专利名称：受内分泌扰乱子影响之基因的检测方法
技术领域：
本发明涉及影响活体稳态的内分泌扰乱子及受该物质影响之基因的检测方法。
背景领域内分泌扰乱子(常指环境激素)统指从环境中释放的、已发现具有激素样活性或抗激素活性的化学物质。已报道由于内分泌扰乱子对野生动物生态系统的影响，导致(其)生殖能力改变(尤其是雄性雌性化)、生殖能力下降、生育率降低、后代存活率降低、生殖行为异常和类似情况。尽管尚未证实，已怀疑由于内分泌扰乱子对人类健康的影响，导致人类出现精子数目减少、子宫内膜异位症、不育、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌和类似情况。
环境部“扰乱内分泌的外源化学物工作组”在间期报告(1997年7月)中报导了认为产生内分泌紊乱的物质(或物质群)。然而，此类物质据认为在未来的研究和实验期间还会增加。
已知确定内分泌扰乱子的方法分为两种，即体外方法和体内方法。前者方法示例包括测量与雌激素或雄激素受体结合活性的方法，和测量激素合成酶系抑制活性的方法。后者方法示例包括测量出生后不同天数大鼠体内多种激素的产生和异常的组织形成的方法，测量青蛙异常变态的方法和鱼异常成熟的方法(分析化学(AnalyticalChemistry)，70(15)528A-532A(1998))。
然而，迄今尚未完全证实疑为内分泌扰乱子的物质是否确实产生内分泌紊乱。另外，倘若它们产生内分泌紊乱的话，尚未完全证实其影响机制以及可能会产生危险的摄入量和摄入时程。
例如，当前的受体结合实验是必需和重要的初步筛选方法。然而，此方法所得的结果并不能保证内分泌扰乱子的身份。具体地，雌二醇(一种天然雌激素)、二乙基己烯雌酚(一种合成的雌激素)、异黄酮(豆类含有的一种成分，对人无害)和二酚-A(疑为内分泌扰乱子的物质)与雌激素受体结合，虽然每种物质的EC50值各不相同。这样，不能根据此分析方法确定每一物质的内分泌干扰活性程度。同样，不能根据任何传统方法来确定该活性，包括使用酵母或培养细胞的分析系统和称重小鼠子宫的系统。
换句话说，当前测量激素受体结合活性或激素合成酶系抑制活性的方法是测定内分泌扰乱子的必需条件。但其不是充分条件。另外，体内测量对大鼠、青蛙、鱼或类似物的生长或变态之影响的方法敏感性低且复杂，并需要长时间操作大量样本。
还有，虽然可用上述传统分析方法来分析可能的内分泌扰乱子与受体的关系，但不能用其分析下游信号传导系统。
如上所述，为解决环境激素的问题，需要鉴别内分泌扰乱子和确定该物质对内分泌系统的影响。这样，需要一些方法来分析何种信号传导通路受内分泌扰乱子的影响和何种物质产生内分泌紊乱。
发明目的本发明的主要目的是提供(1)受内分泌扰乱子影响之基因的检测方法；(2)受内分泌扰乱子影响之基因的检测方法，包括通过该方法对所检测基因的表达进行测量；(3)DNA阵列，其上固定有受内分泌扰乱子影响的基因或源自该基因的DNA片段；和(4)可能产生内分泌紊乱的物质的检测方法。
发明概述经过大量研究，本发明者构建了一种快速检测许多受内分泌扰乱子影响之基因的方法，该方法灵敏性高并能同时操作。本发明者发现了一种应用固定有所述基因或其片段的DNA阵列来检测内分泌扰乱子的方法。另外，本发明者构建了一种可能会产生内分泌紊乱的物质的检测方法。这样，本发明得以完成。
总之，本发明涉及[1]受内分泌扰乱子影响之基因的检测方法，其特征在于该方法包括制备取自细胞、组织或生物、含有mRNA或其cDNA的核酸样本，该细胞、组织或生物已经与含一种内分泌扰乱子的样本相接触；使该核酸样本与一种DNA阵列杂交，该阵列上固定有可能受该内分泌扰乱子影响的基因或来自受该内分泌扰乱子影响之基因的DNA片段；和通过比较该结果与用对照样本制备的核酸样本所得结果，选择受该内分泌扰乱子影响的基因；[2]根据上述[1]的方法，其中应用的基因选自如下(1)核受体基因或与核受体转录偶联有关的基因；(2)与激酶类信号传导有关的基因；(3)与性腺分化有关的基因；(4)与受体类激酶有关的基因；(5)与中间纤维标志有关的基因；(6)与细胞周期或生长调节有关的基因；(7)癌基因、与癌基因有关的基因或与肿瘤抑制有关的基因；(8)与凋亡有关的基因；(9)与DNA损伤应答、修复或重组有关的基因；(10)受体基因与受体有关的基因；(11)与细胞死亡或分化调节有关的基因；(12)与细胞黏附、迁移或侵袭有关的基因；(13)与促血管生成有关的基因；(14)与细胞侵袭有关的基因；(15)与细胞-细胞间的作用有关的基因；(16)Rho家族、GTP酶或其调节因子的基因或与之有关的基因；和(17)生长因子或细胞因子的基因或与之有关的基因，或来自该基因的DNA片段。
内分泌扰乱子的检测方法，其特征在于该方法包括通过上述[1]或[2]的方法对所检测基因的表达进行测量；[4]根据[3]的方法，其中内分泌扰乱子选自以下类别(1)二氧芑(dioxins)；(2)有机氯化合物；(3)酚类；(4)邻苯二甲酸酯；(5)芳香族烃；(6)杀虫剂；(7)有机锡化合物(organotin)；(8)雌激素；或
(9)全氯五环癸烷(mirex)、毒杀芬(toxaphene)、丁醛肟威(aldicarb)或开蓬(kepone)；[5]可能干扰内分泌的物质的检测方法，其特征在于该方法包括制备取自细胞、组织或生物、含有mRNA或其cDNA的核酸样本，该细胞、组织或生物已经与怀疑含有可能干扰内分泌之物质的样本相接触；使该核酸样本与一种DNA阵列杂交，该阵列上固定有受内分泌扰乱子影响的基因或来自受该内分泌扰乱子影响之基因的DNA片段；和通过比较该结果与用对照样本制备的核酸样本所得结果，检测可能干扰内分泌的物质；[6]根据上述[5]的方法，其中将可能干扰内分泌的物质划分为(1)二氧芑；(2)有机氯化合物；(3)酚类；(4)邻苯二甲酸酯；(5)芳香族烃；(6)杀虫剂；(7)有机锡化合物；(8)雌激素；或(9)全氯五环癸烷、毒杀芬、丁醛肟威或开蓬；[7]检测受内分泌扰乱子影响之基因的DNA阵列，其上固定有受内分泌扰乱子影响的基因或可能受内分泌扰乱子影响的基因，或该基因的DNA片段；[8]根据上述[7]的DNA阵列，其上固定的基因选自如下(1)核受体基因或与核受体转录偶联有关的基因；(2)与激酶类信号传导有关的基因；(3)与性腺分化有关的基因；(4)受体类激酶的基因或与之有关的基因；(5)中间纤维标志基因或与之有关的基因；(6)与细胞周期或生长调节有关的基因；(7)癌基因、与癌基因有关的基因或与肿瘤抑制有关的基因；(8)与凋亡有关的基因；
(9)与DNA损伤应答、修复或重组有关的基因；(10)受体基因与受体有关的基因；(11)与细胞死亡或分化调节有关的基因；(12)与细胞黏附、迁移或侵袭有关的基因；(13)与促血管生成有关的基因；(14)与细胞侵袭有关的基因；(15)与细胞-细胞间的作用有关的基因；(16)Rho家族、GTP酶或其调节因子的基因或与之有关的基因；和(17)生长因子或细胞因子的基因或与之有关的基因，或来自该基因的DNA片段；和[9]根据上述[7]或[8]的DNA阵列，其中该基因或来自该基因的DNA片段固定在载玻上。
发明详述(1)本发明检测受内分泌扰乱子影响之基因的方法如此处所用，内分泌扰乱子(也称为外源性内分泌扰乱子或环境激素)是指进入动物活体时可影响活体内天然产生的激素的正常活性的物质。内分泌扰乱子包括保持、提高或抑制激素正常活性的物质。可能影响激素正常活性的物质也包括在此定义内。
当前，约有70种物质(或物质群)疑为具有内分泌扰乱活性。在相应物质之分析方法的基础上将日本环境化学协会第24次会议(1998)摘要中的物质划分如下(1)类别1有机氯化合物(如一般的有机氯化合物、多氯化联苯(PCB))；(2)类别2酚类(如一般的酚、二酚-A、2，4-二氯酚、五氯酚)，(3)类别3邻苯二甲酸酯(如一般的邻苯二甲酸酯)；(4)类别4芳香烃(如苯并芘、二-2-乙基己基己二酸酯(DEHA)、二苯甲酮、4-硝基甲苯、苯乙烯二聚体和三聚体、1，2-二溴基-3-氯丙烷、正丁苯)；(5)类别5杀虫剂(如一般的杀虫剂、2，4，5-T(三氯苯氧乙酸)、2，4-D(二氯苯氧乙酸)、苯菌灵、氨基连三唑、乙肟威)；(6)类别6有机锡化合物；(7)雌激素；不能划分入上述七种类别的二氧化物；和排除在这些类别之外的物质，即全氯五环癸烷、毒杀芬、丁醛肟威或开蓬(十氯酮)。这些类别和物质见表1。
