基因和蛋白质,及它们的用途的制作方法

专利名称：基因和蛋白质,及它们的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌基因和蛋白质的鉴定和它们的用途。特别是，涉及其在免疫治疗和药物筛选中的用途发明背景B群链球菌(Streptococcus)(GBS)，也称为无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)，是多种病症的病原体。特别是，GBS引起；早发性新生儿感染这种感染通常始于子宫中，并在婴幼儿中引起严重的败血症和肺炎，如果未治疗则其是致命的，且即使治疗其也与10-20％的死亡率有关。
迟发性新生儿感染这种感染在出生之后不久直到大约3月龄的一段时间内出现。它引起败血症，在90％的病例中并发有脑膜炎。也发生其它的灶性感染，包括骨髓炎，脓毒性关节炎，脓肿和眼内炎。
成人感染看来这些愈加普遍，频繁地发生在刚生产婴儿的妇女，年长者和无免疫应答的人中。他们的特征在于败血症和灶性感染，包括骨髓炎，脓毒性关节炎，脓肿和眼内炎。
尿道感染GBS是尿道感染的一个原因，且在怀孕期间约占所有感染的10％。
兽医感染GBS在母牛中引起慢性乳腺炎。这又导致牛奶产量减少，并因此消减了相当大的经济价值可以用抗生素治疗GBS感染。然而，免疫接种是优选的。因此希望研制一种能够用于治疗有效的疫苗中的免疫原。
发明概述本发明是基于GBS中一系列基因的鉴定，并与生物体相关，其产物可以位于生物体的外表面并因此可以作为免疫-治疗的靶使用。
根据本发明的一个方面，肽是由可从B群连球菌中获得的包括任一被鉴定为pho1-13，pho3-21，pho2-15，pho3-18，pho3-22，pho3-3，pho3-17，pho2-2，pho1-5，pho3-1，pho3-23，pho3-50，pho1-14，pho2-10，pho3-14，pho3-24和pho3-29的基因的操纵子或其同源物或其功能性片段编码的。这种肽适宜于治疗用途，例如，当分离时。
此处使用术语“功能性片段”以定义保留完整基因或肽活性的基因或肽的一部分。例如，肽的功能性片段可以作为抗原决定因素使用，其在疫苗或抗体的生产中是有益的。
基因片段可以用于编码活性肽。或者，基因片段可能在基因治疗中有用，在体内靶定野生型基因以发挥治疗作用。
本发明的肽可以包含此处被鉴定为SEQ ID NOS。2，4，6，8，10，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33和35的任一氨基酸序列，或其功能性片段。
由于细胞外或细胞表面定位，对于抗GBS的治疗有效的疫苗的生产，本发明的肽可能是适宜的候选物。术语“治疗有效”的意思是包括疫苗的预防作用。例如，疫苗可以包含用于感染治疗的本发明的肽，或用于其表达的工具。可以在怀孕之前或怀孕过程中将疫苗给予女性以保护母亲和新生儿免受GBS感染。
根据本发明的另一方面，肽或基因可以用于筛选潜在的抗微生物药物或用于毒性的检出。
本发明又一方面是此处鉴定的任一产品用于与B群链球菌菌株感染相关病症的治疗或预防的用途。
虽然已经描述了蛋白质在患者治疗中的用途，认为本发明产品的兽医用途也在本发明的范围之内。特别是，肽或疫苗可以用于慢性乳腺炎，特别是在母牛中的治疗。
发明描述本发明是根据B群链球菌菌株M732描述的。然而，所有的GBS菌株和许多其它的细菌菌株可能包括具有与M732肽同源的氨基酸序列的相关肽或蛋白质。可能包括这样的肽的生物体包括，但不限于，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，猪链球菌(Streptococcussuis)，米氏链球菌(Streptococcus milleri)，C群和G群链球菌和肠球菌。每种这些生物体的疫苗均可以按照描述GBS的相同方式来研制。
优选地，对于疫苗生产有益的肽具有大于40％的与此处鉴定的肽的序列相似性。更优选，肽具有大于60％的序列相似性。最优选，肽具有远大于80％的序列相似性，例如，95％相似性。
只要表征了本发明的基因，使用基因序列在其它微生物体中确立同源物是可能的。也可能确定是否其它微生物体具有相似的外表面产物。可以通过在现有的数据库，例如EMBL或Genbank中检索来建立序列同源物。
可以通过本领域已知的方法来纯化和分离本发明的肽或蛋白质。特别是，只要鉴定了基因序列，使用重组技术在适宜的宿主中表达基因序列将是可能的。可以鉴定活性片段和同源物，且其在治疗中是有益的。例如，肽或它们的活性片段可以在疫苗中作为抗原决定簇使用，以引起免疫应答。它们也可以在抗体的制备中使用以用于被动免疫或诊断应用，适宜的抗体包括单克隆抗体，或其片段，包括单链fv片段。抗体的制备方法对于本领域的那些技术人员是显而易见的。
基于减毒微生物体的疫苗的制备对于本领域的那些技术人员是已知的。按照治疗中所用的，所需要的或所期望的，可以用适宜的载体或辅剂，例如明矾配制疫苗组合物，以提供对B群链球菌或其它有关微生物体的有效免疫接种。疫苗制剂的制备对于技术人员来说将是显而易见的。
更通常地，并为本领域的那些技术人员所熟知的，为了治疗的用途，可以选择本发明活性组分适宜的量，适宜的载体或赋形剂，和给药途径。可以根据已知的标准，如所治疗病症的性质/严重性，患者的类型或健康状况等，来选择或确定这些因素。
如下鉴定本发明的产品使用质粒载体pFW-phoA1，pFW-phoA2和pFW-phoA3(Podbielski，A等人，1996。基因(Gene))177137-147)制备GBS(M732菌株)染色体DNA的部分基因库。这些质粒具有组成性大观霉素腺苷酰基转移酶抗生素抗性标记，其赋予高水平的大观霉素抵抗力并因此而容易选择。此外，对于碱性磷酸酶，这些载体包含截短的(无前导序列的(1eaderless))大肠杆菌phoA基因。与上游符合读框BamI限制酶位点相比较，这三个载体仅仅就无前导序列phoA基因是否存在于读框其中这方面不同。因为此截短的大肠杆菌phoA基因缺乏适当的前导序列以输出此酶穿过细菌膜，所以当质粒在大肠杆菌phoA突变体(例如DH5α菌株)中繁殖时，细胞外的碱性磷酸酶活性是缺乏的。产色的碱性磷酸酶底物，XP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸酯)，不进入完整的细菌细胞中，因此仅仅可以检测到被输出的或结合于表面的碱性磷酸酶活性。当被输出或结合于表面的碱性磷酸酶活性存在时，产色XP被切割以产生蓝色色素，且可以通过它们的蓝颜色鉴定相应的细菌菌落。
