专利名称：蛋白质的共表达的制作方法
相关申请的参照这是1997年5月30日提交的共同未决申请08/866，879和1996年5月31日提交的临时申请60/020，424(现已放弃)的部分延续申请。
背景技术：
紫苜蓿(Medicago sativa L.)广泛种植，具有极好的维生素和矿物质平衡，产量高，是生物学固氮的极好来源，而且作为有吸引力的蜜蜂花蜜来源(Barnes等人，1988；Smoliak和Bjorge，1983)，因而被认为是全世界最重要的种植饲料农作物(Hanson等人，1988；Michaud等人，1988)，常常被称为“饲料农作物王后”。为了其饲料品质和植物性能，苜蓿已培育多年。虽然苜蓿和其它豆科饲料农作物蛋白质含量高，但是这些植物缺乏含硫氨基酸(S-氨基酸)，甲硫氨酸和半胱氨酸(Kaldy等人，1979)。羊毛的生长显示受S-氨基酸可获得性的限制。相似的，产乳动物的乳生产受植物中S-氨基酸缺乏的影响。使用传统植物育种和细胞选择技术以提高苜蓿的S-氨基酸含量的努力尚未成功，或进展很小。
用于改进苜蓿和其它饲料农作物的氨基酸平衡的基因工程方法是，将编码富含甲硫氨酸蛋白质的基因导入这些植物，这些基因由叶启动子中的强组成性启动子驱动。为了显著改变豆科饲料的氨基酸平衡，外源蛋白应当包含大约15-25％的S-氨基酸，且占叶总蛋白质的5-10％。为了达到这些蛋白质积累水平，不仅需要确保基因转录和翻译的最大水平，还要确保蛋白质的稳定性。至于反刍动物的饲料农作物，瘤胃细菌和胃酶对含S-氨基酸蛋白质的消化能力对于为反刍动物提供适当的饲料农作物而言是非常重要的问题，但是常常被忽略。因此，富含S-氨基酸的蛋白质应当对反刍动物瘤胃(第一个胃)的降解相对有抗性，且应当在较低的胃肠道中被同化。
关于植物中营养改良的最集中的努力集中于种子蛋白质。由于玉米和其它谷类农作物不容易转化，所以致力于种子蛋白质修饰的大部分工作涉及测试转基因烟草(Williamson等人，1988；Ohtani等人，1990)和爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)(Wallace等人，1988)中经修饰的谷醇溶蛋白的稳定性。还分析了转基因烟草和矮牵牛种子中含赖氨酸的α-玉米醇溶蛋白的合成(Williamson等人，1988；Ohtani等人，1990)。发现正常和经修饰蛋白质都具有很短的半寿期。
为了改进豆科种子蛋白质的S-氨基酸含量的努力包括将含6个甲硫氨酸密码子的45bp寡核苷酸导入β-菜豆蛋白基因的第三个外显子。包含该经修饰基因的转化子显示，高甲硫氨酸的菜豆蛋白以与正常蛋白质相同的水平合成，但是非常不稳定，而且迅速转化(Hoffman等人，1988)。β-菜豆蛋白中额外氨基酸的导入可能引起其二级结构的变形，使之更容易被蛋白水解作用所降解。DeClercq等人(1990)用三种不同的高甲硫氨酸编码片段取代了芥属2S清蛋白第六个和第七个半胱氨酸残基之间的23个氨基酸的编码片段。将这些经修饰的拟南芥2S基因转化到拟南芥(Arabidopsis thaliana)、B.napus、和烟草中。种子中有一些蛋白质积累，但是不如预测得多(M.Chrispeefs，个人通讯)。已经将含多达19％甲硫氨酸、且由β-菜豆蛋白基因启动子驱动的巴西坚果2S清蛋白基因导入烟草(Guerche等人，1990)、芸苔(Altenbach等人，1992)、和大豆(Pioneer种子公司)。最近，Saalbach等人(1994)合成了2S清蛋白基因并将其连接在CaMV 35S启动子之后。导入烟草和一些谷类豆类后，基因在植物叶中显示最高表达水平，且蛋白质位于液泡。然而，巴西坚果清蛋白极易引起过敏，不会被接受用于消费。
用于在植物中增加特定氨基酸库的一种方法是，将编码氨基酸生物合成途径中的重要调控酶的细菌基因导入植物。将编码经脱敏以反馈赖氨酸和苏氨酸抑制的天冬氨酸激酶的细菌基因与β-菜豆蛋白基因启动子融合，并导入烟草。转基因烟草的种子显示游离苏氨酸和甲硫氨酸水平升高(Karchi等人，1993；Galili，1995)。
关于改进饲料农作物的蛋白质品质，做了很少的努力。Schoeder等人(1991)将由CaMV 35S启动子驱动的小鸡卵清蛋白基因(cDNA)导入苜蓿。然而，转基因苜蓿植物在叶中显示很低的蛋白质积累水平(0.005％)。还未确定这种蛋白质丰度这么低的原因。
威斯康辛大学还尝试了一些努力，以获得具有更高的游离甲硫氨酸水平的苜蓿突变体。据报导，对氨基酸类似物的生长抑制具有抗性的细胞系产生比正常量更高的相应天然氨基酸。由此，在特定氨基酸类似物上的生长已被用作选择工具，用于选择高水平积累特定氨基酸的植物。氨基酸的过度生产常常归咎于参与其生产的酶的反馈控制的松懈(Malega，1978)。在改进首蓿甲硫氨酸含量的尝试中，选择经诱变对甲硫氨酸类似物的生长抑制有抗性的苜蓿悬浮培养细胞(Reish等人，1981)。获得了少数包含高甲硫氨酸库的细胞系，然而，这些细胞系的再生未产生具有高甲硫氨酸含量的植株(E.T.Bingham个人通讯)。
玉米醇溶蛋白是一类醇溶性蛋白质，在玉米胚乳的发育过程中合成，占成熟种子总蛋白质的50％(Lee等人，1976)。玉米醇溶蛋白可以根据其溶解度分成4类，α、β、γ、和δ(Larkins等人，1989)。玉米醇溶蛋白还可以根据大小分类。α玉米醇溶蛋白是最丰富的一类，由22kD和19kD玉米醇溶蛋白组成；这些蛋白质的中央区由大约20个氨基酸残基的重复性肽组成(Argos，1982)。β玉米醇溶蛋白包括15kD玉米醇溶蛋白，所含脯氨酸和谷氨酰胺比α玉米醇溶蛋白少。γ玉米醇溶蛋白包括27kD和16kD型，非常富含脯氨酸(25％)。δ玉米醇溶蛋白是相对较少的一类，包括10kD玉米醇溶蛋白(Kirihara等人，1988)。玉米醇溶蛋白的所有类型在结构上是独特的。α和γ玉米醇溶蛋白中的重复区可能在蛋白体包装中起主要作用。玉米醇溶蛋白通常包含极低水平的必需氨基酸，赖氨酸、色氨酸，和较低程度的甲硫氨酸。然而，15kD和10kD玉米醇溶蛋白由于极高的甲硫氨酸含量而与众不同(分别为10％和22.5％)(Giannaza等人，1977)。