表1
已知这些物质具有以下基本活性1)对激素受体的直接活性(如合成的激素制剂、DDT、邻苯二甲酸酯等)；2)通过其他受体的活性(如二氧化物等)；3)抑制代谢的活性(如类固醇代谢抑制剂、芳香酶或5α-还原酶抑制剂等)和4)通过其他系统的活性(如影响神经系统或免疫系统的物质)。这样，它们的作用模式是不同的。[Kagaku(化学(Chemistry))，53(7)12-15(1998)]。
如此处所用，受内分泌扰乱子影响的基因定义为，与对照相比上述内分泌扰乱子提高或抑制其表达的基因。该基因数可为一个、两个或更多。其表达受内分泌扰乱子直接或间接影响的某物质基因或与之有关的基因，可作为固定在本发明的DNA阵列上的基因得以选择。可优选应用表达得以提高的基因和表达得以抑制的基因。优选的此类候选基因(即可能受内分泌扰乱子影响的基因)的例子包括，但不限于，表2所示的基因，划分如下(1)核受体基因或与核受体转录偶联有关的基因(核受体或核受体转录偶联)；(2)与激酶类信号传导有关的基因(激酶类信号传导)；(3)与性腺分化有关的基因(性腺分化)；(4)受体类激酶的基因或与之有关的基因(受体类激酶)；(5)中间纤维标志基因或与之有关的基因(中间纤维标志)；(6)与细胞周期或生长调节有关的基因(细胞周期和生长调节剂)；(7)癌基因、与癌基因有关的基因或与肿瘤抑制有关的基因(癌基因和肿瘤抑制因子)；(8)与凋亡有关的基因(凋亡)；(9)与DNA损伤应答、修复或重组有关的基因(DNA损伤应答、修复或重组)；(10)受体基因与受体有关的基因(受体)；(11)与细胞死亡或分化调节有关的基因(细胞命运和发育调节因子)；(12)与细胞黏附、迁移或侵袭有关的基因(细胞黏附、迁移和侵袭)；(13)与促血管生成有关的基因(血管生成的调节因子)；(14)与细胞侵袭有关的基因(侵袭调节因子)；(15)与细胞-细胞间的作用有关的基因(细胞-细胞间的作用)；(16)Rho家族、GTP酶或其调节因子的基因或与之有关的基因(Rho家族、小的GTP酶及其调节因子)；和(17)生长因子或细胞因子的基因或与之有关的基因(生长因子或细胞因子)。此外，其表达可能直接或间接受内分泌扰乱子影响的其他物质的基因或与之有关的基因，也包括在本发明受内分泌扰乱子影响的基因内。
表2
可能受内分泌扰乱子影响的基因例子还有已知与二乙基己烯雌酚、二酚-A、17β雌二醇及类似物质结合的雌激素受体的基因，和与雌激素受体信号传导通路有关的基因。
可如下所述来检测受内分泌扰乱子影响的基因。
如此处所用，DNA阵列是指其上固定有基因或该基因的DNA片段的支持物，包括所谓的DNA芯片。可以应用能够用来杂交的任何支持物。一般使用承物玻璃、硅芯片、硝酸纤维素膜或尼龙膜或类似物。例如，可如下制备固定到该支持物上的基因或其DNA片段。以待固定基因或其产物的GenBank序列号所鉴定的碱基序列为基础，应用引物分析/构建软件比如OligoTM引物分析软件(Takara Shuzo)可以制备本发明方法中最佳的PCR扩增引物对。根据市售PCR试剂盒所附标准方法，通过使用该引物对和基因组DNA、基因组DNA文库或cDNA文库模板可以获得感兴趣的PCR扩增片段。产生的DNA片段可用例如Microcon-100(Takara Shuzo)纯化。在本发明的方法中可优选使用该纯化的DNA片段。此外，根据已知方法例如通过向支持物中导入氨基，可以把该基因或其片段固定到该支持物上而制备DNA阵列。还有，通过应用制备DNA阵列的仪器比如自GMS制备DNA芯片的仪器来进行固定步骤，可以制备基因高密度排列并固定在其上的DNA阵列。
应用此类DNA阵列使同时测量核酸样本中的多种核酸分子内容物成为可能，并有利于用少量核酸样本进行测量。
本发明使用的DNA阵列上固定有任何基因或其DNA片段。优选地，使编码有望具有内分泌扰乱活性相关功能的蛋白质的基因或源自该基因的DNA片段得以固定。若使用片段的话，可优选使用例如约1kb长的片段，但该片段并不限于特定长度。只要该片段与测试样本中的核酸特异性杂交，其长度可比上述长度长或短。此类基因的示例包括但不限于，激素受体基因、编码受体辅因子的基因、编码与受体信号传导有关的蛋白质的基因、编码与激素的生物合成或代谢有关的蛋白质的基因和癌基因。
例如，取自对内分泌扰乱子敏感的细胞或组织(器官)的mRNA或用该mRNA作模板逆转录得到的cDNA，可用来作为含有因内分泌扰乱子影响而发生表达改变的基因的核酸样本。此类mRNA在经过一段时间后或在接触内分泌扰乱子后不同天数获得。
接触含有内分泌扰乱子的样本的细胞可以是自有机体收集的细胞，或是培养细胞。只要该组织可能受内分泌扰乱子的影响，其并不限于特定组织。还有，所用的细胞或组织或有机体的来源并不限于人类。根据所用的有机体、内分泌扰乱子、受此内分泌扰乱子影响的基因或类似物(的不同)，与内分泌扰乱子的接触时间的长短可以变化。
另一方面，使同样取自对照细胞、组织或有机体的、含有mRNA或其cDNA的核酸样本在严格条件下进行杂交。可对该核酸样本进行如下恰当标记，这样可以轻松确定是否该核酸样本与DNA或DNA阵列杂交。
例如，可用放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、被合适的抗体识别的抗原或类似物进行标记。或者，可首先进行杂交而不标记，然后用能发出荧光或化学发光的嵌入物质来标记。
可根据已知的方法使所得核酸样本与DNA阵列上的DNA进行杂交。自然地，根据DNA阵列上的DNA长度在最佳条件下进行杂交和冲洗步骤。这些步骤可在例如分子克隆，实验室手册，第二版，9.52-9.55(1989)页所属的条件下进行。
通过比较对照核酸样本的杂交结果与取自已接触了含有一内分泌扰乱子的样本的细胞、组织或有机体的核酸样本所得结果，可以检测两种核酸样本中信号强度明显不同的基因。具体地，使阵列与标记如上的核酸样本杂交。应用具体的测量仪器比如层析谱或图象分析仪来检测杂交阵列的放射活性、荧光、发光或类似物的信号强度。在信号强度差异的基础上可以检测因一内分泌扰乱子影响而发生显著表达变化的基因。
通过应用能够检测多种标记(如两类荧光)的多波长检测荧光分析仪，可以比较同一DNA阵列上对照核酸样本的基因表达和同一DNA阵列上接触了一内分泌扰乱子的细胞、组织或有机体的核酸样本的基因表达。例如，使取自接触有一内分泌扰乱子的细胞的核酸样本荧光标记上Cy3-dUTP，而对照样本荧光标记上Cy5-dUTP。通过等量混合核酸样本并使该混合物与DNA阵列杂交而表现出的颜色差异，可以检测两种核酸样本基因表达的差异。根据结果可检测因该内分泌扰乱子影响而发生显著表达变化的基因。
该基因也可用作检测一内分泌扰乱子的指数。
通过比较作为表达水平指数的信号强度和用对照样本制备的核酸样本所得信号强度，来选择受一内分泌扰乱子影响的基因。例如，通过使含有一内分泌扰乱子的样本的荧光信号值除以对照样本的荧光信号值来计算数值。数值大于1.00表示用受试物质处理可促进该基因的表达。数值小于1.00表示用受试物质处理可抑制该基因的表达。数值等于1.00表示用受试物质处理不影响该基因的表达。若促进表达的话，该数值大于1.10，优选1.30，更优选2.00。若抑制表达的话，该数值小于0.90，优选0.80，更优选0.70。
如上所述，根据本发明的方法可同时、体外、快速并高敏地计策手内分泌扰乱子影响之基因的表达(例如细胞内核受体基因和参与下游信号传导通路的大量基因)。另外，可能会发现已知基因参与曾经未知的信号传导通路。
(2)如下所述应用受内分泌扰乱子影响之基因的表达作为指数，可以检测该内分泌扰乱子。
制备一种DNA阵列，如上所述其上固定有已证实受一内分泌扰乱子影响的基因。
如上所述制备怀疑受该内分泌扰乱子影响的细胞、组织或有机体的核酸样本。再如上所述使该核酸样本进行杂交。以信号强度之间的差异为基础可确定基因表达的变化。以结果为基础可确定该内分泌扰乱子的存在。
在另一实施方案中，可如下确定一内分泌扰乱子的存在。制备与已证实受该内分泌扰乱子影响之基因的mRNA相竞争的RNA或DNA。用该RNA或DNA作为内标物进行竞争性RT-PCR。然后通过RT-PCR定量确定受影响基因的表达水平。
