专利名称：脂解酶变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过修饰脂解酶的氨基酸序列来改变其底物特异性的方法，还涉及通过这种修饰得到的脂解酶变体。本发明还涉及脂解酶的筛选方法。
背景技术：
脂解酶(如脂肪酶和磷脂酶)能水解底物中的羧酯键，从而释放羧酸。脂解酶对不同酯键的水解活性在多种工业应用中至关重要。
因此，具有高磷脂酶活性的酶具有广泛的用途，例如烘焙食品(US4,567,046)，过滤小麦淀粉水解物(US5,264,367)和处理植物油以减少磷脂含量(US5,264，367)。为了处理植物油，所述酶应该具有低脂肪酶活性，即对甘油三酯中的酯键的水解活性较低。
WO98/45453指出对双半乳糖甘油二酯(DGDG)具有高水解活性的酶可用于烘焙食品。
众所周知，在洗衣用的去污剂中加入脂肪酶有助于除去油污(如EP258,068)。
为了开发食品的口味，如使奶酪变得更加鲜美，需要释放短链脂肪酸，使其成为游离的脂肪酸(FFA)(M.Hanson，ZFL，41(10)，664-666(1990))。
已知几种脂解酶的三维(3D)结构，已知几种结构含有所谓的“盖帽(lid)”，它可以是覆盖活性位点的开或关的状态，Brady等，自然343，767-770(1990)，Brzozowski A M等，自然，351，491(1991)，Derewenda等，生物化学，31(5)，1532-1541(1992)。
F.Hara等，JAOCS，74(9)，1129-32(1997)指出一些脂肪酶具有某种磷脂酶活性，而大多数脂肪酶对磷脂的活性很小或根本没有活性。已有人描述了得自豚鼠胰腺，尖孢镰孢和猪葡萄球菌的脂肪酶的磷脂酶活性，并且已有人尝试将磷脂酶活性与脂肪酶的结构联系起来WO 98/26057；M.D.van Kampen等，脂质的化学和物理学，93(1998)，39-45；A.Hjorth等，生物化学1993，32，4702-4707。
现有技术描述了德列马根霉脂肪酶中的氨基酸取代对链-长度选择性的影响。因此，R.D.Joerger等，脂质，29(6)，377-384(1994)指出变体F95D，F112W和V209W对C4和C8酸的偏好有所改变。R.R.Klein等，JAOCS，74(11)，1401-1407(1997)指出变体V206T＋F95D对C8酸具有较高的选择性。R.R.Klein等，脂质，32(2)，123-130(1997)显示变体V209W＋F112W，V94W和F95D＋F214R对C4和C8酸具有较高的水解活性，这提示决定中等-链长特异性的结构可能存在于酰基结合沟的远侧末端。
发明简述本发明人发现可以对脂解酶的指定区域的氨基酸序列进行改变以修饰脂解酶的底物特异性，从而增加所需的活性水平，或者降低不需要的活性水平。因此，本发明人研制出具有经修饰的氨基酸序列的脂解酶(下文称之为脂解酶变体，或简称为变体)，所述脂解酶具有专用于特定用途的底物特异性。
因此，本发明提供了产生脂解酶变体的方法，和由此方法制备的脂解酶变体。该方法包括a)选择感兴趣的底物和酯键，b)选择亲代脂解酶，c)按下述，在亲代脂解酶活性位点附近的区域，C-末端附近或盖帽区域内选择至少一个氨基酸残基，d)进行改变，所述改变各为插入，缺失或取代氨基酸残基，e)任选在除c)以外的一个或多个位置上进行改变，所述改变各为插入，缺失或取代氨基酸残基，f)制备所得变体，g)检测该变体对所述底物酯键的活性，和h)选择对该酯键的活性有所改变的变体。
因此，一方面，亲代脂解酶具有醇结合位点，所述位点具有含sn2位置的甘油部分，氨基酸改变发生在距碳原子10的范围内，所述碳原子位于底物甘油三酯的甘油部分的sn2位置。
另一方面，亲代脂解酶具有含催化三联体的结构，所述三联体由活性丝氨酸，活性天冬氨酸和活性组氨酸残基组成，待改变的氨基酸位于所述催化性残基的活性组氨酸残基和C末端之间，或属于如下指定的结构组(set)Ei)米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶结构4TGL含有催化三联体和抑制性磷原子(4TGL-inhp)，将其与所述脂解酶的结构进行对比，以使两种结构中催化三联体的原子之间的方差总和最小化，ii)指定结构组A，它由中心位于4TGL-inhp、半径为18的球体内的所述脂解酶原子组成，iii)形成由4TGL-inhP、亲代脂解酶活性丝氨酸残基的Ca原子、和亲代脂解酶活性天冬氨酸残基的Ca原子所指定的第一平面，将结构组B指定为结构组A的亚结构组，组成结构组B的原子与亲代脂解酶活性组氨酸残基的Ca原子位于第一平面的同一侧，iv)形成由4TGL-inhP、亲代脂解酶活性丝氨酸残基的Ca原子、和亲代脂解酶活性组氨酸残基的Ca原子所指定的第二平面，将结构组C指定为结构组A的亚结构组，组成结构组C的原子与亲代脂解酶活性天冬氨酸残基的Ca原子位于第二平面的相反侧，v)形成结构组D，它由结构组B和C并集的原子组成，且溶剂可接近性为15或更高，和vi)形成结构组E，它由含有结构组D的原子或结构组B和C并集的原子的结构中距结构组D的原子不到3.5的氨基酸残基组成。