用BamHI完全消化质粒DNA并使用虾碱性磷酸酶去磷酸化。用Sau3AI部分地消化GBS基因组DNA，在蔗糖梯度上按大小进行分级分离，将大小＜1kb的片段连接到所制备的pFW-phoA载体上。将大肠杆菌菌株DH5α选作克隆宿主，因为它缺少功能性phoA基因。在包含100μg/ml大观霉素和40μg/ml产色XP底物的Luria琼脂上选择重组质粒。包含带GBS插入DNA的质粒大肠杆菌转化子是通过菌落的蓝颜色鉴定的，所述插入DNA互补了无前导序列phoA基因的输出信号序列。以这种方式筛选了包含GBS插入DNA的大约30000不同的重组质粒，互补无前导序列phoA的83个重组质粒用于进一步研究。
从这些实验中选择多种克隆，每种均包含这样的质粒，该质粒包含互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。
一旦在每种克隆中鉴定了基因，那么如下得到完整长度的基因序列是可能的。
为了基因组DNA测序，使用已经鉴定和测序的基因片段设计寡核苷酸引物。设计这些引物以便从得到的序列中以“向外的”方向上测序。一旦读取，检查所得到的序列以了解是否已经到达基因的5’和3’端。这些特征的存在是通过检查同源物序列，以及对于5’端，Shine-Dalgarno共有序列在先的AUG起始密码子(或公认的相等物)的存在，和对于3’端，翻译终止(停止)密码子的存在鉴定的。
一旦完整长度基因得以鉴定，为了完整长度的产品的扩增而设计引物。所使用的引物包括限制酶识别位点(NcoI位于5’端且Eco0109I位于3’端)以让后来的产品克隆入所用的乳球菌(Lactococcal)表达系统。
使用引物进PCR，且将产品克隆入pCR2.1克隆载体(in Vitrogen)。在克隆片段的存在确证之后，使用限制酶NcoI和Eco0109I切断DNA。
片段插入其中的载体是一修饰的pNZ8048版本(Kuipers，0.P.等人，(1998)生物技术杂志(J.Biotech))6415-21)。此载体带有乳球菌复制起点，氯霉素抗性标记，可诱导的乳链菌肽启动子和一种多克隆位点其被用两个10X His标签对多克隆位点的替换而改变所述标签，最5′端侧翼为NcoI位点，中间用多克隆位点分开(包括Eco0109I位点)，终止密码子在3’端。
插入有关基因，以便10X His标签位于相对于编码区的3’位。重组质粒转化进乳酸乳球菌(L.lactis)(菌株NZ9000-Kuipers，O.P.等人，(1998)同上)之后，准备400ml液体培养物，通过将乳链菌肽加入到培养物中，诱导蛋白质的翻译。培养2小时之后，收获细胞并通过玻珠打浆(bead beating)裂解细胞。通过离心纯化最终的细胞裂解物，然后将其通入金属亲和柱(Talon Clonetech)。在用咪唑洗脱结合蛋白之前，反复洗涤柱子。
为了鉴定包含His标签的重组蛋白级分，用SDS-PAGE，Western印迹分析并用抗His抗体探测源自每一级分的等分试样。
然后将所得到的重组蛋白用于免疫新西兰白兔。免疫之前收获免疫前血清。加强免疫之后，处死白兔并收集血清。此血清用于蛋白质印迹，ELISA和动物保护模型中。
使用从动物研究中获得的血清，进行免疫吸附的研究。
B群链球菌在20ml Todd Hewitt肉汤(THB)中培养8小时，在5ml PBS中收获和重悬浮。50μl的等分试样用于在96孔板(Nunc Immuno-Sorb)中包被孔。在4℃过夜以使细菌吸附于板上。用PBS洗涤板两次，然后在37℃时，在PBS中用3％BSA封闭1小时。再洗涤板。在PBS中产生血清的连续10倍的稀释液，并将50μl的这些稀释液加入到板的孔中，双份。覆盖板并在37℃时培养1小时。洗涤该板，将50μl 1∶5000浓度的抗兔碱性磷酸酶缀合次级抗体加入到每个孔中。37℃培养1小时后，再洗涤该板。将50μ1底物(PNPP)加入到每个孔中，在读取405nm处的吸收值之前，让反应进行30分钟。
也进行动物保护的研究以测试在经免疫的兔上的保护效果。
GBS M732在THB冲培养直到达到对数中期阶段—大约5个小时。在计数室中计数细胞，稀释得到浓度为2×107个细菌/ml的免疫前血清或测试血清。将50μl经由腹膜内途径注射进0-1日龄的小鼠中。观察到小鼠的存活超过48小时。
下列实施例举例说明本发明。
实施例1第一个克隆包含在此处被鉴定为SEQ ID NO.1的基因序列，和被鉴定为SEQID NO.2的氨基酸序列，并被分类为pho1-13。
进行pho1-13的氨基酸序列比较。
可以在酿脓链球菌，肺炎链球菌，唾液链球菌(S.salivarius)，大肠杆菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)，Aquifex aeolicus，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)中鉴定GBS pho1-13基因产物的同源物。酿脓链球菌和肺炎链球菌的同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。在所有其它的情况中，上述同源物可以被鉴定为依赖于ATP的Clp蛋白酶蛋白裂解亚基。在ATP和镁存在情况下，Clp蛋白酶的催化活性导致蛋白质水解为小肽(Giffard，P.M.等人1993.普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)139913-920)。此外，已经证明了Clp蛋白酶的ClpP成分被诱导为热激反应的一部分(Kroh，H.E.和L.D.Simon.1990.细菌学杂志(J.Bacteriol).1726026-6034)且可能此亚基或完全的蛋白裂解结构域与细菌的表面结合。
按照上面描述的进行免疫研究，得到下列结果。
治疗 没有动物 没有动物存活时间(小时)24 48PBS 10 70免疫前 37 13 0经免疫的 38 17 9实施例2选择第二个包括称为pho1-14质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。核苷酸和推定的氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.3和4列出。
进行pho1-14的氨基酸序列比较。