如上所述，根据本发明的方法，用受内分泌扰乱子影响之基因(如细胞内核受体基因或大量下游基因的一种)的表达作为指数可基本并轻松判定该内分泌扰乱子存在与否。
(3)可如下检测可能干扰内分泌的物质此处所用的可能干扰内分泌的物质是指可能影响活体内天然分泌的激素之正常活性的物质。该定义包括活性已得到证实和活性尚未得到证实的物质。
按照上述(1)所述方法，通过以上述方式固定已证实受内分泌扰乱子影响的基因来制备检测可能干扰内分泌之物质的DNA阵列。
如上所述，从已接触怀疑含有可能干扰内分泌之物质的样本的细胞、组织或有机体制备核酸样本。再如上所述使该核酸样本进行杂交。以信号强度之间的差异为基础可确定基因表达的变化。以结果为基础可判定作为内分泌扰乱子的物质。
不仅在DNA阵列上全部DNA发生信号变化的情况下，而且在部分DNA发生变化的情况下，基于所得结果可认为某物质是内分泌扰乱子。具体地，若发现部分DNA发生强度变化，按照上述(1)的方法可通过再选择受该物质作用影响的基因来优化检测方法，这样可更确切地检测与该物质一样产生内分泌紊乱的物质。
在另一实施方案中，如上所述制备与已证实受内分泌扰乱子影响之基因的mRNA相竞争的RNA或DNA。用该RNA或DNA作为内标物进行竞争性RT-PCR。基于基因的表达可定量检测内分泌扰乱程度。可优选使用任何方法来检测或定量如上述(1)所述获得的受内分泌扰乱子影响之基因的表达，只要该方法能用于检测/定量该基因。
(4)本发明的DNA阵列此处所用的DNA阵列是指其上固定有基因或其DNA片段的支持物，并包括所谓的DNA芯片。
能够用于杂交的任何支持物可用于本发明的DNA阵列。一般地，使用承物玻璃、硅芯片、硝酸纤维素或尼龙膜或类似物。优选地，可优先使用由无孔并具有光滑表面的材料制成的支持物(如玻璃比载玻片)。可使用表面上可通过共价键或非共价键固定DNA的任何支持物。优选使用表面具有亲水或疏水功能基的支持物。支持物表面的优选功能基的例子包括但不限于，羟基、氨基、巯基和醛基、羧基和酰基。该功能基可以是支持物本身的表面特性，或可通过表面处理将其导入。表面处理的支持物的例子包括用市售的硅偶联剂比如氨基烷基硅处理或用聚阳离子比如多聚赖氨酸或多聚乙烯亚胺处理的玻璃。一些处理的载玻片可购得。
将内分泌扰乱子影响的基因或其DNA片段固定在本发明的DNA阵列上。该DNA阵列可以是DNA微阵列，其中在变性条件下将基因或其DNA片段的双链DNAs排列并固定到同一支持物上。至少一部分固定的DNA可以是单链。此处的DNA阵列可通过在变性条件下将双链DNA点排到同一支持物上来制备。本发明DNA阵列的排列密度没有具体的限制。例如，可优选使用高密度的DNA阵列比如DNA以100点/平方厘米或更高密度固定在其上的阵列。
本发明中待排列和固定到支持物上的DNA片段没有具体限制。大体上，优先使用长度为50个碱基或更多的双链多聚核苷酸或其衍生物，通过聚合酶链反应(PCR)或类似物进行酶促扩增而制备之，并在固定到支持物上时通过为固定DNA而发生的变性，将其转化为单链DNA或其衍生物。该衍生物可发生促使其固定到支持物表面上的修饰。衍生物的例子包括但不限于，该DNA 5’端导入功能基比如氨基或巯基的DNA。
例如，用基因组DNA文库或cDNA文库作为模板通过PCR或类似方法扩增的DNA可用作固定到支持物上的基因或DNA片段。也可使用以已知的核苷酸序列为基础合成的寡聚核苷酸。本领域已知能够用于杂交的非DNA的核酸(例如通过体外转录制备的RNA)可替代DNA进行固定。根据已知方法例如通过向支持物导入氨基，使该基因或其DNA片段固定到支持物上，可制备DNA阵列。通过应用DNA阵列制备仪比如自GMS制备DNA芯片的仪器进行固定，可制备本发明的DNA阵列，其上排列和固定有基因。
使编码具有参与激素活性发挥之功能的蛋白质的基因或其片段固定到本发明使用的DNA阵列上。若使用片段的话，虽然该片段的长度没有具体限制，可优选使用例如长度约100b到约1kb的片段。只要该片段与受试样本的核酸特异性杂交，其长度可短或长于上述长度。此类基因的例子包括但不限于，激素受体基因、编码受体辅因子的基因、编码与受体信号传导有关蛋白质的基因、编码与激素的生物合成或代谢有关蛋白质的基因、癌基因及类似物。另外，可固定例如根据上述(1)中的方法所得的手内分泌扰乱子影响的基因。还有，既然所有受内分泌扰乱子影响的基因可根据上述(1)的方法获得，可制备检测受内分泌扰乱子影响之基因的DNA阵列，其上固定有全部此类基因。
如上所述，通过应用本发明的方法和DNA阵列，可体外、快速并高敏地检测例如细胞内核受体基因和与下游信号传导通路有关的基因。这样，可基本上并轻松判定可能干扰内分泌之物质的存在与否。
以下实施例将进一步详细说明本发明，但无意限制本发明的范围。
实施例1受内分泌扰乱子影响的基因见表3所示。
表3
如下制备含有3’非翻译区、约1kb的这些基因的cDNA片段。
简而言之，用人类或小鼠的细胞或组织的mRNA(Clontech)做模板，通过逆转录PCR(RT-PCR)来扩增兴趣cNDA片段。通过分析碱基序列来证实所扩增的cDNA是兴趣片段。乙醇沉淀回收所扩增的片段，以1μM浓度溶于10mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。另外，同样制备看家基因β肌动蛋白基因和阴性对照PUC18质粒。用制备DNA芯片(GMS)的仪器将这些片段点到已导入氨基(Sigma)的承物玻璃上并通过紫外照射固定。承物玻璃先用0.2％SDS冲洗，随后用蒸馏水冲洗，干燥后便制成DNA阵列。
实施例2(1)给小鼠给药将10只雌性小鼠(2天大)分成内分泌扰乱子给药组和不给药组。以0.1mg/小鼠/天的给药剂量向每只给药组的小鼠静脉注射可能干扰内分泌的己烯雌酚(DES)，注射两天。在第4天去卵巢，用mRNA提取试剂盒(Qiagen)制备mRNA。用混合物进行CDNA合成反应，每一混合物含有约3μg mRNA、寡聚DT引物、Cy3-dUTP(Amersham)(给药组)或Cy5-dUTP(Amersham)(非给药组)dNTPS和逆转录酶(Gibco-BRL)。混合物经凝胶滤过，减压浓缩，溶于4XSSC/0.2％SDS以制备荧光标记的cDNA。
(2)培养细胞的处理在含5％胎牛血清(FBS)的DME培养基中培养人乳腺癌细胞MCF-7。胰酶消化后以2×105个细胞/孔铺于12孔板内。在同样的培养基中温育细胞24小时。去除培养基后在含有或没有10pM 17β-雌二醇、含5％人类血清的DME培养基中培养细胞72小时，该人血清已通过碳-葡聚糖处理而去除类固醇激素。收集细胞并按照实施例2-(1)所述提取mRNAs。
用混合物进行cDNA合成反应，每一混合物含有3μg的mRNA、寡聚dT引物、Cy3-dUTP(接触17β-雌二醇的细胞)、Cy5-dUTP(不接触17β-雌二醇的细胞)、dNTPS和逆转录酶(Gibco-BRL)。该混合物经凝胶滤过，减压浓缩，溶于4XSSC/0.2％SDS以制备荧光标记的cDNA。
(3)使标记的cDNA与DNA阵列杂交将上述(1)制备的等量的Cy3-标记cDNA和Cy5-标记cDNA一起混合并且进行热变性。将5μl的混合物加到如实施例1制备的DNA阵列上。将盖玻片放在混合物上且其边缘用薄膜密封。在40-45℃温育10小时之后，去除盖玻片。DNA阵列用0.2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC各冲洗30分钟，然后风干。应用微阵列扫描仪(GMS)分析在DNA阵列上各个点的荧光信号。而且，对上述(2)中获得的标记的DNA进行相似的操作。
结果，观察到DES给药小鼠的卵巢和接触17-β雌二醇的MCF-7细胞有明显的信号改变。这样，可发现内分泌扰乱子影响的基因。
实施例3
(1)制备DNA阵列从列在实施例1表3中的基因里选取33个基因。所选基因在表4中列出。β-肌动蛋白基因和pBR322质粒分别用作看家基因和作为阴性对照。
表4
应用在表4中列出的相应的引物对，依据实施例1中描述的方法来制备这些基因的大约100b到1kb的cDNA片段，并且将其点到支持物上以制备DNA阵列。应用人UniGene DNA(遗传学研究)所含的相应的基因的引物来扩增组织蛋白酶G、NGF受体和CSF1受体基因。
