专利名称：组成型抗病性基因(cdr1)及其使用方法
技术领域：
本发明总的来讲涉及植物中的抗病性，更具体地讲，涉及植物抗性因子-组成型抗病性1(CDR1)、编码CDR1的多核苷酸以及用其产生具有提高的病原体抗性的转基因植物的方法。
背景技术：
当植物可以发挥其生理功能，诸如细胞分裂、分化、发育、光合作用、吸收以及从土壤转运水和营养物、代谢、繁殖和食物供应的贮存，且功能未受破坏时，认为该植物是健康的。当植物功能受到病原体破坏时，所述植物则患病。病害可以定义为由于病原体的连续刺激引起的植物宿主细胞和组织的功能失常。病害涉及该植物的生理形式或行为形式的异常变化。
植物病原体通过从植物细胞吸收养料、分泌扰乱或杀伤植物细胞的毒素、酶或生长调节物质、或阻断植物中的食物营养素或水的转运，使植物弱化，而引起病害。根、茎、叶、花或果实都可以被感染。受影响的细胞和组织被弱化或破坏，不能行使正常的生理功能，导致植物生长减弱或死亡，并导致作物品质降低或减产。植物病害的主要病因是细菌、支原体、病毒、线虫和真菌。影响植物的真菌来自各种各样的属，包括镰孢属(Fusarium)、腐霉属(Pythium)、疫霉属(Phytophthora)、轮枝孢属(Verticillium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、壳球孢属(Macrophonmina)、根串珠霉属(Thielaviopsis)、核盘菌属(Sclerotinia)和许多其它属。由真菌引起的植物病害包括出苗前猝倒和出苗后猝倒、下胚轴腐病、根腐病、冠腐病、维管萎蔫病和其它症状。对植物有害的线虫包括来自根结线虫属(Meloidogyne)、异皮线虫属(Heterodera)、茎线虫属(Ditylenchus)和短体线虫属(Pratylencus)的线虫属。由线虫引起的植物病害包括根瘿、根腐病、侵蚀斑、“粗短”根、矮化和其它腐病和萎蔫病。在包括李属(Prunus)、葡萄、烟草和番茄在内的许多植物中，某些线虫(例如毛刺线虫属(Trichodorus)、Lonoidorus、Xipenema)可以作为病毒病的载体。
植物致病细菌引起多种植物病症。约80个细菌物种(例如绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)、野油菜黄单胞菌asclepiadas致病变种(Xanthomonas campestris pv.asclepiadas)、苛养木杆菌(Xyellafastidiosa)、Acidovorax albilineans和燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenae sspl citrulli)引起植物病害，包括果腐病、菌瘿、萎蔫病、叶枯病和叶斑病。当细菌快速繁殖时，在病程早期控制它们是关键性的。铜化合物和链霉素化合物是目前可用于防治细菌病害的仅有的化学化合物。
植物对微生物侵袭的反应涉及从头合成一系列用来限制该病原体生长的蛋白质。这些蛋白质包括富含羟脯氨酸的糖蛋白、蛋白酶抑制剂、合成植物抗毒素(phyoalexin)的酶、有助于增强细胞壁的酶和某些水解酶。
植物防御也可以被衍生自微生物细胞壁和培养液的激卫素激活。在双子叶植物中，广泛的研究已经表明，微生物侵袭或激卫素处理诱导编码参与防御反应的蛋白的一组基因的转录，作为基因表达总体模式中的整体开关的一部分。相比之下，对于单子叶植物中的诱导型防御却知之甚少。
植物的遗传工程需要分离和操作例如DNA或RNA的遗传物质，随后即该物质引入植物或植物细胞中，近几年来植物的遗传工程已经大大改变了植物育种和农业。作物营养价值的提高、产量增加，有饲养价值的提高、生产成本降低、对害虫的抗性、逆境耐性、耐旱性、药物、化学分子和生物分子的生产以及其它有益性状，所有这些均可能通过遗传工程技术获得。提供涉及病原体抗性的基因的遗传工程技术具有限制影响作物产生的潜力可能性。
发明概述本发明是基于对赋予植物增强的抗病性的组成型抗病性(CDR1)因子的发现，所述抗病性包括对病原体丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringe pv.tomato)(Pst)或丁香假单胞菌斑生致病变种(Pseudomonas syringe pv.maculicola)(例如Psm)的抗性。
在一个实施方案中，提供基本纯化的CDR1多肽。也提供分离的编码CDR1多肽的多核苷酸，例如SEQ ID NO:1。还提供含CDR1的载体、表达CDR1的宿主细胞和结合于CDR1的抗体。
在另一实施方案中，本发明提供用于产生与未遗传修饰相比鉴定为抗病性提高的遗传修饰的植物的方法。所述方法包括使植物细胞与编码CDR1多肽、与表达控制序列有效连接的核酸接触，获得转化的植物细胞；由转化的植物细胞产生植株；和选择表现出抗病性提高的植株。也提供一种方法，遗传修饰植物细胞，使得与野生型植物相比，由所述细胞产生的植物被鉴定为抗病性提高。该方法包括将分离的编码CDR1多肽的多核苷酸引入植物细胞中，获得转化的植物细胞，并且在允许表达CDR1多核苷酸的条件下培育转化的植物细胞，由此产生抗病性提高的植物。
在再一实施方案中，提供通过使易感性植物与一种因子接触产生遗传修饰的植物的方法，其中所述因子的量为将CDR1基因表达提高至高于未接触所述因子的植物中CDR1表达所必需的CDR1启动子诱导量，而且与相应的野生型植物相比，所述遗传修饰的植物被鉴定为抗病性提高。例如，所述因子可以是转录因子或化学试剂，诸如地塞米松(DEX)。
也提供一种方法，通过将具有有效连接至编码CDR1多肽的多核苷酸的表达控制序列的核酸序列，引入植物细胞的基因组中，获得转化的植物细胞，产生遗传转化的抗病性植物。本发明也提供通过本发明方法产生的植物、植物组织和种子。
在再一实施方案中，提供一种方法，通过用至少一种编码CDR1的多核苷酸片段探测核酸文库，并选择与所述片段杂交的那些克隆，鉴定新的抗病性基因。
附图简述
图1是激活标记双元载体pSK115的示意图。
图2是pCDR1E和pCDR1C1的组构图。
图3A和3B为CDR1的基因组序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。
图4是显示由CDR1诱导的4.5kDa多肽的1-D银染凝胶。
优选实施方案的描述必须注意，如本文和所附的权利要求书中所用的，单数形式的“a”、“and”和“the”包括复数指示物，除非正文清楚地指明是其它情况。因此，例如提及“a cell”包括多个这种细胞，而提及“thereceptor”包括是指一个或多个受体以及本领域技术人员已知的其等同物等等。
除非另有定义，否则本文所用的所有科技术语均具有本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。尽管可以使用与本文所述的相似或等同的任何方法、装置和材料来实施或检验本发明，但现在描述优选的方法、装置和材料。
为了描述和公开在出版物中描述的、可以结合本发明使用的细胞系、趋化因子和方法，将本文提及的所有出版物均通过引用全文结合到本文中。以上讨论的和在全文中讨论的出版物仅提供在本申请申请日之前的其公开内容。在这一点上决不能凭借先有的发明解释为承认本发明人没有权利说早了这些公开内容的
公开日期。
本发明提供组成型抗病性(CDR1)多肽、多核苷酸和用法。CDR1赋予对植物病原体的抗性，因此可用于产生遗传修饰的抗害虫植物。多核苷酸、多肽、载体和宿主细胞本发明提供基本纯化的CDR1多肽。CDR1最好具有SEQ ID NO:2中提出的氨基酸序列及其保守变异体(参见图3)。本文所用的术语“基本纯化的”是指基本上不含其它蛋白、脂质、糖类或与其天然结合的其它材料的多肽。本领域技术人员可以采用蛋白纯化的标准方法来纯化CDR1。所述基本纯化的CDR1在非还原聚丙烯酰胺凝胶上将产生一条单一的主带。CDR1多肽的纯度可以通过氨基末端氨基酸序列分析来测定。
本发明包括功能性CDR1多肽及其功能片段。本文所用的术语“功能性多肽”是指具有通过限定的功能测定鉴定的生物功能或活性、且与所述细胞中特定生物学、形态学或表型的改变相关的多肽。术语CDR1多肽的功能片段是指保留CDR1活性的所有CDR1片段。生物功能片段例如可以在大小方面改变，从小至能够结合抗体分子的表位的多肽片段至能够参与特征性诱导或编程细胞内表型改变的大的多肽。一个具体的非限制性的CDR1功能片段的实例是编码能够提高PR-1、PR-2或RbohA转录水平的结构域的多肽。另一方面，功能片段可以赋予对特定病原体的抗病性，或可以结合DNA并激活转录或CDR1调节的基因。
对所述CDR1一级氨基酸序列的小的修饰，可能产生与本文所述的未修饰的对应多肽相比具有基本等同活性的蛋白质。这类修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或可以是自发的。本文包括通过这些修饰产生的所有多肽，只要CDR1的生物活性仍存在。另外，缺失一个或多个氨基酸也可能导致所得分子结构的修饰，而不显著改变其活性。缺失可以导致产生可能具有更广泛应用性的更小的活性分子。例如，应该有可能去除CDR1活性所需的氨基末端或羧基末端的氨基酸。显性失活形式的CDRⅠ也包括在此中。
CDR1多肽包括与SEQ ID NO:2中提出的序列基本相同的氨基酸序列。术语基本相同是指氨基酸序列保留本文所述的CDR1活性，例如赋予对植物病原体的抗性。本发明的CDR1多肽包括所述多肽序列的保守变异。本文所用的术语“保守变异”是指一个氨基酸残基被生物上相似的另一残基取代。保守变异的实例包括一个疏水残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)取代另一个疏水残基，或一个极性残基取代另一个极性残基，例如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺，等等。术语“保守变异”也包括用取代的氨基酸替代未取代的母体氨基酸，前提是针对所述取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽免疫反应。
