将核酸分离成不同群体的方法

专利名称：将核酸分离成不同群体的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离核酸片段的方法。特别地，本发明涉及一种将已被或可被组分标记的核酸从核酸群体中分离出来的方法，其中的组分可被固定于基质上。
大多数生物技术的核心是对DNA的操作和处理。DNA操作一般包括使用可将DNA切割成片段的特异性限制酶进行消化，然后纯化DNA片段，将所需片段插入克隆载体并将这些载体转移入非自然宿主以便转录并任选翻译，从而提供颇有价值的生物学信息和/或将插入的DNA表达成产物，如具有治疗作用的产物。举例来说，这种DNA的操作可以实现真核蛋白在细菌中的表达。对DNA分子的切割和连接是现代生物技术的核心。通常，这些DNA片段是经聚合酶链反应(PCR)制备的，后者如今已在研究和工业生物技术领域中普遍使用。这种PCR方法可以通过特异的短核酸引物产生大量的DNA，从而实现特异DNA分子的扩增，而扩增后的DNA可以用于进一步的操作，例如以上所述的克隆技术。
使用例如上述限制酶切割或PCR方法获得的DNA分子进行的核酸操作方法通常效率较低，其原因至少部分的由于一些不需要的DNA分子的存在。这些“不需要的”分子包括例如将插入的DNA片段从重组分子中切割，特别是不完全切割时产生的载体DNA，部分消化的限制性片段或限制酶切割DNA分子产生的其它副产物，过剩的PCR引物，作为核酸操作副产物的错误连接的核酸分子，以及由于PCR引物与模板核酸之间错误的退火而产生的PCR产物。主要终产物DNA的质量对于下游操作如连接和细菌或真核宿主细胞的转化至关重要。能够将核酸分子的混合物，如DNA分子或DNA片段的混合物分离成不同的群体，从而从想要的或目的核酸分子中去除被认为是“不需要的”或污染性的群体的能力将会因此提高用如此所得核酸分子进行进一步处理或下游步骤的效率。
一系列核酸分子的纯化方法已被此行业所共知。然而可以将核酸分子混合物例如含有几种不同DNA分子的混合物分离成不同群体的已知方法却很有限。通常，这些方法依赖于按大小分离核酸分子或片段，例如通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的电泳，进而纯化目的分子或片段。这些方法有许多缺点。其中的一个限制性因素是凝胶自身的容量，它限制了可被分离的DNA的量。一般通过溴化乙锭染色的方法使凝胶中的DNA可被观察到。除了对操作者的毒性外，这一操作可以引起核酸质量的降低，从而可以导致其在下游应用中的性能变差。回收使用凝胶电泳方法分离的核酸分子同样效率低下而导致显著的损失，通常损失至少20％的DNA。凝胶电泳方法还耗费时间。DNA是一种脆性分子，在受到核酸外切和内切核酸酶攻击时很容易被破坏。在电泳分离相对较长的操作过程中，DNA容易被降解，因而这种操作可以破坏DNA的完整性并且影响下游操作的效率。这类分离方法因此是效率低且花费大的。因此，亟需一种可以至少部分的将核酸分子分离成不同群体的新方法。本发明就提供了这样一种方法。
根据本发明的内容，此项发明提供了一种可以至少部分的将样品中的核酸分子分离成各个群体的方法，其中一个群体已被或可以被标记了能固定于基质上的组分，上述方法包括将含有核酸的样品与基质接触，基质借此捕获标记分子从而使其与未标记的分子分离。
与前述电泳分离方法比较，这种方法非常简单而且快捷。因此这种方法也更加经济，拥有更大的综合效率，而且并不受电泳分离方法缺点的影响。
本方法依赖于捕获标记的核酸分子，即将其固定或保留在基质上，从而达到与溶液中剩余的未标记分子相互分离的目的。
本发明方法可以用于将所需未标记核酸分子(目的分子)与标记后的非所需核酸分子或片段分离开来，此时基质将捕获非所需核酸分子而目的分子则留在溶液中。这种方法在当目的核酸分子将用于下游操作，例如进一步的遗传学操作技术时具有优势，因为可以直接进行进一步的步骤而不需要将目的核酸分子从基质上洗脱或分离下来，并且这种方法也可以避免某些情况下必需将标记从核酸分子上去除的需要。因此这就构成了本发明的优选方面。而且，此方法也可用于将标记的目的核酸分子从未标记的非所需核酸片段中分离出来，此时基质将捕获所需核酸分子而非所需核酸分子则留在溶液中。除此以外，本方法可用于为不同下游操作目的而收集所有分离后的核酸级分。
这里使用的“核酸分子”是指任何的核酸分子，包括DNA、RNA、cDNA和杂合复合物，例如像肽核酸(PNA)这样的含有核酸和肽的复合物；在DNA中，包括双链和单链分子，以及任何合成DNA或RNA分子和DNA/RNA杂合分子(即一条链为DNA而另一条链为RNA的分子)。“靶”或“目的”DNA是指目的在于使其与其它核酸分子分开或分离的那些核酸分子。在本发明的上下文中“标记物”是指一种组分，它可以被核酸分子附着、粘合、掺入、携带或作为核酸分子中核苷酸序列的一部分，或以其它方式连接在核酸分子上，这种组分提供了一种从含有以此方式标记的某一特定群体和其它未标记群体的样品中捕获出标记的核酸分子群体的方法。凭借这种标记通过基质保留步骤可将标记分子从未标记分子中分离出来，从而达到核酸混合物分级分离的目的。这种标记可以结合到核酸分子中，即作为核酸分子的一部分，例如它可以是一种修饰后的核苷酸并在合成过程中插入核酸分子中；或者作为分子中核酸序列的一部分，这时核酸分子本身就是标记；或者通过像加入末端核苷酸这样的合成后步骤可将此类标记附着或粘合于核酸分子上；或者将此类标记结合到核酸序列中的某个识别序列上，此时没有与标记结合的核酸被描述为“可被标记”。
本方法可以用于分离或分级分离前述任何一类核酸或其混合物。本发明的优选方面是将样品中DNA分子或片段通过本方法至少部分分离成核酸分子的不同群体。这类方法有DNA标本，如PCR合成的DNA分子或某重组DNA分子，经限制酶消化后从中分离出特定的限制酶切片段并且“纯化”PCR反应，即去除引物错误退火而产生的PCR产物。本方法也有其它用途，例如可以在诊断型PCR和体外噬菌体包装中分离线性和环形核酸。
根据本发明，用于标记核酸分子的组分可以是任何能够标记核酸分子并且能够固定于基质上的组分。与基质的固定可以通过直接或间接的相互作用。因此，标记物可以单独起到固定在基质上的作用，或者通过一个可与基质作用的中间物或连接组分，如所述标记物的结合配对物起作用。
因此另一方面，本发明提供了一种可以至少部分的将样品中的核酸分子分离成各个群体的方法，其中一个群体已被或可以被标记了组分，此组分能直接或通过标记的结合配对物而间接固定于基质上，所述方法包括将含有核酸的样品与基质接触，或当标记物通过其结合配对物与基质间接相互作用时，使标记物与其结合配对物及与基质接触，从而捕获标记分子并使其与未标记的分子分离。
标记物的特性至少部分依赖于待分离的分子和所用的基质。适合使用的标记包括可以插入核酸分子的组分，例如生物素、荧光素等配基，或类固醇或类固醇样分子如地高辛配基，或者可用于修饰核酸分子中单个核苷酸的组分，或者蛋白类的组分，例如对核酸分子中特定结合位点具亲和性的蛋白。因此，可以在核酸分子的合成过程中通过例如插入标记核苷酸的方法实现标记，或可以在合成后通过例如酶反应在核酸一端加入标记核苷酸的方法实现标记。根据使用基质的不同，标记物可以直接与基质作用或者通过其结合配对物间接作用于基质，其中结合配对物的作用是将标记固定于基质上，即作为一种连接因子。结合配对物本身可以直接作用于基质，或者通过进一步的连接因子起作用，此时标记分子可以经过顺序或同时进行的结合步骤而被基质捕捉。
在一个实施方案中，标记物可以是一种小分子配基。此时，被标记的核酸分子可以通过此配基的结合配对物固定于本发明方法中所用的基质上，这种结合配对物可以其衍生型基质的形式本身固定于基质上，或者作为一个独立的连接基团使标记物固定于基质上。
在此方法的一个实施方案中，核酸样品首先在溶液中与配基标记物的结合配对物接触，此结合配对物只与标记的核酸分子结合，此后使用与结合配对物有亲和性的基质提取结合了结合配对物的标记核酸分子。在另一个实施方案中，结合配对物首先固定于基质上，然后再与核酸样品接触，这样只有标记的核酸分子存留在薄膜上。在这个实施方案中，采用合适于所选配基和结合配对物类型的传统方法将结合配对物固定在基质上，这些方法包括直接以化学键例如共价键结合，吸附或通过亲和力结合。
生物素是一个可用于本发明的配基标记物的例子。其它类似物在此行业内已为人所知。当生物素作为配基使用时，其结合配对物应为抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，基质可以选用那些对蛋白有亲和性的基质从而能够捕获链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白以及任何与链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白结合的分子。抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白可以各自作为生物素的结合配对物，下文中提及的均为细菌蛋白链霉抗生物素蛋白，但应说明的是也可以使用抗生物素蛋白。生物素可以很容易的插入核苷酸中，甚至生物素化核苷酸已经可以通过商业渠道获得。我们也发现在本发明方法中使用生物素标记具有很高的效率。生物素从而代表了本发明方法中一种优选的标记。
在一个以生物素作为配基的实施方案中，生物素化核酸分子可以首先在溶液中与链霉抗生物素蛋白保温，从而使得作为结合配对物的链霉抗生物素蛋白与含有生物素的核酸分子结合并形成结合复合物。然后使用能选择性固定蛋白但至少在所用条件下应不能固定核酸分子的基质将附着有链霉抗生物素蛋白的这些标记分子固定，这样就可以将含有生物素的核酸分子从样品中分离出来。
在以生物素作为标记物的另一个相关实施方案中，所述基质本身有链霉抗生物素蛋白结合或附着于其上。此时，当溶液中的核酸样品与所述基质接触后，生物素标记的分子将被保留在基质上，而未标记的分子则游离在溶液中。
在另一个实施方案中，标记物可以是像荧光素或地高辛配基或抗原这样的配基。这些标记物可以通过结合其配体而被捕获在基质中，例如结合配基可以是针对标记物的多克隆或单克隆抗体或其片段。若配基是类固醇，捕获可通过抗体或其片段，或此类固醇的受体或其具有结合类固醇能力的片段实现。这些捕获方法可以使用与前述链霉抗生物素蛋白相似的方法，并联合对蛋白具亲和力的基质。
在本发明的进一步的实施方案中，这种标记物可以是蛋白，尤以在待标记的核酸分子内有特定识别序列的核酸结合蛋白为优选。这些核酸结合蛋白的实例包括结合AP-1识别序列的转录因子AP-1，结合特定短识别序列的myb蛋白，以及结合lac操纵子序列的lacI抑制子蛋白。