第三方面，所述脂解酶具有含活性组氨酸残基的活性位点，氨基酸改变发生于活性组氨酸残基和C末端之间的氨基酸序列中。
在本发明的另一方面，氨基酸改变发生于C末端的10个氨基酸残基中。
另一方面，亲代脂解酶具有盖帽，氨基酸改变发生于该盖帽中。
本发明还提供了编码所述变体的DNA序列，含有所述DNA序列的表达载体，携有所述DNA序列或所述表达载体的转化型宿主细胞，本发明还涉及产生所述变体的方法，所述方法包括培养所述转化型宿主细胞以产生变体，并从所得培养液中回收变体。另外，本发明还提供了所述变体的用途。
本发明人还发现具有脂肪酶和磷脂酶活性以及对双半乳糖甘油二酯具有活性的脂解酶能特别有效地用于烘焙食品，他们通过检测这些活性设计出筛选脂解酶的方法。
附图简述
图1显示出脂肪酶序列的对比排列。
发明详述改变的对底物中选定酯键的活性与亲代脂解酶相比，本发明的目的是改变针对至少一种底物中的至少一个选定酯键的活性，即通过降低不需要的活性与需要的活性的比例来增加需要的活性，降低不需要的活性，或改变底物特异性。
因此，具有增加的磷脂酶活性的酶可用于例如烘焙食品或纯化植物油。烘焙食品时可能需要增加对双半乳糖甘油二酯(DGDG)的水解活性。
可能在使用脂肪酶的任何工业中都需要增加脂肪酶活性。为了应用于去污剂或烘焙面包类食品，需要增加对长链(C16-C20)甘油三酯的活性，并且需要通过降低对短链或中等长度链(C4-C8)脂肪酸的活性与对长链脂肪酸的活性的比例来增加对长链脂肪酸的特异性。
为了应用于食品口味的开发(例如使奶酪味道鲜美)，需要增加脂肪酶对短链或中等长度链(C4-C8)甘油三酯的活性。
为了用作纯化植物油所用的磷脂酶，需要降低针对长链(C16-C20)甘油三酯的脂肪酶活性与磷脂酶活性的比例。
亲代脂解酶本发明所用的脂解酶是能水解酯键的酶。这种酶包括例如脂肪酶，如三酰甘油脂肪酶(EC3.1.1.3)，脂蛋白脂肪酶(EC3.1.1.34)，甘油单酯脂肪酶(EC3.1.1.23)，溶血磷脂酶，阿魏酸酯酶和酯酶(EC3.1.1.1，EC3.1.1.2)。括号中的编号是国际生物化学联会酶学委员会根据酶的酶反应性类型指定的分类号。
亲代脂解酶可以是原核生物，尤其是细菌的酶，例如可以是自假单胞菌属的酶。实例如假单胞菌属脂肪酶，如得自洋葱假单胞菌(US5,290,694，pdb文件夹为1OIL)，荚壳假单胞菌(N Frenken等.(1992)，应用环境微生物学.583787-3791，pdb文件夹为1TAH和1QGE)，类产碱假单胞菌(EP 334 462)和假单胞菌菌株SD 705(FERM BP4772)(WO 95/06720，EP721 981，WO96/27002，EP 812 910)的脂肪酶。英壳假单胞菌的脂肪酶序列与粘稠色杆菌的氨基酸序列(DE 3908131 A1)相同。其它例子是细菌的角质酶(cutinase)，如得自如门多萨假单胞菌(US 5,389,536)或恶臭假单胞菌(WO 88/09367)的假单胞菌角质酶。
或者，亲代脂解酶可以是真核生物，如真菌的脂解酶，如腐质霉科和接合菌科的脂解酶和真菌角质酶。
真菌角质酶的例子是Fusarium solani pisi(S.Longhi等，分子生物学杂志，268(4)，779-799(1997))和Humicola insolens的角质酶(US5,827,719)。
腐质霉科的脂解酶由H.lanuginosa菌株DSM 4109的脂肪酶和与所述脂肪酶具有50％以上同源性的脂肪酶组成。H.lanuginosa(Thermomyceslanuginosus的同义词)的脂肪酶描述于EP258068和EP305216，并具有US5,869,438的SEQ ID NO2第1-269位所示的氨基酸序列。
腐质霉科也包括下列脂解酶沙门氏柏干酪青霉的脂肪酶(P25234)，尖孢镰孢的脂肪酶/磷脂酶(EP 130064，WO 98/26057)，异孢镰孢的脂肪酶(R87979)，臭曲霉的溶血磷脂酶(W33009)，米曲霉的磷脂酶A1(JP-A 10-155493)，米曲霉的脂肪酶(D85895)，黑曲霉的脂肪酶/阿魏酸酯酶(Y09330)，塔宾曲霉的脂肪酶/阿魏酸酯酶(Y09331)，塔宾曲霉的脂肪酶(WO98/45453)，黑曲霉的溶血磷脂酶(WO 98/31790)，茄病镰孢的脂肪酶，其等电点为6.9，表观分子量为30kDa(WO96/18729)。
接合菌科含有与米赫根毛霉脂肪酶(P19515)至少50％同源的脂肪酶。该科也包括反射犁头霉，A.sporophora，伞枝犁头霉，A.blakesleeana，A.griseola的脂肪酶(皆描述于WO96/13578和WO 97/27276)和米根霉的脂肪酶(P21811)。括号中的号码表示EMBL，GenBank，GeneSeqp或Swiss-Prot数据库的
发明者柯尔斯滕·博杰森, 阿伦·斯文德森, 克劳斯·C·富格尔桑, 阿南特·P·沙姆康特, 基姆·博尔奇, 杰斯珀·文达, 安德烈亚斯·皮特里, 桑尼·S·格拉德, 吉特·布多尔夫森 申请人:诺维信公司