在再一实施方案中，本发明提供基本纯化的多肽，所述多肽经PAGE鉴定为分子量约4.5kDa；被CDR1多肽诱导；且具有诱导植物抗病性的生物活性。实施例13提供了CDR1表达导致特异性诱导4.5kDa蛋白的实验证据。尽管不希望束缚于特定的理论，但认为该蛋白可能在植物中负责提供抗病性。因此，分离出所述4.5kDa蛋白后，则可以将其独立地用来在植物提供抗病性，抗4.5kDa抗体可以用于在植物中提高对病害的易感性。
本发明提供编码所述CDR1蛋白的多核苷酸。这些多核苷酸包括编码CDR1的DNA、cDNA和RNA序列。要理解的是，编码CDR1的所有多核苷酸也都包括在本文中，只要它们编码具有CDR1活性的多肽或其片段。这类多核苷酸包括天然存在的、合成的、和有意操作的多核苷酸。例如，可以对CDR1多核苷酸进行定点诱变。CDR1的多核苷酸序列也包括反义序列和编码显性失活形式的CDR1的序列。本发明的多核苷酸包括由于遗传密码简并的序列。存在20种天然的氨基酸，其中大多数由一个以上的密码子来确定。因此，所有简并的核苷酸序列均包括在本发明中，只要由所述核苷酸序列编码的CDR1多肽的氨基酸序列在功能上未改变。
本文具体公开了编码CDR1多肽的核酸序列(图3)。在SEQ ID NO:1中提出了典型的CDR1核苷酸序列。术语多核苷酸序列或核酸序列是指多聚形式的核苷酸，其长度至少为10个碱基。所谓分离的多核苷酸是指与在衍生其的生物的天然存在的基因组中与其紧密相邻的两个编码序列(一个位于5’端，一个位于3’端)不紧密相邻的多核苷酸。因此，该术语包括例如加入载体中的重组DNA；加入自主复制型质粒或病毒中的重组DNA；或加入原核生物或真核生物基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其它序列的单独的分子(例如cDNA)存在的重组DNA。本发明的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或这两种核苷酸中任一种的修饰形式。该术语包括单链形式和双链形式的DNA。
编码CDR1的多核苷酸包括SEQ ID NO:1、编码显性失活形式的CDR1的多核苷酸和与SEQ ID NO:1互补的核酸序列。互补序列可以包括反义核苷酸。当该序列为RNA时，SEQ ID NO:1中的脱氧核苷酸A、G、C和T分别由核糖核苷酸A、G、C和U取代。本发明也包括上述核酸序列的片段，所述片段的长度至少为15个碱基，足以允许所述片段选择性地杂交至在生理条件下编码SEQ ID NO:2的蛋白或一CDR1的密切相关家族成员的DNA。也包括SEQ ID NO:1的简并变异体、其中T也可以是U的SEQ ID NO:1、以及至少长15个碱基的将杂交至编码CDR1的DNA或RNA的片段。术语选择性地杂交是指在排除非相关核苷酸序列的中等严格或高严格条件下的杂交。
在核酸杂交反应中，用来达到特定严格水平的条件将根据待杂交的核酸的性质而变化。例如，在选择杂交条件时，可以考虑所述核酸杂交区的长度、互补性的程度、核苷酸序列的组成(例如GC相对于AT的含量)和核酸类型(例如RNA相对于DNA)。另一考虑为是否将所述核酸之一固定在例如滤膜上。
渐进式较高严格条件的一个实例如下2×SSC/0.1SDS，室温下(杂交条件)；0.2×SSC/0.1SDS，室温下(低严格条件)；0.2×SSC/0.1SDS，约42℃(中等严格条件)；和0.1×SSC，约68℃(高严格条件)。可以仅采用这些条件之一进行洗涤，例如采用高严格条件，或可以使用每种所述条件，例如以上述所列的顺序，每种条件10-15分钟，重复所列步骤中的任一步骤或所有步骤。然而，如上所述，最适条件将根据所涉及的具体杂交反应而变化，可以凭经验确定。
可以通过将DNA转移到合适的宿主细胞中，在体外表达编码CDR1的DNA序列。“宿主细胞”是载体可以在其中繁殖并表达载体DNA的细胞。所述细胞可以是植物细胞或原核细胞或真核细胞。该术语也包括所述宿主细胞的任何后代。人们理解，不可能所有后代均与亲代细胞完全相同，因为在复制期间可能发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，包括这类后代。稳定转移是指外源DNA在宿主中持续保留，稳定转移的方法是本领域已知的。
在本发明中，可以将所述CDR1多核苷酸插入表达载体中。术语“表达载体”是指本领域已知的、已经通过插入或加入所述CDR1基因序列进行操作的质粒、病毒或其它载体。编码CDR1的多核苷酸序列可以有效地连接至表达控制序列。有效连接是指一种并列，其中所述组分所处的关系允许它们以其计划的方式起作用。连接有效连接至编码序列的表达控制序列，以使在与所述表达控制序列相容的条件下完成所述编码序列的表达。本文所用的术语表达控制序列是指调节与其有效连接的核酸序列表达的核酸序列。如果表达控制序列控制并调节核酸序列的转录以及翻译(合适时)，则表达控制序列有效地连接至所述核酸序列。因此，表达控制序列可以包括合适的启动子、增强子、转录终止子、在蛋白编码基因前面作为起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、保持该基因正确读框以允许正确地翻译mRNA和终止密码子。术语控制序列将最少包括其存在可以影响表达的组分，也可以包括其存在有利的另外的组分，例如前导序列和融合配偶体(partner)序列。表达控制序列可以包括启动子。
所谓启动子是指足以指导转录的最小序列。本发明也包括足以使依赖于启动子的基因表达成为细胞类型特异性、组织特异性控制的或可由外部信号或因子诱导的那些启动子元件；这类元件可以位于该基因的5’或3’区中。
可以任选地将选择标记与所述CDR1多核苷酸连接。本文所用的术语“标记”是指编码允许选择或筛选含所述标记的细胞的性状或表型的基因。所述标记基因最好是抗生素抗性基因，由此可以用合适的抗生素从未转化的细胞中选择转化的细胞。适用于植物中的选择标记的实例包括腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和氨基糖苷3’-O-磷酸转移酶Ⅱ(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。其它合适的标记是本领域技术人员已知的。
可以利用各种各样的宿主-表达系统来表达所述CDR1编码序列。这些系统包括但不限于微生物，诸如用含所述CDR1编码序列的重组噬菌体核酸、质粒核酸或粘粒核酸表达载体转化的细菌；用含所述CDR1编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含所述CDR1编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的、或用含所述CDR1编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；用含所述CDR1编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；或用含所述CDR1编码序列的重组病毒表达载体(例如反转录病毒、腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞系统、或为稳定表达而进行工程改造的转化的动物细胞系统。CDR1抗体本发明的CDR1多肽可以用来产生对CDR1多肽的表位具有免疫反应性或与其结合的抗体。提供基本上由具有不同表位特异性的混合单克隆抗体组成的抗体以及不同的单克隆抗体制剂。
多克隆抗体的制备是本领域技术人员众所周知的。参见例如Green等，Production of Polyclonal Antisera，载于InununochemicalProtoco1s，第1-5页，Manson编辑，Humana Press,1992；和Coligan等，Production of Polyclonal Antiserain Rabbits,Rats,Mice and Hamsters，载于Current Protocols in Immunology,2.4.1部分，1992；所述文献通过引用结合到本文中。
单克隆抗体的制备同样是常规方法。参见例如Kohler和Milstein，Nature 256:495,1975；Coligan等，2.5.1-2.6.7部分，见上文；和Harlow等，载于Antibodies:a Laboratory Manual，第726页，Cold SpringHarbor Pub.,1988；所述文献通过引用结合到本文中。简而言之，通过给小鼠注射包含抗原的组合物，通过取出血清样品证实存在抗体产生，取出脾以获得B淋巴细胞，将所述B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤，克隆所述杂交瘤，选择产生针对所述抗原的抗体的阳性克隆，并从杂交瘤培养物中分离所述抗体，可以获得单克隆抗体。可以通过多种很好建立的技术，从杂交瘤培养物中分离并纯化单克隆抗体。这类分离技术包括使用蛋白A Sepharose的亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析。参见例如Coligan等，2.7.1-2.7.12部分和2.9.1-2.9.3部分，见上文；Bames等，Purification of Immunoglobulin G(IgG)，载于Methods in Molecuar Biology，第10卷，第79-104页，Humana Press,1992。