(2)测定内分泌扰乱子的影响测定用多种内分泌扰乱子对培养细胞处理2或24小时所造成的影响。
处理2小时在含有10％胎牛血清(FBS)的DME培养基中培养人乳腺癌MCF-7细胞。用胰蛋白酶消化后，将2×106细胞种植于10cm培养皿上。将这些细胞在含有5％胎牛血清(FBS)的DME培养基中培养24小时，该血清已用活性碳-葡聚糖处理而去除了类固醇激素。在去除培养基后，将这些细胞在含有10nM17-β雌二醇(E2)、10 nM己烯雌酚(DES)或5μM二酚-A(BisA)的相同的培养基中培养2小时。作为对照，也同样制备不在这些化学物质中培养的细胞。如实施2(1)中所述收集该处理的细胞，并提取总RNAs。
处理24小时在含有10％胎牛血清(FBS)的DME培养基中培养人乳腺癌MCF-7细胞。用胰蛋白酶消化后，将2×106细胞种植于10cm培养皿上。在相同的培养基中将该细胞温育24小时。在去除培养基后，将这些细胞在含有5％人血清和10nM17-β雌二醇(E2)、10 nM己烯雌酚(DES)或5μM二酚-A(BisA)的DME培养基中培养24小时，该人血清用活性碳-葡聚糖处理已去除类固醇激素。作为对照，也同样制备不在这些化学物质中培养的细胞。如实施2(1)中所述收集该处理的细胞，并提取总RNAs。
(3)用DNA酶处理在上述(2)中制备的总RNAs。制备12μl含有大约100-300μg总RNA、10μl10×AMV缓冲液(生命科学)和10U的DNA酶I(Takara Shuzo)的反应混合物，37℃温育10分钟，用苯酚/氯仿提取两次，然后进行乙醇沉淀。部分用来测定所产生的总RNAs的浓度。
(4)应用在上述(3)制备的总RNAs中的一种来进行逆转录反应。反应混合物的成分如下所述。
反应混合物A大约130μg总RNA、10μg寡聚-dT引物(TakaraShuzo)和20μl经焦碳酸二乙酯(DEPC，Wakeo Pure化学工厂)处理的水。
反应混合物B12μl5×AMV核糖核酸酶缓冲液(生命科学)、0.5mM的dATP、dCTP和dGTP、0.2mMdTTP、60U RNA酶抑制剂(Takara Shuzo)和0.1mMCy3-标记dUTP(Amersham Pharmacia)。
在70℃将反应混合物A温育10分钟，然后在冰上冷却。向其加入反应混合物B，所产生的混合物在42℃下温育5分钟。向其加入大约60U的AMVRNA酶(生命科学)。再加入DEPC-处理的水使最终容量达60μl。所产生的RT反应混合物在42℃下温育70分钟。向反应混合物加入7.5μl 500mM EDTA溶液和15μl的1M氢氧化钠。在60℃将该混合物温育1小时以降解模板RNA。冷却至室温后，向该混合物中加入37.5μl 1M的tris-盐酸(PH7.5)。应用MICROCON YM-30(Millipore)将该溶液浓缩至20μl，向其加入200μl含有1 mM EDTA的10mMtris-盐酸，然后将产生的混合物浓缩至20μl。这样获得的Cy3标记的cDNA溶液用于后来的杂交。
(5)将上述(4)中制备的Cy3标记的cDNA热变性，并且将整个溶液加到上述(1)制备的DNA阵列上。将盖玻片放在混合物上并且其边缘用薄膜密封。在40-45℃温育10小时之后，去除盖玻片。DNA阵列用0.2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC各冲洗30分钟，然后风干。应用微阵列扫描仪(GMS)分析在DNA阵列上各个点的荧光信号。一种物质处理的样本的荧光信号值除以对照样本的荧光信号值而获得的代表性数值见表5。在表5中，数值高于1.00表示通过该物质处理后该基因的表达增强。数值低于1.00表示通过该物质处理后该基因的表达降低。数值等于1.00表示通过该试验物质处理后该基因的表达未受影响。
表5
在许多情况下，可能由内分泌扰乱活性干扰所致的野生动物生殖的异常和人类精子生成能力的降低，认为是由特定阶段的内分泌活动信号降低和受到干扰所造成的。因此，认为除过度表达的基因外，应注意与对照细胞的表达相比表达受到抑制的基因。例如，如表5所示，在本实施例1所用的基因中，发现E2刺激后许多认为与雌激素作用密切相关的基因表达上调(例如P300/CBP、ACTR、RIP140、TIF2、PDGF受体和VEGF受体基因)，但关于其通路、机制或类似机理知之甚少。用可干扰内分泌的DES处理24小时可活化除C-Myc外几乎所有的基因。发现DES处理2小时可抑制N-CoR/SMRT和ARA70(核受体或核受体转录偶联)、P38γ(数据未列)和JNK2(激酶类信号传导)及PDGF受体(受体类激酶)基因的表达。另一方面，用怀疑具有内分泌扰乱活性的BisA处理2小时可抑制ACTR(核受体或核受体转录偶联)和VEGF受体(受体类激酶)基因的表达。认为BisA处理后对基因的影响要小于DES刺激后所观察到的影响。BisA处理24小时抑制JNK2和BMK2(激酶类信号传导)及VEGF受体(受体类激酶)基因的表达。这样，发现BisA处理后对基因表达的控制方式不同于DES刺激。如上所述，应用本发明的芯片提供了一种方法，其中，根据处理物质和处理时间的不同发现表达信号有明显的变化。可明显检测受内分泌扰乱子影响的基因尤其是表达受内分泌扰乱子抑制的基因。
工业应用如上所述，本发明的方法是很有效的，因为其能同时、体外、快速和高敏地检测受内分泌扰乱子影响的大量基因。而且，本发明提供可用来快速并高敏地检测受内分泌扰乱子影响之基因的DNA阵列。本发明的方法也可用来检测参与未知信号传导通路的基因。另外，本发明的高效性还在于，采用据本发明方法所得的大量受内分泌扰乱子影响之基因的表达作指数，可判定内分泌扰乱子或可能干扰内分泌的物质存在与否。
序列表SEQ ID NO1所设计的扩增Smad3 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO2所设计的扩增Smad3 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO3所设计的扩增VEGF受体mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO4所设计的扩增VEGF受体mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO5所设计的扩增ACTR mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO6所设计的扩增ACTR mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO7所设计的扩增N-CoR/SMRT mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO8所设计的扩增N-CoR/SMRT mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO9所设计的扩增efp mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO10所设计的扩增efp mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO11所设计的扩增c-Myc1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO12所设计的扩增c-Myc1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO13所设计的扩增维生素D受体mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO14所设计的扩增维生素D受体mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO15所设计的扩增c-Myc2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO16所设计的扩增c-Myc2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO17所设计的扩增Bax mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO18所设计的扩增Bax mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO19所设计的扩增JNK1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO20所设计的扩增JNK1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO21所设计的扩增p38 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO22所设计的扩增p38 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO23所设计的扩增TRIP1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO24所设计的扩增TRIP1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO25所设计的扩增ARA70 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO26所设计的扩增ARA70 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO27所设计的扩增胰岛素受体mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO28所设计的扩增胰岛素受体mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO29所设计的扩增PDGF受体mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO30所设计的扩增PDGF受体mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO31所设计的扩增CSF1受体-2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO32所设计的扩增CSF1受体-2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO33所设计的扩增FGF受体mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO34所设计的扩增FGF受体mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO35所设计的扩增p38γmRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO36所设计的扩增p38γmRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO37所设计的扩增Bcl-X mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO38所设计的扩增Bcl-X mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO39所设计的扩增c-Myc3 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO40所设计的扩增c-Myc3 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO41所设计的扩增PS2蛋白质mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO42所设计的扩增PS2蛋白质mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO43所设计的扩增乳铁蛋白mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO44所设计的扩增乳铁蛋白mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO45所设计的扩增RIP140 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO46所设计的扩增RIP140 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO47所设计的扩增TIF2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO48所设计的扩增TIF2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO49所设计的扩增JNK2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO50所设计的扩增JNK2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO51所设计的扩增BaxδmRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO52所设计的扩增BaxδmRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO53所设计的扩增BMK-1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO54所设计的扩增BMK-1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO55所设计的扩增BMK-2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO56所设计的扩增BMK-2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO57所设计的扩增Src-1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO58所设计的扩增Src-1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO59所设计的扩增P300/CBP mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO60所设计的扩增P300/CBP mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO61所设计的扩增β肌动蛋白mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO62所设计的扩增β肌动蛋白mRNA的寡聚核苷酸引物。