玉米醇溶蛋白在粗糙内质网(RER)上合成，并在RER中直接聚集成蛋白体(Larkins和Hurkman，1978)。根据玉米胚乳中发育中的蛋白体的玉米醇溶蛋白组成分析，Lending和Larkins(1989)提出了玉米胚乳中蛋白体形成过程中玉米醇溶蛋白沉积模式的描述性模型β和γ玉米醇溶蛋白首先开始在RER中积累；随后，α玉米醇溶蛋白开始在β和γ玉米醇溶蛋白的小腔中积累；随着时间，α玉米醇溶蛋白小腔融合并形成中央孔，而β和γ玉米醇溶蛋白形成蛋白体周围的连续层。在独立的研究中，Esen和Stetter(1992)证明蛋白体的孔区存在δ玉米醇溶蛋白。
玉蜀黍中的突变影响不同玉米醇溶蛋白基因的表达。玉米醇溶蛋白基因表达的改变反过来对种子的氨基酸组成具有直接影响。隐性突变不透明-2纯合子植株的种子的赖氨酸水平相对于野生型种子升高(Misra等人，1972)。赖氨酸的升高归功于22kDα玉米醇溶蛋白表达的降低(Langridge等人，1983)。近交系繁殖系BSSS-53种子的甲硫氨酸水平比其它同系繁殖系高30％。甲硫氨酸含量的升高是由于10kD玉米醇溶蛋白水平升高了2倍(Phillips和McClure，1985)。
已知在内质网积累的蛋白质在其羧基末端附近具有氨基酸序列Lys(his)Asp Glu Leu(K(H)DEL)，以防止它们进入高尔基体(Pelham，1990)。然而，玉米醇溶蛋白和其它谷醇溶蛋白缺乏这种序列。70kD热激蛋白的同源物，BiP，作为分子伴侣，显示涉及水稻胚乳中醇溶谷蛋白蛋白体的形成(Li等人，1993b)。BiP在玉米醇溶蛋白蛋白体形成中的作用是基于BiP在玉米的一些玉米醇溶蛋白调控突变体的ER中和异常蛋白体上积累的事实(Boston等人，1991；Zhang和Boston，1992)。总之，对玉米醇溶蛋白靶向蛋白体并在其中装配的机制了解很少，而且尚未知道分子间和分子内相互作用是否在蛋白体形成中具有重要作用。Abe等人(1991)提出细胞骨架在玉米醇溶蛋白蛋白体的生源论中具有重要作用。
根据上文，可以理解，本领域仍然需要包含稳定的、S-氨基酸含量高的蛋白体的植物和饲料农作物。本发明提供了用于改进植物的饲料品质的新的且有利的方法。
图的简要描述
图1A-1B显示15kD玉米醇溶蛋白在转基因L.japonicus(图A)和苜蓿Regen SY(图B)的叶中的稳定状态积累模式。将来自不同独立转化子的叶的70％乙醇(EtOH)可溶性蛋白(相当于50μg磷酸盐缓冲液可溶性级分)进行SDS-PAGE，电转印至硝酸纤维素膜，随后用15kD玉米醇溶蛋白抗体进行免疫印迹分析。
图1C显示15kD玉米醇溶蛋白基因构建体的示意图。
图2A-2B显示10kD玉米醇溶蛋白在转基因L.japonicus(图A)和苜蓿Regen SY(图B)的叶中的稳定状态积累模式。将来自不同独立转化子的叶的70％EtOH可溶性蛋白(相当于50μg磷酸盐缓冲液可溶性部分)进行SDS-PAGE，电转印至硝酸纤维素膜，随后用10kD玉米醇溶蛋白抗体进行免疫印迹分析。
图2C显示10kD玉米醇溶蛋白基因构建体的示意图。
图3A-3C显示10kD玉米醇溶蛋白在转基因烟草中的稳定状态积累模式。
图3A.pM10Z的示意图。构建体由CaMV 35S启动子融合在含10kD玉米醇溶蛋白基因编码区的470bp之BglII-XhoI片段的BglII位点而组成。随后是pMON316(Rogers等人，1987)的NOS 3’终止子。
图3B.不同独立转化子的10kD玉米醇溶蛋白积累的分析。将由叶提取的EtOH可溶性蛋白(相当于50μg PBS可溶性蛋白)进行SDS-PAGE，转硝酸纤维素膜，随后用10kD玉米醇溶蛋白抗体进行免疫印迹分析。转化子下标号1-7的泳道含来自不同转化子的叶的样品，对照下标号1-2的泳道是来自未转化烟草植株的叶样品。
图3C.不同植物器官(转化子6)的10kD玉米醇溶蛋白积累的分析。将来自标明的各种植物部分的EtOH可溶性部分(相当于50μg PBS可溶性蛋白)与2μg玉米种子蛋白一起进行SDS-PAGE，随后用10kD玉米醇溶蛋白抗体进行Western分析。UT和Mat分别表示未转化的和成熟种子。凝胶中包含分子量标准，标明了2种相关标记的大小。
图4显示10kD玉米醇溶蛋白在转基因烟草发芽种子/幼苗中的命运。将10kD玉米醇溶蛋白植物的种子灭菌，并在无菌条件下发芽。在图中标明的精确时间收获种子/幼苗，并提取EtOH可溶性部分。然后将相当于50μg PBS可溶性蛋白的EtOH可溶性级分进行SDS-PAGE，随后用10kD玉米醇溶蛋白抗体进行Western分析。标明了10kD玉米醇溶蛋白在凝胶中的位置，DAG表示发芽后的天数。
图5A-5D.10kD玉米醇溶蛋白在转基因烟草叶中的超微结构和免疫金定位。
图5A.10kD玉米醇溶蛋白转化子中显示多个10kD玉米醇溶蛋白蛋白体(由箭头标明)的2个叶肉细胞区域。
图5B.10kD玉米醇溶蛋白蛋白体(由箭头标明)的更大倍数的放大图像。
图5C.15kD玉米醇溶蛋白转化子的叶肉细胞中15kD玉米醇溶蛋白蛋白体的结构。
图5D.10kD玉米醇溶蛋白在10kD玉米醇溶蛋白转化子的叶细胞中的5nm金颗粒免疫定位(由箭头标明)。
图6A-6D.10kD、15kD、和10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的叶和种子中10kD和15kD玉米醇溶蛋白水平的比较。
图6A.将来自10kD和10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的叶(相当于10μg PBS可溶性蛋白)和种子(相当于50μg PBS可溶性蛋白)的EtOH可溶性级分进行SDS-PAGE，随后用10kD玉米醇溶蛋白抗体进行Western分析。
图6B.使用生物影像智能定量仪(Bio Image IntelligentQuantifier)对图6A的条带亮度进行定量。
图6C.将来自10kD和10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的叶和种子(相当于50μg PBS可溶性蛋白)的EtOH可溶性级分进行SDS-PAGE，随后用15kD玉米醇溶蛋白抗体进行Western分析。
图6D.使用生物影像智能定量仪对图6C的条带亮度进行定量。