体外和体内增殖单克隆抗体的方法是本领域技术人员众所周知的。可以在合适的培养基中进行体外增殖，所述培养基例如Dulbecco的改进Eagle培养基或RPMⅠ 1640培养基，任选地补充哺乳动物血清如胎牛血清、或微量元素和生长持续补充物，如正常小鼠腹膜渗出细胞、脾细胞、胸腺细胞或骨髓巨噬细胞。体外生产提供相对纯的抗体制剂，并允许扩大规模以产生大量的所需抗体。可以在气升式反应器中通过同质悬浮培养、在连续搅拌式反应器中或在固定化或截留细胞培养中进行大规模杂交瘤培养。通过将细胞克隆注射到与亲代细胞组织相容的哺乳动物(例如同源小鼠)中，以使得产生抗体的肿瘤生长，可以进行体内增殖。任选地在注射之前，用一种烃、特别是油诸如降植烷(四甲基十五烷)激发所述动物。1-3周后，从该动物的体液中回收所需的单克隆抗体。
本发明所用的术语“抗体”包括完整的分子及其能够结合表位决定簇的片段，诸如Fab、F(ab’)2和Fv。这些抗体片段保留了某些选择性地与其抗原或受体结合的能力，其定义如下(1)Fab，可以通过用木瓜蛋白酶消化完整的抗体，产生一条完整的轻链和一条重链的一部分，来产生含有抗体分子的单价抗原结合片段的Fab片段；(2)Fab’，通过用胃蛋白酶处理完整的抗体，然后还原，产生一条完整轻链和重链的一部分，可以获得抗体分子的Fab’片段；每个抗体分子获得两个Fab’片段；(3)(Fab’)2，可以通过用胃蛋白酶处理完整的抗体、但随后不还原所获得的抗体的片段；F(ab’)2是两个Fab'片段通过两个二硫键保持在一起的二聚体；(4)Fv，定义为含有轻链可变区和重链可变区、作为两条链表达的基因工程片段；和(5)单链抗体(“SCA”)，定义为含有轻链可变区、重链可变区、通过合适的多肽接头连接的作为基因融合单链分子的基因工程分子。
制备这些片段的方法是本领域已知的。(参见例如HarloW和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork,1988，该文献通过引用结合到本文中)。在本发明所用的术语“表位”是指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面聚集(grouping)，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
通过蛋白水解抗体，或通过在大肠杆菌中表达编码该片段的DNA，可以制备本发明的抗体片段。可以用常规方法，通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整的抗体，获得抗体片段。例如，可以通过用胃蛋白酶酶切抗体产生抗体片段，提供命名为F(ab’)2的5S片段。可以用巯基还原剂进一步切割该片段，和任选地用封闭基封闭由二硫键切割产生的巯基，产生3.5S Fab'单价片段。或者，采用胃蛋白酶酶切，直接产生两个单价的Fab’片段和Fc片段。例如Goldenberg的美国专利第4,036,945号和第4,331,647号和其中的参考文献描述了这些方法。这些专利通过引用结合到本文中。也参见Nisonhoff等，Arch.Biochem.Biophys.89:230,1960；Porter,Biochem.J.73:119,1959；Edelman等，Methods in Enzymology，第1卷，第422页，Academic Press，1967；和Coligan等，2.8.1-2.8.10部分和2.10.1-2.10.4部分，见上文。
也可以使用其它切割抗体的方法，诸如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一步切割片段，或其它酶技术、化学技术或基因技术，只要所述片段结合于所述完整抗体识别的抗原。
例如，Fv片段包含结合的VH和VL链。这种结合可以是非共价的，如描述于Inbar等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 69:2659,1972。或者，可以通过分子间二硫键连接所述可变链，或用例如戊二醛的化学试剂交联所述可变链。参见例如Sandhu，见上文。Fv片段最好包含用肽接头连接的VH和VL链。通过构建包含编码通过寡核苷酸连接的VH和VL结构域的DNA序列的结构基因，制备这些单链的抗原结合蛋白(sFv)。将所述结构基因插入表达载体中，随后将该表达载体引入诸如大肠杆菌的宿主细胞中。这些重组的宿主细胞合成具有桥接所述两个V结构域的接头肽的多肽单链。例如WhitloW等，Methods:a Companionto Methods in Enzymologv，第2卷，第97页，1991；Bird等，Science242:423-426,1988；Ladner等，美国专利第4,946,778号；Pack等，Bio/Technology 11:1271-77,1993；和Sandhu，见上文，它们描述了生产sFv的方法。
另一种形式的抗体片段是编码单一互补决定区(CDR)的肽。通过构建编码目的抗体的CDR的基因，可以获得CDR肽(“最小识别单位”)。例如通过用聚合酶链式反应，从抗体生产细胞的RNA合成可变区，制备这种基因。参见例如Larrick等，Methods:a Companion toMethods inEnzymology，第2卷，第106页，1991。
用完整的多肽或含目的小肽的片段作为免疫抗原，可以制备结合于本发明CDR1多肽的抗体。在一个说明性实例中，实施例14(6)中描述的肽DTVSKTVSFKPTDC用于抗体生产。用来免疫动物的多肽或肽可以衍生自翻译的cDNA或化学合成，需要时可以将其缀合于载体蛋白。这类常用的化学偶联至所述肽的载体包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。然后用偶联的肽免疫动物(例如小鼠、大鼠或兔子)。
如果需要，可以例如将抗体所针对的多肽或肽结合于基质，通过将多克隆抗体或单克隆抗体结合于所述基质并从中洗脱，可以进一步纯化多克隆抗体或单克隆抗体。本领域技术人员知道免疫学领域中用于纯化和/或浓缩多克隆抗体以及单克隆抗体的常用的各种技术(参见例如Coligan等，Current Protocols in Immunology，第9单元，WileyInterscience,1991；其通过引用结合到本文中)。
也有可能使用抗独特型技术来生产模拟表位的单克隆抗体。例如，针对第一单克隆抗体制备的抗独特型单克隆抗体将在超变区中具有一个结合结构域，所述结合结构域是所述第一单克隆抗体结合的表位的“映象”。遗传修饰的植物和制备方法在另一实施方案中，本发明提供用于产生与未遗传修饰的植物(例如野生型植物)相比鉴定为抗病性提高的遗传修饰的植物的方法。术语抗病性或病原体抗性是指当暴露于感染时相对于非转基因植物能够保持所需表型的能力。通过将本发明植物的物理特性与已经暴露于或尚未暴露于感染的非转基因植物的物理特性相比较，可以确定抗性水平。观察的典型的物理特性包括能够经受病原体攻击的植物群体增加、延迟侵蚀斑产生、侵蚀斑大小减小等。术语“病害”是指病原体攻击引起的已知引起植物感染症状的任何因子，包括但不限于细菌、线虫、病毒、支原体和真菌。在一个优选实施方案中，病原体为细菌病原体，包括但不限于假单胞菌属。典型的生物包括丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst)和丁香假单胞菌斑生致病变种(Psm)。术语“对病原体的提高的抗性”或“提高的抗病性”是指本发明转基因植株具有的、高于限定的参考水平(诸如相同物种的非转基因植株表现出的抗性水平)的对植物病原体的抗性水平。因此，相对于先前存在的相同物种的植株，测定提高的抗性。在一个实施方案中，所述抗性大大增加，高于限定的参考水平，抗性的增加大于或等于20％，优选大于或等于50％，更优选大于或等于75％，最优选增加95％或95％以上。短语“相同物种的非转基因植株”是指不含有任何异源转基因或不含有任何含衍生自CDR1的序列的转基因的相同物种的植株。本文所用的术语“异源核酸序列”是指对于受体植物宿主为外来的核酸，或所述宿主自身的核酸，只要所述自身核酸由其原始形式进行明显的修饰。用本领域技术人员众所周知的方法，可以测定病原体抗性水平。这些方法包括美国专利第5,530,187中描述的细菌抗性测定和真菌感染测定，该文献通过引用结合到本文中。
本发明的方法包括以下步骤将至少一种编码CDR1的核酸序列引入植物细胞中，以获得转化的植物细胞，其中所述核酸序列与启动子有效连接；在允许表达CDR1多核苷酸产生CDR1多肽的条件下，从转化的植物细胞产生植株；并且此后选择表现出病原体抗性提高的植株。该植物或者可以是重要的，或者可以是双子叶植物。单子叶植物的实例包括但不限于石刁柏、饲料用玉蜀黍和甜玉米、大麦、小麦、稻(例如Japonica或Indica)、高粱、洋葱、珍珠粟、黑麦和燕麦。双子叶植物的实例包括但不限于番茄、烟草、棉花、rapist、蚕豆、大豆、马铃薯、葡萄、草莓、胡椒、莴苣、豆类作物、苜蓿、三叶草、甘蓝类蔬菜或甘蓝(Brassica oleracea)(例如卷心菜、嫩茎花椰菜、花椰菜、抱子甘蓝)、萝卜、胡萝卜、甜菜、茄子、菠菜、黄瓜、南瓜、甜瓜、网纹甜瓜、向日葵和各种观赏植物。木本物种包括杨属、松属、红杉、柏树、橡树等。
本文所用的术语“遗传修饰”是指将一种或多种异源核酸序列引入一种或多种植物细胞中，提供有性能力的有活力的植株。本文所用的术语“遗传修饰的”是指已经通过上述方法产生的植物。本发明的遗传修饰植物能够自花传粉或用相同物种的其它植株异花传粉，以使在生殖系中携带的外源基因可以插入或者育种到农业上有用的植物变种中。本文所用的术语“植物细胞”是指原生质体、产生配子的细胞和再生为完整植株的细胞。因此，包括多个能够再生为完整植株的细胞的种子包括在“植物细胞”的定义内。
本文所用的术语“植物”是指或者完整植株、植物部分、植物细胞或一组植物细胞，例如植物组织。小植株也包括在“植物”的含义中。本发明包括的植物是适合于转化技术的任何植物，包括被子植物、裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。
上面已经描述了术语“异源核酸序列”。任何目的核酸序列均可以与本发明一起使用。例如，该术语包括起源于宿主物种的核酸，其中这种序列有效连接至不同于天然或野生型启动子的启动子。在广义的本发明方法中，至少一种编码CDR1多肽的核酸序列与合适的启动子连接。最好可以将一个以上拷贝的CDR1多核苷酸引入植物中，以增强CDR1表达。例如，多个拷贝的该基因可能具有增加植物中CDR1多肽生产、提供更大抗病性的效应。