可以在酿脓链球菌，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和肺炎链球菌中鉴定GBS pho1-14基因产物的同源物。这些同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。另外，也可以从弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)(SpaR)和假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)(YscT)中鉴定两种可能的同源物。这后两种同源物是相关蛋白质，认为其在细菌的膜上锚定(Bergman，T1994.细菌学杂志1762619-2626)。在弗氏志贺氏菌中，已经证明了spaR基因产物对于上皮细胞的入侵是重要的(Sasakawa，C.et al.1993.细菌学杂志1752334-2346)。此外，spaR基因产物对于侵入质粒抗原的表面呈递来说，也是需要的。在假结核耶尔森氏菌中，类似的蛋白质是Yop分泌系统的组成部分，且对于生物体中的毒性也是重要的。
实施例3选择第三个包括称为pho1-5质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。核苷酸和推定的氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.5和6列出。
进行pho1-5的氨基酸序列比较。
仅可以在酿脓链球菌，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)(sceA)中鉴定出GBS pho1-5基因产物的同源物。酿脓链球菌同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。此外，在源自肉葡萄球菌的sceA基因产物上，几乎没有信息是可以利用的。SceA基因产物表现出某些与源自加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)的促集聚蛋白质相似的序列。基于sceA基因产物的分析，此分子包含充分保守的信号序列且其被很显然地分泌或与细菌细胞的表面结合。
实施例4选择又一个包括称为pho3-3质粒的克隆。此质粒包括补充无前导序列phoA的基因(或其一部分)。核苷酸和推定的氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.7和8列出。
进行pho3-3的氨基酸序列比较。
可以在变异链球菌(Streptococcus mutans)(rmiC)，(cpsM)肺炎链球菌和酿脓链球菌中鉴定GBS pho3-3基因产物的同源物。酿脓链球菌同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。在肺炎链球菌中，同源物可以被鉴定为dTDP-4-酮-6-去氧葡萄糖-3，5-差向异构酶。在其它两种情况下，上面的同源物可以被鉴定为dTDP-4-酮-L-鼠李糖还原酶(rmlC)。在变异链球菌中，编码此酶基因的rmlC是rml基因座的一部分。rml基因座包括三种基因，其显示出与参与dTDP-鼠李糖(变异链球菌多糖胶囊中鼠李糖成分的直接前体)的生物合成中的酶显著的相似性(Tsukioka，Y.等人。1997.细菌学杂志.1773-83)。在肺炎链球菌中鉴定类似的基因座(coffey等人，1998，分子微生物学，1773-83)。几乎所有的链球菌在它们与多糖有关的细胞壁中特征性地具有鼠李糖(Schleifer，K.H.和R.Kilper-Balz.1987.系统应用微生物(Syst.Appl.Microbiol).10∶1-19)，且在链球菌中，很可能dTDP-4-酮-L鼠李糖还原酶与外表面结合。
实施例5选择又一个包括称为pho2-10质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。
核苷酸序列分别作为SEQ ID NO.9列出。由此，鉴定了上游的和下游的编码区，推定的氨基酸序列作为SEQ ID NOS.10和11列出。
进行pho2-10的氨基酸序列比较。
可以在酿脓链球菌，粪肠球菌，Debaryomyces occidentalis(hatI)和大肠杆菌(trkD)中鉴定GBS pho2-10基因产物的同源物。酿脓链球菌和大肠杆菌同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。在酵母菌D.occidentalis中，hak1基因是源自大肠杆菌的trkD基因的同源物(Banuelos，M.A.等人。1995.EMBO J.143012-3027)。大肠杆菌的trkD基因是kup钾摄取系统的一部分。此处鉴定的特定同源物是kup系统钾摄取蛋白。在大肠杆菌中，kup系统是一种组成型钾摄取系统。Kup系统钾摄取蛋白包含高度疏水的N-端，预测其至少12次跨越膜。Kup不与其他已知的膜蛋白序列同源。没有ATP结合的迹象，并提示通过化学渗透的梯度来推动系统(Schleyer，M.&E.P.Bakker，1993.细菌学杂志.1756925-6931)。
实施例6选择又一个包括称为pho2-15质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.12和13列出。
进行pho2-15的氨基酸序列比较。
可以在酿脓链球菌，肺炎链球菌，粪肠球菌和大肠杆菌(gat C和SgcC)中鉴定GBS pho2-15基因产物的同源物。酿脓链球菌，肺炎链球菌和粪肠球菌同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。在大肠杆菌中，gatC和sgcC基因产物可以被鉴定为磷酸烯醇丙酮酸依赖的糖磷酸转移酶系统(PTS)(一种重要的碳水化合物活性-运送系统)的IIC成分。在PTS系统中，IIC成分一般参与细胞外碳水化合物的结合，并与IID成分形成一复合体以组成膜通道(Nobelmann，B.和J.W.Lengeler.1995.生物化学和生物物理学学报(Biochin.Biophys.Acta)126269-72)。
实施例7选择又一个包括称为pho2-2质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.14和15列出。
进行pho2-2的氨基酸序列比较。
