用于减少免疫应激的酶的制作方法

用于减少免疫应激的酶的制作方法
【专利摘要】提供了适合于向动物口服施用的组合物，该组合物包含有效降低所述动物中阳性急性期蛋白的水平、提高所述动物中阴性急性期蛋白的水平、和/或改善动物生长表现的量的至少一种减少免疫应激的酶，还提供了使用这种组合物的方法。所述组合物包括动物饲料组合物、除了动物饲料之外的液体组合物和除了动物饲料之外的固体组合物。
【专利说明】用于减少免疫应激的酶 本申请为分案申请，原申请的申请日为2006年12月14日，申请号为200680052912.7 (PCT/US2006/047592)，发明名称为"用于减少免疫应激的酶"。 发明领域
[0001] 本发明提供了用于减少免疫应激和改善动物生长表现的组合物和方法。特别地， 本发明提供了包含酶的组合物，所述酶有效减少免疫应激、或有效治疗或预防感染、或有效 改善动物生长表现。本发明还提供了使用所述组合物的方法。 背景
[0002] 动物可能因为许多原因经历免疫应激，包括对动物的免疫系统所识别的抗原的暴 露。抗原可能触发免疫应答，所述免疫应答是适应性免疫应答或者是先天免疫应答。当免疫 应答被触发时，随着动物的免疫系统响应于所察觉到的威胁，动物经历了免疫应激。通常， 免疫应激阻碍动物的生长表现。
[0003] 急性期蛋白（APP)是一组血液蛋白，当动物经历着应激，例如感染、炎症、手术创 伤、或其他内部或外部攻击时，它们的血液浓度改变。参见，例如，Murata et al.， Vet. J. 168:28(2004) APP被认为在动物的先天免疫应答中起到作用。例如，APP可能参与恢 复稳态和限制微生物生长直到发展出获得性免疫。
[0004] APP包括浓度在应激时降低的"阴性"蛋白，和浓度在应激时提高的"阳性"蛋白。参 见，例如，Murata et al.，同上。阴性APP包括白蛋白和转铁蛋白。阳性APP包括在促炎细胞 因子刺激时由肝细胞合成的、并释放到血流中的蛋白，例如触珠蛋白、C-反应蛋白、血清淀 粉样蛋白A、血浆铜蓝蛋白、纤维蛋白原和α-1-酸性糖蛋白（AGP)。对于大多数哺乳动物物种 也已经报道了肝脏外的APP产生。同上。促炎细胞因子例如白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死 因子a(TNF-a)被认为是肝脏中APP合成的主要介导物。炎症、感染或组织损伤触发防御定向 细胞释放细胞因子，从而诱导APP合成。阳性APP的诱导还与阴性APP的合成减少相关。同上。
[0005] 已经确立了定量APP的方法，循环APP浓度(例如，APP的血清水平）已经与动物状况 的严重度相关联。同上。因而，APP浓度可以用作动物免疫应激水平的指标。
[0006] 动物的免疫系统可以识别对动物的健康不构成实际威胁的抗原，例如在动物饲料 组合物中的植物和动物来源的成分。这些抗原可能触发免疫应答，例如先天免疫应答，从而 引起动物经历免疫应激。这种应激反应可以通过血清APP浓度来鉴定和监视。
[0007] 即使当免疫触发抗原不对动物的健康构成实际威胁时，应激反应可能具有有害的 影响。例如，这可以作为饲料转化的降低、体重增加速率的降低或体重的降低、对感染的敏 感度的提高、体温的提高来观察到。
[0008] 已经描述了利用抗体，例如抗磷脂酶A2抗体来减少动物中的胃肠炎症。参见，例如 美国专利No. 6，383，485。已经描述了饲料组合物，其包含能够降解含β-甘露聚糖的半纤维 素的半纤维素酶(例如，β-甘露聚糖酶型半纤维素酶），例如，内-1，4-β-甘露聚糖酶，或磷脂 酶，例如磷脂酶Α2，用于改善饲料转化。参见，例如，W0 97/41739、美国专利No. 6，162，473和 美国专利Νο·6,183,739。