在一个相关的实施方案中，标记物可被看作是一段核酸序列或核酸分子内诸如特异性识别序列等序列。这种序列标记物可以对能结合基质之蛋白具有亲和力。这样的实例包括前述AP-1识别序列，其上可以结合作为结合配对物的AP-1从而实现与蛋白结合基质的结合。类似的，myb蛋白作为结合配对物可结合到作为标记物的特异短识别序列上，而lacI蛋白作为结合配对物可结合到作为标记物的lac操纵子序列上。
在本发明的这种实施方案中，一种含有包括蛋白识别序列的核酸分子的样品可首先在溶液中通过接触被其特异序列识别的蛋白而被进一步标记，然后此样品与基质接触从而使被标记的分子保留在基质上，而未被标记的分子即没有结合蛋白的分子则留在溶液中。或者，这种DNA结合蛋白可被固定在基质上，然后通过与前述使用链霉抗生物素蛋白类似的方法从溶液中捕获核酸。
在每一个这样的实施方案中，捕获一定群体的核酸分子的过程都涉及一种或作为标记物本身或作为标记物的结合配对物(例如抗体，或链霉抗生物素蛋白)的蛋白。这种方法是优势的，因为这样可以将易于接受蛋白的物质用作基质，尤以至少在所使用的条件下能选择性的结合蛋白而不能结合核酸的物质为优选的基质物质，从而可以保证未被标记的分子不能被薄膜捕获或从样品中去除。这种蛋白可被基质捕获并通过多种作用方式与基质结合，包括离子作用，疏水相互作用及其亲和性结合。
这种基质可以采用任何方便的物理形态，并且许多已为业内所共知，例如薄层，凝胶，滤膜，膜，纤维，管，微量滴定板，柱，颗粒，而且既可能是微粒状的也可以是多孔状的。无论是滤去非所需的标记DNA或是收集所需的标记DNA，使用多孔材料如滤膜和薄膜等对于本发明分离方法是很方便的。实例包括以下样品，其中未标记群体将进一步处理，而标记的核酸群体，即构成“非所需”群体的那些，可通过直接滤膜过滤而从溶液中捕获，这是一种有效而快速的捕获方法，其可同时将未标记的核酸群体分离至滤液中，从而提供一种迅速而有效的捕获方法并同时将未被标记的核酸分级分离入滤液中，所以这种方法提供了一种进入下一步操作阶段的直接途径。因此，像滤膜这样的多孔材料构成了用于本发明中的一种优选的基质。
因此多孔基质可方便的用于滤去不需要的被标记的核酸分子，或用于收集需要的被标记核酸分子。这些基质可用作单步或多步分离设备的组成部分，或作为其它步骤，例如对DNA或下游反应流程中的其它产物进行检测、评估或定量的步骤中的组成部分。这些多孔基质可被合并入例如离心管，微滴定板，套筒或注射器这样的分离设备，并且根据样品和待操作的下游步骤，可用系列的方式提供一种或多种这样的设备。这种设备可以人工、半自动或全自动的方式操作。
在一个实施方案中可使用NycoCardTM。当被标记的核酸片段是待侧的序列或分子时，此片段可通过结合到对所述标记物具有亲和力的蛋白上，再直接被保留于NycoCardTM设备中的蛋白结合膜捕获。这种设备应包括一张合适的薄膜，其一侧附有吸收性衬垫如纤维素纸以促进液体样品通过薄膜。在一个实施方案中，在膜的另一侧可安放一个非渗透性的片层并提供一些空洞以允许在多样品待分析时在膜上加载样品。当将要去除被标记的序列而收集未被标记的核酸时，可以使用一种蛋白结合滤膜用作预过滤膜，其位于安装在NycoCard设备上的核酸结合滤膜上，以便将标记的非所需分子存留在预过滤膜上，而未标记的所需分子则存留在核酸结合滤膜上。
基质可由多种业内已知的用于此目的的材料构成，包括聚合材料例如纤维素、聚苯乙烯、琼脂糖、乳胶，这些材料可以被衍生或修饰以供捕获标记物本身，或捕获作为标记物与基质间连接因子的标记物之结合配对物。所述材料可以用诸如对标记物具有亲和力的物质、或结合配对物、或用于介导标记物捕获的连接因子包被。优选地，基质对标记物或其结合配对物比对核酸更有特异结合性，以便未被标记的分子不能被基质存留。在本发明一优选方面，捕获过程涉及蛋白，标记物或是蛋白，或是含有可连接该标记物与基质之蛋白性结合配对物的物质，从而使所述基质具有可接受蛋白的特性。这方面的实例已为业内所知，包括已知的蛋白结合基质，其至少在所用条件下被对蛋白有特异亲和力的多聚体包被。依照业内已知的方法，这种基质可携带或被标记物的结合配对物取代，如WO90/04786所述，其包括直接化学键结合如共价结合，吸附或亲和结合。特别优选含有蛋白结合多聚体的膜，如在WO98/23630、EP-0524800和EP-0580305中所述，如Edge Biosystems，USA出售的Centriflex(TM)膜。
在样品待分级分离且溶液中未标记的核酸分子将被收集并用于下游步骤时，本发明的分离方法特别方便。但这种方法同样可用于待收集以便进一步处理的标记的核酸分子。当标记分子是被收集以便进一步操作的那些时，这些分子需要从基质上释放出来，并且根据所用捕获方法，还需从标记物的结合配对物中释放出来。所用释放方法可能依赖于标记物的特性，其结合配对物，以及它们互相之间结合力的类型和强度。
用于释放步骤的反应条件也是可选择的，以便防止已释放的标记核酸与基质或其结合配对物重新结合。所述方法的实例已为业内所知。因此，可改变化学或物理条件以协助被标记的核酸分子从基质结合复合物中释放出来。化学方法的实例包括改变离子强度或pH值，加入螯合剂，以及使用竞争性游离标记分子，或化学上与之相关的分子，含有标记物或标记物样组分的分子，可改变结合配对物的构型而减少、消除或修饰标记-结合配对物间作用的分子或离子，加入去污剂或解离剂，或通过酶处理。物理方法的实例包括改变温度、超声处理、振动。这些物理或化学方法的任何组合都可以使用。
根据标记物与其结合配对物之间相互作用强度的不同，可以通过如下方法释放结合配对物或基质上的标记物或已标记的分子，即加入过量标记物使其与标记DNA竞争对结合配对物或对基质的结合位点，然后被释放的标记DNA可以简单的被洗脱下来。因此当标记为荧光素而结合配对物为荧光素抗体时，可以通过在溶液中加入游离荧光素而从基质上释放荧光素-DNA。但是，当标记物-结合配对物之间的相互作用、结合配对物-基质之间的相互作用或标记物-基质之间的相互作用非常强时，加入游离标记物并非总能有效干扰上述相互作用。此时，可以使用其它方法，如通过调节pH值或用酶降解结合配对物从而使其从基质和/或标记物上释放下来。通过如用化学试剂干扰基质使其变为不能结合蛋白的形式，从而释放蛋白-DNA或蛋白-标记物-DNA复合物，或者通过化学方法干扰蛋白与基质之间的相互作用或影响它们之间的亲和性也可以达到释放的目的。
生物素-链霉抗生物素蛋白之间的结合配对存在非常强的相互作用，因此很难通过加入游离生物素的方法破坏。即当标记物为生物素，基质通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白捕捉标记DNA时，不能通过加入游离生物素的方法使生物素化DNA从薄膜上释放下来。但这种方法可以用于对链霉抗生物素蛋白的结合亲和性比生物素低的生物素衍生物，此时标记DNA可以通过加入游离生物素的方法从基质上释放下来。游离生物素将与生物素化DNA竞争对链霉抗生物素蛋白的结合位点，释放后的生物素化DNA可以简单的从基质上洗脱下来。
根据所用标记的不同可能需要插入一个步骤，使将要用于下游步骤的标记DNA从标记物的结合配对物上释放下来，此时结合配对物的作用是将标记DNA固定于基质上。如加入化学物质或离子或应用可以减弱标记与其结合配对物之间结合力的物理条件，然后收集释放后的DNA。
本发明方法可以用于包括分析、制备和诊断等许多不同的应用，实例见下文。其它应用对于熟悉此行业的人员是显而易见的。
本发明的一个重要的应用是切割和连接DNA分子，例如分离特定限制酶消化产物，及从连接反应的其它产物中分离已连接的环状DNA分子。
因此，本发明的一个应用是对限制酶消化的DNA片段的操作，特别是当某一特定片段需要进一步的操作而因此必需从酶反应的其它产物中分离出来时。分离方法可以从未标记分子中分离出一端或两端带有标记物的线性DNA分子群体。标记分子可以在合成过程中被标记，例如使用像生物素化核苷酸这样的标记核苷酸，如以生物素化引物的形式，或可用业内已知的酶学末端标记方法标记DNA分子。
因此另一方面，本发明提供了一种可以至少部分分离DNA的限制酶消化片段之混合物的方法，其中起始材料是线性DNA分子，其一端或两端已被或可以被组分标记，此组分能固定于基质上，所述方法包括使用限制酶消化DNA分子，然后将样品与基质接触借此使基质捕获来自起始材料某个末端的标记分子，从而使其与未标记的分子分离。
由于合成的操作方式，此方法特别适用于分离PCR所得DNA的消化产物。在使用PCR扩增DNA的方法中使用了两种特异性寡核苷酸引物，其中一个与编码链的5′端互补并因此杂交而另一个引物则与非编码链的5′端互补并因此杂交，以致当适当DNA聚合酶存在时可以合成靶序列的全长拷贝。该拷贝在两条合成DNA链中，每条链5′端均插入有寡核苷酸引物。这种PCR合成方法经常用于为随后的遗传学操作制备特异的DNA分子或片段，其中所需特异性DNA片段可以通过限制酶切割较长的PCR产物获得。如前所述，由于限制酶切割后的其它产物，例如部分消化产物和未消化的DNA分子的连接混合物存在于随后的操作中，这些随后的遗传学操作通常效率不高。当用于下游步骤的目的产物是全长PCR的内部片段时，限制酶消化后的“非所需”副产物将至少包括全长PCR产物的一个末端，通过使用像生物素化引物这样的标记引物，本发明方法可以用于至少部分的从含有末端的片段和未消化分子中分离出所需产物。通过这样的方法，可以从核酸样品中去除标记后的核酸分子，存留于样品溶液中的只有所需内部限制片段，因为它不含有像PCR引物这样的末端因此也就未被标记。
本发明涉及PCR方法学的另一个方面是所谓的“纯化(clean-up)”PCR反应产物，即去除由于引物错误退火而导致的非所需产物。核酸模板越大，这种问题越严重。当PCR反应欲扩增的核酸样品的末端或接近末端处存在唯一的限制酶位点或其它可切割序列时可以应用本发明方法。
这一方法包括使用标记后的或可被标记的PCR引物，此引物与欲扩增的序列末端互补因此可以与模板核酸杂交，并且只与每个唯一限制位点部分重叠。如果使用与模板核酸内全长限制酶识别序列互补并杂交的引物，无论引物是否与目的序列退火或者无论PCR产物是否为引物错误退火的产物，PCR反应产生的任何核酸分子都将带有所述限制酶识别位点。然而使用只与模板中限制酶识别位点部分杂交的引物，产物仅限于在限制酶识别位点按要求退火而的那些。因此通过使用标记后的或可被标记的引物，就有可能通过PCR反应操作，然后用特异于上述限制识别位点的限制酶切割或消化该PCR反应产物而使之纯化。通过这种限制酶消化，只有正确的PCR产物，即能被切割并去除引物和标记的那些，可与不能被切割而仍然留有标记物的非所需PCR延伸产物分离开来。