可以在粪肠球菌，大肠杆菌(malK和afuC)，枯草芽孢杆菌(glh0)，流感嗜血杆菌(yebM和potA)，酿脓链球菌，肺炎链球菌，和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(malK)中鉴定GBS pho2-2基因产物的同源物。粪肠球菌，酿脓链球菌和肺炎链球菌同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。在所有其它的情况中，同源物代表了ATP-结合转运蛋白，其是ABC型转运蛋白的一部分。ABC型转运蛋白的许多成分是结合于膜或细胞表面，这些系统参与在大分子从细胞外环境向细胞内隔室的转运。
实施例8选择又一个包括称为pho3-14质粒的克降。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定的氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.16和17列出。
进行pho3-14的氨基酸序列比较。且没有同源物能够在任何公开数据库中被鉴定。GBSpho3-14基因产物的一个同源物可以在酿脓链球菌中鉴定，但是这个同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。使用此酿脓链球菌同源物来检索公开的数据库，没有得到更多的信息。既然pho3-14产品互补了无前导序列phoA基因，可以推断此蛋白质(或其一部分)将最可能位于细胞外。
实施例9选择又一个包括称为pho3-17质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.18和19列出。
进行pho3-17的氨基酸序列比较。
可以在变异链球菌和乳酸乳球菌中鉴定GBS Pho3-17基因产物的同源物，具有与N-乙酰基胞壁质酶的相似性。也注意到与未鉴定的基因即源自枯草芽孢杆菌的yubE的相似性。
N-乙酰基胞壁质酶是一种参与细胞分裂中的自溶素。使用这种有限的信息连同pho3-17互补无前导序列phoA基因的事实，可以推断出pho3-17产物将最可能位于细胞外。
实施例10选择又一个包括称为pho3-18质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.20和21列出。
进行pho3-18的氨基酸序列比较。
可以在酿脓链球菌和肺炎链球菌中鉴定GBS Pho3-18基因产物的同源物。这些同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。使用这些酿脓链球菌和肺炎链球菌同源物检索公开的数据库，其表现出某些与外表面和跨越膜蛋白的相似性。既然ORF3-18产物互补了无前导序列phoA基因，可以推断出此蛋白质(或其一部分)将最可能位于细胞外。
实施例11选择又一个包括称为pho3-1质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.22和23列出。
进行pho3-1的氨基酸序列比较。
可以在酿脓链球菌，肺炎链球菌，枯草芽孢杆菌(yutD)和粪肠球菌中鉴定GBS Pho3-1基因产物的同源物。酿脓链球菌，肺炎链球菌和粪肠球菌同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。在枯草芽孢杆菌中，yutD基因产物的功能是未知的。然而可以注意到，yutD基因位于枯草芽孢杆菌染色体中含有参与细胞壁合成的基因的区域中。此DNA序列互补了无前导序列的phoA基因的事实暗示此基因产物位于细胞外。
实施例12选择又一个包括称为pho3-21质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.24和25列出。
进行pho3-21的氨基酸序列比较。
可以在酿脓链球菌，肺炎链球菌，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)(bspA)和路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)(cnb)中鉴定GBS Pho3-21基因产物的同源物。酿脓链球菌，肺炎链球菌同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。在发酵乳杆菌中，bspA基因产物已经被鉴定为基本(basic)细胞表面-定位的蛋白质，其具有某些与细菌溶质-结合蛋白质第III家族相似的序列(Turner，M.S.等人.1997.细菌学杂志.1793310-3316)。在路氏乳杆菌中，cnb基因产物已经被鉴定为胶原结合蛋白，其具有某些与细菌ABC转运蛋白溶质结合组分相似的序列(Roos，S.等人1996.FEMS Microbiol.Lett.14433-38)。
实施例13选择又一个包括称为pho3-22质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.26和27列出。
进行pho3-22的氨基酸序列比较。
可以在粪肠球菌，似马链球菌(Streoticiccys eqyusunukus)(lppC)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(oprI)和嗜热链球菌(orfl42)中鉴定GBS Pho3-22基因产物的同源物。粪肠球菌同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。在似马链球菌中，lppC基因产物已经被鉴定为脂蛋白，其与源自流感嗜血杆菌的E(P4)外膜蛋白质同源(Gase，K.等人1997医学微生物免疫学(Med.Microbiol.Immunol).18663-73)。同样地，荧光假单胞菌oprI基因编码一重要的外膜脂蛋白(Cornelis，P.等人。1989.分子微生物学3421-428)。在嗜热链球菌中，orf142产物已经推定地被鉴定为暴露于细胞表面的脂蛋白，其充当噬菌体kTP-J34和Sfi21的受体(Neve，H.等人。1998.病毒学(Virology)24161-72)。ORF3-22产品显示出了与上面同源物较好的相似性，特别是在N-端。这很可能是无前导序列的phoA基因之互补所需要的区域。并因此作为前导序列。
实施例14
选择又一个包括称为pho3-23质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.28和29列出。
进行pho3-23的氨基酸序列对照。