通过将包括至少一种编码CDR1的核酸序列的载体引入植物细胞中，产生本发明的遗传修饰植物。为了一次有效地引入植物细胞中，所述CDR1核酸序列必须与在该植物细胞中有效的启动子有效连接，以引起CDR1转录。另外，也可以使用也在植物中识别的聚腺苷酸化序列或转录控制序列。最好是，如本文所述，带有待插入核酸序列的载体也含有一种或多种标记基因，以便可以从培养物中的非转化细胞选择转化细胞。
本发明中的CDR1多肽的表达可以由许多启动子驱动。可以利用CDR1的内源或天然启动子来转录调节该基因，或可以利用作为外源调节序列的异源启动子。关于植物表达载体，合适的病毒启动子包括CaMV的35S RNA启动子和19S RNA启动子(Brisson等，Nature310:511,1984；Odell等，Nature 313:810,1985)；玄参花叶病毒(FMV)的全长转录物启动子(GoWda等，J.Cell Biochem.13D:301,1989)和TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu等，EMBO J.6:307,1987)。或者，可以使用诸如以下的植物启动子核酮糖双磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光诱导型启动子(Coruzzi等，EMBO J.3:1671,1984；Broglie等，Sicence 224:838,1984)；甘露氨酸合酶启动子(Velten等，EMBO J.3:2723,1984)、胭脂氨酸合酶启动子(NOS)和章鱼氨酸合酶启动子(OCS)(在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导质粒上携带)或热激启动子例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等，Mol.Cell.Biol.6:559,1986；Severin等，Plant Mol.Biol.,15:827,1990)。
可用于本发明的启动子包括天然的组成型启动子和诱导型启动子以及工程启动子。CaMV启动子是组成型启动子的实例。为了最有效，诱导型启动子应该1)在缺乏所述诱导物的情况下提供低表达；2)在存在所述诱导物的情况下提供高表达；3)使用不干扰该植物正常生理的诱导方案；和4)对其它基因的表达没有影响。可用于植物中的诱导型启动子的实例包括用化学方法诱导的启动子，诸如被铜离子激活的酵母金属硫蛋白启动子(Mett等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4567,1993)；被取代的苯磺酰胺(例如除草剂安全剂)激活的In2-1和In2-2调节序列(Hershey等，Plant Mol.Biol.,17:679,1991)；和被糖皮质激素诱导的GRE调节序列(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:10421,1991)(参见实施例10)。其它组成型和诱导型启动子是本领域技术人员已知的。
选择的特定启动子应该能够引起有效表达，导致产生有效量的结构基因产物，例如CDR1多肽，引起抗病性提高，最终导致植物产量提高。需要时，可以对用于本发明载体构成物中的启动子进行修饰，以影响其控制特性。
组织特异性启动子也可以用于本发明中。组织特异性启动子的一个实例是在茎分生组织(shoot meristems)中有活性的启动子(Atanassova等，Plant J.2:291,1992)。可用于转基因植物中的其它组织特异性启动子例如cdc2a启动子和cyc07启动子是本领域技术人员已知的。(参见例如Ito等，Plant Mol.Biol.,24:863,1994；Martinez等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7360,1992；Medford等，Plant Cell 3:359,1991；Terada等，Plant Journal,3:241,1993；Wissenbach等，Plant Journal 4:411,1993)。有已知将表达限于特定植物部分或限制对特定刺激物应答而表达的启动子(例如patatin启动子或ADP葡糖焦磷酸化酶的大亚基或小亚基的启动子)。这些限制表达的启动子例如将表达导向根的启动子，可以与CDR1有效连接，以指导主要在块茎中表达。本领域技术人员将知道许多可用于本发明中的这类植物部分特异性启动子。
需要时，可以对用于本发明核酸构成物中的启动子进行修饰，以影响其控制特性。例如，可以将CaMV 35S启动子连接至在无光情况下阻抑ssRUBISCO表达的ssRUBISCO基因部分，以产生在叶中有活性而在根中无活性的启动子。所产生的嵌合启动子可以如本文所述使用。为该描述起见，短语“CaMV 35S”启动子因此包括CaMV 35S启动子的变异，例如通过与操纵基因区连接、随机诱变或控制的诱变等而衍生的启动子。此外，可以改变所述启动子，以含有多个“增强子序列”以有助于提高基因表达。
或者，可以选择所用的启动子，以赋予对诸如真菌感染的病害应答而特异性表达CDR1。真菌病原体对植物的感染激活了防御相关的或致病机理相关的(PR)基因，所述基因编码(1)参与苯基丙酸类似物(phenylpropanoid)代谢的酶，诸如苯丙氨酸氨解酶、查耳酮合酶、4-香豆酸coA连接酶和香豆酸4-羟化酶，(2)修饰植物细胞壁的蛋白质，诸如富含羟脯氨酸的糖蛋白、富含甘氨酸的蛋白和过氧化物酶，(3)降解真菌细胞壁的酶，诸如壳多糖酶和葡聚糖酶，(4)奇异果甜蛋白样蛋白，或(5)尚不知功能的蛋白。已经从许多植物物种中分离出并鉴定了防御相关基因或PR基因。可以使用这些基因的启动子，以在转基因植物受病原体攻击，特别是真菌病原体(诸如Pi)攻击时，在这类植物中获得CDR1的表达。选择的具体启动子应该能够引起CDR1充分表达，导致产生有效量的多肽。
可以任选地将选择标记与待插入的核酸序列连接。术语“标记”如以上定义。最好是，所述标记基因为抗生素抗性基因，由此可以用合适的抗生素从未转化的植物细胞中选择转化的植物细胞。以上描述了合适的选择标记的实例。所述标记基因最好是抗生素抗性基因，由此可以从未转化的细胞中选择转化细胞。用于植物中的合适的选择标记包括腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和氨基-糖苷3’-O-磷酸转移酶Ⅱ(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。其它合适的标记是本领域技术人员已知的。
用于本发明中以转化植物细胞的载体包括与启动子有效连接的、编码CDR1多肽的核酸序列。为了实施按照本发明的转化方法，首先必须构建一种合适的载体，然后将其适当地引入所述植物细胞中。此中所用的载体的构建细节是植物基因工程领域的技术人员已知的。
可以用根癌农杆菌的Ti质粒、毛根诱导(Ri)质粒和植物病毒载体，将用于本发明的CDR1核酸序列引入植物细胞中。(关于这类技术的综述，参见例如Weissbach和Weissbach,Methodsfor Plant MolecularBiology,Ⅷ部分，第421-463页，Academic Press,NY,1988；Grierson和Corey,Plant Molecular Biology，第2版，第7-9章，Blackie,London,1988；和Horsch等，Science,227:1229,1985；每个文献均通过引用结合到本文中)。除了衍生自农杆菌的Ti质粒或毛根诱导(Ri)质粒的植物转化载体之外，还可以利用可选择的转化方法，包括应用脂质体、电穿孔、提高游离核酸摄入的化学试剂、采用病毒或花粉的转化和应用生物弹道(biolistic)转化。
本领域技术人员能够选择用于引入相对完整状态的所述CDR1多核苷酸序列的合适载体。因此，产生携带所引入核酸序列的植物的任何载体应该是足够的。可以预期甚至应用裸露的核酸，也可提供本发明的特性，尽管其效力低。选择的转化方法通常指导载体的选择或是否使用载体。
按照本发明的植物转化可以基本上用植物分子生物学领域的技术人员已知的各种方法中的任一种进行。(参见例如Methods ofEnzvmology，第153卷，Wu和Grossman编辑，Academic Press,1987，通过引用结合到本文中)。本文所用的术语“转化”是指通过引入CDR1核酸序列引起的宿主植物表型的改变。
例如，可以如上简述，利用含Ti质粒的根癌农杆菌，将CDR1核酸序列引入植物细胞中。在使用根癌农杆菌培养物作为转化载体时，最好使用农杆菌的非致癌性菌株作为载体，以使转化组织可能进行正常的非致癌性分化。也优选所述农杆菌带有双元Ti质粒系统。这种双元系统包含1)第一Ti质粒，具有将转移核酸(T-DNA)引入植物所必需的侵入性区，和2)嵌合质粒。后者含有邻接待转移核酸的野生型Ti质粒T-DNA区的至少一个边界区。已经表明双元Ti质粒系统有效转化植物细胞(De Framond,Biotechnology 1:262,1983；Hoekema等，Nature 303:179,1983)。优选这种双元系统，因为它不需要整合到农杆菌的Ti质粒中，老方法需要整合。
在按照本发明的转化中涉及应用农杆菌的方法包括但不限于1)将农杆菌与培养的分离的原生质体共培养；2)用农杆菌转化植物细胞或组织；或3)用农杆菌转化种子、顶端或分生组织。
另外，可以如Bechtold等所述(C.R.Acad.Sci.Paris 316:1194,1993)和本文实施例中所例举的，用农杆菌转化植物完成基因转移。这种方法基于农杆菌细胞悬浮液的真空浸润或浸渍。