因此从一方面看，本发明提供了一种至少部分的从PCR引物与模板不正确退火造成的PCR产物中分离出所需正确PCR扩增产物的方法，其中模板核酸分子在其一个末端或附近含有一个唯一的限制酶识别位点，并且被标记的或可被标记的PCR引物只与模板上部分延伸至该唯一限制酶位点的序列互补，此方法包括通过PCR扩增模板，使用特异作用于上述唯一限制酶识别位点的限制酶消化PCR产物，以及将所得产物与可以固定标记物的基质接触，从而通过基质捕获标记核酸分子使之与未标记分子相分离。
在此文中，唯一限制酶位点是指在模板核酸分子中只有单一识别位点的限制酶，但也包括在特殊情况下在模板的每一端处或附近有同样的限制位点。
在一个实施方案中，将要用PCR扩增的模板核酸分子只在一个末端出或附近掺入一个唯一限制位点。当用这种酶处理反应产物，将产生部分“纯化”的PCR产物，“纯化”的程度至少部分依赖于与含有这一唯一位点之模板退火的引物可能造成错误退火的程度。在这个实施方案中，只有延伸至所述唯一限制酶位点的引物被标记或可被标记。在一个优选的实施方案中，将要通过PCR扩增的模板在其每一个末端或近侧都含有一个唯一的限制酶位点。这些位点可以是同一种限制酶的位点，即一种限制酶切割模板和PCR产物两次，每次位于一个末端，或者这些位点可以是不同限制酶的位点，只要每个上述限制酶在模板上只有一个单一识别位点并且分别在模板的两端即可。
在这种方法中，每个唯一限制位点相对于核酸模板末端的位置至少部分依赖于所使用的特定限制酶，因为在有效限制切割时不同的酶对于其位点与末端的最小距离有不同的要求。这些最适参数已为业内所共知，且在如限制酶生产商提供的目录中均有描述。总体来说，限制酶位点应距末端至少一个碱基。对酶及其位置的选择可由技术人员根据领域内常识并根据厂家提供的信息很容易地确定。总体来说限制位点应至少距末端有最小距离以便相应酶进行有效切割，但位点也可以远离所述末端。例如，此最小距离在BamHI为至少距末端一个碱基，在NdeI为至少距末端6个碱基。最小距离可参见限制酶生产商出版的目录，如New England Biolabs Catalogue 1999，和Moreira and Noren，生物技术，19，56-59(1999)。
因此通过使用或以业内已知的重组DNA技术构建在其每一端或近侧含有唯一限制酶位点的模板，就可以去除由于PCR引物与模板非目的位置错误退火而产生的非所需PCR副产物。当一对引物都被标记或可被标记时，所有PCR产物的两端都可以在最初被标记。使用在模板每个末端都有唯一识别位点的前述限制酶同时或顺序消化PCR产物，未被切割或只有一端被切割的分子将保留标记物，由限制酶切割出的正确PCR产物的双末端也是如此；它们可与两个引物都被去除而因此不再含有标记或可被标记的组分的目的产物分离开来。这一方法的优点在于可以省却用于精细调整PCR反应的大量时间和材料，而使用凝胶电泳或其它通过大小分离PCR产物的方法则必需对PCR反应进行精细调整。如果两个PCR引物中只有一个被标记或可被标记则仍可以实现对PCR产物的至少部分“纯化”。
标记物为生物素时操作很方便，其中在限制酶消化之前或之后将PCR产物接触链霉抗生物素蛋白，然后可以通过蛋白结合基质将有链霉抗生物素蛋白结合的标记分子与未标记分子分离开。如前所述，另一种方法是基质本身可以带有链霉抗生物素蛋白。
在本发明的这个特定实施方案中，标记物可以附加在引物的任何位置，只要引物的3′末端可由PCR聚合酶的延伸。更方便的方法是可在引物的5′末端附加标记物，因为在这一位置添加标记不会导致合成困难。而且一些并非局限于理论的观点认为位于引物5′末端的标记物较不可能干扰PCR聚合酶的活性，并且在本文中描述的任何捕获方法中也更容易被捕获。
以下表示了一个实例
5’-tttactggatcctag------ttacgtacattaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgtaattagcc-5’该片段具有两个唯一的限制位点，一个位于“左侧”的BamHI位点(ggatcc)以及一个位于“右侧”的AsnI位点(attaat)。以一般方式扩增这一片段通常需要制备两个引物，可任选在其5’末端标记生物素，如下所示BamHI引物5’-生物素-tttactggatcctag-3’AsnI引物5’-生物素-ccgattaatgtacgtaa-3’在PCR反应中使用这些引物通常将产生许多产物，主要原因是在PCR中引物错误的退火。
BamHI和AsnI引物在其序列中充分体现了核酸识别序列。这将使得以这些引物进行的PCR反应所产生的每个DNA片段都含有BamHI和AsnI限制酶识别位点。所有PCR反应所产生的片段，不论正确的(即目的)产物或副产物，都将可以被BamHI和AsnI酶切割。
然而，本发明实施方案中使用稍短的引物，可以非常有效的去除所有非所需副产物。
可用的引物实例如下BamHI短引物5’-生物素-tttactgga-3’AsnI短引物5’-生物素-ccgatt-3’这些引物只与限制酶的识别位点部分重叠。因此，只有通过与其目的核酸位点退火才能形成完整的酶识别位点。其结果是，只有PCR反应产生的正确的(或目的)片段才能被两种限制酶切割。
使用上述引物可能产生的4组PCR产物如下(B＝生物素标记)5’-Btttactggatcctag------ttacgtacattaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgtaattagccB-5’(正确片段-2个限制位点)5’-Btttactggtag------ttacgtacattaatcgg-3’3’-aaatgaccatc------aatgcatgtaattagccB-5’(不正确片段-只方1个限制位点(AsnI))5’-Btttactggatcctag------ttacgtacaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgttagccB-5’(不正确片段-只有1个限制位点(BamHI))
5’-Btttactggatag------ttacgtacaatcgg-3’3’-aaatgacctatc------aatgcatgttagccB-5’(不正确片段-没有限制位点)以AsnI和BamHI切割得到如下片段5’-Btttactggatcctag------ttacgtaca ttaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgtaattagccB-5’(正确片段-2个限制位点-2个生物素都被去除)5’-Btttactggtag------ttacgtaca ttaatcgg-3’3’-aaatgaccatc------aatgcatgtaattagccB-5’(不正确片段-只有1个限制位点(AsnI)-只有1个生物素被去除)5’-Btttactggatcctag------ttacgtacaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgttagccB-5’(不正确片段-只有1个限制位点(BamHI)-只有1个生物索被去除)5’-Btttactggatag------ttacgtacaatcgg-3’3’-aaatgacctatc------aatgcatgttagccB-5’(不正确片段-没有限制位点-由于没有限制位点无一生物素被去除)在所有上述片段的混合物中，只有一种片段即正确的片段将没有生物索附着。通过在片段中加入链霉抗生物素蛋白并将反应产物与蛋白结合基质接触，例如通过一个Centriflex薄膜，则只有正确的片段将不被捕获并且在使用Centriflex薄膜这样的情况下，其可以不受任何阻碍的通过薄膜。
使用短引物(即不能完全延伸进入模板上限制酶位点的引物)和长引物(掺入了全长限制酶位点)的区别是显而易见的，因为在使用长引物的情况下，所有的片段甚至错误的片段也导入了AsnI和BamHI限制酶位点。此时就无法区分正确和错误的PCR反应产物。
本方法也可以用于分离DNA分子经限制酶消化后的产物，这种产物可以是线性的或已经被线性化，并且通过业内已知的末端标记方法，例如酶学方法在一端或两端进行了标记。一个实例是单独使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或与DNA聚合酶I(Klenow片段)联合使用，在线性DNA分子3′末端的游离羟基上加入标记的核苷酸，如生物素或荧光素或地高辛配基标记的核苷酸。如果用于限制酶消化的线性DNA是平末端或有突出3′的末端则只需TdT就可以标记3′末端。然而当其5′末端为突出端，3′末端为凹进端时，需另加入Klenow片段等酶填以补凹进末端而提高效率。
当标记物是生物素时，样品首先在溶液中与链霉抗生物素蛋白接触，然后将样品通过一个可以结合链霉抗生物素蛋白的蛋白结合薄膜，从而存留不需要的、标记的核酸分子而溶液中留下目的片段，其形式适于进一步操作。
这比现有方法有显著改进，现有方法工作量大，并涉及在琼脂糖凝胶中分离限制酶消化混合物，通过溴化乙锭染色使片段可见，切除所需DNA片段并将其从凝胶中纯化出来，这一过程非常冗长，且操作过程中DNA暴露于核酸酶的危险极大。
本发明此方面的另一应用是在PCR扩增产物的限制酶消化领域。有时需进行部分限制酶消化，即，使用有限量的酶进行消化。限制酶制剂经常含有少量的内切核酸酶，它们可以降解新切割的DNA末端从而降低所需片段的质量，并使进一步操作，如将DNA连接入表达载体发生困难。然而，由于核酸酶污染导致的这类问题可以通过使用有限量的限制酶和缩减保温时间最小化。但一个缺点是消化产物将会含有一些不需要的限制酶消化副产物，例如只部分切割的分子或未被切割的分子。本发明方法却可以实现部分消化，方法是使用标记的如生物素化引物DNA通过PCR合成限制酶消化底物，以便任何至少含有一个末端的DNA分子或片段(例如未被消化的分子，或部分消化的分子)可以通过合适的基质被去除，而溶液中只富含所需内部限制片段。