可以在酿脓链球菌，肺炎链球菌，粪肠球菌和变异链球菌(perM)中鉴定GBSpho3-23基因产物的同源物。酿脓链球菌，肺炎链球菌和粪肠球菌同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定，没有注释是可利用的。在变异链球菌中，perM基因产物已经被假定地鉴定为通透酶，但是关于此蛋白质的功能没有其它信息是可利用的。考虑到pho3-23编码区域互补无前导序列phoA基因，可以推断pho3-17基因产物将最可能位于细胞外。
实施例15选择又一个包括称为pho3-24质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.30和31列出。
进行pho3-24的氨基酸序列比较。
可以在变异链球菌(dltB)，肺炎链球菌，酿脓链球菌，粪肠球菌，干酪乳杆菌(Lactobaillus casei)(dltB)和枯草芽孢杆菌(dltB)中鉴定GBS pho3-24基因产物的同源物。肺炎链球菌，酿脓链球菌和粪肠球菌同源物是从基因组序列数据中鉴定的，且关于基因或基因产物的鉴定。没有注释是可利用的。在变异链球菌，干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌中，dltB基因产物已经被鉴定为基本膜蛋白，其参与穿过细胞膜的活性D-丙氨酸的转运中。dltB基因产物参与D-丙氨酰-脂磷壁酸质的生物合成(Heaton，M.P.和F.C.Neuhaus.1992.细菌学杂志1744707-4717)。在干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌中，认为dltB基因产物包含至少9个膜跨越结构域，显示蛋白质或其一部分暴露于细胞的外面。
实施例16选择又一个包含称为pho3-29质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.32和33列出。
进行pho3-29的氨基酸序列比较。
可以布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(p23或ospC)，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)(owp)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(oprI)中鉴定GBS pho3-29基因产物的同源物。虽然这些同源物彼此并不相关，它们全部代表重要的外表面蛋白。在布氏疏螺旋体中，ospC基因产物已经被鉴定为23-kDa蛋白，它是这种细菌表面上的免疫显性抗原(Padula，S.J.等人。1993感染与免疫(Infect.Immun).615097-5105)。源自短芽孢杆菌的owp基因产物是包括在表面层晶格中的两种主要细胞壁蛋白中的一种(Tsuboi，A.1988.细菌学杂志170935-945)。最后，源自绿脓假单胞菌的oprI基因编码重要的外膜脂蛋白前体(Saint-Onge，A.等人1992普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol).138733-741)。
实施例17选择又一个包含称为pho3-50质粒的克隆。此质粒包括互补无前导序列phoA的基因(或其一部分)。基因的核苷酸和推定氨基酸序列分别作为SEQ ID NOS.34和35列出。
进行pho3-50的氨基酸序列比较。
可以在链球菌(penA，pbp2B，pbpB2)，布氏疏螺旋体(pbp2)，粪肠球菌(pbpC)，金黄色葡萄球菌(Stephylococcus aureus)(pbpA)，麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)(pbpC)和幽门螺杆菌(pbp2)中鉴定GBS Pho3-50基因产物的同源物。在所有的情况中，上面的同源物可以被鉴定为青霉素结合蛋白(PBP)。编码青霉素结合蛋白的基因通常位于与细胞壁合成相关的一簇基因中(Pucci，M.J.等人.1997.细菌学杂志1795632-5635)。此外，PBP到细菌的细胞壁中，某些或全部蛋白质暴露于外部细菌表面的一般整合。
序列表<110>Microscience Limited<120>基因和蛋白质，及其用途<130>REP05973WO<140><141><160>35<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>587<212>DNA<213>B群链球菌<220><221>CDS<222>(1)..(582)<400>1atg atc cca gta gta atc gaa caa aca agt cgt ggt gaa cgt tct tat48Met Ile Pro Val Val Ile Glu Gln Thr Ser Arg Gly Glu Arg Ser Tyr1 5 10 15gat att tac tca cgt ctt tta aaa gat cgt att att atg ttg aca ggc96Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Leu Lys Asp Arg Ile Ile Met Leu Thr Gly20 25 30caa gtt gag gat aat atg gcc aat agt atc att gca cag tta ttg ttt144Gln Val Glu Asp Asn Met Ala Asn Ser Ile Ile Ala Gln Leu Leu Phe35 40 45ctc gat gca caa gat aat aca aag gat att tac ctt tat gtc aat aca192Leu Asp Ala Gln Asp Asn Thr Lys Asp Ile Tyr Leu Tyr Val Asn Thr50 55 60cca ggt ggt tca gta tcg gct gga ctt gct att gtg gac acc atg aac240Pro Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly Leu Ala Ile Val Asp Thr Met Asn65 70 75 80ttc att aaa tcg gac gta cag acg att