从而形成含唾液酸或其类似物的α-2,3唾液酸化岩藻糖基化寡糖。
2.权利要求1的方法,其中,所述苷元部分选自-(A)-Z′,其中,A表示一个键,2~10个碳原子的亚烷基,以及式-(CH2CR4R5G)n(CH2CR4R5)-这样的一个部分,其中,n是等于0~5的整数;R4和R5独立地选自氢,苯基,被1~3个选自胺、羟基、卤素、1~4个碳原子的烷基和1~4个碳原子的烷氧基的取代基取代的苯基,甲基或者乙基;G选自一个键,氧,硫,NH;Z′选自氢、甲基、-OH、-SH、-NH2、-NHR6、-N(R6)2、-C(O)OH、-C(O)OR6、-C(O)NHNH2、-C(O)NH2、-C(O)NHR6、-C(O)N(R6)2和-OR7,其中,每个R6独立地是1~4个碳原子的烷基,R7是3~10个碳原子的烯基。
3.一种酶促合成岩藻糖基化和α-2,3唾液酸化寡糖的方法,该方法包括如下步骤a)选择一种能使在非还原次末端糖位置具有一个岩藻糖基的寡糖唾液酸化的α-2,3唾液酸转移酶;b)选择一种岩藻糖基转移酶;c)选择与步骤(a)中选定的唾液酸转移酶相容的CMP-唾液酸或其类似物;d)选择与步骤(b)中选定的岩藻糖基转移酶相容的GDP-岩藻糖或其类似物;e)在如上步骤(a)和步骤(b)中选定的所述唾液酸转移酶和所述岩藻糖基转移酶存在下,在使唾液酸或其类似物以及岩藻糖或其类似物分别从CMP-唾液酸或其类似物以及GDP-岩藻糖或其类似物转移到所述寡糖的非还原糖末端的条件下,将所述CMP-唾液酸或其类似物以及所述GDP-岩藻糖或其类似物与下式的寡糖接触R1-R2-(糖)n-Y-R3其中,R1表示糖残基,R2表示糖残基,并且,R1和R2一起表示选定的唾液酸转移酶和选定的岩藻糖基转移酶的受体;n是0~约10,Y选自O、NH和S,R3选自H、蛋白质、脂质或具有至少一个碳原子的苷元部分;从而形成α-2,3唾液酸化岩藻糖基化寡糖。
4.权利要求3的方法,其中,所述苷元部分选自-(A)-Z′,其中,A表示一个键,2~10个碳原子的亚烷基,以及式-(CH2CR4R5G)n(CH2CR4R5)-这样的一个部分,其中,n是等于0~5的整数;R4和R5独立地选自氢,苯基,被1~3个选自胺、羟基、卤素、1~4个碳原子的烷基和1~4个碳原子的烷氧基的取代基取代的苯基,甲基或者乙基;G选自一个键,氧,硫,NH;Z′选自氢、甲基、-OH、-SH、-NH2、-NHR6、-N(R6)2、-C(O)OH、-C(O)OR6、-C(O)NHNH2、-C(O)NH2、-C(O)NHR6、-C(O)N(R6)2和-OR7,其中,每个R6独立地是1~4个碳原子的烷基,R7是3~10个碳原子的烯基。
5.一种测定未知寡糖受体的非还原末端结构的方法,该方法包括如下步骤a)将所述寡糖受体与不能使在非还原次末端糖位置具有一个岩藻糖基的寡糖的非还原末端唾液酸化的唾液酸转移酶接触,测定所述寡糖是否被唾液酸化了;b)将所述寡糖与能使在非还原次末端糖位置具有一个岩藻糖基的寡糖的非还原末端唾液酸化的α-2,3唾液酸转移酶接触,测定所述寡糖是否被唾液酸化了;以及c)比较所得结果,确定所述非还原末端是否被岩藻糖基化了。
6.权利要求5的方法,其中,步骤(c)包括确定如果未知受体在权利要求5的步骤(a)中未被唾液酸化但在权利要求5的步骤(b)中被唾液酸化了,那么,未知受体在非还原次末端糖位置被岩藻糖基化了。
全文摘要
公开了酶促合成α-唾液酸化寡糖糖苷的方法。具体地说,在公开的方法中,应用α2,3-唾液酸转移酶将唾液酸的类似物(作为它的CMP-核苷酸衍生物应用的)转移到寡糖的非还原糖末端,所述寡糖在非还原糖末端的次末端糖单元中具有一个岩藻糖基。在该方法中选择应用的唾液酸类似物和寡糖与应用的唾液酸转移酶应是相容的。
文档编号C12P19/00GK1317053SQ99810599
公开日2001年10月10日 申请日期1999年9月2日 优先权日1998年9月3日
发明者M·M·帕尔西克, K·筋野 申请人:辛索尔布生物技术有限公司