[0009] 同样描述了包含酶，例如PI-PLC的饲料组合物，其裂解键，从而实现细胞表面蛋白 质或碳水化合物的释放，用于治疗或预防消化道感染。参见，例如，W0 01/41785 Jalsh et al. J.Anim.Sci.73:1074(1995)，讨论了包含葡聚糖酶的饲料组合物，所述酶裂解混合的 连接葡聚糖底物，例如，裂解混合的β-l，3、β-1，4底物的1，4-α-葡聚糖酶。然而，在我们的测 试中，PI-PLC和1，4-β-葡聚糖酶都没有显示减少免疫应激的活性。
[0010] 迄今还没有描述包含除了 β-甘露聚糖酶型半纤维素酶或磷脂酶之外的、并以有效 减少免疫应激的量存在的酶的饲料组合物。
[0011]因而，需要用于在动物中减少免疫应激的组合物和方法。 发明概述
[0012] -个实施方式提供了适合于向动物口服施用的组合物，其包含口服可接受的载体 中的减少免疫应激的酶。所述组合物选自下组：（i)动物饲料，其包含有效降低动物中阳性 急性期蛋白的水平、提高动物中阴性急性期蛋白的水平、和/或改善动物生长表现的量的 酶；（i i)除了动物饲料之外的液体组合物，其包含至少40，000IU酶/L;和（i i i)除了动物饲 料之外的固体组合物，其包含至少40，000IU酶/kg。所述酶不是β-甘露聚糖酶型半纤维素酶 或磷脂酶，并且如果所述酶包含1，3-β-葡聚糖酶，所述组合物选自下组：（i)包含至少20IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg饲料的动物饲料；（ii)除了动物饲料之外的液体组合物，其包含至少 155，000IU 1，3-β-葡聚糖酶/L;和（i i i)除了动物饲料之外的固体组合物，其包含至少300， 000IU 1，3-β-葡聚糖酶。
[0013] 在一个实施方式中，所述组合物是包含至少20IU酶/kg饲料的动物饲料。在另一个 实施方式中，所述组合物是除了动物饲料之外的固体组合物，其包含至少80，000IU酶/kg、 或至少 160,000IU 酶/kg。
[0014] 在一个实施方式中，所述组合物是动物饲料，其包含诱导动物中的免疫应答的成 分，所述酶包含降解所述成分的酶。在一个实施方式中，所述成分是病原微生物展示的抗 原。
[0015] 在一个实施方式中，所述酶包含1，3-β-葡聚糖酶。在一个实施方式中，所述酶包含 1，3-β-葡聚糖酶，所述组合物选自下组：（i)包含至少30IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg饲料的动物 饲料；（ii)除了动物饲料之外的液体组合物，其包含至少230，000IU 1，3-β-葡聚糖酶/L;和 (i i i)除了动物饲料之外的固体组合物，其包含至少450，000IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg。
[0016] 另一个实施方式提供了适合于向动物口服施用的组合物，其包含两种或更多种减 少免疫应激的酶，其中所述组合物包含除了 1，4-β-甘露聚糖酶和1，3-β-葡聚糖酶之外的至 少一种减少免疫应激的酶。所述组合物选自下组：（i)动物饲料，其包含有效降低所述动物 中阳性急性期蛋白的水平、提高所述动物中阴性急性期蛋白的水平、和/或改善动物生长表 现的量的所述减少免疫应激的酶；（ii)除了动物饲料之外的液体组合物，其包含至少一种 减少免疫应激的酶，含量为至少40，000IU酶/L;和（i i i)除了动物饲料之外的固体组合物， 其包含至少一种减少免疫应激的酶，含量为至少40，000IU酶/L。
[0017] 在一个实施方式中，所述组合物是动物饲料，其包含至少一种减少免疫应激的酶， 含量为至少20IU酶/kg饲料。在另一个实施方式中，所述组合物是除了动物饲料之外的固体 组合物，其包含至少一种减少免疫应激的酶，含量为至少80,000IU酶/kg、或至少160,000IU 酶/kg〇