gtt atg ggg atg gct gct tcg288Phe Ile Lys Ser Asp Val Gln Thr Ile Val Met Gly Met Ala Ala Ser85 90 95atg gga acc att att gct tca agt ggt gct aaa gga aaa cgt ttt atg336Met Gly Thr Ile Ile Ala Ser Ser Gly Ala Lys Gly Lys Arg Phe Met100 105 110tta ccg aat gca gaa tat atg atc cac caa cca atg ggc gga aca ggc384Leu Pro Asn Ala Glu Tyr Met Ile His Gln Pro Met Gly Gly Thr Gly115 120 125gga ggt aca cag caa tct gat atg gct atc gct gct gag cat ctt tta432Gly Gly Thr Gln Gln Ser Asp Met Ala Ile Ala Ala Glu His Leu Leu130 135 140aaa acg cgt cat act tta gaa aaa atc tta gct gat aat tct ggt caa480Lys Thr Arg His Thr Leu Glu Lys Ile Leu Ala Asp Asn Ser Gly Gln145 150 155 160tct att gaa aaa gtc cat gat gat gca gag cgt gat cgt tgg atg agt528Ser Ile Glu Lys Val His Asp Asp Ala Glu Arg Asp Arg Trp Met Ser165 170 175gct caa gaa aca ctt gat tat ggc ttt att gat gaa atc atg gct aat576Ala Gln Glu Thr Leu Asp Tyr Gly Phe Ile Asp Glu Ile Met Ala Asn180 185 190aat gaa taagg 587Asn Glu<210>2<211>194<212>PRT<213>B群链球菌<400>2Met Ile Pro Val Val Ile Glu Gln Thr Ser Arg Gly Glu Arg Ser Tyr1 5 10 15Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Leu Lys Asp Arg Ile Ile Met Leu Thr Gly20 25 30Gln Val Glu Asp Asn Met Ala Asn Ser Ile Ile Ala Gln Leu Leu Phe35 40 45Leu Asp Ala Gln Asp Asn Thr Lys Asp Ile Tyr Leu Tyr Val Asn Thr50 55 60Pro Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly Leu Ala Ile Val Asp Thr Met Asn65 70 75 80Phe Ile Lys Ser Asp Val Gln Thr Ile Val Met Gly Met Ala Ala Ser85 90 95Met Gly Thr Ile Ile Ala Ser Ser Gly Ala Lys Gly Lys Arg Phe Met100 105 110Leu Pro Asn Ala Glu Tyr Met Ile His Gln Pro Met Gly Gly Thr Gly115 120 125Gly Gly Thr Gln Gln Ser Asp Met Ala Ile Ala Ala Glu His Leu Leu130 135 140Lys Thr Arg His Thr Leu Glu Lys Ile Leu Ala Asp Asn Ser Gly Gln145 150 155 160Ser Ile Glu Lys Val His Asp Asp Ala Glu Arg Asp Arg Trp Met Ser165 170 175Ala Gln Glu Thr Leu Asp Tyr Gly Phe Ile Asp Glu Ile Met Ala Asn180 185 190Asn Glu<210>3<211>218<212>DNA<213>B群链球菌<220><221>CDS<222>(1)..(216)<400> 3atc aga gca tat tct ggt cct ctt tcg gtt ttc ctg cca cgt ttt aaa48Ile Arg Ala Tyr Ser Gly Pro Leu Ser Val Phe Leu Pro Arg Phe Lys1 5 10 15gct tgt gat ara ata gtc aat gtg agg agg act atc atg tta ttt aag96Ala Cys Asp Ile Ile Val Asn Va1 Arg Arg Thr Ile Met Leu Phe Lys20 25 30gaa aaa att cct gga cta ata tta tgc ttt att att gct ata cca tct144Glu Lys Ile Pro Gly Leu Ile Leu Cys Phe Ile Ile Ala Ile Pro Ser
