一种包封溶菌酶的脂质体及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种包封溶菌酶的脂质体及制备方法。
【背景技术】
[0002]脂质体是一种人工膜，在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25-1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。
[0003]溶菌酶，又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β -1, 4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。还可作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效。但是在潮湿、阳光、高温等条件下，溶菌酶的生物活性容易被破坏，在非保护状态下生物利用率不高，针对以上溶菌酶在实际利用当中出现的问题，有必要对溶菌酶进行包埋并制备溶菌酶脂质体，提高它的生物利用度，延长溶菌酶的寿命，有效地保持其活性，可广泛用于食品、保健品和药品中。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种包封溶菌酶的脂质体及制备方法。具体技术方案如下:
一种包封溶菌酶的脂质体，由以下组份组成:大豆卵磷脂、胆固醇、溶菌酶、缓冲液，其中，大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为2-5:1，大豆卵磷脂与溶菌酶的质量比为10-50:1，溶菌酶与缓冲液的固液比(mg/mL)为0.1-0.6:1o
[0005]进一步的，所述胆固醇为蛋白胆固醇、血清胆固醇、蛋黄胆固醇或胆囊胆固醇中的任一种。
[0006]进一步的，所述缓冲液为PH=6.8的磷酸盐缓冲溶液。
[0007]进一步的，所述缓冲液为0.2mol/L的Na2HPO4溶液与0.2mol/L的NaH 2P04溶液按
0.9-1:1体积比混合制得。
[0008]—种包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，采用如下步骤:
1)将大豆卵磷脂与胆固醇按质量比2-5:1的比例溶解在有机溶剂中得溶液A，其中，固液比(mg/mL)为 16:1 ;
2)将溶菌酶溶于PH=6.8的磷酸盐缓冲溶液中得溶液B，其中，固液比(mg/mL)为1-4:1 ； 3)将A液和B液混合，先后经磁力搅拌及水浴超声仪超声处理，使混合液变成澄清的单相，再将混合液置于旋转蒸发仪中减压蒸发直至形成一层脂质薄膜；
4)向脂质薄膜中加入磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C;
5)将溶液C过滤膜，超声，放4°C冰箱中保存，即得包封溶菌酶的脂质体。
[0009]进一步的，步骤I)中所述的有机溶剂为乙醚与三氯甲烷的混合溶剂，所述乙醚与二氯甲烧的体积比为1-2:1。
[0010]进一步的，步骤3)中磁力搅拌时间为30-55分钟，水浴超声仪在功率10Hz的条件下，超声7-12分钟。
[0011]进一步的，步骤3)中减压蒸发真空度为0.06-0.1Mpao
[0012]进一步的，步骤5)中所述的滤膜孔径为0.45ΜΠ1，超声时间为13-17分钟。
[0013]进一步的，所述磷酸盐缓冲溶液为0.2mol/L的Na2HPO4溶液与0.2moI/L的NaH2PO4溶液按0.9-1:1体积比混合制得。
[0014]本发明的有益效果是:
本发明的包封溶菌酶的脂质体及制备方法，通过采用逆向蒸发法制备溶菌酶脂质体，并采用水浴超声仪进行超声处理，直至为稳定的体系，该方法可显著提高溶菌酶脂质体的稳定性，通过调整确定了脂质成分及缓冲液的比例，经过磁力搅拌、超声及旋转蒸发等工艺步骤，可有效的控制脂质体的粒径，提高包封率；本发明溶菌酶脂质体开拓了脂质体的应用范围，运用脂质体作为载体包埋溶菌酶，其制备工艺简单，设备要求较低，便于推广应用，可产业化生产。
【附图说明】
[0015]图1是本发明的溶菌酶脂质体的粒径示意图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明予以进一步详述。
[0017]实施例1
将192mg大豆卵磷脂和48mg胆固醇溶于含有6mL三氯甲烷和9mL乙醚的混合溶液中得A液，将Smg溶菌酶溶于4mL磷酸盐缓冲溶液中得B液，将A液和B液两种溶液混合，先磁力搅拌40min，然后在水浴超声仪频率为10Hz的条件下超声lOmin，再磁力搅拌lOmin，使混合液变成澄清的单相；在37°C的水浴，0.09 Mpa的真空压下，将混合溶液旋转蒸发直至形成一层脂质薄膜；向脂质薄膜中加入30mL磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C ;将溶液C过0.45Mffl滤膜，滤液超声15min，置于4°C冰箱保存，即得包封溶菌酶的脂质体。
[0018]磷酸盐缓冲液的配置:
0.2mol/L的Na2HPO4溶液:称取磷酸氢二钠71.64g，加蒸馏水溶解并定容到lOOOmL。
[0019]0.2mol/L的NaH2PO4溶液:称取磷酸二氢钠31.21g，加蒸馏水溶解并定容到100mL0
[0020]将上述两溶液分别装在棕色瓶内，于4°C冰箱中保存，用时两溶液各按不同比例混合，即可得到所需pH的缓冲液。
[0021 ]将 0.2mol/L 的 Na2HPO4溶液、0.2mol/L 的 NaH 2P04溶液按 0.9-1: I 体积混合，即得到pH为6.8的磷酸盐缓冲液。
[0022]实施例2