[0018] 在特定的实施方式中，所述组合物选自下组：（i)包含1，4-β_甘露聚糖酶和几丁质 酶的组合物；（ii)包含1，4-β-甘露聚糖酶和木葡聚糖酶的组合物；（iii)包含1，4-β-甘露聚 糖酶和阿拉伯聚糖酶的组合物；（iv)包含1，3-β-葡聚糖酶和几丁质酶的组合物；（ν)包含1， 3-β-葡聚糖酶和木葡聚糖酶的组合物；（vi)包含1，3-β-葡聚糖酶和阿拉伯聚糖酶的组合 物，和(vi i)包含1，4-β-甘露聚糖酶、1，3-β-葡聚糖酶和阿拉伯聚糖酶的组合物。
[0019] 另一个实施方式提供了适合于向动物口服施用的组合物，其包含1，4-β-甘露聚糖 酶和1，3-β-葡聚糖酶。所述组合物选自下组：（i)包含1，4-β-甘露聚糖酶和至少20IU 1，3- 葡聚糖酶/kg饲料的动物饲料，（i i)除了动物饲料之外的液体组合物，其包含1，4-β-甘露 聚糖酶和至少155，000IU 1，3-β-葡聚糖酶/L，和(i i i)除了动物饲料之外的固体组合物，其 包含1，4-β-甘露聚糖酶和至少300,000IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg。在一个实施方式中，所述组 合物选自下组：（i)包含1，4-β-甘露聚糖酶和至少30IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg饲料的动物饲 料；（i i)除了动物饲料之外的液体组合物，其包含1，4-β-甘露聚糖酶和至少230，000IU 1， 3-β-葡聚糖酶/L，和（i i i)除了动物饲料之外的固体组合物，其包含1，4-β-甘露聚糖酶和至 少450,000IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg。在一个实施方式中，所述组合物进一步包含一种或多种 其他的减少免疫应激的酶。
[0020] 另一个实施方式提供了改善动物生长表现和/或减少动物中的免疫应激的方法， 包括向所述动物口服施用任何如上所述的组合物。
[0021] 在一个实施方式中，所述动物施用了诱导动物中的免疫应答的成分，并且所述组 合物包含降解所述成分的至少一种减少免疫应激的酶。在一个实施方式中，所述成分和酶 在同一组合物中施用。在一个实施方式中，所述组合物是动物饲料。在一个实施方式中，所 述成分是病原微生物展示的抗原。
[0022] 另一个实施方式提供了预防或治疗与展示抗原的病原微生物相关的感染的方法， 包括向有需要的动物口服施用任何如上所述的组合物，其中所述组合物包含降解抗原的至 少一种减少免疫应激的酶。 附图的简要说明
[0023] 附图1显示了用于使用实施例1中获得的数据计算测试鸡的血浆样品中鸡α-1-酸 性糖蛋白（AGP)的浓度的最佳曲线拟合(和基础多项式方程）。
[0024]附图2是图示来自测试鸡的鸡血清中AGP水平的Box和Wisker图表，如实施例2所描 述。数据的范围由垂直线条代表。方框代表平均值的一个标准差内的数据的范围。水平的线 条代表数据平均值。
[0025] 附图3显示了来自接受几种不同饲料之一的鸡的血清的AGP水平，包括根据本发明 的饲料和现有技术的饲料，如实施例3中描述的。
[0026] 附图4显示了用于使用实施例8中获得的数据计算测试火鸡的血浆样品中AGP浓度 的最佳曲线拟合(和基础多项式方程）。 详细说明
[0027]如以下的讨论中使用的，术语"一个"或"一种"应当理解为包括一个或多个，除非 另作说明。
[0028]如在此使用的，术语"动物"是指任何动物，包括人类和其他动物，例如非人动物， 包括宠物，例如狗和猫，家畜，例如牛和其他反会动物、水牛、马、猪、绵羊，家禽(例如，鸡、 鸭、火鸡和鹅)和水产业动物(例如，鱼和虾和鳗）。
[0029] 在本说明书中，用语"降解抗原的酶"和"降解成分的酶"是指所述酶将抗原或成分 转化成不被动物的免疫系统识别的形式。酶降解抗原或成分的能力可以通过测量动物的血 清APP浓度来鉴定，从而阳性APP的血清浓度降低、或阴性APP的血清浓度提高表明所述酶降 解了所述抗原或成分。