35 40 45tgg ttg ctt ggg ctt tat ctc cct tta ata gga gca cca gtc ttt gct 192Trp Leu Leu Gly Leu Tyr Leu Pro Leu Ile Gly Ala Pro Val Phe Ala50 55 60atc ttg att gga ata att gtt gga tc 218Ile Leu Ile Gly Ile Ile Val Gly65 70<210>4<211>72<212>PRT<213>B群链球菌<400>4Ile Arg Ala Tyr Ser Gly Pro Leu Ser Val Phe Leu Pro Arg Phe Lys1 5 10 15Ala Cys Asp Ile Ile Val Asn Val Arg Arg Thr Ile Met Leu Phe Lys20 25 30Glu Lys Ile Pro Gly Leu Ile Leu Cys Phe Ile Ile Ala Ile Pro Set35 40 45Trp Leu Leu Gly Leu Tyr Leu Pro Leu Ile Gly Ala Pro Val Phe Ala50 55 60Ile Leu Ile Gly Ile Ile Val Gly65 70<210>5<211>705<212>DNA<213>B群链球菌<220><221>CDS<222>(1)..(705)<400>5atg aat aaa aga aga aaa tta tca aaa ttg aat gta aaa aar caa cat48Met Asn Lys Arg Arg Lys Leu Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Gln His1 5 10 15tta gct tat gga gct atc act tta gta gcc ctt ttt tca tgt att ttg96Leu Ala Tyr Gly Ala Ile Thr Leu Val Ala Leu Phe Ser Cys Ile Leu20 25 30gct gta acg gtc atc ttt aaa agt tca caa gtt act act gaa tct ttg144Ala Val Thr Val 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10 15gcc att cct gaa ttg ttg gaa ttc gat att acc gtt cgt gga gac aac96Ala Ile Pro Glu Leu Leu Glu Phe Asp Ile Thr Val Arg Gly Asp Asn20 25 30cgt gga tgg ttc aaa gag aac ttt caa aaa gaa aaa atg ata ccg ctt144Arg Gly Trp Phe Lys Glu Asn Phe Gln Lys Glu Lys Met Ile Pro Leu35 40 45ggt ttc cca gaa agc ttc ttt gag gca gac aaa cta caa aat aat att192Gly Phe Pro Glu Ser Phe Phe Glu Ala Asp Lys Leu Gln Asn Asn Ile50 55 60tcg ttt aca aaa aaa aat act ttg cga ggt ctc cat gca gag cct tgg240Ser Phe Thr Lys Lys Asn Thr Leu Arg Gly Leu His Ala Glu Pro Trp65 70 75 80gat aaa tat gtt tcg atc gct gat gaa gga cgt gtg atc ggt act tgg288Asp Lys Tyr Val Ser Ile Ala Asp Glu Gly Arg Val Ile Gly Thr Trp85 90 95gtt gac ctc cgt gaa ggt gac agt ttt ggt aac gtt tac caa acg att336Val Asp Leu Arg Glu Gly Asp Ser Phe Gly Asn Val Tyr Gln Thr Ile100 105 110atc gat gcc tca aaa ggt att ttt gtt cca cgc ggc gtt gct aat ggt384Ile Asp Ala Ser Lys Gly Ile Phe Val Pro Arg Gly Val Ala Asn Gly115 120 125ttc caa gtt ctt tca gat aaa 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Ile Ala Asp Glu Gly Arg Val Ile Gly Thr Trp85 90 95Val Asp Leu Arg Glu Gly Asp Ser Phe Gly Asn Val Tyr Gln Thr Ile100 105 110Ile Asp Ala Ser Lys Gly Ile Phe Val Pro Arg Gly Val Ala Asn Gly115 120 125Phe Gln Val Leu Ser Asp Lys Ala Ala Tyr Thr Tyr Leu Va1 Asn Asp130135 140Tyr Trp Ala Leu Glu Leu Lys Pro Lys Tyr Ala Phe Val Asn Tyr Ala145 150 155 160Asp Pro Asn Leu Gly Ile Gln Trp Glu Asn Xaa Glu Glu Ala Glu Val165 170 175Ser Glu Ala Asp Lys Asn His Pro Leu Leu Lys Asp Val Lys Pro Leu180 185 190Lys Lys Glu Asp Leu195<210>9<211>1217<212>DNA<213>B群链球菌<220><221>CDS<222>(1)..(570)<220><221>CDS<222>(679)..(945)<400>9tat tat tta arc gga ggg ttg gca gaa atg caa cat gtc aat cat tct48Tyr Tyr Leu Ile Gly Gly Leu Ala Glu Met Gln His Val Asn His Ser1 5 10 15tct ttt gat aaa gca tca aaa gca gga ttt att att gct tta ggc att96Ser Phe Asp Lys Ala Ser Lys Ala Gly Phe Ile Ile Ala Leu Gly Ile