本发明基于标记的分离方法的另一应用涉及诊断型PCR。已知可用PCR检测突变，包括仅单个核苷酸差异的突变，如镰刀型细胞贫血症中出现的情况。有时，PCR片段的大小可以预示特定突变的存在或缺失。但通常，诊断型PCR技术还需在最初PCR后，对患者样品实施其它技术，以诊断样品中是否存在突变，如限制酶分析和/或测序。这些技术可能花费巨大，因为它们经常需要使用像肽核酸这样昂贵的化学制剂并且也相当费时，而且导致延缓了对患者状况的判断。使用本发明的标记物-捕获方法，通过使用至少一种标记的或可被标记的PCR引物进行PCR可以大大简化现有方法。通过使用标记引物就可以不必进行上述进一步的步骤，即只用PCR扩增的步骤就可以检测突变的存在。
因此当应用于诊断型PCR时，本发明方法可以代替现有诊断方法中对PCR产物进行测序的需要。在这个实施方案中，与样品3′末端退火并在其位延伸的引物被标记或可被标记，所用方式使其保留3′OH基团并可因此在PCR反应中延伸，而且它对突变核酸具有特异性；即它可与疾病状态下改变了的核酸序列杂交。或者，3′引物可以与正常核酸序列杂交。
在一个实施方案中，本方法可以用于检测单个碱基突变，此时引物的3′末端与突变碱基相对应。当有多个碱基突变时，引物3′末端可以与任何一个突变碱基相对应。
因此当突变已知时，在此实施方案中的一种方案中，对样品DNA进行两个PCR反应，每个反应都使用相同的对样品5′末端的引物，却使用不同的3′末端引物，一种3′引物杂交并可以产生一种与“正常”DNA相对应的延伸产物，而另一个引物则与突变核酸序列特异互补从而可以产生与该突变序列相对应的延伸产物。在使用适于突变DNA的标记引物对突变的靶序列进行PCR时，PCR扩增产物中将插入标记物，而使用“正常”引物进行PCR反应时，在引物的3′末端将会有错配碱基，它们将被PCR聚合酶如Tap聚合酶去除，如果3′碱基被标记，则其去除将远离其携有的标记物或可被标记的组分。PCR产物将因此不含有标记。因此仅有突变核酸的PCR反应产物，它们由被标记的或可被标记的突变引物延伸而成，并可用任何前述方法检测。
使用不含待检测之特定突变的“正常”DNA进行PCR延伸时出现相反的情况。此时，用突变引物可获得PCR产物，其中引物的3′核苷酸错配并因此连同标记物一起被去除，因而在全长反应产物中检测不到，而使用“正常”引物的产物中将会含有标记物或可被标记的组分，它们可被检测。
在这个实施方案中，标记物或可被标记的组分存在或附着于3′碱基，其方式使3′OH仍能由PCR聚合酶延伸。
因此另一方面，本发明提供了一种诊断型PCR的方法，其中待测样品分别进行PCR反应，其中如有突变则位于与3′引物互补的序列中，第一PCR反应使用与正常靶核酸互补的3′引物而第二PCR反应使用与突变的靶核酸互补的3′引物，其中突变引物的3′核苷酸与突变核酸中已突变的核苷酸之一相对应，上述3′引物的任何一个在其3′核苷酸上都含有一个标记或可以被标记，在此方法中检测的是PCR反应产物中标记物的存在或缺失。
在其最简单的实施方案中，3′引物被诸如生物素标记，而生物素可以通过本文所述的任何一种方法检测。可以检测生物素化PCR产物的方法有，加入链霉抗生物素蛋白，在蛋白结合薄膜上滤过，检测存留在薄膜上的DNA，或者加入链霉抗生物素蛋白包被的金颗粒，如EP-0564494所述，过膜，如上述NycoCardTM系统中的硝酸纤维素膜。可任选，但优选需要较小PCR片段时，薄膜可用聚赖氨酸包被以增进其DNA结合容量。在这种检测方法中，PCR反应产物将会全部结合到薄膜上但只有生物素化反应产物有金微粒附着从而发出可检测的信号。在另一种可选择的方法中，可以在PCR反应产物中加入链霉抗生物素蛋白并将混合物通过Centriflex薄膜。如果在通过薄膜的物质中检测不到DNA，则说明DNA已经存留在薄膜上，从而证明其已经生物素化了。
在引物本身并未被标记但可以被标记的情况下，需要在检测步骤前加入标记物。
在另一个实施方案中，可以使用特异性针对正常或突变序列的标记引物进行单次PCR反应，根据引物是特异性针对正常DNA还是突变DNA，可以通过PCR产物中标记物的存在预示突变的存在或缺失。即，如果标记引物对正常DNA有特异性，则正常DNA的PCR产物可以被标记，同时突变DNA的PCR产物则不会被标记，如果标记引物对突变DNA有特异性，则正常DNA的PCR产物将不被标记，同时突变DNA的PCR产物可以被标记并因此被检测到。因此虽然进行双重的PCR反应可以给出更加可靠的结果，单一PCR至少可以给出突变存在或缺失的指征。
因此另一方面，本发明提供了针对核酸分子中突变的诊断型PCR方法，应用此方法可检测核酸样品中突变的存在或缺失，此方法所用3′引物特异性针对正常核酸或突变核酸，其中与所述引物互补的核酸区在正常与突变DNA之间有一个碱基的差异，而所述引物的3′末端对应于样品中正常与突变DNA存在差异的位置，所述引物被标记或可被标记，借此检测PCR产物中所述标记物的存在或缺失。
使用特异性针对正常DNA的3′引物也至少可以进行初步诊断。
因此本发明另一方面提供了一种诊断型PCR方法，其中待测样品用互补于正常靶DNA的引物进行PCR，其中用于延伸所述靶3′末端的引物与一段其3′端核苷酸在突变体中已突变的序列退火，所述3′引物在3′核苷酸处或其上带有标记物或可被标记，可对PCR反应产物中所述标记物的存在精细检测。
通过这种方法，产物中可检测标记的缺失意味着样品中不含有正常DNA。
检测单个碱基突变的实例如下所示在这一实例中，用于延伸样品3′末端的引物的3′末端与模板上突变的DNA对应。
假定本实例的目的是确定某患者基因正常还是带有异常的遗传突变。
所述基因的正常DNA序列是5’-ccccatg------atgacctaggAccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccTggtgga-5’此患者的DNA似乎是5’-ccccatg------atgacctaggCccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccGggtgga-5’其中存在一个突变。本检验并非必需了解患者的DNA情况。只需知道正常状况以便诊断突变。
为了进行PCR需要一对引物，其中一个引物在5’末端区域退火，而另一个则在3’末端区域退火。5’端引物对于有无突变的患者来说是完全相同的，如下所示1号引物5’-ccccatg-3’对于另一个3’区域，需要一条与正常状态匹配的引物，如下所示2号正常引物5’-aggtggg-3’如果突变已知，可以按以下所示构建引物2号异常引物5’-aggtggt-3’为了使此方法达到预期效果，最后一个3’末端核苷酸被生物素标记，其仍然保留在PCR反应中延伸的能力(具有游离的3’端OH)。
所述3’末端引物如下所示2号正常引物5’-aggtgggB-3’2号异常引物5’-aggtggtB-3’(B＝生物索)使用这些引物扩增正常DNA获得的PCR产物将会是
(1号引物+2号正常引物)5’-ccccatg------atgacctaggAccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccTggtgga-5’|生物素(1号引物+2号异常引物)5’-ccccatg------atgacctaggAccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccTggtgga-5’+生物素只有用2号正常引物扩增正常模板DNA才会得到生物素化PCR产物。PCR酶会从2号异常引物上将生物素去除，从而得到非生物素化产物。
使用以下引物扩增异常DNA模板得到的PCR产物将会是(1号引物+2号异常引物)5’-ccccatg------atgacctaggCccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccGggtgga-5’|生物素(1号引物+2号正常引物)5’-ccccatg------atgacctaggCccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccGggtgga-5’结果如上所述，但正好相反。
生物素化产物的存在将可以说明患者是否带有突变。
以下对单个碱基突变所致镰刀形细胞贫血症的诊断型PCR实例在这个实例中，引物表示为已经被生物素标记。这只是可用之标记的一个实例，并非限于此例；也可以使用其它标记物。
正常人血红素A1中，单元型A1β-球蛋白基因的第1外显子(编码部分)的DNA序列如下起始正常DNAatg gtg cac ctg act cct gag gag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…以上核酸序列将翻译成
正常氨基酸序列MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…对于人类镰刀形细胞贫血症，单元型Sβ-球蛋白基因的第1外显子的DNA序列如下起始镰刀形细胞贫血症DNAatg gtg cac ctg act cct gtg gag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…以上核酸序列将翻译成镰刀形细胞贫血症氨基酸序列MVHLTPVEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…对正常DNA和镰刀形细胞贫血症DNA的比较发现，单个碱基取代足以将正常血红素基因转变为异常血红素基因，而后者已知可以引起严重的镰刀形细胞贫血症。Gag密码子突变为gtg密码子导致酸性氨基酸谷氨酸被非极性氨基酸缬氨酸取代。
为检测这种突变的存在与否，分离基因组DNA，且必要时在诊断型PCR之前进行传统形式的PCR扩增。
用于扩增血红素β链基因一部分的引物是基于EMBEL搜索程序对独特标示EMBL-IDHSBETGLOB′搜索后给出的DNA序列而得到的。
血红素β链基因(以下表示为分隔的三联体)之前有一个内含子序列(内含子1)，之后接以另一个序列(内含子2)，这两个内含子均以斜体表示如下。
部分内含子(下划线)可用于构建引物(见下)。
gcataaaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatg gtg cac ctg act cct gaggag aag tct gcc gtt act gcc ctg tgg ggc aag gtg aac gtggat gaa gtt ggt ggt gag gcc ctg ggc aggggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacc...