序列表<110>Takara Shuzo co..Ltd.<120>检测受环境内分泌影响之基因的方法<130>661516<150>.JP 10-310285<151>1998-10-30<160>62<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增Smad3 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>1caggtgtccc atcggaagg 19<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增Smad3 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>2ctctctggta gtggtaggga tt 22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增VEGF受体mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>3tacaagatcg acgttagctc 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增VEGF受体mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>4cagccaaatt cacagttaaa 20<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增ACTR mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>5gctttgaaga tataatccga aggt24<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增ACTR mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>6ggcctggtga tgacagagta gataa 25<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增N-CoR/SMRT mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>7tatggaggac cctatgaaag tgta24<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增N-CoR/SMRT mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>8ttacgaccat gttctactag acctt 25<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增efp mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>9cgccgtgaag acgtgcttgg 20<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增efp mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>10tcttggtcag gctctgttca atctc 25<210>11<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增c-Myc-1 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>11cgccaagctc gtctca 16<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增c-Myc-1 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>12tcaactgttc tcgtcgtttc 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增vit D受体mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>13caaacgctgt gtggacatcg g 21<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增vit D受体mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>14ttctggatca tcttggcata gag 23<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增c-Myc-2 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>15gtagtaattc cagcgagagg 20<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增c-Myc-2 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>16ctatgggcaa agtttcgtg 19<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增Bax mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>17tgttttctga cggcaacttc 20<210>18<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增Bax mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>18gagcactccc gccacaa 17<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增JNK1 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>19gagcagaagc aagcgtgac 19<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增JNK1 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>20gacattgatg tacgggtgtt 20<210>21<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增p38 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>21gtgcccgagc gttacca 17<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增p38 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>22aaagttcatc ttcggcatct 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增TRIP1 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>23aaatgctaaa gttcgcctat 20<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增TRIP 1 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>24acatggactc gccgttct18<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增ARA 70 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>25agttgcataa gccgtcac 18<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增ARA 70 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>26actagccaat ctgataggtc 