[0030] 如上所述，术语"APP"包括浓度在应激时降低的"阴性"蛋白，和浓度在应激时提高 的"阳性"蛋白。本发明包括提高阴性急性期蛋白的浓度的组合物和方法，所述阴性急性期 蛋白的浓度一般在应激时降低，还包括降低阳性急性期蛋白的浓度的组合物和方法，所述 阳性急性期蛋白的浓度一般在应激时提高。为了方便起见，在以下的论述中，本发明参考针 对阳性急性期蛋白的组合物和方法的效果来进行例证。因而，术语"APP"在以下的论述中泛 指与动物的应激反应相关的任何一种或多种阳性急性期蛋白。要理解的是，在此描述为降 低"APP"（是指阳性急性期蛋白）浓度的组合物和方法的对于提高阴性急性期蛋白的浓度也 是有用的。
[0031] 本发明的一个方面涉及包含酶的组合物，所述酶有效减少动物经历的免疫应激。 为了方便起见，这些酶在此称为"减少免疫应激的"酶。如在此使用的，术语"减少免疫应激 的酶"是指任何以下这样的酶:其降解动物的免疫系统所识别的抗原或分子模式，例如，触 发免疫应答从而引起动物经历免疫应激的抗原或分子模式。如在此使用的术语"分子模式" 包括一般的分子模式，其在先天免疫系统的环境中被受体结合，例如通常与病原体相关的 分子的模式。
[0032] 根据一个实施方式，所述减少免疫应激的酶不是β-甘露聚糖酶型半纤维素酶。根 据一个实施方式，减少免疫应激的酶不是内-1，4H-甘露聚糖酶。根据另一个实施方式， 所述酶不是磷脂酶。根据另一个实施方式，所述减少免疫应激的酶不是l，4-i3_D-葡聚糖酶。 根据另一个实施方式，所述减少免疫应激的酶不是PI-PLC。根据另一个实施方式，所述减少 免疫应激的酶不是β-甘露聚糖酶型半纤维素酶或磷脂酶。根据又一个实施方式，所述减少 免疫应激的酶不是β-甘露聚糖酶型半纤维素酶、不是1，4-β-葡聚糖酶、并且不是磷脂酶。根 据进一步的实施方式，所述减少免疫应激的酶不是β-甘露聚糖酶型半纤维素酶、不是1，4_ β-葡聚糖酶、不是磷脂酶、并且不是PI-PLC。根据任何以上描述的实施方式的一个方面，所 述酶不是1，3-β-葡聚糖酶。
[0033] 虽然不希望受到任何理论的限制，本发明人相信，减少免疫应激的酶对抗原或分 子模式的降解抑制或减少了所述抗原或分子模式触发的免疫应答，从而减少动物的免疫应 激。免疫应激的减少可以通过使用用于定量ΑΡΡ的本领域已知的方法测量动物的血清ΑΡΡ浓 度来鉴定和监视。这些方法的实例在Murata，et al.，同上中提及，并在Hulten et al.， Vet.Microbiol.95:75(2003)和Holt et al.，同上中描述和提及，以及在以下的实施例1中 提及。
[0034] 在相关的实施方式中，本发明提供了减少动物中免疫应激的方法，其包括向所述 动物施用组合物，所述组合物包含有效降低所述动物中APP水平的量的减少免疫应激的酶。 [0035]已经鉴定了许多不同的阳性急性期蛋白，包括α-1-酸性糖蛋白（AGP)、血浆铜蓝蛋 白（Cp)、胶原凝素家族的蛋白（例如，肺表面活性蛋白、共凝集素和结合甘露聚糖的凝集 素）、纤维蛋白原(Fb)、C-反应蛋白（CRP)、触珠蛋白、蛋白酶抑制物(例如，α-1 -抗胰蛋白酶、 α-1-抗胰凝乳蛋白酶和α-2-巨球蛋白）和血清淀粉样蛋白-A(SAA)。其他潜在的APP包括脂 多糖结合蛋白（LPB)、磷脂结合蛋白例如膜联蛋白，和主要急性期蛋白（MAP) jurata^t al.，同上。这些或其他APP的任何一种的血清浓度可以用于根据本发明鉴定、评定和监视酶 活性。