此基因编码序列两侧为非编码性的内含子；第2内含子将上述编码序列与处于更下游的下一部分编码序列分开。
为扩增此基因的第1编码部分以便随后进行诊断型PCR，可以使用例如分别与第1和第2内含子退火的一对引物。与引物退火的序列如上以下划线的斜体表示。
引物l5’-ctagcaacctcaaacagacacc-3’引物25’-gtaaccttgataccaacctgcc-3’这一对引物只用于PCR扩增以获得更多用于诊断型PCR的DNA模板，因此并不需要生物素化或任何形式的修饰。
由于已知突变的特点，即上述外显子第6密码子的单个碱基突变，为进行诊断型PCR，设计了3个引物，它们对应于正常和异常(镰刀形细胞贫血症)DNA。
对应于正常血红素的引物引物N5’-atg gtg cac ctg act cct ga-生物素-OH对应于镰刀形细胞贫血症血红素的引物引物S5’-atg gtg cac ctg act cct gt-生物素-OH对应于该基因另一末端的引物引物25’-gtaaccttgataccaacctgcc-3’(这个引物可以与扩增步骤所用的引物相同；其不需标记或修饰)然后以第1步中的引物和样品或PCR扩增样品进行诊断型测试。
进行了两个PCR反应a)使用引物N+引物2的PCRb)使用引物S+引物2的PCR然后如上述检测PCR反应a)和b)所得产物中是否存在生物素。
检测两个PCR反应a)和b)的结果为以下四种可能之一。
本方法也可以用于诊断多碱基突变，如下所示，同样以镰刀形细胞贫血症为例在β球蛋白基因的第1外显子中存在一个多碱基突变(以粗体下划线表示)，其DNA序列如下所示atg gtg cac ctg act cctaacgag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…以上核酸序列将翻译成以下氨基酸序列MVHLTPNEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…诸如引物N等上述引物可用于揭示是否存在正常基因。为了检测潜在突变的存在需要可以检测这种突变的引物。
其中一个可用的引物对应于突变血红素如下5′-atggtgcacctgactcctaac-生物素-OH这条引物将会准确鉴定出第6密码子中的′acc′突变。
另一条可用的引物如下5′-atggtgcacctgactccta-生物素-OH这种引物可用来鉴定第6密码子中以′a′碱基起始的所有突变。
以正常引物N和一个或多个对应于(即互补于)突变序列的引物进行PCR反应。
这一方法可以用于正常基因的任何已知序列，血红素镰刀形细胞突变只是其中一例。当群体中常见的突变已知时，可以使用多种引物以明确查明所存在的突变。
本发明方法的另一用途是从重组分子中切割并分离所需DNA片段以便进一步操作。其中一个相关方面是切割并分离载体DNA以便。克隆及其它生物技术性方法中需要能获得高质量线性化载体DNA片段的有效方法。正如业内已知的，质粒和病毒等载体中除含有调控复制和转录的相应元件外，还含有一或多个克隆位点以便插入异源性DNA并扩增或表达。正如限制酶可用于将异源片段插入克隆载体以制备重组载体，限制酶也可用于切割异源性片段或载体元件以便进一步遗传学操作。这类载体包含环状DNA分子。这些包括一个填充片段，通常还有一个多聚接头以及一个含前述调控序列的片段。在一种方法中，插入了异源性DNA片段的重组载体通过限制酶消化以切割插入的DNA片段，这一过程将会产生线性DNA分子的混合物，包括载体本身的填充片段，插入片段和部分切割的重组DNA分子。本发明方法用于当需要切除异源插入片段之重组DNA分子中的填充(或载体)元件包含特异性蛋白识别序列，如AP-1识别序列时。在本发明方法中，限制酶消化产物在溶液中与此核酸特异性蛋白接触，此例中应为AP-1，然后使溶液通过蛋白选择性膜从而捕获与AP-1结合的核酸分子，只有那些含有异源性插入DNA因此没有AP-1识别序列的DNA分子存留于溶液中。
在另一个相关的实施方案中，本方法可用来分离载体本身的线性化形式，即通过限制酶消化而线性化并已切除填充片段的载体以便进一步操作。这类载体片段可随后用于插入并连接异源性DNA，环化后又可继续使用，如转化宿主细胞。
在一实例中，填充片段是或包含带有唯一限制酶识别位点的多聚接头。该载体用所述酶之一切割而产生线性化分子。然后使用前述酶学技术可以在这些线性分子末端进行标记。为使后续操作简化，优选此唯一切割酶是可产生3′突出端的限制酶。此时，线性载体分子可以通过加入标记的核苷酸如利用TdT加入生物素化核苷酸而进行末端标记。如果所述酶产生5′突出端，则需要再加入Klenow片段以延伸3′末端。我们发现这种方法效率较高，特别是当使用了大于10μg的较大量DNA时。在标记了线性载体后，进一步用一个或多个限制酶消化，优选在最初切割位点两侧各有一个的填充片段中具有唯一切割位点的限制酶。这样可以对末端片段进行标记，并通过本发明方法从填充片段中分离出未标记的所需片段。因此当样品通过滤膜时，充分切割的载体将会通过薄膜。
在进一步的应用中，本发明的方法可用于从连接混合物中去除非复制型连接产物。使用DNA连接酶对两个DNA片段进行共价连接是生物技术的中心环节。一般来说，连接反应包括将小DNA片段或插入片段插入到较大的载体DNA中。确保最终的连接产物被正确的环化是非常重要的，因为只有这样才能避免其在转化入宿主细胞如细菌后不被降解。因此，线性连接产物是没有用途的，而且在宿主细菌中也无法存在。不幸的是，连接酶反应的效率并不高，通常只有80％的线性产物可连接。这就降低了大肠杆菌摄取环状复制型连接产物的效率。从这个角度看，线性产物因此可以看成是连接反应的污染物或副产物。如果能够在转化前从反应混合物中去除不需要的线性连接产物，那将会提高连接产物的转化效率。然而现在没有可行的方法。由于环状复制型连接产物的多形性特点，因而其不能通过切割从凝胶中回收。
因此本发明另一方面提供了一种将样品中线性核酸分子与环状核酸分子分离的方法，该方法包括在线性核酸分子末端引入标记物，该标记可通过直接与基质作用或通过其结合配对物间接与基质作用而固定于基质上，使样品与基质接触，或当所述标记物与基质是间接相互作用时，使样品与该标记物的简化配对物以及与基质接触，从而将上述被标记的线性核酸分子固定于基质上。
本发明方法可用于此例，因为连接混合物中除目的环状分子以外的所有DNA分子都有游离末端，以及暴露的反应性磷酸基团和羟基。它们可通过前述酶学方法使用标记的核苷酸如生物素化核苷酸进行末端标记。环状分子由于没有反应性3′羟基可供标记附着因而不能被标记。这样，被标记的线性分子可以被基质捕获从而与存留在溶液中的环化分子分离，这些环状分子就可以用于后续步骤如转化宿主细胞。
在本发明另一实施方案中，所述方法可用于噬菌体颗粒如λ噬菌体的体外包装，如在构建基因文库以及噬菌体展示文库时。噬菌体既可以在体外包装也可以在细菌内包装，体外包装时将病毒DNA与各种病毒衣壳蛋白成分在体外混合从而引发病毒装配，细菌中包装时病毒DNA被引入适当细菌，由细菌提供病毒装配所必需的蛋白成分。体外包装比细菌转化方法更快捷，因为体外包装可以在若干分钟内完成，而细菌转化方法则需要1-2天。然而与细菌转化方法相比，体外包装的效率较低，特别是当被包装的噬菌体DNA已经被操作过，例如已经插入了异源性DNA的λDNA，有实验表明与未被修饰的线性λ病毒相比，经分子操作后得到的线性DNA的包装效率可以减少103/μg DNA。这种效率的降低至少部分是由于DNA操作中副产物的存在。因此如果包装前将这些副产物去除较有利，因为这样可提高体外包装的效率，使这种体外包装方法成为更快捷且更有效的综合方法从而得以取代细菌转化的方法。本发明方法可通过使用标记系统标记不需要的片段并使其从所需连接产物中分离而实现上述设想。
本方法得益于噬菌体基因组中存在的cos位点。在λ噬菌体基因组的两个末端都有一DNA单链互补区域，当线性λDNA插入到细菌细胞后，这两个区域相互退火形成一个环形基因组，这种环形基因组可以复制，并且不象线性DNA那样易被细菌核酸内切核酸酶降解。
在这个实施方案中，在将异源DNA克隆到λ载体之前，首先通过如加入双脱氧核苷酸以及适当DNA聚合酶如klenow片段来封闭λ载体的3′末端，klenow片段可以有效的去除3′cos位点的反应性OH而只留下非反应性氢，这样的末端既不能被延伸也不能被标记。因此在克隆反应结束后，将DNA分子标记上只能加入到3′OH基团的标记物。这样，只有正确连接的产物没有3′OH基团且不能被标记；所有其它的DNA分子，包括已切割的载体片段以及将要克隆的片段都有反应性3′OH基团而可以被标记。由于只有正确连接的DNA分子没有被标记，因而可以使用本文所述的任何方法将这些正确连接的DNA分子很容易地从不需要的副产物中分离出来。
因此本发明另一方面提供了一种重组噬菌体体外包装的方法，其中载体DNA用一个或多个限制酶切割，载体DNA的3′OH基团被封闭，载体和将被插入的DNA在适合DNA片段连接的条件下相接触，连接产物用可以附着于反应性3′OH基团的组分标记，随后分离标记和未标记的分子。
在本文中，封闭3′OH基团是指3′OH基团缺失、或被保护或经某些方式被修饰而因此不能进一步被延伸。
在一个方便的实施方案中，标记物是生物素，其可以通过使用酶学方法如用klenow片段以生物素化核苷酸的形式加入到反应性3′OH基团中。
在一个实施方案中，首先使用诸如双脱氧核苷酸封闭载体的3′末端，然后使用在载体内部只有单一识别位点的酶切割载体，此识别位点应位于克隆所用的两个识别位点之间。EcoRI就是这样的限制酶的一个实例。这个起始限制酶切割的目的在于通过标记去除所有在随后的步骤中不被切割的载体DNA分子。然后使用两个分别在载体中只有唯一切割位点的酶在两个位置切割载体从而形成克隆位点。在产生用于克隆的载体片段以外，也将获得许多可通过标记(例如当标记为生物素时通过上述链霉抗生物素蛋白结合)去除的被部分切割的限制酶切产物。然后将用于克隆的DNA片段连接到λ载体DNA中。为了去除所有不需要的反应产物，所有暴露的3′末端均使用例如生物素进行标记。正确的连接产物因没有3′OH基团而不能被标记，从而可以通过本文所述方法从所有标记分子中分离出来。
现在参考以下非限制性的实施对本发明进行详细的介绍。
实施例实施例1对带有5′突出型DNA末端的限制酶切DNA片段进行末端标记试剂5μg经HindIII切割后的λDNA(Gibco 15612-13)40个单位的DNA聚合酶I，Klenow大片段(New England Biolabs#210S)10μlDNA聚合酶I，Klenow大片段的缓冲液(New England Biolabs)5 nmol生物素-14-dCTP(Gibco 19518-018)5 nmol dATP (Gibco 10216-018)5 nmol dTTP(Gibco 10219-012)5 nmol dGTP(Gibco 10218-014)蒸馏水100μl反应混合物在25℃保温45分钟。
将反应混合物通过一个S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)，加入10μg链霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保温5分钟。
在Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中加入反应混合物并按生产商所描述的方法使其扩散入薄膜中，随后10000xg离心30秒。在薄膜上加10μl蒸馏水，水平翻转180°并再次10000xg离心。
在1％琼脂糖(FMC#50080)凝胶电泳中分析洗脱物，按Maniatis，分子克隆实验指南，第2版，1989中所述方法用溴化乙锭染色。
在凝胶中未见λDNA的痕迹，表明有链霉抗生物素蛋白附着的末端带标记的线性分子已存留在薄膜上。
实施例2有钝端和3′突出端的DNA片段的末端标记试剂
2μg Low DNA MassTM序列梯(Gibco 10068-013)40个单位末端化双脱氧核苷酸转移酶，重组型(Gibco 10533-016)20μl末端化双脱氧核苷酸转移酶缓冲液，重组型(Gibco)5 nmol生物素-14-dCTP(Gibco 19518-018)蒸馏水100μl反应混合物在37℃保温45分钟。
将反应混合物通过一个S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)，加入10μg链霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保温5分钟。
在Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中加入反应混合物并按生产商所描述的方法使其扩散入薄膜中，随后10000xg离心30秒。在薄膜上加10μl蒸馏水，水平翻转180°并再次10000xg离心。
为观察，洗脱物于2％的琼脂糖(FMC#50080)凝胶中电泳，按Maniatis，分子克隆实验指南，第2版，1989中所述方法用溴化乙锭染色。
在凝胶中未见λDNA的痕迹，表明有链霉抗生物素蛋白附着的末端带标记的线性分子已存留在薄膜上。
实施例3通过去除填充片段来制备载体DNA使用Qiagen maxiprep(Qiagen#12166)制备含有待测插入片段的Cantab5E载体(Pharmacia-Amersham 279401-01)Cantab 5E载体含有SfiI、NotI和BsmI的唯一限制位点，其中SfiI和BsmI位点位于NotI位点的两侧。
试剂25μg上述的Cantab 5E载体40个单位的NotI内切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI内切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)的缓冲液用水补平至50μl反应混合物在37℃保温1小时。
将反应混合物通过一个S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)，随后加入40个单位的DNA聚合酶I，Klenow大片段(New England Biolabs#210S)10μlDNA聚合酶I，Klenow大片段的缓冲液(New England Biolabs)5 nmol生物素-14-dCTP(Gibco 19518-018)5 nmol dGTP(Gibco 10218-014)用蒸馏水补平至100μl反应混合物在25℃保温45分钟。