20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增胰岛素受体mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>27gctgccacca atacgtcatt 20<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增胰岛素受体mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>28gcatcctgcc catcgaact 19<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增PDGF受体mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>29tcaccattcc atgccgagta acaga 25<210>30<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增PDGF受体mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>30aggacagtgg gcggtgggta gg 22<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增CSF1受体-2 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>31ccaccctgaa tgaagtcaac20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增CSF1受体-2 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>32ggtggatgga ttaagactga 20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增FGF受体mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>33cagactccgg cctctatgct 20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增FGF受体mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>34gggcttccag aacggtcaac 20<210>35<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增p38γmRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>35tgatcgggct gctggacgta ttc 23<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增p38γmRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>36agagggcttg cattggtcag gatag 25<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增Bcl-X mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>37ccgggagctg gtggttgact tt 22<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增Bcl-X mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>38ttcttaccca gccgccgttc t 21<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增c-Myc-3 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>39gtagtaattc cagcgagagg20<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增c-Myc-3 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>40ctatgggcaa agtttcgtg 19<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增pS2蛋白质mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>41ggcccagaca gagacgtgta 20<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增pS2蛋白质mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>42gctcgatggt attaggatag aa 22<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增乳铁蛋白mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>43ggagctgcgc aagtgtaac 19<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增乳铁蛋白mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>44attagtaatg cctgcgacat 20<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增RIP 140 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>45gcctctttgc ttcagtcatt 20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增RIP140 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>46ttggcttagg tatagtctgg 20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增TIF2 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>47tccaaggcaa gatcacgtct 20<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增TIF2 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>48aagccaacga tgaccctaat 20<210>49<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增JNK2 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。tatagtgtcc aagtggcaga ctcaa 25<210>50<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增JNK2 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物．<400>50atgtatgggt gacgcagagc ttc 23<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增BoxδmRNA所设计的寡聚核苷酸引物．