[0036]不同的APP可能在不同的动物的应激反应中起到更显著的作用。例如，已知AGP在 牛中是临床重要的，并且在猪、狗、猫和鸡(包括母鸡）中与感染相关。已经报道了Cp是牛、马 和鸡中感染的指标。已经在反刍动物、马、猪、狗和猫中鉴定了 CRP，然而没有显示CRP是牛中 的APP。已经显示了 CRP与马和猪中的感染相关联。Fb是牛和羊中炎症、细菌感染或手术创伤 的可靠指标，并且与马中的感染相关联。Hp是许多生产动物和宠物中的APP，包括反刍动物， 例如牛、绵、猪、马和狗。SAA与牛中的炎症和感染相关联，并且与马、猪、宠物例如狗和鸡中 的感染相关联。已经在患有乳腺炎的母牛和母羊中发现了 SAA乳水平的提高。血清LBP已经 与牛中的感染相关联，膜联蛋白的局部水平也是(在感染的牛的肺中分泌上皮的表面上）。 报道了 MAP是猪中感染的指标。另外，虽然转铁蛋白通常被认为是阴性急性期蛋白，它看起 来在鸡中作为阳性急性期蛋白起作用。Murata，et al，同上；Holt et al.，Poultry Sci . 81:1295-1300(2002)。其他还报道了SAA和Hp、以及CRP和MAP与猪中的感染相关联。 Hulten et al·，同上。
[0037] 在某些实施方式中，本发明的组合物包含有效降低动物中APP的血清浓度的量的 减少免疫应激的酶。所述量可以取决于所述动物和所述减少免疫应激的酶而变化，可以由 本领域技术人员使用本领域已知的方法容易地确定。例如，可以在施用所述酶之前或之后 测量动物的血清APP水平，或者可以比较等同处理的动物和对照动物的血清APP水平。（就此 来说，可能有益的是比较相同年龄的处理的和对照动物，因为APP水平可能随年龄而改变。 例如，我们发现血清AGP水平随着鸡的年龄提高。）与所述酶的施用相关的血清APP浓度的降 低表明施用了有效量的酶。
[0038] 在其他实施方式中，本发明的组合物包含有效改善动物生长表现(也称为"存活表 现"，特别是在家禽领域)的量的减少免疫应激的酶。如在此使用的，用语"动物生长表现"包 括反映动物生长的任何参数，包括饲料转化、水摄取、粪便水含量、动物的群或组之内的体 重均匀性、存活率和死亡率。虽然不希望受到任何理论的限制，相信的是，在某些条件下，减 少免疫应激的酶对APP浓度的影响被因子例如免疫应激诱导因子所屏蔽，例如，在动物群体 中低水平感染的存在或紧张的生活条件。在这些条件之下，尽管如此，减少免疫应激的酶可 有效改善动物生长表现。因而，动物生长表现是本发明的组合物和方法的有效性的备选度 量。
[0039] 所述组合物可以是适合于向动物施用的任何组合物。在一个实施方式中，所述组 合物适合于口服施用。在一个特定的实施方式中，适合于口服施用的所述组合物一般被认 为对于向动物口服施用是安全的。在另一个特定的实施方式中，适合于口服施用的所述组 合物仅含有一般被认为对于向动物口服施用是安全的成分，以及所述成分的量。在另一个 特定的实施方式中，适合于口服施用的所述组合物不含有一般认为对于向动物口服施用不 安全的任何成分，或所述成分的量。在另一个特定的实施方式中，适合于口服施用的所述组 合物仅含有容许、或不禁止向动物口服施用的成分和所述成分的量。在另一个特定的实施 方式中，适合于口服施用的所述组合物不含有不允许、或禁止向动物口服施用的任何成分、 或所述成分的量。
[0040] 在某些实施方式中，所述组合物包含所述酶的口服可接受的载体。如在此使用的， " 口服可接受的载体"包括适合于口服施用的任何生理学可接受的载体。口服可接受的载体 包括但不限于动物饲料组合物、水性组合物、以及适用于动物饲料产物中和/或用于向动物 口服施用的液体和固体组合物。适合的载体是本领域已知的，包括在美国专利6,780,628中 描述的那些。
[0041] 在某些实施方式中，所述组合物是动物饲料。如在此使用的，术语"动物饲料"具有 畜牧业领域中其常规的含义。例如，动物饲料包括为了它们的营养价值被家畜消耗的可食 用材料。动物饲料包括饲料配给，例如，满足动物的营养需求的组合物，并且还包括不满足 动物的营养需求的组合物。
[0042]在这种实施方式的特定实例中，酶的量是至少约50,000国际单位（IU)/美吨 (U.S.ton)饲料、至少约60,000IU/吨饲料、至少约70,000IU/吨饲料、至少约80,000IU/吨饲 料、至少约90,000IU/吨饲料、至少约100,000IU/吨饲料、至少约200,000IU/吨饲料、或至少 约500,000IU/吨饲料，或更高。