将CDR1多核苷酸引入植物细胞的优选方法是用转化的农杆菌感染这种植物细胞、外植体、分生组织或种子，如上所述或如实施例中所述。在本领域已知的合适条件下，让转化的植物细胞生长形成苗、根，并进一步发育为植株。
或者，可以用机械或化学方法将CDR1多核苷酸引入植物细胞中。例如，可以用微量移液管(micropipette)，通过微注射将所述核酸机械转移到植物细胞中。或者，可以采用聚乙二醇，聚乙二醇与被细胞吸收的遗传物质形成沉淀复合物，将所述核酸转移到植物细胞中。
可以通过电穿孔将CDR1多核苷酸引入植物细胞中(Fromm等，Proc.Nalt.Acad.Sci.U.S.A.82:5824,1985，其通过引用结合到本文中)。在该技术中，在含有相关核酸序列的载体或核酸存在下，将植物原生质体电穿孔。高场强度的电脉冲可逆地透化膜，使得可以引入核酸。电穿孔的植物原生质体再形成细胞壁、分裂并形成植物愈伤组织。如本文所述，用表型标记完成对用转化的基因转化的植物细胞的选择。
另一种将CDR1多核苷酸引入植物细胞的方法是用带有待引入核酸的小粒子高速冲击穿透，所述核酸或者包含在这种粒子基质中，或者包含在其表面(Klein等，Nature 327:70,1987)。在Sanford等(Techniques 3:3-16,1991)和Klein等(Bio/Techniques 10:286,1992)中也描述了轰击转化法。尽管通常仅需要单一引入新核酸序列，但该方法尤其提供多次引入。
花椰菜花叶病毒(CaMV)也可以用作将核酸引入植物细胞的载体(美国专利第4,407,956)。CaMV病毒核酸基因组插入亲代细菌质粒中，产生可以在细菌中繁殖的重组核酸分子。克隆后，可以再次克隆所述重组质粒，并通过引入所需核酸序列(例如CDR1序列)进行进一步修饰。然后从亲代细菌质粒上切下所述重组载体的修饰的病毒部分，用来接种植物细胞或植株。
本文所用的术语“接触”是指将CDR1引入植物细胞的任何方法，包括如上所述的化学方法和物理方法。接触最好是指通过用如上所述的CDR1编码核酸转化的根癌农杆菌，将所述核酸或载体引入植物细胞(包括外植体、分生组织或种子)中。
通常，将转化的植物细胞再生，以获得来自转化方法的整个植株。转化的直接产物称为“转基因子”。本文所用的术语“生长”或“再生”是指从植物细胞、一组植物细胞、植物部分(包括种子)或植物段(plant piece)(例如原生质体、愈伤组织或组织部分)培育出整株植株。
从原生质体再生在种间是不同的，但一般通过首先提供原生质体悬浮液开始该过程。在某些物种中，植株的形成可以从原生质体悬浮液诱导，然后成熟并萌发为天然植株。所述培养基一般含有生长和再生必需的各种氨基酸和激素。所用的激素的实例包括植物生长素和细胞因子。有时最好于培养基中加入谷氨酸和脯氨酸，尤其是对于诸如玉米和苜蓿的植物种。有效的再生将取决于培养基、基因型和培养史。如果控制这些变量，则再生可重现。
也可以从植物愈伤组织、外植体、器官或部分发育再生。可以在器官或植物部分再生背景下进行转化。(参见Methods in Enzymology，第118卷，1987，和Klee等，Annual Review of Plant Physiology,38:467，1987)。利用Horsch等，Science 227:1229,1985的叶圆盘-转化-再生法，将圆盘在选择培养基上培养，然后在约2-4周内形成苗。从愈伤组织中切下发育的苗，并移植到合适的促进生根选择培养基中。在出现根后，将发根的小植株尽可能快地移植到土壤中。如果需要，可以将小植株再进行盆栽直至达到成熟。
在无性繁殖的作物中，通过利用插条或组织培养技术，产生多个相同的植株，繁殖成熟的转基因植物。选择所需的转基因子，获得新变种，并无性繁殖用于商业应用。
在种子繁殖的作物中，使成熟的转基因植株自交产生纯合近交植株。所得的近交植株产生含新引入的外源基因的种子。种植这些种子，产生将产生所选定表型(例如增产)的植株。
从再生植株获得的部分例如花、种子、叶片、枝条、根、果实等包括在本发明内，前提是这些部分包含如上转化的细胞。所述再生植株的后代和变异体和突变体也包括在本发明范围内，前提是这些部分包含所引入的核酸序列。
在选择转化的细胞后，人们可以证明所需异源基因的表达。用本领域众所周知的方法，诸如RNA印迹杂交，可以简单地检测用所插入DNA编码的mRNA。所插入的序列也可以通过DNA印迹杂交来鉴定。
可以通过目测，选择与野生型植株相比表现出抗病性提高的植株。(也参见美国专利第5,530,187号，其通过引用结合到本文中)。本发明包括用本发明方法产生的植物以及植物组织和种子。
在再一实施方案中，本发明提供一种方法，用于遗传修饰植物细胞，以使与野生型植株相比由所述细胞产生的植株被鉴定为抗病性提高。该方法包括将至少一种编码CDR1多肽的核酸序列引入植物细胞中转化的植物细胞；在允许CDR1多肽表达的条件下培养所述转化的植物细胞，由此产生抗病性提高的植株。诸如环境条件和启动子诱导条件的条件根据物种的不同而变化，但在一个种内应该相同。
在另一实施方案中，本发明提供产生被鉴定为抗病性提高的植物的方法，所述方法是将CDR1多核苷酸引入植物细胞中，以获得转化的细胞，然后在允许表达CDR1多肽的条件下培养所述转化的植物细胞，以产生抗病性提高的植株。术语“表达”是指增加CDR1 DNA的转录或CDR1 mRNA的翻译或提高CDR1多肽的活性。
在再一实施方案中，本发明提供产生与野生型植物相比抗病性提高的植物的方法，即通过使敏感植物与CDR1启动子诱导量的诱导CDR1基因表达的因子接触，其中CDR1基因表达的诱导导致产生与未接触所述因子的植株相比抗病性提高的植株。所述因子可以诱导例如内源CDR1基因表达。在一个优选实施方案中，所述植株是一种转基因植株，它含有有效连接至编码CDR1的核酸的编码诱导型启动子的核酸。可用于植物中的诱导型启动子的实例包括用化学方法诱导的那些诱导型启动子，诸如被铜离子激活的酵母金属硫蛋白启动子(Mett等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4567,1993)；被取代的苯磺酰胺(例如除草剂安全剂)激活的In2-1和In2-2调节序列(Hershey等，Plant Mol.Biol.,17:679,1991)；和被糖皮质激素诱导的GRE调节序列(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:10421,1991)。术语启动子诱导量是指将CDR1基因表达提高至高于未接触所述因子的植物细胞中CDR1表达所必需的因子的量。例如，可以用转录因子或化学试剂提高来自CDR1天然启动子的基因表达。本发明的方法设想了接触含内源CDR1启动子或重组产生的CDR1启动子的细胞。筛选鉴定新的抗病性基因本发明提供一种方法，通过用至少一种编码CDR1的分离的多核苷酸片段探测核酸文库，并选择与该片段杂交的那些克隆，鉴定与CDR1相关的新的抗病性基因。用多种方法中的任一种，鉴定新的抗病性基因诸如CDR1的同系物。可以按照本领域技术人员已知的多种方法中的任一种，分离出编码新抗病性基因的核苷酸序列。例如，可以或者从cDNA文库，或者从基因组DNA文库中分离编码CDR1同系物的DNA(参见例如Sambrook等，1989,Molecular Cloning:aLaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)。在一个实施方案中，编码CDR1的多核苷酸片段可以用作杂交探针，来探测得自目的靶生物的cDNA文库，其中使用低严格条件。所述探针可以是大片段，或是一种或多种短的简并引物。在一个优选实施方案中，所述探针至少长8个核苷酸。
通过在低严格条件下例如50℃和10×SSC(0.9M盐水/0.09M柠檬酸钠)杂交，探测具有序列相似性的核酸，所述核酸当于55℃在1×SSC中洗涤时仍结合。可以在更严格的条件下，例如于50℃或更高温度和0.1×SSC(9mM盐水/0.9mM柠檬酸钠)下杂交，可以测定序列同一性。通过采用探针，特别是标记的DNA序列探针，人们可以分离出同源或相关的基因。同源基因的来源可以是任何物种，例如植物种、灵长类物种，特别是人；啮齿动物，诸如大鼠和小鼠；犬科动物、猫科动物、牛、绵羊、马、酵母和线虫。
另一种方法是，可以例如如Mullis等的美国专利第4,800,159号所述方法，或采用本领域众所周知的表达克隆法(参见例如Sambrook等，1989,Molecular Cloning:a Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)，用标准的聚合酶链式反应(PCR)扩增合成的寡核苷酸引物，分离出编码新抗病性基因的DNA。根据编码CDR1多肽的多核苷酸序列，本领域技术人员可以容易设计PCR扩增的引物。
在植物物种例如单子叶植物、双子叶植物和木本植物物种之间，同系物通常具有显著的序列相似性，例如在核苷酸序列之间至少75％序列同一性。根据参比序列计算出序列相似性，所述参比序列可以是一组较大的序列，例如保守的基元、编码区或侧翼区。参比序列通常至少长约18个核苷酸(nt)，更常见至少长约30nt，并可以延长至要比较的全序列。序列分析的算法是本领域已知的，例如BLAST，描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。本文提供的序列是在数据库检索中识别CDR1相关和同源蛋白所必需的。
用抗体、反义或核酶抑制CDR1以提高病害易感性在另一实施方案中，本发明提供通过抑制CDR1表达提高植物对病害易感性的方法。例如，可能最好如上所述提供CDR1特异性抗体，或在植物中提供反义寡核苷酸，以提供杀伤或减少植物生长的方法，例如除草。实施例表明，CDR1是一种胞外蛋白，因此容易被CDR1抗体抑制。反义技术提供非常特异性且有效的方法，例如通过降低细胞中CDR1的表达量来抑制CDR1表达。本发明内容中的反义多核苷酸既包括通常长10-50个碱基的称为寡核苷酸的短DNA序列，又包括本身可以超过所述CDR1基因序列长度的较长的DNA序列。可用于本发明的反义多核苷酸与相应的靶mRNA的特定区互补。反义多核苷酸与其靶转录物的杂交因互补碱基配对，可以为高度特异性的。反义寡核苷酸杂交的能力受诸如转录物的长度、化学修饰和二级结构的参数的影响，这些参数可以影响多核苷酸进入靶位点。参见Stein等，Cancer Research 48:2659(1988)。通过将编码反义多核苷酸的DNA区段引入细胞中，以使所述多核苷酸在所述细胞中制备，可以将所述多核苷酸引入所述细胞。通过将反义多核苷酸加入所述细胞的环境中，以使细胞可以直接吸收所述多核苷酸，也可以将反义多核苷酸引入细胞。对于最多长约20个碱基的较短的多核苷酸，优选后一途径。