图7A-7D.10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的叶中10kD和15kD玉米醇溶蛋白的亚细胞定位。
图7A.来自10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的叶的传统固定和染色部分。箭头指向细胞质中形成的蛋白体。
图7B.使用小鼠抗10kD玉米醇溶蛋白抗体(1∶50稀释)随后10nm直径的金缀合山羊抗小鼠IgG的10kD玉米醇溶蛋白的免疫定位。
图7C.使用小鼠抗10kD玉米醇溶蛋白抗体和兔抗15kD玉米醇溶蛋白抗体随后10nm直径的金缀合山羊抗小鼠IgG和5nm金缀合山羊抗兔IgG的10kD和15kD玉米醇溶蛋白的共免疫定位。
图7D.图C显示双重标记的区域的更大倍数的放大图像。箭头指向10nm的金颗粒而箭号指向5nm金颗粒。
图8.δ-、β-、和δ-/β-玉米醇溶蛋白烟草转化子中BiP积累模式的分析。
将来自对照(NT)、δ-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、和δ-/β-玉米醇溶蛋白植株的叶的磷酸盐缓冲盐可溶性提取物(100μg蛋白质)进行SDS-PAGE，随后用针对来自玉蜀黍的BiP的抗体进行Western印迹。凝胶包含的阳性对照泳道含纯化BiP(1μg)。下图表示使用智能定量仪的条带定量的结果。
图9A表示SEQ ID NO5。
图9B表示SEQ ID NO6。
图10是转化入烟草的Z10/OCI质粒的构建概述图。
图11A和11B是转化烟草植物的提取样品的Western印迹，显示与Z10(14A)和OCI(14B)抗体的阳性免疫反应。
序列的简要描述SEQ ID NO1表示引物PA，用于由质粒prep(993)Z10 pMON316/DH5δ扩增Z10片段。
SEQ ID NO2表示引物PB，用于由质粒prep(993)Z10 pMON316/DH5α扩增Z10片段。
SEQ ID NO3表示引物PC，用于由质粒(809)OclpSP73/DH5α扩增OC-1片段。
SEQ ID NO4表示引物PD，用于由质粒(809)OclpSP73/DH5α扩增OC-1片段。
SEQ ID NO5表示Z10片段，如图9A所示。
SEQ ID NO6表示OCI片段，如图9B所示。
发明概述本发明涉及导致一种蛋白质在细胞中的积累相对于同一蛋白质单独表达时的水平而言增高的蛋白质的共表达。蛋白质在原核或真核细胞中表达。当一起表达时，这两种蛋白质中的一种或两种在细胞中以高于在细胞中单独表达的水平积累。采用标准的、常规的基因工程技术，以(i)分离编码期望蛋白质(包含调控序列)的适当DNA，(ii)转化靶细胞，并且在为植物的情况中，再生转基因植物。在足以导致两种蛋白质中的一种或两种以高水平积累的条件下，培养转基因细胞。在细胞中积累的蛋白质展示升高的稳定性和对降解的抗性。
本发明还涉及能够高水平表达稳定蛋白质的植物和植物组织，这些蛋白质在植物细胞中以蛋白体的形式存在。特别例示了共表达15kD和10kD玉米醇溶蛋白的植物。共表达15kD和10kD玉米醇溶蛋白的经转化植物可用于提供饲料农作物，所述饲料作物中含有增加的含硫氨基酸(诸如甲硫氨酸)，从而增高通常以这些农作物为食的动物的食物中含硫氨基酸(诸如甲硫氨酸)的水平。本发明还涵盖经转化包含新的异型蛋白体的植物或植物组织，这些蛋白体的一种或多种必需氨基酸(如精氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸)升高。本发明还涵盖导致在植物组织中通常不稳定的蛋白质的积累增加的蛋白体。
本发明还涉及包含瘤胃稳定的蛋白体的植物或植物组织，这些蛋白体包含其它蛋白质物质，例如能够引发免疫应答的抗原决定簇、蛋白质药物、杀虫剂、或抗微生物肽。异源蛋白质可以在用作为“载体蛋白”的本发明贮藏蛋白转化的植物中表达，由此蛋白质在细胞中以蛋白体的形式结合并积累。在另一个实施方案中，在植物或植物组织中以融合蛋白的形式提供瘤胃稳定的蛋白体，融合蛋白在包含玉米醇溶蛋白和异源蛋白质或肽的细胞中表达。
发明详述本发明涉及能够高水平表达稳定的贮藏蛋白的植物和植物组织，这些蛋白质在植物细胞中以蛋白体的形式存在。本发明范围涵盖的植物包括经转化表达本发明蛋白质的饲料农作物植物，包括例如苜蓿、三叶草、玉米青贮饲料、高粱、和其它豆科农作物。本发明范围还涵盖用于人类消费、经转化表达蛋白质的植物，这些蛋白质增强了植物的蛋白质品质从而改良营养。特别例示了表达含高水平S-氨基酸(诸如甲硫氨酸和半胱氨酸)的蛋白质的植物。在优选的实施方案中，玉米醇溶蛋白在植物或植物组织中表达。更优选的，表达的玉米醇溶蛋白是15kD和10kD玉米醇溶蛋白。最优选的，15kD和10kD玉米醇溶蛋白在植物或植物组织中共表达。将基因型携带10kD和15kD玉米醇溶蛋白基因的植物有性杂交，以产生携带两种构建体的杂种。在经转化植物中表达的玉米醇溶蛋白对瘤胃降解有抗性，由于这种蛋白质能够“避开”瘤胃，因此可用于提供重要营养的氨基酸，氨基酸能够在胃中消化，并被反刍动物吸收。
本发明还涵盖包含瘤胃稳定的蛋白体的植物或植物组织，这些蛋白体包含其它蛋白质物质，例如能够引发免疫应答的抗原决定簇、蛋白质药物、杀虫剂、或抗微生物肽。具有必需氨基酸的异源和内源蛋白质及合成肽能够在用作为“载体蛋白”的本发明贮藏蛋白转化的植物中表达，由此蛋白质在细胞中以蛋白体的形式结合并积累。在另一个实施方案中，瘤胃稳定的蛋白体在植物或植物组织中以包含玉米醇溶蛋白与异源蛋白质或肽的融合蛋白的形式表达。融合蛋白可以设计通过选定酶的切割或在特定生理学条件下生产异源蛋白质部分。优选的，作为融合蛋白一部分表达的玉米醇溶蛋白是15kD或10kD玉米醇溶蛋白。更优选的，15kD和10kD玉米醇溶蛋白在包含融合蛋白的植物或植物组织中共表达。
本发明还涵盖瘤胃稳定的蛋白体。本发明的瘤胃稳定的蛋白体不被动物瘤胃中的瘤胃细菌消化，但是能够被动物胃中的蛋白水解酶消化。本发明的瘤胃稳定的蛋白体可以制备成除了瘤胃稳定的蛋白质还包含异源蛋白质物质。例如，能够引发免疫应答的抗原决定簇、蛋白质药物、杀虫剂、或抗微生物肽。瘤胃稳定的蛋白体可以由用编码期望的瘤胃稳定蛋白质的多核苷酸分子转化的植物中分离。使用本领域已知的标准技术，可以容易的选择表达编码期望的瘤胃稳定蛋白质的多核苷酸分子的植物细胞，并再生成植物或植物组织。