将反应混合物通过一个S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)。
将反应混合物样品(5μg)稀释到50μl并加入到一个Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生产商所描述的方法使其扩散入薄膜中，随后10000xg离心30秒。在薄膜上加10μl蒸馏水，水平翻转180°并再次10000xg离心。
为观察，洗脱物于2％的琼脂糖(FMC#50080)凝胶中电泳，按Maniatis，分子克隆实验指南，第2版，1989中所述方法用溴化乙锭染色。
在凝胶中未见载体DNA的痕迹，表明所有DNA均已存留在薄膜上。
将反应混合物通过一个S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)，对每一等分试样处理如下(1)33μl反应混合物置于一个单独的试管(1)中，其中再加入20个单位的BsmI(Boehringer-Mannheim 1292315)5μl BsmI缓冲液(Boehringer-Mannheim 1292315)用蒸馏水补平至50μl反应混合物在65℃保温1小时。
(2)33μl反应混合物置于一个单独的试管(2)中，其中再加入20个单位的SfiI(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI缓冲液(Boehringer-Mannheim 1288032)
用蒸馏水补平至50μl反应混合物在50℃保温1小时。
(3)33μl反应混合物置于一个单独的试管(3)中，其中再加入20个单位的SfiI(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI缓冲液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸馏水补平至50μl反应混合物在50℃保温1小时。然后将反应混合物通过一个S400 HRMicroSpin柱，随后在反应混合物中加入以下试剂20个单位的BsmI(Boehringer-Mannheim 1292315)5μl BsmI缓冲液(Boehringer-Mannheim 1292315)用蒸馏水补平至50μl反应混合物在65℃保温1小时。
上述3种反应混合物的每一种分别通过S400 HR MicroSpin柱纯化，在每种混合物中加入10μg链霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保温5分钟。
将每种反应混合物样品分别加入Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生产商所述的方法使其扩散入薄膜中，随后10000xg离心30秒。在薄膜上加10μl蒸馏水，水平翻转180°并再次10000xg离心。
3种反应混合物于1％的琼脂糖(FMC#50080)凝胶中电泳，用溴化乙锭染色。
只有来自于第3个反应样品中的纯化的载体DNA在凝胶中可见，样品1和2没有可检测到的DNA痕迹。这表明只有正确限制性切割的载体通过了薄膜。
实施例4生物素化PCR片段的限制使用高质量生物素化PCR引物扩增scFV构建体而获得PCR产物。
上述scFV构建体是800碱基对的片段，其在40和760位碱基处分别有SfiI和NotI的唯一位点。
将1μg的PCR产物与2μg的链霉抗生物素蛋白(Promega#7041)混合，并在25℃保温5分钟。
将反应混合物加入到一个Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生产商所描述的方法使其扩散入薄膜中，随后10000xg离心30秒。在薄膜上加10μl蒸馏水，水平翻转180°并再次10000xg离心。
为观察，洗脱物于2％的琼脂糖(FMC#50080)凝胶中电泳，用溴化乙锭染色。
检测不到任何PCR产物的痕迹，表明所有的PCR产物均已存留在薄膜上。
然后将各等分试样处理如下(1)3μg的PCR产物加入到一个单独的试管(1)中，该试管中有20个单位的NotI内切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI缓冲液用蒸馏水补平至50μl在37℃保温1小时。
(2)3μg的另一份PCR产物加入到一个单独的试管(2)中，该试管中有20个单位的SfiI内切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI缓冲液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸馏水补平至50μl在50℃保温1小时。
(3)3μg的另一份PCR产物加入到一个单独的试管(3)中，该试管中有20个单位的SfiI内切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI缓冲液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸馏水补平至50μl反应混合物在50℃保温1小时。
将反应混合物通过S400 MicroSpin柱，再加入以下试剂20个单位的NotI内切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI缓冲液(Boehringer-Mannheim 1014714)用蒸馏水补平至50μl并在37℃保温1小时。
上述3种反应混合物的每一种分别通过S400 HRMicroSpin柱纯化，在每种混合物中加入10μg链霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保温5分钟。
将每种反应混合物样品分别加入Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生产商所描述的方法使其扩散入薄膜中，随后10000xg离心30秒。在薄膜上加10μl蒸馏水，水平翻转180°并再次10000xg离心。
为观察，洗脱物于1％的琼脂糖(FMC#50080)凝胶中电泳，用溴化乙锭染色。
只有来自于第3个反应样品中的纯化的PCR产物在凝胶中可见，样品1和2没有可检测到的DNA痕迹。这表明含有末端的片段存留在薄膜上，而内部片段通过了薄膜。
实施例5非生物素化PCR片段的限制性切割使用高质量生物素化PCR引物扩增scFV构建体而获得PCR产物。
1μg的PCR产物与2μg的链霉抗生物素蛋白(Promega#7041)混合，并在25℃保温5分钟。
将反应混合物加入到一个Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生产商所描述的方法使其扩散入薄膜中，随后10000xg离心30秒。在薄膜上加10μl蒸馏水，水平翻转180°并再次10000xg离心。
为观察，洗脱物于2％的琼脂糖(FMC#50080)凝胶中电泳，用溴化乙锭染色。
在凝胶中检测到PCR产物，表明PCR产物并未存留在薄膜上。
在3μgPCR产物中加入以下试剂40个单位的末端化双脱氧核苷酸转移酶，重组型(Gibco 10533-016)20μl末端化双脱氧核苷酸转移酶缓冲液，重组型(Gibco)5nmol生物素-14-dCTP(Gibco 19518-018)用蒸馏水补平至100μl37℃保温45分钟。
将反应混合物通过S200 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275120-01)，加入10μg链霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保温5分钟。
将反应混合物加入到Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生产商所描述的方法使其扩散入薄膜中，随后10000xg离心30秒。在薄膜上加10μl蒸馏水，水平翻转180°并再次10000xg离心。
为观察，洗脱物于2％的琼脂糖(FMC#50080)凝胶中电泳，用溴化乙锭染色。
在凝胶中检测不到PCR产物，表明PCR产物已存留在薄膜上。
然后对3种等分试样处理如下(1)3μg的PCR产物加入到一个单独的试管(1)中，该试管中有20个单位的NotI内切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI缓冲液用蒸馏水补平至50μl并在37℃保温1小时。
(2)3μg的另一份PCR产物加入到一个单独的试管(2)中，该试管中有20个单位的SfiI内切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI缓冲液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸馏水补平至50μl并在50℃保温1小时。
(3)3μg的另一份PCR产物加入到一个单独的试管(3)中，该试管中有20个单位的SfiI内切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI缓冲液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸馏水补平至50μl并在50℃保温1小时。
将此种反应混合物通过S400 MicroSpin柱，再加入以下试剂20个单位的NotI内切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI缓冲液(Boehringer-Mannheim 1014714)
用蒸馏水补平至50μl并在37℃保温1小时。
上述3种反应混合物的每一种分别通过S400 HR MicroSpin柱纯化，在每种混合物中加入10μg链霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保温5分钟。
将每种反应混合物样品分别加入Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生产商所描述的方法使其扩散入薄膜中，随后10000xg离心30秒。在薄膜上加10μl蒸馏水，水平翻转180°并再次10000xg离心。
为观察，洗脱物于1％的琼脂糖(FMC#50080)凝胶中电泳，用溴化乙锭染色。
只有来自于第3个反应样品中的纯化的PCR产物在凝胶中可见，样品1和2没有可检测到的DNA的痕迹，这表明含有末端的片段存留在薄膜上，而内部片段通过了薄膜。
实施例6从环状和线性DNA分子的群体中去除线性DNA环状DNA起始物质是pUC19克隆载体，其在多聚接头克隆位点处有唯一的HindIII位点。
将5μg pUC19载体DNA(New England Biolabs#301-1S)加入40个单位的HindIII限制酶(New England Biolabs#104S)5μl HindIII缓冲液(New England Biolabs)用蒸馏水补平至50μl并在37℃保温1小时。
将反应混合物通过S400 HR MicroSpin柱，然后加入到5μl pUC19载体DNA(New England Biolabs#301-1S)40个单位的DNA聚合酶I，Klenow大片段(New England Biolabs#210S)10μl DNA聚合酶I，Klenow大片段的缓冲液(New England Biolabs)5 nmol生物素-14-dCTP(Gibco 195 18-018)5 nmol dATP(Gibco 10216-018)5 nmol dTTP(Gibco 10219-012)
5 nmol dGTP(Gibco 10218-014)用蒸馏水补平至100μl反应混合物在25℃下保温45分钟。
将反应混合物通过S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275120-01)，加入10μg链霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保温5分钟。
将反应混合物加入到Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生产商所描述的方法使其扩散入薄膜中，随后10000xg离心30秒。在薄膜上加10μl蒸馏水，水平翻转180°并再次10000xg离心。
为观察，洗脱物于1％的琼脂糖(FMC#50080)凝胶中电泳，按Maniatis，分子克隆实验指南，第2版，1989中所述方法用溴化乙锭染色。
凝胶(FMC#50080)上只检测到环状载体，表明环状载体通过了薄膜，而线性DNA存留在薄膜上。
实施例7使用预先切割的λ载体体外包装λ噬菌体使用预切割的λ载体Uni-ZAPXR(Stratagene，产品目录号236612)。
试剂10μg预切割的λ载体双脱氧鸟苷三磷酸(终浓度为200μM)双脱氧腺苷三磷酸(终浓度为200μM)Klenow片段(10个单位)NEB EcoPol缓冲液总体积为30μl反应混合物在24℃保温20分钟。
将反应混合物通过一个S400 HR MicroSpin柱以去除蛋白和核苷酸，纯化后的反应混合物中加入200ng预先制备的DNA插入片段T4 DNA连接酶NEB T4连接酶的缓冲液体积为40μl反应混合物在16℃保温48小时。
将反应混合物通过一个S400 HR MicroSpin柱，纯化后的反应混合物中加入生物素化dCTP(5 nmol)生物素化dATP(5 nmol)dTTP(终浓度为200μM)dGTP(终浓度为200μM)Klenow片段(10个单位)NEB缓冲液体积为50μl反应混合物在24℃保温20分钟。
将反应混合物通过S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275120-01)，并按照实施例2中的方法在纯化的反应混合物中加入链霉抗生物素蛋白并将反应混合物加入到Centriflex柱中。
进一步的操作应按照Stratagene公司提供的包装插入片段的操作指导进行。对细菌板的嗜菌斑计数显示，所述连接比标准方法得到更多的活性噬菌体。
实施例8使用未切割的λ载体体外包装λ噬菌体使用含有一个待测插入片段的未切割的λ载体Uni-ZAPXR(Stratagene)。
试剂5μg未切割的λ载体双脱氧鸟苷三磷酸(终浓度为200μM)双脱氧腺苷三磷酸(终浓度为200μM)Klenow片段(10个单位)NEB缓冲液总体积为20μl反应混合物在24℃保温20分钟。此步骤将封闭载体的3′末端。