20 25 30gtt tat gga gat att ggt aca agc cca ctc tat acg atg caa tca ttg 144Val Tyr Gly Asp Ile Gly Thr Ser Pro Leu Tyr Thr Met Gln Ser Leu35 40 45gtt gaa aac caa ggt ggt att tct agt gtc aca gaa tcg ttt atc tta 192Val Glu Asn Gln Gly Gly Ile Ser Ser Val Thr Glu Ser Phe Ile Leu50 55 60ggt tct ata tct tta atc ata tgg acc ttg aca ctt att aca act atc 240Gly Ser Ile Ser Leu Ile Ile Trp Thr Leu Thr Leu Ile Thr Thr Ile65 70 75 80aag tat gtg ctt gta gct tta aag gcg gat aat cac cac gaa ggt ggt 288Lys Tyr Val Leu Val Ala Leu Lys Ala Asp Asn His His Glu Gly Gly85 90 95att ttt tct tta tat acc ctt gtt aga aaa atg aca cct tgg tta att 336Ile Phe Ser Leu Tyr Thr Leu Val Arg Lys Met Thr Pro Trp Leu Ile100 105 110gtt ccg gct gtt att gga ggt gca acc ttg ttg tca gat gga gct ttg 384Val Pro Ala Val Ile Gly Gly Ala Thr Leu Leu Ser Asp Gly Ala Leu115 120 125acg cca gct gta acc gta ctt cag ccg tta agg att aaa gta gtt cct 432Thr Pro Ala Val Thr Val Leu Gln Pro Leu Arg Ile Lys Val Val Pro130 135 140agt ttg cag 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Leu Leu Ile Met Leu Ile Val100 105 110aat att gtt atg att gtt atg aaa aaa aaa cgg ata cct tag378Asn Ile Val Met Ile Val Met Lys Lys Lys Arg Ile Pro115 120 125<210>13<211>125<212>PRT<213>B群链球菌<400>13Met Gln Val Phe Leu Asn Ile Val Asn Lys Phe Phe Asp Pro Val Ile1 5 10 15His Met Gly Ser Gly Val Val Met Leu Ile Val Met Thr Gly Leu Ala20 25 30Net Ile Phe Gly Val Lys Phe Ser Lys Ala Leu Glu Gly Gly Ile Lys35 40 45Leu Ala Ile Ala Leu Thr Gly Ile Gly Ala Ile Ile Gly Ile Leu Thr50 55 60Gly Ala Phe Ser Glu Ser Leu Gln Ala Phe Val Lys Asn Thr Gly Ile65 70 75 80Asn Leu Ser Ile Ile Asp Val Gly Trp Ala Pro Leu Ala Thr Ile Thr85 90 95Trp Gly Ser Pro Tyr Thr Leu Tyr Phe Leu Leu Ile Met Leu Ile Val100 105 110Asn Ile Val Met Ile Val Met Lys Lys Lys Arg Ile Pro115 120 125<210>14<211>705<212>DNA<213>B群链球菌<220><221>CDS<222>(118)..(705)<400>14ggatcgggcg caagcttaac gattcttttt aaaatcatta aattttaaaa caaatttcag 60acatattgcc aaagttttga tattattact ataatatagt ttgtagagga gaataat 117atg ggc caa gaa cct arc atc gaa 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1.一种由可从B群链球菌中获得的包括此处被鉴定为phol-13，pho3-21，pho2-15，pho3-18，pho3-22，pho3-3，pho3-17，pho2-2，pho1-5，pho3-1，pho3-23，pho3-50，pho1-14，pho2-10，pho3-14，pho3-24和ho3-29的基因中任一个的操纵子或其同源物或其功能性片段编码的肽。
2.权利要求1的肽，包含在此处被鉴定为SEQ ID NOS.2，4，6，8，10，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33和35的任一氨基酸序列。
3.用于治疗用途的权利要求1或权利要求2的肽。
4.一种编码用于治疗用途的权利要求1或权利要求2的肽的多核苷酸。
5.一种表述权利要求1或权利要求2的肽的转化宿主。
6.一种疫苗，包含权利要求1或权利要求2的肽，或用于其表达的工具。
7.权利要求1-5中任何一项的产品用于筛选潜在药物或用于毒性检出的用。
8.权利要求1-5中任何一项的产品在制备用于治疗或预防与细菌感染相关的病症的药物中的用途。
9.权利要求8的用途，其中的感染是B群链球菌感染。
10.权利要求8或权利要求9的用途，其中的感染是灶性感染。
11.权利要求8或权利要求9的用途，其中的感染是尿道感染。
12.针对权利要求1或权利要求2的肽所产生的抗体。
全文摘要
根据本发明,在B群链球菌中鉴定一系列基因,其产物可能与生物体的外表面结合。该基因或其功能性片段在制备治疗制剂,例如使患者对微生物感染产生免疫的疫苗中可能是有益的。
文档编号C12Q1/37GK1331745SQ99814780
公开日2002年1月16日 申请日期1999年12月22日 优先权日1998年12月22日
发明者M·J·G·休斯, J·D·桑坦格罗, J·D·莱恩, P·埃弗里斯特, R·斯尔德曼, J·C·穆尔, R·K·威尔逊, R·J·多布森, G·杜根 申请人:微科学有限公司