在本发明的一个实施方案中，贮藏蛋白基因在细胞中与第二种蛋白质基因共表达，由此第二种蛋白质在细胞中以高于在细胞中单独表达(即不存在贮藏蛋白基因)时的水平积累。在优选的实施方案中，贮藏蛋白基因是种子贮藏蛋白基因，靶细胞是植物细胞，且第二种蛋白质基因可以是任何编码期望的蛋白质的基因。与蛋白质基因一起采用的调控序列(启动子、起始序列、终止序列、多腺苷酸化序列、增强子、等等)可以由本领域普通技术人员根据多种因素容易的选择，诸如i)采用的特定蛋白质基因，ii)将要转化的靶细胞，iii)期望表达/积累的植物组织，iv)将要转化的特定植物(单子叶植物、双子叶植物、等等)物种，等等。例如，若植物细胞是靶细胞，则可以选择组成性启动子(如CaMV 35S、泛有素、等等)，或者可以采用组织特异的启动子，从而在特定组织(种子、绿色组织、等等)中高水平表达。
在本发明的另一个实施方案中，植物细胞中一起采用15kD玉米醇溶蛋白基因与第二种蛋白质基因，导致第二种蛋白质在植物细胞中积累。采用标准转化及再生技术，可以将两种基因包含于单个表达盒中并插入植物基因组。或者，可以将两种蛋白质基因以分开的表达盒独立插入植物细胞基因组，并由此再生转基因植株。同样，可以将两种蛋白质基因插入分开的植物细胞，并再生成各自包含一种蛋白质基因的、可育转基因植株。然后采用标准植物育种技术将这些转基因植物异体受精，以产生包含15kD玉米醇溶蛋白基因和第二种蛋白质基因的杂种，其中第二种蛋白质在一种或多种植物组织中积累。
在本发明的优选实施方案中，用15kD玉米醇溶蛋白基因和10kD玉米醇溶蛋白(第二种蛋白质)转化苜蓿、烟草、或其它植物细胞，其中两种基因都由组成性启动子驱动。将包含两种基因构建体的可育转基因植株再生。培养后代植株，10kD玉米醇溶蛋白在绿色组织中以相对于10kD蛋白质单独表达时的积累水平的5-10倍或更高水平积累。
此外，本发明涵盖作为在绿色植物组织中表达贮藏蛋白基因和第二种蛋白质基因的结果而形成的新的蛋白体。在一个实施方案中，新的蛋白体包含15kD玉米醇溶蛋白和第二种蛋白质。蛋白体通常位于叶组织。在优选的实施方案中，新的蛋白体位于叶组织，并包含15kD玉米醇溶蛋白和10kD玉米醇溶蛋白。
本发明还涵盖用于提高植物的饲料品质的方法，包括用编码本发明贮藏蛋白的多核苷酸分子转化植物或植物组织。用于转化植物并选择转化基因型之表达的方法在本领域是已知的。在该方法的优选实施方案中，多核苷酸编码在植物或植物组织中表达的玉米醇溶蛋白。更优选的，表达的玉米醇溶蛋白是15kD或10kD玉米醇溶蛋白。最优选的，15kD和10kD玉米醇溶蛋白在经转化植物或植物组织中共表达。使用本领域已知的标准技术，可以由经转化植物或植物组织容易的制备转基因植物。
本发明还涵盖用于提高异源蛋白质在植物或植物组织中的稳定性和贮藏的方法。异源蛋白质可以在用作为“载体蛋白”的本发明贮藏蛋白转化的植物中表达，由此蛋白质在细胞中以蛋白体的形式结合并积累。在本发明的另一个实施方案中，用编码融合蛋白的多核苷酸分子转化植物，融合蛋白包含与异源蛋白质或肽可操作连接的本发明贮藏蛋白。
本发明的玉米醇溶蛋白不仅包括那些具有在自然界中发现的氨基酸序列的蛋白质(包括等位基因变体)，还包括那些在蛋白质序列中具有保守氨基酸替代、加入、和删除的变体玉米醇溶蛋白，只要这些变体蛋白质基本保留了与天然玉米醇溶蛋白相同的有关生物学活性。熟练技术人员根据此处公开的技术可以容易的确定变体蛋白质是否基本保留了与未修饰蛋白质相同的生物学化学。
材料和方法重组DNA技术使用标准步骤进行重组DNA操作(Maniatis等人，1982)。包含由玉米胚乳cDNA文库分离的10kD玉米醇溶蛋白cDNA的质粒pMZEI10k(Kirihara等人，1988)，由Dr.J.Messing惠赠。由pUC119获得包含完整编码区的470bp EcoRI/XbaI片段，并克隆到pSP73的EcoRI和XbaI位点中。10kD玉米醇溶蛋白的终止密码子包含于XbaI位点中。然后以BglII/XhoI片段回收10kD玉米醇溶蛋白基因，并插入pMON316多接头的BglII和XhoI位点(Rogers等人，1987)。10kD玉米醇溶蛋白的终止密码子之后的翻译终止子是NOS终止子。将产生的质粒称为pM10Z(图1A)。质粒pMEZ由Gagga等人(1995)描述。植物转化和再生通过三亲交配(Rogers等人，1987)将质粒pM10Z由大肠杆菌DH5α动员到根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)受体菌株pTiT37ASE中。通过叶盘法(Horsch等人，1987)转化烟草(Nicotianatabacum cv Xanthi)。选择转化子并在含100μg/ml卡那霉素的MS培养基上再生，苗在接种后4-6周内出现。将苗在不含激素的相同培养基上生根，并转移至土壤。
为了获得包含由CaMV 35S启动子驱动的两种玉米醇溶蛋白基因的10kD玉米醇溶蛋白/15kD玉米醇溶蛋白植株，将包含pM10Z或pMEZ的烟草转化子杂交，并将获得的种子在含200μg/ml卡那霉素的培养基上发芽。使用15kD玉米醇溶蛋白和10kD玉米醇溶蛋白抗体，对来自幼苗的蛋白质提取物进行Western分析。将表达两种玉米醇溶蛋白基因的植株(10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株)和亲本植株(10kD玉米醇溶蛋白和15kD玉米醇溶蛋白植株)用于所有比较性分析。玉米醇溶蛋白提取和Western分析将植物组织磨碎，在磷酸盐缓冲液(PBS)中提取，并离心。使用Bradford实验(BIO-RAD)将上清液用于蛋白质测定。将来自离心的沉淀在含1％巯基乙醇的70％乙醇中于65℃温育30分钟以提取玉米醇溶蛋白。对于Western分析，将EtOH可提取部分(相当于已知量的PBS可溶性蛋白质提取物)进行SDS-PAGE(Laemmli，1970)，随后转硝酸纤维素膜。将膜在含0.05％吐温20的Tris缓冲液(TBST)中用1％BSA封闭1-2小时，随后在含适当抗体的相同缓冲液中温育过夜。