将160mg大豆卵磷脂和80mg胆固醇溶于含有6mL三氯甲烧和9mL乙醚的混合溶液中得A液，将12mg溶菌酶溶于4mL磷酸盐缓冲溶液中得B液，将A液和B液两种溶液混合，先磁力搅拌40min，然后在水浴超声仪频率为10Hz的条件下超声lOmin，再磁力搅拌lOmin，使混合液变成澄清的单相；在37°C的水浴，0.09 Mpa的真空压下，将混合溶液旋转蒸发直至形成一层脂质薄膜；向脂质薄膜中加入30mL磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C ;将溶液C过0.45Mffl滤膜，滤液超声15min，置于4°C冰箱保存，即得包封溶菌酶的脂质体。
[0023]磷酸盐缓冲液的配置同实例I。
[0024]实施例3
将200mg大豆卵磷脂和40mg胆固醇溶于含有6mL三氯甲烷和9mL乙醚的混合溶液中得A液，将16mg溶菌酶溶于4mL磷酸盐缓冲溶液中得B液，将A液和B液两种溶液混合，先磁力搅拌40min，然后在水浴超声仪频率为10Hz的条件下超声lOmin，再磁力搅拌lOmin，使混合液变成澄清的单相；在37°C的水浴，0.09 Mpa的真空压下，将混合溶液旋转蒸发直至形成一层脂质薄膜；向脂质薄膜中加入30ml磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C ;将溶液C过0.45Mffl滤膜，滤液超声15min，置于4°C冰箱保存，即得包封溶菌酶的脂质体。
[0025]磷酸盐缓冲液的配置同实例I。
[0026]如图1所示溶菌酶脂质体的粒径，从图中可以看出，曲线圆滑，曲线的范围在200nm左右，说明采用该制备方法制得的溶菌酶脂质体的粒径较小，基本处于纳米级别，粒径小的纳米脂质体能更好的渗透组织、细胞，到达目标发挥作用。
【主权项】
1.一种包封溶菌酶的脂质体，其特征在于:由以下组份组成:大豆卵磷脂、胆固醇、溶菌酶、缓冲液，其中，大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为2-5:1，大豆卵磷脂与溶菌酶的质量比为10-50:1，溶菌酶与缓冲液的固液比(mg/mL)为0.1-0.6:1o
2.如权利要求1所述的包封溶菌酶的脂质体，其特征在于:所述胆固醇为蛋白胆固醇、血清胆固醇、蛋黄胆固醇或胆囊胆固醇中的任一种。
3.如权利要求1所述的包封溶菌酶的脂质体，其特征在于:所述缓冲液为PH=6.8的磷酸盐缓冲溶液。
4.如权利要求3所述的包封溶菌酶的脂质体，其特征在于:所述缓冲液为0.2mol/L的Na2HPO4溶液与0.2mol/L的NaH 2P04溶液按0.9-1:1体积比混合制得。
5.一种包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，其特征在于:采用如下步骤: 1)将大豆卵磷脂与胆固醇按质量比2-5:1的比例溶解在有机溶剂中得溶液A，其中，固液比(mg/mL)为 16:1 ; 2)将溶菌酶溶于PH=6.8的磷酸盐缓冲溶液中得溶液B，其中，固液比(mg/mL)为1-4:1 ； 3)将A液和B液混合，先后经磁力搅拌及水浴超声仪超声处理，使混合液变成澄清的单相，再将混合液置于旋转蒸发仪中减压蒸发直至形成一层脂质薄膜； 4)向脂质薄膜中加入磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C; 5)将溶液C过滤膜，超声，放4°C冰箱中保存，即得包封溶菌酶的脂质体。
6.如权利要求5所述的包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，其特征在于:步骤I)中所述的有机溶剂为乙醚与三氯甲烷的混合溶剂，所述乙醚与三氯甲烷的体积比为1-2:1。
7.如权利要求5所述的包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，其特征在于:步骤3)中磁力搅拌时间为30-55分钟，水浴超声仪在功率10Hz的条件下，超声7-12分钟。
8.如权利要求5所述的包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，其特征在于:步骤3)中减压蒸发真空度为0.06-0.1Mpa0
9.如权利要求5所述的包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，其特征在于:步骤5)中所述的滤膜孔径为0.45Mm，超声时间为13-17分钟。
10.如权利要求5所述的包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，其特征在于:所述磷酸盐缓冲溶液为0.2mol/L的Na2HPO4溶液与0.2mol/L的NaH 2P04溶液按0.9-1:1体积比混合制得。
【专利摘要】本发明公开了一种包封溶菌酶的脂质体，由以下组份组成：大豆卵磷脂、胆固醇、溶菌酶、缓冲液，其中，大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为2-5:1，大豆卵磷脂与溶菌酶的质量比为10-50:1，溶菌酶与缓冲液的固液比（mg/ml）为0.1-0.6:1。本发明还公开了一种包封溶菌酶的脂质体的制备工艺。本发明的包封溶菌酶的脂质体及制备方法，通过采用逆向蒸发法制备溶菌酶脂质体，并采用水浴超声仪进行超声处理，直至为稳定的体系，该方法可显著提高溶菌酶脂质体的稳定性，通过调整确定了脂质成分及缓冲液的比例，经过磁力搅拌、超声及旋转蒸发等工艺步骤，可有效的控制脂质体的粒径，提高包封率。
【IPC分类】A61K38-47, A61P31-12, A61P35-00, A61P31-04, A61K9-127, A23L3-3571
【公开号】CN104824787
【申请号】CN201510159964
【发明人】关荣发, 吴知盼, 吕飞, 刘明启, 王彦波, 沈海涛
【申请人】中国计量学院
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月7日