将反应混合物通过一个S400 HR MicroSpin柱，在纯化后的反应混合物中加入EcoRI限制性内切核酸酶(20个单位)
NEB EcoRI缓冲液总体积为30μl。
反应混合物在37℃保温120分钟。此步骤将载体消化成适当的等长片段。
将反应混合物通过一个S400 HR MicroSpin柱，在纯化后的反应混合物中加入生物素化dATP(5 nmol)dTTP(终浓度为200μM)dCTP(终浓度为200μM)dGTP(终浓度为200μM)Klenow片段(10个单位)NEB缓冲液体积为40μl反应混合物在24℃保温30分钟。此反应中，生物素将标记EcoRI消化的λ载体。
在反应混合物中加入NEB 2缓冲液中的Xbal和Xhol限制性内切核酸酶(各20个单位)，总体积为50μl。此反应将形成克隆位点。
反应混合物在37℃保温60分钟。
将反应混合物通过S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275120-01)，并按照实施例2中的方法在纯化的反应混合物中加入链霉抗生物素蛋白并加入到Centriflex柱中。此步骤中，链霉抗生物素蛋白将结合未被切割的载体。
将反应混合物通过一个S400 HR MicroSpin柱，纯化后的反应混合物中加入200 ng预先制备的DNA插入片段T4 DNA连接酶NEB T4连接酶的缓冲液体积为60μl反应混合物在16℃保温48小时。
将反应混合物通过一个S400 HR MicroSpin柱，纯化后的反应混合物中加入生物素化dCTP(5 nmol)生物素化dATP(5 nmol)dTTP(终浓度为200μM)dGTP(终浓度为200μM)Klenow片段(10个单位)NEB缓冲液体积为70μl反应混合物在24℃保温20分钟。此反应中，所有以前未封闭的暴露的3′OH末端可以被标记。
将反应混合物通过S400 HR MicroSpin柱，并按照实施例2中的方法在纯化的反应混合物中加入链霉抗生物素蛋白并加入到Centriflex柱中。此步骤将标记分子从未标记分子中分离出来。
进一步的操作应按照Stratagene公司提供的包装插入片段的操作指导进行。对细菌的嗜菌斑计数显示，所述连接比标准方法得到更多的活性噬菌体。
实施例9纯化再扩增的PCR反应a)修饰Cantab5E载体(Pharmacia)从而获得Cantab5EBamHI(1)在100μl的总反应体积中加入10个单位的BamHI和10μl NEBBamHI缓冲液以切割Cantab5E载体(1μg)，体系在37℃保温1小时。在1％琼脂糖凝胶中分离反应混合物并用普通凝胶提取方法分离出分子量最大的片段。在分离所得大片段500 ng中加入1 Weiss单位的T4 DNA连接酶和5μl NEB连接酶缓冲液并使总反应体积为50μl，体系在24℃保温1小时。用电穿孔的方法将连接混合物转化入TGI细胞中，并将细菌细胞在含氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂板上保温过夜。分离形成克隆的细菌中的DNA并通过大小和限制性内切核酸酶切割验证其只含一个BamHI限制位点。此DNA命名为Cantab5EBamHI(1)。
b)使用修饰后的载体Cantab5EBamHI(1)为模板进行PCR试剂
10μg Cantab5EBamHI(1)载体dNTP混合物(由Finnzyme提供；终浓度为200μM)10μl expand高保真酶的缓冲液(Boehringer-Mannheim AG)30 pmol与唯一的afiIII限制位点部分重叠的引物1和30 pmol与唯一的BamHI限制位点部分重叠的引物2用蒸馏水补平至100μl在加入1μl expand高保真酶(Boehringer-Mannheim AG)之前将PCR反应物96℃加热2分钟。
在热循环仅上对反应混合物进行20个循环，条件如下-首先96℃2分钟，然后按如下方式进行20个循环-55℃，30秒-72℃，80秒-96℃，30秒。
琼脂糖凝胶电泳后用溴化乙锭染色的方法鉴定PCR产物。通常可以观察到不需要的副产物。
将热循环反应混合物通过S400 HR MicroSpin柱。
使用限制性内切核酸酶AflIII和BamHI以常规操作对纯化的PCR产物进行酶切，随后加入链霉抗生物素蛋白并将反应混合物加入到Centriflex柱中(如实施例2)。在琼脂糖凝胶电泳结果中只能观察到正确切割的PCR产物，因为不需要的杂质存留在蛋白结合基质上。
实施例10在对镰刀形细胞贫血症的诊断型PCR中使用含生物素的DNA正常人血红素A1中单元型A1β-球蛋白基因的第1外显子(编码部分)以如下所示的DNA序列开始正常DNAatg gtg cac ctg act cct gag gag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…上述核酸序列将翻译成正常氨基酸序列MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…
对于人类镰刀形细胞贫血症，单元型Sβ-球蛋白基因的第1外显子以如下所示的DNA序列开始镰刀形细胞贫血症DNAatg gtg cac ctg act cct gtg gag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…上述核酸序列将翻译成镰刀形细胞贫血症氨基酸序列MVHLTPVEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…对正常DNA和镰刀形细胞贫血症DNA的比较发现，单个碱基取代足以将正常血红素基因转变为异常血红素基因，而后者已知可以引起严重的镰刀形细胞贫血症。Gag密码子突变为gtg密码子导致酸性氨基酸谷氨酸被非极性氨基酸缬氨酸取代。
为检测这种突变的存在与否，分离基因组DNA，且必要时在诊断型PCR之前进行传统形式的PCR扩增。
实施例10(a) 患者DNA的分离用商品化试剂盒(GFX Genomic Blood DNA纯化试剂盒；Pharmacia-Amersham #27-9603-01)按照生产商的建议从患者血液样本中分离基因组DNA。
如果获得了足够的DNA，可以直接进行实施例10c中的步骤。如果没有获得足够的DNA，需扩增部分的血红素β链基因(实施例10b)。
实施例10(b)扩增步骤(可选，材料不足时必需)将实施例10a分离得到的DNA扩增以增加可用于进一步操作的DNA的量，如下所示。
250 ng基因组DNA10μl expand高保真酶的缓冲液20 nmol dNTP各20 pmol的两种引物(引物1和引物2；见下)用蒸馏水补平至100μl3个单位的Expand高保真PCR酶混合后，在以下标准条件下进行30轮PCR
96℃热起始56℃退火30秒72℃聚合1分钟96℃变性30秒用于扩增血红素β链基因一部分的引物是基于EMBEL搜索程序对独特标示EMBL-IDHSBETGLOB′搜索后给出的DNA序列而得到的。
血红素β链基因(以下表示为分隔的三联体)之前有一个内含子序列(内含子1)，之后接以另一个序列(内含子2)，这两个内含子均以斜体表示如下。
部分内含子(下划线)可用于构建引物(见下)。
gcataaaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatg gtg cac ctg act cct gaggag aag tct gcc gtt act gcc ctg tgg ggc aag gtg aac gtggat gaa gtt ggt ggt gag gcc ctg ggc aggggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacc...
此基因编码序列两侧为非编码性的内含子；第2内含子将上述编码序列与处于更下游的下一部分编码序列分开。
为扩增此基因的第1编码部分以便随后进行诊断型PCR，可以使用例如分别与第1和第2内含子退火的一对引物。与引物退火的序列如上以下划线的斜体表示。
引物15′-ctagcaacctcaaacagacacc-3′引物25′-gtaaccttgataccaacctgcc-3′这一对引物只用于PCR扩增以获得更多用于诊断型PCR的DNA模板，因此并不需要生物素化或任何形式的修饰。
实施例10c 诊断型PCR步骤1-引物的构建由于已知突变的特点，即上述外显子第6密码子的单个碱基突变，为进行诊断型PCR，设计了3个引物，它们对应于正常和异常(镰刀形细胞贫血症)DNA。
对应于正常血红素的引物
引物N5′-atg gtg cac ctg act cct ga-生物素-OH对应于镰刀形细胞贫血症血红素的引物引物S5′-atg gtg cac ctg act cct gt-生物素-OH对应于该基因另一末端的引物引物25′-gtaaccttgataccaacctgcc-3′(这个引物可以与扩增步骤所用的引物相同；其不需标记或修饰)步骤2-使用步骤1的引物和实施例10b的PCR产物进行诊断型检测在与实施例10b相同的条件下进行了两个PCR反应a)使用引物N+引物2的PCR100 ng实施例10b的PCR产物DNA10μl expand高保真缓冲液20 nmol dNTP各20 pmol的扩增引物(引物N和引物2)3个单位的Expand高保真PCR酶用水补平至100μlb)使用引物S+引物2的PCR除使用扩增引物AB代替引物N外，其它均与PCR反应(a)相同。
然后按照实施例1中所述方法，使用S400HR MicroSpin柱纯化由PCR反应a)和b)获得的PCR产物。然后按照实施例1中所述的方法通过centriflex薄膜检测产物中是否存在生物素。将反应混合物分为两部分。在9/10的反应混合物中加入过量的链霉抗生物素蛋白(5μg)，并按照实施例1中所述方法在25℃下保温5分钟，然后加到一张centriflex薄膜上。按照实施例1中所述的方法，在琼脂糖凝胶中分析收集到的洗脱物中是否存在DNA产物。另1/10未与链霉抗生物素蛋白接触的反应混合物作为对照样品于琼脂糖凝胶中平行电泳。
检测两个PCR反应a)和b)的结果为以下四种可能之一。
本方法也可以用于诊断多碱基突变，如下所示，同样以镰刀形细胞贫血症为例实施例11对镰刀形细胞贫血症的诊断型PCR(多碱基突变)在β球蛋白基因的第1外显子中存在一个多碱基突变(以粗体下划线表示)，其DNA序列如下所示atg gtg cac ctg act cctaacgag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…以上核酸序列将翻译成以下氨基酸序列MVHLTPNEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…虽然有3个碱基发生改变，但可用类似于实施例10的方法检测突变。
如实施例10，用引物N揭示是否存在正常基因。为了检测潜在存在的突变构建了两个引物。
对应于突变的血红素的引物如下所示引物AB 2a5′-atggtgcacctgactcctaac-生物素-OH该引物将会准确鉴定出第6密码子中的′acc′突变。
第2个引物为引物AB 2b5′-atggtgcacctgactccta-生物素-OH此引物可鉴定出第6密码子中以′a′碱基起始的所有突变。
在与实施例10相同的条件下，以正常引物N和一个或多个对应于(即互补于)突变序列的引物进行PCR反应。
这一方法可以用于正常基因的任何已知序列，血红素镰刀形细胞突变只是其中一例。当群体中常见的突变已知时，可以使用多种引物以明确查明所存在的突变。
实施例12-22重复实施例1-11，只是用带有NycoCard的蛋白结合薄膜代替centriflex柱以去除或分离带有生物素标记并与链霉抗生物素蛋白形成复合体的DNA分子。
序列表<110>Nycomed Pharma ASIhle，OysteinMichaelsen，Terje EinarJohne，BeritGrant，Anne R<120>将核酸分离成不同群体的方法<130>28.69235/001<140>PCT/GB99/03995<141>1999-11-30<150>GB9826247.0<151>1998-11-30<160>26<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述BamHI引物的靶片段<400>1tttactggat cctag 15<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述AsnI引物的靶片段<400>2ttacgtacat taatcgg17<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述AsnI引物的靶片段<400>3ccgattaatg tacgtaa 17<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述片段中不正确的限制性位点<400>4ttacgtacaa tcgg14<210>5<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述片段中不正确的限制性位点<400>5tttactggta g 11<210> 6<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述片段中不正确的限制性位点<400>6tttactggat ag 12<210>7<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述片段中正确的限制性位点(互补链)<400>7gatccagtaa a11<210>8<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述不正确的限制性片段(互补链)<400>8ttaatgtacg taa 13<210>9<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述不正确的限制性片段(互补链)<400>9ctaccagtaa a11<210>10<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述不正确的限制性片段(互补链)<400>10ccgattgtac