10kD玉米醇溶蛋白单克隆抗体由DEKALB Genetics公司提供，10kD玉米醇溶蛋白多克隆抗体由Dr.J.Messing提供，15kD玉米醇溶蛋白多克隆抗体由Dr.B.Larkins提供。使用碱性磷酸酯酶偶联的二抗(在多克隆抗体的情况中，使用山羊抗体或兔IgG；在单克隆抗体的情况中，使用小鼠IgG)和底物氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸，根据制造商的指示(Promega)，将与抗体反应的蛋白质条带显色。10kD玉米醇溶蛋白的单克隆和多克隆抗体在10kD玉米醇溶蛋白植株的Western分析和免疫定位上都给出了相似的结果，但是多克隆抗体显示一定程度与15kD玉米醇溶蛋白的交叉反应性，因此，在我们所有涉及亲本和杂交后代的比较性分析中只使用单克隆抗体。BiP分析将来自不同植株的叶的磷酸盐缓冲液(PBS)可溶性提取物进行SDS-PAGE，随后使用玉米BiP的多克隆抗体(由Dr.R.Boston提供)，使用上文玉米醇溶蛋白提取和Western分析部分中描述的步骤，进行Western分析。叶盘的体内标记将来自年轻、正扩展的叶的四个叶盘(直径7mm)在含120μci 35S甲硫氨酸(比活1047ci/mMol)的120μl标记混和液(1mM磷酸钾，pH6，1％蔗糖，50μg氯霉素)中在光照下温育2小时。然后将圆片用温育缓冲液清洗干净，并将样品在冷的PBS中磨碎。在PBS中提取样品，估计PBS可溶性部分中的蛋白质，并如Gagga等人(1995)所述由沉淀回收玉米醇溶蛋白。通过SDS-PAGE对蛋白质进行分析，随后在PVDF膜(Millipore)上进行电印迹。对膜喷洒Enhance(NEN)，空气干燥，并使X射线胶片暴光。电子显微镜检查法将小片叶和种子组织在含2.5％戊二醛的0.07M二甲胂酸钠缓冲液中固定2小时，然后在1％水溶四氧化锇中后固定1小时。将样品在EtOH中脱水，并在Spurr氏树脂中于70℃包埋。然后将铜网上的银色部分在醋酸双氧铀和Reynold氏柠檬酸铅中染色。在日立H7000透射电镜中检查栅网。免疫电子显微镜检查法将小片叶和种子组织在含4％聚甲醛和0.6％戊二醛及0.1M蔗糖的0.33M磷酸钠/钾缓冲液(pH7.3)中在冰上固定2小时。将组织用含7％蔗糖的缓冲液清洗3次，并在最后一次的缓冲液中于4℃保存过夜。这一阶段使用两种不同方案将经固定组织在EtOH中脱水，用Lowicryl于-10℃浸润，并将树脂在UV光下于-10℃聚合24小时，然后于室温24小时。在第二种方案中，将组织在EtOH中脱水，在Spurr氏树脂或LR White树脂中包埋，并于50℃聚合。剩余步骤都在室温进行。(不同的树脂购自EIecton Microscopy Sciences，Ft.Washington，PA)。首先将镍网上的银色部分在封闭液，含1％BSA(Sigma)、0.05％吐温20(Sigma)、和15mM NaCl的10mMTris缓冲液中温育。此缓冲混和液用于所有剩余步骤。对于免疫标记的种子部分，向封闭液中加入来自抗体动物来源的5-20％的正常血清，以降低非特异性染色。
用10kD玉米醇溶蛋白抗体进行免疫标记将10kD和10kD/15kD玉米醇溶蛋白杂种切片的栅网吸干，并与在缓冲液中1∶50稀释的10kD玉米醇溶蛋白单克隆抗体一起温育45分钟-4小时。将对照与未免疫小鼠IgG一起温育。然后将它们在缓冲液中清洗，并在用缓冲液1∶50稀释的金标记的、直径10nm的山羊抗小鼠IgG(Sigma)保存45分钟。在来自10kD玉米醇溶蛋白植株的切片的情况中，将栅网与用缓冲液1∶1000稀释的多克隆兔抗10kD玉米醇溶蛋白一起温育60分钟。然后将它们清洗，并在1∶50稀释的金缀合的、直径5nm的抗兔IgG中温育60分钟。由于多克隆10kD玉米醇溶蛋白抗体与15kD玉米醇溶蛋白交叉反应，所以在10kD/15kD玉米醇溶蛋白杂种的情况中，将栅网与10kD玉米醇溶蛋白单克隆抗体一起温育，随后是金缀合的、直径10nm的抗小鼠IgG。将栅网在含吐温20和1％BSA的Tris缓冲液中清洗，随后用双蒸水。然后检查未染色的或者在醋酸双氧锇和柠檬酸铅中轻微后染色的栅网。
用10kD和15kD玉米醇溶蛋白抗体进行双重标记将栅网在1∶100稀释的兔抗15kD玉米醇溶蛋白中温育45-60分钟。清洗栅网，并在1∶50稀释的金缀合的、直径5nm的山羊抗兔IgG中温育45-60分钟。然后在缓冲液中彻底清洗栅网，与用缓冲液1∶50稀释的小鼠抗10kD玉米醇溶蛋白一起温育45-60分钟。然后用缓冲液清洗栅网，随后用蒸馏水，并在用缓冲液1∶50稀释的金缀合的、直径10nm的山羊抗小鼠IgG中温育45分钟。用含吐温20和1％BSA的Tris缓冲液清洗栅网，随后用双蒸水。然后检查未染色的或者在醋酸双氧锇和柠檬酸铅中轻微后染色的栅网。
下文是例示本发明某些实施方案的实施例。这些实施例是例示性的，不应当解释为以任何方式对本发明的限制。实施例1-15kD和10kD玉米醇溶蛋白在L.japonicus和苜蓿的营养组织中的积累将受CaMV 35S启动子控制的15kD和10kD玉米醇溶蛋白的编码序列导入L.japonicus和苜蓿(Regen SY)。如图1和2所示，两种玉米醇溶蛋白在所有转化子的营养组织中显示高水平积累(占总蛋白质的1-2％)。相反的，由CaMV 35S启动子驱动的β-菜豆蛋白基因显示转录本的组成性积累，但是只有种子显示蛋白质的特异性积累。这些结果说明玉米醇溶蛋白在营养组织中是稳定的，而作为液泡蛋白质的β-菜豆蛋白则不然。玉米醇溶蛋白的稳定性可以归功于蛋白质的内在特性或其亚细胞定位。实施例2-玉米醇溶蛋白在烟草转化子的营养组织中的积累用包含由CaMV 35S启动子驱动的10kD玉米醇溶蛋白基因的基因构建体pM10Z(图3A)转化烟草植物。将来自7株随机选取的独立转化子的叶进行Western分析，以测量10kD玉米醇溶蛋白的积累(图3B)。所有转化子显示两种免疫反应蛋白质，一条带随来自玉米种子的10kD玉米醇溶蛋白(由箭头表明的位置)共迁移，另一条带是29kD条带。后者不随在玉米种子中看见的较大分子量的免疫反应条带共迁移(图3C)。由转基因植株的叶获得的29kD免疫反应条带可能表示10kD玉米醇溶蛋白与另一种内源叶蛋白质的聚集物。相似的，玉米种子中的20kD免疫反应蛋白质可能表示10kD玉米醇溶蛋白与内源玉米蛋白质的聚集物。在不同的转化子中，10kD和29kD免疫反应条带的积累量差别大约10倍。转化子4显示的两种免疫反应条带的水平几乎可以忽略。在各个转化子中，10kD玉米醇溶蛋白积累量的差异可能归咎于位置效应或整合基因的拷贝数。