在选择用于给定多核苷酸的优选长度时，必须权衡利弊，以获得最适特征。例如10-mer至15-mer的较短的多核苷酸虽然提供较高的细胞渗透，但其基因特异性较低。相反，虽然20-30个碱基的较长多核苷酸提供更好的特异性，但它们表现出吸收到细胞中的动力学降低。参见Stein等，硫代磷酸寡脱氧核苷酸类似物，载于“Oligodeoxynucleotides-Antisense Inhibitors of Gene Expression”Cohen编辑，McMillan Press,Lodon(1988)。mRNA靶序列的可及性也很重要，因此，靶mRNA中的回折形成区提供有前景的靶。
在本说明书中，术语“多核苷酸”既包括在大自然中发现的类型的寡聚核酸部分，诸如DNA和RNA的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸结构，也包括能够结合于大自然中发现的核酸的人造类似物。本发明的多核苷酸可以基于通过磷酸二酯键连接的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体，可以基于或通过甲基磷酸酯、硫代磷酸酯或其它键连接的类似物。它们也可以包括具有碱基结构改变或其它修饰、但仍保留结合于天然存在的DNA或RNA结构的能力的单体部分。这类多核苷酸可以用本领域熟知的方法制备，所述方法例如采用市售仪器和可得自Perkin-Elmer/Applied Biosystems(Foser City,CA)的试剂。
磷酸二酯连接的多核苷酸对血清或细胞内的核酸酶作用特别敏感，因此在一个优选实施方案中，本发明的多核苷酸为硫代磷酸酯或甲基磷酸酯连接的类似物，已经表明它们抗核酸酶。本领域的一般技术人员将能够选择用于本发明的其它键合。这些修饰还可以用来提高细胞吸收和所述多核苷酸的稳定性。
在本发明的另一实施方案中，所述反义多核苷酸是通过将表达构成物引入靶细胞中产生的RNA分子。选择如此产生的RNA分子，以具有杂交至cDR1 mRNA的能力。具有这种能力的这类分子可以抑制CDR1 mRNA的翻译，并因此在含有所述RNA分子的植物细胞中增强对病害的易感性。
具有与mRNA靶杂交的能力的多核苷酸可以通过多种机制抑制相应的基因产物的表达。在“翻译停滞”方面，多核苷酸与靶mRNA的相互作用阻断了核糖体复合物的作用，因此阻止信使RNA翻译为蛋白质。Haeuptle等，Nucl.Acids.Res.14:1427(1986)。关于磷酸二酯或硫代磷酸酯DNA多核苷酸，当靶RNA序列杂交至所述DNA寡聚物后，可以用胞外RNA酶H消化靶RNA序列。Walder和Walder,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5011(1988)。关于另外的作用机制，在“转录停滞”方面，看来某些多核苷酸可能形成“三链体(triplex)”或三股螺旋结构，该结构具有含目的基因的双链基因组DNA，因此干扰RNA聚合酶的转录。Giovannangeli等，Proc.Natl.Acad.Sci.90:10013(1993)；Ebbinghaus等，J.Clin.Invest.92:2433(1993)。
在一个优选实施方案中，按照标准方法合成CDR1多核苷酸。通常在可得自多个生产商的自动DNA合成仪上，合成硫代磷酸酯修饰的DNA多核苷酸。这些仪器能够合成纳摩尔量的长至100个核苷酸的多核苷酸。用现代仪器合成的较短的多核苷酸通常适合不用进一步纯化而使用。如有必要，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向层析纯化多核苷酸。参见Sambrook等，MOLECULAR CLONING:A LaboratoryManunal，第2卷，第11章，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor(1989)。
或者，根据反义RNA形式的CDR1多核苷酸在细胞中表达，可将其从标准DNA表达载体引入所述细胞。可以将CDR1 DNA反义序列从标准质粒克隆到表达载体中，该表达载体具有允许高水平或更有效表达所述停留(resident)多核苷酸的特征。这些构成物至少需要启动所插入DNA序列转录的原核启动子序列、植物特异性启动子序列或真核启动子序列。一种优选的表达载体是其中可将表达诱导至高水平的载体。这可以通过加入在合适的宿主细胞中提供增加下游序列转录的调节区来完成。参见Sambrook等，第3卷，第16章(1989)。
例如，可以用聚合酶链式反应(PCR)由已经掺入CDR1 cDNA的质粒的单链cDNA扩增合适的片段，构建CDR1反义表达载体。Fang等，J.Biol.Chem.267 25889-25897(1992)。多核苷酸合成和纯化技术分别描述于Sambrook等和Ausubel等(编辑)，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(Wiley Insterscience 1987)(本文称为“Ausubel”)。通过众所周知的方法进行PCR程序。参见例如Ausubel和Bangham，“聚合酶链式反应占尽优势”，载于PROTOCOLS INHUMAN MOLECULAR GENETICS(Humana Press 1991)。此外，PCR试剂盒可以购自例如Stratagene Cloning Systems(La Jolla,CA)和Invitrogen(San Diego,CA)公司。
按照本发明的反义多核苷酸衍生自所述CDR1 cDNA可读框的任何部分。最好靶向(ⅰ)翻译起始位点周围的mRNA序列和(ⅱ)形成回折结构的mRNA序列。根据人基因组的大小，统计学研究表明，长约14-15个碱基对的DNA区段在基因组中将具有一个特有的序列。因此，为了确保靶向CDR1 RNA的特异性，最好所述反义多核苷酸至少长15个核苷酸。因此，本发明设想的最短的多核苷酸包括对应于所述CDR1cDNA序列的位置1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、2-16、3-17等的核苷酸。位置1是指所述CDR1编码区的第一个核苷酸。在实施例9中，用衍生自完整CDR1基因的反义序列抑制CDR1的表达，由此提高转基因植物对病害的易感性。
不是每种反义多核苷酸均提供对CDR1靶足够的抑制程度或足够的特异性水平。因此，必需筛选多核苷酸，以确定哪种多核苷酸具有合适的反义特征。一种优选的有用反义多核苷酸的测定方法是如实施例9中所述用致病生物感染接受反义构成物的植物，并测定所述植物对病害的易感性。
上述公开内容一般性地描述了本发明。通过参考以下具有实施例，可以获得更全面的理解，本文提供所述实施例仅用于说明，并非意在限制本发明的范围。
实施例1T-DNA活化标记突变体的产生活化标记双元载体pSKI15示于图1中。该载体衍生自pPCVICEn4HPT(Walden等，1994,Plant Molec.Bio.26:152，其通过引用结合到本文中)。该载体具有BAR基因作为植物选择标记，这使得可以在土壤中选择转化体。衍生自花椰菜花叶病毒35S RNA启动子的4个拷贝的转录增强子(4×35S增强子)紧接T-DNA右边界序列定位，预期将其插入植物基因组中，引起相邻植物基因的强异位表达或过量表达。所述T-DNA也含有pBluescript序列，允许通过质粒拯救分离标记的植物基因。用带有pSKI15的农杆菌菌株GV3101直接转化拟南芥属(Arabidopisis)植物(哥伦比亚生态型)。混合从T0植株收获的种子并将其播种在土壤中。用除草剂Basta喷洒幼苗以选择转化体。转化率平均达到约1％。将Basta抗性幼苗(T1植株)单个移植，并在突变体筛选之前培育4周。
实施例2CDR突变体的鉴定为了筛选表现出抗病性增强的显性突变体，用3-4×108cfu/ml毒性丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst)或丁香假单胞菌斑生致病变种(Psm)喷洒4周大的T1转基因单株。感染后4-7天记录表型。没有表现出病症或病症严重程度较低的单株被鉴定为假定的突变体。当在T1代进行筛选时，这种鉴定的突变体推测是显性的，最可能是由于35S增强子驱动的相应基因的激活引起的获得功能的突变。这些突变体被命名为cdr(组成型抗病性)。
对约5000个活化标记系筛选cdr突变体，鉴定出12个推定的cdr突变体。通过或者用Psm或者用Pst感染，再筛选这些推定的cdr突变体的自交后代(T2植株)。cdr1-D是一个经证实的突变体，本文中进一步描述。
cdr1-D最初因其抗Pst而被鉴定。在喷洒Pst后周围的植株感染严重，而该cdr植株几乎完全无症状。cdr1-D植株矮小，叶片略微卷缩且颜色更深。在苗和花的发育中没有观察到异常，cdr1-D植株表现出正常结籽。cdr1-D等位基因的基因分析在241株T2植株中，176株矮小并抗Basta,28株具野生型外观并抗Basta,37株具野生型外观且对Basta易感。没有发现矮小的Basta易感性后代。在迄今测试的超过60株矮小的T2植株中，所有植株均表现出抗病性增强，在测试的20多株野生型外观的植株中没有表现出抗病性增强。因此，在记录的超过80株T2后代中，没有检测到在cdr1-D突变植株矮小和Basta抗性之间的重组。该结果强有力地表明，cdr1-D突变是由T-DNA插入引起的，植株矮小可能是由cdr1-D突变介导的组成型抗病性表达机制的副作用。分离数据表明，cdr1-D突变相对于其野生型等位基因是显性的。得自野生型哥伦比亚和cdr1-D T1植株回交的后代(杂合后代)，cdr1-D和野生型植株的分离比为1∶1，表明cdr1-D突变是显性的。另外，F2分离数据也表明，cdr1-D T1植株含有两个T-DNA插入片段，它们符合39cM的遗传距离。仅一个插入片段与cdr1-D突变有关。DNA分析进一步证明，cdr1-D T1植株含有两个T-DNA插入片段(参见下文)。