[0043]在其他特定的实例中，本发明提供了动物饲料，其包含至少约20IU/kg饲料，例如 至少20IU/kg饲料、至少25IU/kg饲料、至少30IU/kg饲料、至少35IU/kg饲料、至少40IU/kg饲 料、至少45IU/kg饲料、至少50IU/kg饲料、或更多量的减少免疫应激的酶。虽然不希望受到 任何理论的限制，相信的是，包含至少约20IU/kg饲料的量的减少免疫应激的酶的动物饲料 将有效降低所述动物中阳性急性期蛋白的水平、提高所述动物中阴性急性期蛋白的水平、 和/或改善动物生长表现。
[0044] 因而，在某些实施方式中，本发明提供了动物饲料，其包含有效降低动物中阳性急 性期蛋白的水平、提高动物中阴性急性期蛋白的水平、和/或改善动物生长表现的量的减少 免疫应激的酶。
[0045] 所述饲料组合物可以通过本领域已知的方法来制备。例如，减少免疫应激的酶可 以在制造过程期间的任何阶段添加到其他饲料成分中，如本领域技术人员认为合适的。在 一个实施方式中，作为溶液来提供所述酶，例如在制造过程期间被添加到其他饲料成分中 的液体酶浓缩物。做为选择，含有酶的溶液被喷雾到动物饲料的基本最终的形式上。在另一 个实施方式中，作为固体组合物(例如，粉未)来提供所述酶，例如在制造过程期间被添加到 其他饲料成分中的固体组合物。制造含有酶的饲料的示范性的方法在W0 97/41739中描述。
[0046] 在某些实施方式中，所述组合物不是动物饲料。例如，所述组合物可以是除动物饲 料之外的液体组合物，或除动物饲料之外的固体组合物。这样的组合物可能适合于直接施 用给动物，或可以用作饲料添加剂(例如，在喂饲之前添加到饲料中）或饲料补充剂(包括在 喂饲之前用其他饲料成分稀释的补充剂，和在自由选择、独立的基础上向动物提供的补充 剂）。除动物饲料之外的液体组合物的实例包括液体酶浓缩物，包括在向动物口服施用之前 一般用其他成分稀释或与其他成分组合的液体酶浓缩物。
[0047] 在所述组合物是除动物饲料之外的液体组合物，例如酶溶液的实施方式中，所述 液体组合物或溶液可以包含至少约40，000国际单位(IU) /升溶液，例如至少40，000IU/L、至 少 50,000IU/L、至少60,000IU/L、至少 70,000IU/L、至少80,000IU/L、至少 90,000IU/L、至少 100,00011]/1、至少约500,00011]/1、至少约600,00011]/1、至少约700,00011]/1、至少约800， OOOIU/L、至少约 900,000IU/L、至少约 1，000,00011]/1、至少约2,000,00011]/1或至少约5， 000,000IU/L〇
[0048] 在某些实施方式中，一定量的除了动物饲料之外的液体组合物，例如约500mL溶 液，被应用于或组合于一定量的饲料，例如一吨饲料，来得到具有如上所述的酶水平的饲料 制剂。在其他实施方式中，一定量的除动物饲料之外的液体组合物被应用于或组合于一定 量的饲料，来制备动物饲料，该饲料具有有效降低动物中阳性急性期蛋白的水平、提高动物 中阴性急性期蛋白的水平、和/或改善动物生长表现的量的酶。
[0049] 相信的是，目前可得到的适合于口服施用的液体酶浓缩物组合物（除了以下讨论 的1，3-β_葡聚糖酶组合物之外）包含比至少约40,000IU/L少得多的减少免疫应激的酶(如 果有），并且当根据它们的说明书使用时，对于降低阳性急性期蛋白的水平、提高阴性急性 期蛋白的水平、和/或改善动物生长表现是无效的。
[0050] 在组合物是除动物饲料之外的固体组合物的实施方式中，所述组合物可以包含至 少约 40，000IU/kg，例如至少 40，000IU/kg、至少 50，000IU/kg、至少 60，000IU/kg、至少 70， 000IU/kg、至少80,000IU/kg、至少90,000IU/kg、至少 100,000IU/kg、至少 120,000IU/kg、至 少 140,000IU/kg、至少 160,000IU/kg、至少 180,000IU/kg、至少 200,000IU/kg，或更多。