<400>51gatgattgcc gccgtggaca caga24<210>52<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增BoxδmRNA所设计的寡聚核苷酸引物．<400>52ggtgagcact cccgccacaa agatg 25<210>53<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增BMK-1 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物．<400>53ttaaagcccg ctccttcgat gtgac25<210>54<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增BMK-1 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物．<400>54ggcggtcggc acctgggtac act23<210>55<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增BMK-2 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>55ggtggccatc aagaagatcc ctaat 25<210>56<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增BMK-2 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>56cctcacgcct tgcatggaag tcct24<210>57<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增Src-1 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>57gtatgaatga aggacccaat aactc 25<210>58<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增Src-1 mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>58ctggcaggat ctccgatttg a 21<210>59<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增p300/CBP mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>59ttcagtcacc aacgtgccaa atatg25<210>60<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增p300/CBP mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>60ttagagctgc gggatcaggt gtt 23<210>61<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增β-肌动蛋白mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>61caagagatgg ccacggctgc t 21<210>62<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>为扩增β-肌动蛋白mRNA所设计的寡聚核苷酸引物。<400>62tccttctgca tcctgtcggc a 2权利要求
1.检测受内分泌扰乱子影响之基因的方法，其特征在于该方法包括制备取自细胞、组织或生物、含有mRNA或其cDNA的核酸样本，该细胞、组织或生物已经与含一种内分泌扰乱子的样本相接触；使该核酸样本与一种DNA阵列杂交，该阵列上固定有可能受该内分泌扰乱子影响的基因或来自受该内分泌扰乱子影响之基因的DNA片段；和通过比较该结果与用对照样本制备的核酸样本所得结果，选择受该内分泌扰乱子影响的基因；
2.根据权利要求1的方法，其中应用的基因选自如下(1)核受体基因或与核受体转录偶联有关的基因；(2)与激酶类信号传导有关的基因；(3)与性腺分化有关的基因；(4)受体类激酶基因或与之有关的基因；(5)中间纤维标志基因或与之有关的基因；(6)与细胞周期或生长调节有关的基因；(7)癌基因、与癌基因有关的基因或与肿瘤抑制有关的基因；(8)与凋亡有关的基因；(9)与DNA损伤应答、修复或重组有关的基因；(10)受体基因与受体有关的基因；(11)与细胞死亡或分化调节有关的基因；(12)与细胞黏附、迁移或侵袭有关的基因；(13)与促血管生成有关的基因；(14)与细胞侵袭有关的基因；(15)与细胞-细胞间的作用有关的基因；(16)Rho家族、GTP酶或其调节因子的基因或与之有关的基因；和(17)生长因子或细胞因子的基因或与之有关的基因，或来自该基因的DNA片段。
3.检测内分泌扰乱子的方法，其特征在于该方法包括通过权利要求1或2的方法对所检测基因的表达进行测量；
4.根据权利要求3的方法，其中内分泌扰乱子选自以下类别(1)二氧芑；(2)有机氯化合物；(3)酚类；(4)邻苯二甲酸酯；(5)芳香族烃；(6)杀虫剂；(7)有机锡化合物；(8)雌激素；或(9)全氯五环癸烷、毒杀芬、丁醛肟威或开蓬。
5.可能干扰内分泌的物质的检测方法，其特征在于该方法包括制备取自细胞、组织或生物、含有mRNA或其cDNA的核酸样本，该细胞、组织或生物已经与怀疑含有可能干扰内分泌之物质的样本相接触；使该核酸样本与DNA阵列杂交，该阵列上固定有受内分泌扰乱子影响的基因或来自受该内分泌扰乱子影响之基因的DNA片段；和通过比较该结果与用对照样本制备的核酸样本所得结果，检测可能干扰内分泌的物质；
6.根据权利要求5的方法，其中将可能干扰内分泌的物质划分为(1)二氧芑；(2)有机氯化合物；(3)酚类；(4)邻苯二甲酸酯；(5)芳香族碳氢化合物；(6)杀虫剂；(7)有机锡化合物；(8)雌激素；或(9)全氯五环癸烷、毒杀芬、丁醛肟威或开蓬。
7.检测受内分泌扰乱子影响之基因的DNA阵列，其上固定有受内分泌扰乱子影响的基因或可能受内分泌扰乱子影响的基因，或该基因的DNA片段。
8.根据权利要求7的DNA阵列，其上固定的基因选自如下(1)核受体基因或与核受体转录偶联有关的基因；(2)与激酶类信号传导有关的基因；(3)与性腺分化有关的基因；(4)受体类激酶的基因或与之有关的基因；(5)中间纤维标志基因或与之有关的基因；(6)与细胞周期或生长调节有关的基因；(7)癌基因、与癌基因有关的基因或与肿瘤抑制有关的基因；(8)与凋亡有关的基因；(9)与DNA损伤应答、修复或重组有关的基因；(10)受体基因与受体有关的基因；(11)与细胞死亡或分化调节有关的基因；(12)与细胞黏附、迁移或侵袭有关的基因；(13)与促血管生成有关的基因；(14)与细胞侵袭有关的基因；(15)与细胞-细胞间的作用有关的基因；(16)Rho家族、GTP酶或其调节因子的基因或与之有关的基因；和(17)生长因子或细胞因子的基因或与之有关的基因，或来自该基因的DNA片段。
9.根据权利要求7或8的DNA阵列，其中该基因或来自该基因的DNA片段固定在承物玻璃片上。
全文摘要
检测受内分泌扰乱子影响之基因的方法,其特征在于(该方法)包括制备源自细胞、组织或有机体、含mRNA的核酸样本或其cDNA,该细胞、组织或有机体已接触了含该内分泌扰乱子的样本;使该核酸样本与已固定有可能受该内分泌扰乱子影响的基因或其DNA片段的DNA阵列杂交;然后比较所得结果与用其他源自对照样本的核酸样本所得结果,从而选择受该内分泌扰乱子影响的基因。
文档编号C12N15/12GK1331754SQ99814877
公开日2002年1月16日 申请日期1999年10月28日 优先权日1998年10月30日
发明者近藤昭宏, 佐川裕章, 峰野纯一, 君塚房夫, 加藤郁之进 申请人:宝酒造株式会社