实施例3cdr1-D同时抗Pst和Psm通过采用浸渍感染法(参见下文)测定细菌在植物中的生长，进一步监测cdrl-D植株和野生型植株中对Pst的抗性。在野生型植株中，4天后病原体的生长超过接种水平的10,000倍。然而，在cdr1-D突变体中，病原体的生长增加200倍。也检查了cdr1-D植株对Psm的抗性。在用Psm感染后，发现cdr1-D植株无症状。
实施例4防御相关基因在cdr1-D突变体中的激活对病原体侵袭应答，植物在感染部位以及在远离感染部位的组织中激活了一组防御相关基因。这类基因包括编码病理相关蛋白的PR基因，诸如编码苯丙氨酸氨解酶的PLA1和编码谷胱甘肽S-转移酶的GST。组成型表达抗病性的其它突变体累积了高水平的防御相关基因。为了研究所述防御相关基因是否在cdrl-D突变体中组成型表达，检查了PR1、PR2、PAL1、GST1和rbohA转录物的稳态水平。在cdr1-D突变体中PR1和PR2转录物的基础水平相对于健康的野生型植株高约200倍。cdr1-D突变植株积累的rbohA转录物也比野生型植株多至少20倍。然而，在突变植株中GST1的转录物水平仅比野生型植株高2-3倍。另外，在cdr1-D突变植株中基因表达受到抑制。
在病原体侵袭或施用茉莉酮酸后也激活防卫素基因。其激活显然与水杨酸无关。在cdr5和cdr6突变体中，组成型地激活编码防卫素蛋白的拟南芥属基因PFD1.2。然而，在cdr1-D植株中PFD1.2转录物水平没有升高。
实施例5cdr1-D表现出水杨酸(SA)水平和水杨酸糖苷(SAG)水平的提高在对病原体感染的主要抗性应答以及系统获得性抗性诱导中，水杨酸(SA)起重要作用。已经发现，SA和一种糖缀合形式的SA-SA-糖苷(SAG)与先前报道的某些组成型抗病性突变体有关。表2显示了在cdr1-D突变体中SA和SAG的水平比野生型植株中发现的水平分别高约15倍和35倍。cdr1-D介导的抗病性需要水杨酸为了检查cdr1-D突变体表型和水杨酸之间的关系，将cdr1-D植株杂交为表达细菌nahG基因的植株。nahG基因编码水杨酸水解酶，该酶将水杨酸转化为儿茶酚，由此防止水杨酸积累。将nahG植株用作母本，而cdr1-D植株用作父本。选择Basta抗性F1植株。虽然cdr1-DnahG F1植株更坚实，叶片略有波纹，但cdr1-D矮小株型在F1植株中受到抑制。
在cdr1-D nahG植株中检查防御基因激活的抑制。与cdr1-D突变体相对比，cdr1-D nahG植株没有表现出PR1和PR2转录物水平提高。此外，cdr1-D nahG植株不再表现出对毒性Pst的增强抗性。在人工浸润程序后在植物中的细菌生长测定也证明cdr1-D介导的抗性在cdr1-D nahG F1植株中完全被抑制。
该资料表明，nahG抑制的cdr1-D介导的防御基因的激活，增强了抗病性以及矮小性状，证明SA在cdr1-D介导的抗病性途径中是一种必需组分。
实施例6在拟南芥Landsberg erecta(Ler)生态型中cdr1-D介导的信号途径的显性抑制cdr1-D产生自发的微氧化爆发和微侵蚀斑。高水平的rbohA表达提示该突变体可能产生高水平的活性氧物质。为了检查这一点，用DAB染色进行体内和原位检测H2O2。当DAB一与H2O2接触后，DAB就立即局部聚合。DAB聚合物表现出红褐色。有趣的是，在未感染的cdr1-D叶片中，某些细胞产生高水平的H2O2。
大多数组成型抗病性突变体产生可见的自发侵蚀斑。cdr1-D突变体没有表现出明显的侵蚀斑。然而，用锥虫蓝染色技术，在突变体叶片中观察到小的侵蚀斑。
实施例7CDR1基因的克隆和分析与表明T1 cdr1-D植株含有至少两个T-DNA插入物的分离数据一致，在分离自cdr1-D T1植株的混合自交后代的、EcoRⅠ消化的基因组DNA中，DNA凝胶印迹分析检测到两个含有35S增强子序列的基因组片段。5kb EcoRⅠ片段存在于Basta抗性野生型后代和cdr1-D植株中，而10kb片段与cdr1-D等位基因共分离。分离出仅含10kb 35S增强子杂交片段的cdr1-D系。采用质粒拯救(参见下文)分离出含10kb35S增强子的EcoRⅠ片段。拯救的质粒被命名为pCDR1E。PCDR1E的序列分析和限制消化分析表明，它含有约4.5kb的植物序列。
在RNA分析中使用完整的4.5kb植物序列作为探针。在cdr1突变植株中检测到1.5-1.6kb转录物的单一强带，但在野生型植株中检测不到。在或者野生型植株或者cdr1-D植株中没有检测到其它转录物。1.6kb转录物代表候选CDR1基因的编码序列。
用pCDR1E的所述4.5kb植物序列筛选来自cDNA文库(CD4-7)的约4×105个噬菌斑和来自另一大小分离的(1-2kb部分)cDNA文库(CD)的1×105噬菌斑。鉴定出来自后一文库的两个cDNA克隆(pCDR1C1和pCDR1C2)。序列分析表明，这两个cDNA克隆均衍生自同一基因。pCDR1C1的cDNA插入片段长1485bp，且无polyA尾，发现比pCDR1C2的插入片段长64bp。
对pCDR1E和pCDR1C1进行全测序，在图2显示了其组构。所述cDNA衍生自35S增强子下游0.8kb的基因组区(参见图3)。不存在内含子。
将来自pCDR1E、包括一个拷贝的35S增强子和所述候选CDR1基因的XbaⅠ片段，亚克隆到双元载体pBI101中，产生pBI/CDR1X构成物。当转化到野生型植株中时，发现该片段引起的表型与原始cdr1-D突变体中见到的表型相似，证明所述克隆化序列实际上是CDR1基因。
实施例8CDR1蛋白的序列分析CDR1基因含有一个可读框，编码推定分子量为47kDa的437个氨基酸的多肽(图3)。通过PSORT算法(Nakai和Kanehisa,1992)预测推导的蛋白质为胞外蛋白，具有于位置25切割的信号肽。
GenBank数据库的BLAST(Altschul等，1990,J Mol.Biol 215:403-410)检索表明，CDR1与天冬氨酸蛋白酶具有显著的序列同源性。象迄今从多种生物中鉴定出的大多数天冬氨酸蛋白酶一样，CDR1包含2个天冬氨酸蛋白酶结构域。在该数据库中同源性最强的序列是从拟南芥属基因组测序计划鉴定出的功能未知的拟南芥基因组序列(GenBank登录号AC006193，从序列4600至55982)。该序列与CDR1在氨基酸水平上的序列同一性为71％。数据库检索也表明，拟南芥属基因组含有至少14个与CDR1具有显著序列相似性的基因。
实施例9反义抑制CDR1基因引起病害易感性增强将CDR1基因的全长cDNA以反义方向与35S启动子融合。将反义构成物转移到野生型拟南芥属植物(哥伦比亚生态型)中。用无毒性Psm avrRpml感染12株独立的T1转基因植物。其中一个转基因系(抗-12-1)表现出对感染的易感性。
实施例10通过化学试剂瞬时诱导CDR1基因诱导局部和系统抗病性反应将CDR1 cDNA亚克隆到糖皮质激素介导的转录诱导系统中，产生pTA-CDR1，其中CDR1表达在糖皮质激素诱导型启动子的控制之下。为了诱导CDR1基因，用合成激素地塞米松(Dex)喷洒植物。在Dex施用后3小时内检测到CDR1基因表达的诱导，并在2天内达到其最高水平。CDR1基因的诱导在PR2基因和PR1基因的表达上快速转换。发现通过人工Dex浸润局部诱导CDR1，以系统水平(systemicleaves)诱导PR1和PR2表达。
为了检查CDR1的瞬时诱导是否可以增强对病原体感染的抗性，通过在用Dex处理植物后两天喷洒PSt悬浮液，感染TA-CDR转基因植株和对照植株(仅具有pTA载体序列)。所述TA-CDR1转基因植株表现出对感染的抗性增强。局部诱导CDR1基因也使得整个植株对感染的抗性更强。
实施例11CDR1为胞外蛋白针对衍生自推导的CDR1蛋白的近C末端的合成肽，产生抗CDR1多克隆抗体。然后用在大肠杆菌中表达的重组CDR1蛋白，亲和纯化粗制抗体。在包括cdr1-D植侏和Dex诱导的TA-CDR1植株在内的CDR1过量表达植株中，纯化的抗体检测到大小约58kDa的单一多肽。推测在野生型植株中CDR1蛋白的丰度太低，以致用所述抗体检测不到。检测到的CDR1蛋白的大小大于完整的CDR1蛋白的预测大小(47kDa)，表明成熟的CDR1蛋白被修饰。
预测所述CDR1蛋白是胞外蛋白。为了测试这一点，从CDR1过量表达的植株中和对照植株中分离胞间液(IF)。在IF中用所述抗体检测到的CDR1蛋白的丰度比全粗制提取物中的丰度至少高10-15倍，表明CDR1蛋白位于胞间隙。
实施例12得自CDR1过量表达的拟南芥的胞间液局部和系统诱导PR基因表达当将IF人工浸润到野生型叶片中时，发现分离自cdr1-D植株和Dex诱导的TA-CDR1植株的IF强烈诱导PR1和PR2基因表达。为了进一步确定诱导PR蛋白的激卫素活性的分子特征，用10kDa分子量截留滤膜将所述IF进行大小分离。发现较高(＞10kDa)分子量部分(HMWF)负责粗制IF中见到的主要激卫素活性。HMFW也在次生叶中诱导PR基因表达。发现较低分子量部分(LMWF)在初生叶中弱诱导PR基因表达。有趣的是，LMWF能够在次生叶中与HMWF同样有效地诱导PR基因表达。用3kDa分子量截留滤膜进一步进行大小分离，证明LMWF中的激卫素活性的大小为3-10kDa。
实施例13CDR1在胞间液中释放4.5kDa多肽用3kDa分子量截留滤膜浓缩所述IF。在1D PAGE凝胶上分离浓缩的IF，并银染。在分离自CDR1诱导的植株的IF中仅积累约4.5kDa多肽(图4)。这种CDR1释放的多肽可能具有诱导局部和系统抗病性反应的激卫素活性。