为了测定不同植物部分间的10kD玉米醇溶蛋白的积累量，将来自转化子6的叶、茎、根、和种子的等量蛋白质提取物(相当于50μgPBS可溶性蛋白质)，与玉米种子提取物(相当于2μg PBS可溶性蛋白质)一起，进行Western分析(图3C)。叶显示10kD玉米醇溶蛋白积累的最高水平，随后是茎。种子的10kD玉米醇溶蛋白水平比叶低大约10倍，正如转基因烟草中的15kD玉米醇溶蛋白的情况(Bagga等人，1995)。总之，我们的结果说明10kD玉米醇溶蛋白在转基因烟草的所有器官中积累至显著水平，正如我们以前关于15kD玉米醇溶蛋白的报导(Bagga等人，1995)。实施例3-玉米醇溶蛋白在发芽的烟草种子中的稳定性以前已经显示转基因烟草种子中的15kD玉米醇溶蛋白在发芽过程中不被蛋白水解消化(Hoffman等人，1987；Bagga等人，1997)。为了确定10kD玉米醇溶蛋白是否类似，将来自10kD玉米醇溶蛋白植株的种子进行不同时间(0-10天)的发芽，收获种子/幼苗，提取它们的乙醇可溶性蛋白质，并使用10kD玉米醇溶蛋白抗体进行Western分析(图4)。10kD玉米醇溶蛋白的水平在发芽的最初4天基本保持不变，此后其水平显示浓度显著增加。在发芽后第0天与第1天之间(DAG)观察到10kD玉米醇溶蛋白水平略微下降，但是此后水平维持至4DAG。由3DAG样品观察到的下降在不同的实验中不一致，这归咎于泳道中蛋白质提取物的上样量较小。4DAG时间点与第一组绿叶的出现一致，可能与发育幼苗中CaMV 35S启动子的激活有关。免疫反应的10kD玉米醇溶蛋白条带在来自幼苗阶段的蛋白质的SDS-凝胶中还显得相当弥散，正如由叶样品观察到的，说明叶在乙醇可溶性蛋白质部分中具有一些物质妨碍了10kD玉米醇溶蛋白的迁移。这些结果说明10kD玉米醇溶蛋白在烟草种子的发芽过程中不降解。实施例4-15kD和10kD玉米醇溶蛋白在转基因植株的新的蛋白体中的免疫定位为了理解15kD和10kD玉米醇溶蛋白在转基因植株的叶中的稳定性的基础，检查了这些蛋白质在亚细胞水平的定位。将转化子的叶，与对照植株一起，进行超微结构分析，随后是免疫细胞化学(使用15kD和10kD玉米醇溶蛋白抗体)。15kD玉米醇溶蛋白显得均一分布于沿RER排列的独特花结形蛋白体中(Gagga等人，1995，附录)。这些蛋白体还在表达15kD玉米醇溶蛋白基因的L.japonicus和苜蓿中发现。
还在来自表达10kD玉米醇溶蛋白的转基因烟草的叶组织上进行了电镜检查，以检验任何蛋白体的存在。如图5A和图5B所示，在10kD玉米醇溶蛋白植株的叶中看到与15kD玉米醇溶蛋白蛋白体(图5C)非常不同的蛋白体。10kD玉米醇溶蛋白植株中的蛋白体显得很嗜高渗，嗜高渗物(osmophilia)浓缩在(蛋白质)体的周围。在一些杂种切片中，嗜高渗物显得由中心不连续放射(图5B)。在15kD玉米醇溶蛋白植株中看到的蛋白体不展示这种极端嗜高渗物(图5C)。在一些叶切片中，发现10kD玉米醇溶蛋白蛋白体与ER相关，但是在大多数情况中，由于蛋白体的体形较大，ER膜显得不连续。根据免疫定位，发现10kD玉米醇溶蛋白平衡分布于这些独特蛋白体中，说明它们由10kD玉米醇溶蛋白装配产生(图5D)。实施例5-15kD和10kD玉米醇溶蛋白在表达这两种基因的转化子中的同时积累表达15kD或10kD玉米醇溶蛋白的烟草转化子之间进行有性杂交，以确定这些蛋白质是否相互作用并影响在植物细胞中的蛋白质积累。将来自这些杂种的种子在200μg/ml卡那霉素上发芽，并使用15kD和10kD玉米醇溶蛋白基因特异引物，根据阳性PCR选择表达两种基因的幼苗。使用15kD和10kD玉米醇溶蛋白抗体，通过免疫印迹，对来自表达两种基因的两株独立植株及其亲本的叶的蛋白质提取物进行分析。15kD玉米醇溶蛋白的积累在两亲本和10kD/15kD玉米醇溶蛋白杂交植株中显得相似，而10kD/15kD玉米醇溶蛋白杂交植株中的10kD玉米醇溶蛋白积累比相应的10kD玉米醇溶蛋白亲本高许多倍。
为了测定10kD玉米醇溶蛋白由于与15kD玉米醇溶蛋白的共表达而增加的精确水平，将来自一株10kD玉米醇溶蛋白植株、一株15kD玉米醇溶蛋白植株、和相应的10kD/15kD玉米醇溶蛋白杂种的叶和种子的等量蛋白体提取物进行Western分析，随后使用智能定量仪(BioImage)对免疫反应条带进行定量(图6)。此定量分析显示，10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的种子和叶中的15kD玉米醇溶蛋白水平，与15kD玉米醇溶蛋白亲本植株基本相似(图6C和6D)。然而，10kD玉米醇溶蛋白在10kD/15kD玉米醇溶蛋白杂种的叶和种子中的量比亲本植株高4-5倍(图6A和6B)。由于用于形成印迹的两种抗体的抗原性和浓度差异，15kD和10kD玉米醇溶蛋白在杂种与亲本系中的水平不能直接进行比较。这些结果还确认了以前的研究，指出叶比种子积累更多的玉米醇溶蛋白。注意，在10kD玉米醇溶蛋白的情况中(图6A和6B)，凝胶上的蛋白质上样量是叶样品10μg，种子样品50μg。实施例6-10kD玉米醇溶蛋白与15kD玉米醇溶蛋白在共表达10kD和15kD玉米醇溶蛋白基因的植株中定位于同一ER衍生蛋白体10kD玉米醇溶蛋白在10kD/15kD玉米醇溶蛋白杂种中的积累比单单10kD玉米醇溶蛋白植株增加，暗示10kD与15kD玉米醇溶蛋白之间存在某种相互作用。来自10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的叶组织的电镜和免疫细胞化学，只显示通常是15kD玉米醇溶蛋白的ER衍生蛋白体(图7A)。我们没有观察到任何与在10kD玉米醇溶蛋白植株中检测到的相似的蛋白体。然而，10kD玉米醇溶蛋白的免疫定位显示，蛋白质限制于15kD玉米醇溶蛋白蛋白体中(图7B)。