gtaa 14<210>11<211>17<212>DNA<213>人<400>11atgacctagg accacct 17<210>12<211>17<212>DNA<213>人<400>12atgacctagg cccacct 17<210>13<211>93<212>DNA<213>人<400>13atggtgcacc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc agg 93<210>14<211>30<212>PRT<213>人<400>14Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp1 5 10 15Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly20 25 30<210>15<211>93<212>DNA<213>人<400>15atggtgcacc tgactcctgt ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc agg 93<210>16<211>30<212>PRT<213>人<400>16Met Val His Leu Thr Pro Val Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp15 10 15Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly20 25 30<210>17<211>306<212>DNA<213>人<400>17gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttacatttg cttctgacac aactgtgttc 60actagcaacc tcaaacagac accatggtgc acctgactcc tgaggagaag tctgccgtta 120ctgccctgtg gggcaaggtg aacgtggatg aagttggtgg tgaggccctg ggcaggggca 180ggttggtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcatgtggag 240acagagaaga ctcttgggtt tctgataggc actgactctc tctgcctatt ggtctatttt 300cccacc306<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>18ctagcaacct caaacagaca cc 22<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>19gtaaccttga taccaacctg cc 22<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>20atggtgcacc tgactcctga 20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>21atggtgcacc tgactcctgt 20<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>22gtaaccttga taccaacctg cc 22<210>23<211>93<212>DNA<213>人<400>23atggtgcacc tgactcctaa cgagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc agg 93<210>24<211>30<212>PRT<213>人<400>24Met Val His Leu Thr Pro Asn Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp1510 15Gly Lys Val Asn Val Asp G1u Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly20 25 30<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>25atggtgcacc tgactcctaa c21<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>26atggtgcacc tgactccta 19
权利要求
1.一种可以将样品中的核酸分子至少部分分离成各个群体的方法，其中一个群体已被或可以被能固定于基质上的组分标记，上述方法包括将含有核酸的样品与基质接触，基质借此捕获标记分子从而使其与未标记的分子分离。
2.权利要求1的方法，其中一个分子群体已被或可以被固定于基质上的组分标记，所述组分能直接或通过所述标记物的结合配对物而间接固定于基质上，上述方法包括将含有核酸的样品与基质接触，或当所述标记物与基质是通过结合配对物间接相互作用时，使含有核酸的样品与所述标记物的结合配对物以及基质接触，从而由所述基质捕获标记分子并使标记分子与未标记的分子分离。
3.以上任一权利要求的方法，其中所述标记物是可加入核酸分子中的组分或与核酸分子有亲和性的组分。
4.以上任一权利要求的方法，其中所述标记物直接与基质相互作用。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述标记物通过该标记物的结合配对物间接作用于基质。
6.以上任一权利要求中的方法，其中所述标记物是一种配基。
7.权利要求6中的方法，其中所述配基选自生物素或荧光素。
8.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述标记物是类固醇或类固醇样分子。
9.权利要求8中的方法，其中所述类固醇是地高辛配基。
10.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述标记物是一种抗原。
11.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述标记物是一种蛋白。
12.权利要求11中的方法，其中所述蛋白是一种核酸结合蛋白。
13.权利要求1-5任一项的方法，其中所述标记物是一种核酸分子。
14.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述标记物是生物素，且所述标记物由链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白捕获。
15.以上任一权利要求中的方法，其中所述基质的形式是薄层，凝胶，滤膜，膜，纤维，管，微量滴定板，柱或颗粒。
16.权利要求15中的方法，其中所述基质是多孔材料。
17.权利要求16中的方法，其中将所述基质加入一种分离设备，所述设备选自离心管、微量滴定板、套筒和注射器。
18.权利要求15-17中任一项的方法，其中在所述多孔材料上放置一吸收垫，在所述吸收垫远离所述多孔材料的一面放置一个不能渗透液体的薄层，而在所述多孔材料远离所述吸收垫的一面放置一个带有一或多个空洞的不能渗透液体的薄层，从而待测样品可上样于所述空洞之一并可通过所述吸收垫的吸收而横向扩散至整个多孔材料。
19.以上任一权利要求中的方法，其用于至少部分分离限制酶消化产物，或用于纯化PCR反应产物。
20.以上任一权利要求中的方法，其用于至少部分分离DNA之限制酶消化片段混合物的方法，其中起始材料是线性DNA分子，在其一个末端或两个末端处或附近已被或可以被能固定于基质上的组分标记，所述方法包括用限制酶消化DNA分子，然后使样品与基质接触，借此使来自起始材料某个末端的标记分子被基质捕获从而使其与未标记的分子分离。
21.以上任一权利要求中的方法，其用于使所需正确PCR扩增产物与PCR引物与模板不正确退火造成的PCR产物至少部分分离，其中模板核酸分子在其一个末端处或附近含有一个唯一的限制酶识别位点，已被或可以被标记之PCR引物与模板上部分延伸至所述唯一限制酶位点的序列互补，此方法包括通过PCR扩增模板，使用特异作用于上述唯一限制酶识别位点的限制酶消化PCR产物，以及将所得产物与能固定所述标记物的基质接触，以使标记的核酸分子被该基质捕获，从而与未标记的分子分离。
22.权利要求21中的方法，其中所述标记物附着于引物的5′末端。
23.权利要求1到18中任一项的方法，其用于诊断型PCR。
24.权利要求23的诊断型PCR方法，该方法中对待测样品分别进行PCR反应，其中如果有突变则该突变应位于与3′引物互补的序列中，第一PCR反应使用与正常靶核酸互补的3′引物而第二PCR反应使用与突变的靶核酸互补的3′引物，其中突变引物的3′核苷酸对应于突变核酸中已突变的核苷酸之一，上述每一3′引物均在其3′核苷酸处携有标记物或可以被标记，此方法对PCR反应产物中标记物的存在或缺失进行检测。
25.权利要求23中对核酸分子中的突变实施诊断型PCR的方法，其中对核酸样品中突变的存在或缺失进行检测，其中使用特异性针对正常核酸或突变核酸的3′引物，其中所述引物互补于在正常和突变型DNA之间有一个碱基差异的核酸区域，所述引物的3′末端对应于样品中正常型与突变型有差异的位置，所述引物已被或可以被标记，该方法对PCR产物中所述标记物的存在或缺失进行检测。
26.权利要求23的诊断型PCR方法，其中使用互补于正常靶DNA的引物对待测样品进行PCR，其中用于延伸所述靶3′末端的引物与一段其3′端核苷酸在突变体中已突变的序列退火，所述3′引物在3′核苷酸处或其上携有标记或能被标记，该方法对PCR反应产物中所述标记物的存在进行检测。
27.权利要求1-18中任一项的方法，其用于使线性DNA分子与环状DNA分子分离。
28.权利要求27中将样品中的线性核酸分子与环状核酸分子分离的方法，所述方法包括在线性核酸分子的末端引入标记物，所述标记物能通过直接与基质作用或借该标记物的结合配对物间接与基质作用而被固定于基质上，使样品与基质接触，或当所述标记物与基质间接作用时，使样品与所述标记物的结合配对物以及与基质接触，从而使所述标记的线性核酸分子固定于基质上。
29.权利要求1-18中任一项的方法，其用于噬菌体颗粒的体外包装。
30.权利要求29的方法，其用于重组噬菌体的体外包装，其中所述载体DNA用一或多种限制酶切割，该载体DNA的3′OH基团被封闭，该载体与待插入的DNA在适于DNA片段连接的条件下相接触，所得连接产物用能附于反应性3′OH基团的组分进行标记，然后使标记和未标记的分子分离。
31.一种可以将样品中的核酸分子至少部分分离成各个群体的方法，其中一个群体已被或可以被能固定于基质上的组分标记，此组分直接固定于基质上或通过其结合配对物而间接固定，所述方法包括将含有核酸的样品与基质接触，或当所述标记物与基质为间接相互作用时使样品与标记物的结合配对物及与基质接触，从而使标记分子由所述基质捕获并因此与未标记的分子分离。
32.一种对DNA的限制酶消化片段的混合物进行至少部分分离的方法，其中起始材料是线性DNA分子，在其一个末端或两个末端处或附近已被或可以被能固定于基质上的组分标记，所述方法包括用限制酶消化DNA分子，然后使样品与基质接触，借此使来自起始材料某个末端的标记分子被基质捕获从而使其与未标记的分子分离。
33.一种用于使所需正确PCR扩增产物与PCR引物与模板不正确退火造成的PCR产物至少部分分离的方法，其中模板核酸分子在其一个末端处或附近含有一个唯一的限制酶识别位点，已被或可以被标记之PCR引物与模板上部分延伸至所述唯一限制酶位点的序列互补，此方法包括通过PCR扩增模板，使用特异作用于上述唯一限制酶识别位点的限制酶消化PCR产物，以及将所得产物与能固定所述标记物的基质接触，以使标记的核酸分子被该基质捕获，从而与未标记的分子分离。
34.一种诊断型PCR方法，该方法中对待测样品分别进行PCR反应，其中如果有突变则该突变应位于与3′引物互补的序列中，第一PCR反应使用与正常靶核酸互补的3′引物而第二PCR反应使用与突变的靶核酸互补的3′引物，其中突变引物的3′核苷酸对应于突变核酸中已突变的核苷酸之一，上述每一3′引物均在其3′核苷酸处携有标记物或可以被标记，此方法对PCR反应产物中标记物的存在或缺失进行检测。
35.一种对核酸分子中的突变实施诊断型PCR的方法，其中对核酸样品中突变的存在或缺失进行检测，其中使用特异性针对正常核酸或突变核酸的3′引物，其中所述引物互补于在正常和突变型DNA之间有一个碱基差异的核酸区域，所述引物的3′末端对应于样品中正常型与突变型有差异的位置，所述引物已被或可以被标记，该方法对PCR产物中所述标记物的存在或缺失进行检测。
36.一种诊断型PCR方法，其中使用互补于正常靶DNA的引物对待测样品进行PCR，其中用于延伸所述靶3′末端的引物与一段其3′端核苷酸在突变体中已突变的序列退火，所述3′引物在3′核苷酸处或其上携有标记或能被标记，该方法对PCR反应产物中所述标记物的存在进行检测。
37.一种将样品中的线性核酸分子与环状核酸分子分离的方法，所述方法包括在线性核酸分子的末端引入标记物，所述标记物能通过直接与基质作用或借该标记物的结合配对物间接与基质作用而被固定于基质上，使样品与基质接触，或当所述标记物与基质间接作用时，使样品与所述标记物的结合配对物以及与基质接触，从而使所述标记的线性核酸分子固定于基质上。
38.一种重组噬菌体体外包装的方法，其中所述载体DNA用一或多种限制酶切割，该载体DNA的3′OH基团被封闭，该载体与待插入的DNA在适于DNA片段连接的条件下相接触，所得连接产物用能附于反应性3′OH基团的组分进行标记，然后使标记和未标记的分子分离。
全文摘要
一种可以将样品中的核酸分子至少部分分离成各个群体的方法,其中一个群体已被或可以被能固定于基质上的组分标记,上述方法包括将含有核酸的样品与基质接触,基质借此捕获标记分子从而使其与未标记的分子分离。本方法可以用于多种不同的用途,包括分离限制性内切核酸酶消化产物,从环状核酸分子中分离出线性核酸分子,噬菌体颗粒的体外包装,诊断型PCR。
文档编号C12QGK1344331SQ9981576
公开日2002年4月10日 申请日期1999年11月30日 优先权日1998年11月30日
发明者奥伊斯坦·伊尔, 特杰·E·迈克尔森, 贝里特·约翰尼 申请人:尼康姆德法尔马公司