实施例14材料和方法1．植物材料在短日光周期(9小时光和15小时黑暗)下于23℃培育用于转化的拟南芥哥伦比亚生态型(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)30天，然后在长日条件下培育直至成熟。
如前所述用携带激活标记载体pSKⅠ15(图1)的农杆菌菌株GV3101 pMP90RK转化拟南芥植株，pSKⅠ15具有用Basta选择的BAR基因。将T1种子种植在土壤中，用Basta喷洒幼苗以选择转化体。将Basta抗性幼苗移植到短日条件下并在此条件下培育约4周，然后筛选抗病性增强的突变体。2．病原体和突变体筛选如所述获得并培养丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst)和丁香假单胞菌斑生致病变种。从过夜培养物中沉淀细菌，并再悬浮于水中至浓度为2-4×108cfu/ml。加入洗涤剂Silwet-L177至终浓度为0.02％。采用人工喷洒瓶，用所述细菌悬浮液喷洒植株，然后覆盖24小时以保持高湿度。记录感染后4-7天的症状。将推定的突变体移植到长日条件下并培育至成熟。3．拟南芥核酸的分离和分析用修改的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法(Saghai-Maroff等，1984)分离拟南芥基因组DNA。从尚未开始抽苔的4-5周大的植株的地上部分分离总RNA。用磷-32标记DNA片段，按照标准方法(Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press)，进行电穿孔、核酸印迹和杂交。4．T-DNA侧翼植物序列的克隆为了克隆邻接T-DNA边界的植物序列，进行质粒拯救法。简而言之，用KpnⅠ或EcoRⅠ消化约2μg的基因组DNA，然后通过用1∶1苯酚∶氯仿抽提1次，然后乙醇沉淀进行纯化。在200μl总反应体积中将纯化的DNA片段连接过夜。用苯酚∶氯仿(1∶1)将连接反应物抽提1次，用乙醇沉淀，将其再悬浮于10μl蒸馏水中。采用如前所述的电穿孔法(Sambrook等，1989，见上文)，用1μl纯化的连接反应物转化大肠杆菌。5．基因组克隆和cDNA克隆的克隆按照标准方法(Sambrook等，1989，见上文)，筛选出1个衍生自Ler生态型的拟南芥基因组文库(Voytas等，1990)和两个衍生自哥伦比亚生态型的cDNA文库。6．抗体产生和纯化以及免疫印迹分析合成14个氨基酸的肽DTVSKTVSFKPTDC，将其注射到兔子中，以产生多克隆抗体。如所述(Sambrook等，1989)，用固定于硝化纤维素滤膜上的CDR1融合蛋白亲和纯化所产生的抗血清。
按照标准方法(Sambrook等，1989)进行蛋白分离和免疫印迹法。7．胞间液的分离将叶片切为0.2-0.5cm宽的切片，并用水冲洗。将叶切片浸入水中，真空浸润5-10分钟，将其吸干，置于20ml或30ml注射器针筒中。将注射器置于合适大小的离心管中，以800g离心10分钟。收集管底部的胞间液。
应该理解，虽然已经结合详细的描述描述了本发明，但前述说明意在说明本发明，而不是限制本发明，本发明由所附的权利要求书的范围限定。其它方面、优点和修改在以下权利要求书的范围内。
权利要求
1．基本纯化的组成型抗病性1(CDR1)多肽。
2．权利要求1的多肽及其保守变异体，其中所述蛋白的氨基酸序列基本上与SEQ ID NO:2中提出的氨基酸序列相同，
3．权利要求1的多肽，其中所述蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:2中提出。
4．编码权利要求1的组成型抗病性1(CDR1)多肽的分离的多核苷酸。
5．编码SEQ ID NO:2中提出的氨基酸序列的分离的多核苷酸。
6．分离的多核苷酸，选自a)SEQ ID NO:1；b)SEQ ID NO:1，其中T也可以是U；c)与SEQ ID NO:1互补的核酸；d)a)、b)或c)的至少长15个碱基的片段，所述片段将与编码SEQ ID NO:2中提出的组成型抗病性1(CDR1)多肽的DNA杂交；和a)、b)、c)或d)的简并变异体。
7．权利要求4的多核苷酸，其中所述多核苷酸分离自植物细胞。
8．权利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸有效连接至表达控制序列。
9．权利要求8的多核苷酸，其中所述表达控制序列为启动子。
10．权利要求9的多核苷酸，其中所述启动子为组织特异性启动子。
11．含有权利要求5的多核苷酸的表达载体。
12．权利要求11的表达载体，还包含一种选择标记。
13．权利要求12的表达载体，其中所述选择标记赋予抗生素抗性。
14．权利要求11的表达载体，其中所述载体为病毒载体。
15．权利要求11的表达载体，其中所述载体为质粒。
16．权利要求15的表达载体，其中所述质粒为根癌农杆菌的Ti质粒。
17．权利要求15的表达载体，其中所述质粒为根癌农杆菌的Ri质粒。
18．含有权利要求11的表达载体的宿主细胞。
19．结合于权利要求1的多肽或结合于所述多肽抗原性片段的抗体。
20．产生与相应的野生型植物相比被鉴定为抗病性提高的遗传修饰植物的方法，所述方法包括a)使植物细胞与编码组成型抗病性1(CDR1)多肽的核酸接触，其中所述核酸与表达控制序列有效连接，获得转化的植物细胞；b)在允许表达组成型抗病性1(CDR1)的条件下由所述转化的植物细胞产生植株；和c)选择表现出所述抗病性的植株。
21．权利要求20的方法，其中所述抗病性提高是对细菌病原体的抗性提高。
22．权利要求21的方法，其中所述细菌病原体选自丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst)和丁香假单胞菌斑生致病变种(Psm)。
23．权利要求20的方法，其中所述表达控制序列为启动子。
24．权利要求20的方法，其中所述接触通过物理方法进行。
25．权利要求20的方法，其中所述接触通过化学方法进行。
26．权利要求20的方法，其中所述植物细胞选自原生质体、产生配子的细胞和再生为完整植株的细胞。
27．权利要求20的方法，其中所述核酸包含于T-DNA衍生载体中。
28．通过权利要求20的方法产生的植物。
29．得自权利要求28的植物的植物组织。
30．得自权利要求28的植物的种子。
31．产生遗传修饰植物细胞和方法，使得由所述细胞产生的植物与野生型植物相比被鉴定为抗病性提高，所述方法包括a)将权利要求5的组成型抗病性1(CDR1)多核苷酸引入植物细胞中，获得转化的植物细胞；并且b)在允许表达组成型抗病性1(CDR1)多肽的条件下培育所述转化的植物细胞，由此产生抗病性提高的植物。
32．权利要求31的方法，其中所述抗病性提高是对细菌病原体的抗性提高。
33．权利要求32的方法，其中所述细菌病原体选自丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst)和丁香假单胞菌斑生致病变种(Psm)。
34．产生与野生型植物相比被鉴定为抗病性提高的植物的方法，所述方法包括使易感性植物与一种因子接触，其中所述因子的量为将组成型抗病性1(CDR1)基因表达提高至高于未接触所述因子的植物中组成型抗病性1(CDR1)表达所必需的组成型抗病性1(CDR1)启动子诱导量。
35．权利要求34的方法，其中所述因子为转录因子。
36．权利要求34的方法，其中所述因子为化学试剂。
37．权利要求34的方法，其中所述抗病性提高是对细菌病原体的抗性提高。
38．权利要求37的方法，其中所述细菌病原体选自丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst)和丁香假单胞菌斑生致病变种(Psm)。
39．产生遗传转化的抗病性植物的方法，所述方法包括将包含有效连接至编码组成型抗病性1(CDR1)多肽的多核苷酸的表达控制序列的核酸序列，引入植物细胞的基因组中，获得转化的植物细胞。
40．权利要求39的方法，其中所述表达控制序列将表达靶向选自叶片、根、苗和茎的植物组织。
41．权利要求39的方法，其中所述多核苷酸为权利要求5的多核苷酸。
42．权利要求39的方法，其中所述抗病性是对细菌病原体的抗性。
43．权利要求42的方法，其中所述细菌病原体选自丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst)和丁香假单胞菌斑生致病变种(Psm)。
44．通过权利要求39的方法产生的植物。
45．衍生自用权利要求39的方法产生的植物的植物组织。
46．衍生自用权利要求39的方法产生的植物的种子。
47．鉴定新的抗病性基因的方法，所述方法包括e)用至少一种权利要求5的多核苷酸片段探测核酸文库；并f)选择所述文库中与所述片段杂交的那些克隆。
48．经PAGE鉴定为分子量约4.5kDa的基本纯化的多肽；所述多肽由CDR1多肽诱导，并具有在植物中诱导抗病性的生物活性。
49．在植物中提高病害易感性的方法，所述方法包括使所述植物与CDR1抑制量的因子接触，以使所述植物对病害的易感性高于未接触所述因子的野生型植物。
50．权利要求49的方法，其中所述因子为抗体。
51．权利要求49的方法，其中所述因子为反义寡核苷酸。
全文摘要
本发明提供所有以下物质基本纯化的CDR1多肽、编码CDR1多肽的分离的多核苷酸、包含CDR1的载体、表达CDR1的宿主细胞和结合CDR1的抗体。本发明还提供生产与野生型植物相比被鉴定为抗病性提高的遗传修饰植物。还提供一种方法，通过用至少一种编码CDR1的多核苷酸片段探测核酸文库，并选择与所述片段杂交的那些克隆，鉴定新的抗病性基因。
文档编号C12N15/29GK1317054SQ99810840
公开日2001年10月10日 申请日期1999年7月14日 优先权日1998年7月14日
发明者R·A·迪科松, 夏亦荠, C·拉姆 申请人:索尔克生物学研究院