为了确定10kD玉米醇溶蛋白和15kD玉米醇溶蛋白是否都位于15kD玉米醇溶蛋白蛋白体中，我们使用10kD玉米醇溶蛋白的单克隆抗体和15kD玉米醇溶蛋白的多克隆抗体，对10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的叶和种子切片进行了双重标记免疫细胞化学。10kD玉米醇溶蛋白(由较大的10nm金颗粒表示)和15kD玉米醇溶蛋白(由较小的5nm金颗粒表示)都免疫定位于同一15kD玉米醇溶蛋白蛋白体中(图7C和7D)。因此，15kD和10kD玉米醇溶蛋白经证明有相互作用，且这种相互作用稳定了这两种蛋白质。实施例7-将多拷贝的15kD和10kD玉米醇溶蛋白基因导入苜蓿作为提高含S-氨基酸蛋白质总叶含量的方法，可以将多拷贝的15kD和10kD基因导入植物。除了那些采用35S启动子的构建体，可以使用由SSU启动子和甘露碱合酶启动子驱动的基因构建体，以避免任何潜在的共抑制问题。可以有性形成携带10kD、15kD、或10kD和15kD玉米醇溶蛋白二者的构建体的同基因种群。根据种群中期望玉米醇溶蛋白构建体的平均数目的一般性比较，可以确定玉米醇溶蛋白剂量在苜蓿中对表达“自身”的影响、构建体之间的相互作用、和每种构建体对植物发育、饲料品质、和产量的影响。还可以检查来自3个种群的遗传学定义的基因型，这三个种群分别携带1-4个拷贝的10kD或15kD构建体，或者1-2个拷贝的10kD和15kD二者构建体。有性增加再生体细胞克隆中玉米醇溶蛋白拷贝数的最直接方法是，自花授粉个体再生或杂交。然而，在这种情况中，杂交再生在遗传学上等同于自交。为了使同系繁殖抑制的混淆效应最小化，可以形成一系列杂交种群，以检查玉米醇溶蛋白构建体对苜蓿的饲料产量和品质的影响。实施例8-蛋白质的瘤胃消化在反刍动物中，食物首先受到栖息于动物第一个胃(瘤胃)中的微生物作用。由于这些动物自身不产生纤维素酶，植物材料中的纤维素被栖息微生物消化。然而，这些微生物还能够破坏植物蛋白质并将释放的氨基酸用于其自身的生长。这些瘤胃微生物随后在通过动物的剩余消化道时降解，由此提供重要的蛋白质和其它营养来源。然而，很大部分的这些蛋白质在排泄到尿中的氮中是脱氨的。这不仅降低了食料的营养品质，还导致过度的氮环境污染。当在使牛奶产量最大化的努力中给予反刍动物以很高蛋白质食物时，问题恶化了。氨基酸补充物(如甲硫氨酸或赖氨酸)也在瘤胃中基本降解，因此发展了多种瘤胃防护氨基酸补充物。由此，极其期望喂以对微生物降解更有抗性的完整蛋白质。由此，重要的是确定玉米醇溶蛋白是否能够被瘤胃细菌降解，并确定玉米醇溶蛋白是否能够被反刍动物胃中的酶消化。
使用研钵和乳杵加工植物组织。将样品置于DACRON聚酯袋中(孔径52μm)。每种样品保留大约0.3g用于比较目的，将剩余量在插管的Holstein(荷兰的一种乳牛)母牛瘤胃中温育12小时。然后由瘤胃中取出袋子，清洗，并在60℃烘箱中干燥过夜。通过免疫学(Western印迹)和染色步骤，监测15kD玉米醇溶蛋白和10kD玉米醇溶蛋白。监测瘤胃细菌高度降解的核酮糖二磷酸羧化酶(Nugent等人，1983)，作为内在对照。处理后观察到很低水平的玉米醇溶蛋白降解，而核酮糖二磷酸羧化酶完全降解。测定经处理和未处理样品中的玉米醇溶蛋白水平，以进行比较。还确定了玉米醇溶蛋白被反刍动物的胃酶降解。实施例9-表达玉米醇溶蛋白基因的转基因植株中的BiP诱导由于BiP(一种内源植物蛋白质)在醇溶蛋白蛋白体的生源论中发挥作用(Li等人，1993a；Zhang和Boston，1991)，推论BiP可能在转基因烟草植株的玉米醇溶蛋白蛋白体的形成中发挥作用。为了测试BiP是否在产生玉米醇溶蛋白蛋白体的植物中升高，使用玉米BiP抗体，对来自δ-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、和δ-/β-玉米醇溶蛋白植株的叶的蛋白质样品进行定量Western分析(Zhang和Bostong，1992)。来自在系统条件下生长的相同发育阶段的对照植株和3株转基因植株(δ-、β-、和δ-/β-玉米醇溶蛋白植株)的PBS可溶性样品(100μg)，与1μg来自玉米的纯化BiP一起，进行SDS-PAGE，随后Western分析(图8，上图)。然后使用智能定量仪分析免疫反应条带。图8中的下图是表示免疫反应条带相对亮度的示意图。所有3株转基因植株显示的BiP积累水平都显著比对照高；3株转化子中的BiP水平或多或少有些相似。因此，转基因植株中的玉米醇溶蛋白合成诱导了BiP的合成或稳定积累。实施例10-用于植物害虫控制目的的蛋白质的表达和固定设计了包含以符合读框地融合在稻胱蛋白I(OCI)蛋白酶抑制剂基因前端的10kD玉米醇溶蛋白基因(Z10)的嵌合基因(Z10/OCT)，以增强OCI在用于控制植物害虫的转基因植株中稳定性和有效性。嵌合基因包含10kD玉米醇溶蛋白的编码区和信号肽区，以及OCI的编码区，由组成性的CaMV 35S启动子控制。用OCI和10kD玉米醇溶蛋白抗体进行探查的Western印迹证明，大约26kD的预期蛋白质产物在用嵌合基因转化的植物中表达。我们以前已经显示了，当使用玉米醇溶蛋白抗体进行探查时，用10kD玉米醇溶蛋白单独转化的植物表达期望蛋白质产物，而当用OCI抗体进行探查时，用OCI单独转化的植物不显示可检测的表达。这个观察结果显示Z10/OCI嵌合基因导致OCI的稳定性增加，并且，根据玉米醇溶蛋白趋向定位于封闭蛋白体中的发现，进一步证明蛋白质产物相当稳定。别人已经报导了蛋白酶抑制剂对多种植物害虫的有效性，包括科罗拉多马铃薯甲虫和植物寄生线虫。实施例11-表达10kD玉米醇溶蛋白/OCI融合蛋白的转基因植株的构建使用剪接重叠延伸(SOE)技术(R.M.Horton等人，1989)，构建了10kDsp10kD玉米醇溶蛋白OC-I(Z10/OCI)融合体。此技术利用聚合酶链式反应(PCR)将两种分开的片段剪接在一起。首先使用下列引物通过PCR由质粒prep(993)Z10pMON316/DH5α扩增Z10片段SEQ ID NO1PA(CTACAAGATCTGATATCATCGATG)和SEQ ID NO2PB(GACATGGATCCGAATGCAGCAC)从而产生长度大约500碱基对(bp)的产物。使用下列引物由质粒(809)OclpSP73/DH5α扩增OC-I片段
SEQ ID NO3PC(GTGCTGCATTCGGATCCATGTCG)和SEQ ID NO4PD(CCGGTACCCTTAAATCGATGC)从而产生322bp片段的产物。将两种PCR产物以相同浓度混和，并作为模板用于第二轮PCR反应。为了获得期望的Z10/OCI片段，使用引物PA和PD产生800bp的产物。引物序列PA、PB、和PC中的粗体较大核苷酸表示取自Z10片段的序列。引物序列PB、PC、和PD中的较小核苷酸表示取自Ocl的序列。粗体核苷酸来自Z10序列，较小核苷酸来自Ocl序列。图9中的引物序列标了下划线，引物名称在引物序列的上面或下面以粗体标出。图9中标了下划线的引物序列PB和PD与上文所列PB和PD序列的反向互补。引物的取向由箭头标明。
为了将此片段克隆到NewpFLAG-1(NPF-1)中，加入Klenow和dNTP将PCR片段补平末端，并与用EcoRI消化并用Klenow和dNTP补平末端的NPF-1连接。连接Z10/OCINPF-1，并转化到DH5α感受态细胞中。一旦通过PCR确认了插入片段的存在，用IPTG诱导Z10/OCINPF-1，并将诱导的蛋白质进行Western印迹。使用3份蛋白质样品，用Z10、OC-I、和FLAG多克隆抗体探查。与所有3种抗体发生反应证明读码框中的完整构建。此Western印迹数据，与序列分析一起，确认了核苷酸序列的正确性。序列分析对于确认没有引入PCR诱导差错是重要的。然而，在测序之前，用BglII和KpnI消化构建体，并连接到相似消化的pSP73中。实施例12-烟草叶盘转化为了转化烟草植物，需要将构建体亚克隆到质粒pGG中。将Z10/OCINPF-1和pGG都用BglII和KpnI消化，连接，并转化到DH5α中。用PCR确认插入片段的存在。图10是Z10/OCI的构建图。质粒pGG-2是pMON316的衍生物(Rogers等人，1987)，加入了AMV外壳蛋白以增强翻译(D.V.Sutton等人，1992)。使用与pTiT37SE的三亲交配(Rogers等人，见上文)共整合含Z10/OCI插入片段的pGG-2。通过Horsch等人的方法(Horsch等人，1985)，转化烟草叶盘。当看见个别烟草苗时，将它们转移至含头孢氨噻肟(500μg/ml)和卡那霉素(100μg/ml)的Murashige和Skoog培养基(T.Murashige和F.Skoog，1962)。然后通过Western印迹对个别植株测试蛋白质表达。
图11A和11B的Western印迹显示与Z10和OCI抗体的阳性反应。
应当这样理解，此处所述实施例和实施方案只是为了例示性目的，本领域技术人员将根据它们提出各种修饰或改变，并包含于本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。
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权利要求
1.一种包含贮藏蛋白的植物或植物组织，该蛋白质在所述植物或植物组织的营养组织中以蛋白体的形式表达并积累。
2.权利要求1的植物或植物组织，其中所述贮藏蛋白是瘤胃稳定的。
3.权利要求2的植物或植物组织，其中所述瘤胃稳定蛋白质是玉米醇溶蛋白。
4.权利要求3的植物或植物组织，其中所述玉米醇溶蛋白选自15kD玉米醇溶蛋白和10kD玉米醇溶蛋白。
5.权利要求1的植物或植物组织，其中所述植物共表达15kD和10kD玉米醇溶蛋白。
6.权利要求1的植物或植物组织，其中所述贮藏蛋白在所述植物或植物组织中组成性表达。
7.一种提高植物的饲料品质的方法，包括用编码贮藏蛋白的多核苷酸分子转化植物或植物组织，所述贮藏蛋白在所述植物或植物组织的营养组织中以蛋白体的形式表达并积累。
8.权利要求7的方法，其中所述贮藏蛋白是瘤胃稳定的。
9.权利要求8的方法，其中所述瘤胃稳定蛋白质是玉米醇溶蛋白。
10.权利要求9的方法，其中所述玉米醇溶蛋白选自15kD玉米醇溶蛋白和10kD玉米醇溶蛋白。
11.权利要求7的方法，其中所述植物共表达15kD和10kD玉米醇溶蛋白。
12.一种提高外源蛋白质在植物中稳定性和贮藏的方法，包括用编码贮藏蛋白的多核苷酸分子转化表达异源蛋白质的植物或植物组织，所述贮藏蛋白在所述植物或植物组织的营养组织中以蛋白体的形式表达并积累。
13.权利要求12的方法，其中所述贮藏蛋白是瘤胃稳定的。
14.权利要求13的方法，其中所述瘤胃稳定蛋白质是玉米醇溶蛋白。
15.权利要求14的方法，其中所述玉米醇溶蛋白选自15kD玉米醇溶蛋白和10kD玉米醇溶蛋白。
16.权利要求12的方法，其中所述植物共表达15kD和10kD玉米醇溶蛋白。
17.一种包含瘤胃稳定蛋白体的组合物，其中所述蛋白体在植物中表达并积累。
18.权利要求17的组合物，其中所述蛋白体包含玉米醇溶蛋白。
19.权利要求18的组合物，其中所述玉米醇溶蛋白选自15kD和10kD玉米醇溶蛋白。
20.权利要求17的组合物，其中所述蛋白体包含15kD和10kD玉米醇溶蛋白。
全文摘要
本发明涉及用于转化能够高水平表达稳定蛋白质的植物和植物组织的材料和方法,这些蛋白质在植物细胞中以蛋白体的形式存在。本发明公开了高水平共表达15kD和10kD玉米醇溶蛋白的经转化植物,这些蛋白质在植物的营养性组织中高水平积累。共表达15kD和10kD玉米醇溶蛋白的经转化植物可用于提供饲料农作物,所述农作物含有增加的含硫氨基酸(诸如甲硫氨酸)的水平,从而提高通常以这些农作物为食的动物的食物中含硫氨基酸(诸如甲硫氨酸)的水平。本发明还涵盖经转化包含稳定蛋白体的经转化的植物或植物组织,这些蛋白体包含异源蛋白质物质。在一个实施方案中,稳定的蛋白体在植物或植物组织中以包含玉米醇溶蛋白与可操作连接的蛋白质或肽的融合蛋白表达。本发明提供的蛋白体对瘤胃消化或环境降解有抗性。
文档编号C12N5/10GK1334877SQ99816020
公开日2002年2月6日 申请日期1999年4月16日 优先权日1998年12月31日
发明者S·拜嘉, C·森古普塔－戈帕兰, J·D·肯普 申请人:新墨西哥州立大学技术转让公司