[0051] 在某些实施方式中，一定量的除了动物饲料之外的固体组合物被应用于或组合于 一定量的饲料，来得到具有如上所述的酶水平的饲料制剂。在其他实施方式中，一定量的除 动物饲料之外的固体组合物与一定量的饲料组合，来制备动物饲料，所述饲料具有有效降 低动物中阳性急性期蛋白的水平、提高动物中阴性急性期蛋白的水平、和/或改善动物生长 表现的量的酶。
[0052]相信的是，目前可得到的适合于口服施用的固体酶粉未组合物包含比至少约40， οοοιυ/kg少得多的减少免疫应激的酶(如果有），并且当根据它们的说明书使用时，对于降 低阳性急性期蛋白的水平、提高阴性急性期蛋白的水平、和/或改善动物生长表现是无效 的。
[0053] 如本领域中常规的，术语"IU"或"国际单位"是指在酶的最佳条件下每分钟催化1 微摩尔底物的转化的酶的量。相当于减少免疫应激的酶的国际单位的重量是本领域已知 的，可以使用标准的分析来测定。下文列出了用于代表性的减少免疫应激的酶的示范性的 标准分析。
[0054] 在一个实施方式中，所述酶被动物饲料中使用的植物表达。例如，玉米可以被遗传 工程化来表达减少免疫应激的酶，产生的遗传修饰的玉米产物可以用于饲料中。生产还可 以使用其他遗传修饰的或经典修饰的系统，例如细菌，例如大肠杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌;酵 母，例如毕赤氏酵母、耶氏酵母、糖酵母、裂殖酵母(例如粟酒裂殖酵母、汉逊氏酵母、克鲁维 氏酵母、假丝酵母)和其他真菌，例如曲霉、根霉、木霉、腐质霉、青霉和腐质霉。
[0055] 根据另一个实施方式，所述减少免疫应激的酶在用于口服摄入的胶囊或片剂中提 供。本发明还包括这样的实施方式，其中酶通过其他途径施用，例如，静脉内、腹膜内或皮 下，作为根据已知的药理学实践为这种施用配制的组合物的成分。
[0056] 动物的免疫系统可以将饲料组合物的某些成分识别为不对动物的健康构成实际 威胁的抗原或分子模式。尽管如此，成分触发了免疫应答，其引起动物经历免疫应激，并且 可以通过一种或多种APP的血清浓度的提高来鉴定和监视。虽然不希望受到任何理论的限 制，本发明人相信，这种"不必要的和对抗产生的（counterproductive)"免疫应答可能涉及 模式识别受体(PRR)，例如在先天免疫系统中涉及的那些。
[0057] 先天免疫系统提供了不依赖于特异性抗原识别的免疫应答。参见，例如，Tosi， J.Allergy Clin. Immunol · 116:241(2005)。先天免疫系统的一个方面涉及PRR，其识别并结 合病原体相关的分子模式，传导免疫应答信号。参见，例如，Fabrick et al.， J. Biol. Chem. 279:26605(2004) 1RR的实例包括Toll样受体(TLR)，其识别一系列分子模式 并产生用于活化一系列宿主反应的细胞内信号。参见，例如，Tosi，同上;Blach-Olszewska， Arch · Immunol · Ther.Exp · 53:245(2005)。已经鉴定了识别甘露糖的PRR/TLR(例如，Blach-Olszewska，同上）、1，3-β-葡聚糖（例如Rice et al ·，J.Leukoc·Biol · 72:140(2002))、脂多 糖和磷酸胆喊（例如，Baumgarth et al ·，Semin · Immunopathol · 26:347(2005))、脂胞壁酸、 苯酸可溶的调节蛋白、胞壁酰二肽和肽聚糖（例如，F o u r n i e r e t a 1， Clin.Microbiol.Rev.l8:521(2005))。甘露聚糖（例如，Klabunde et al·， ?&抑5^切1.此8.88:113(2002)(结合甘露聚糖的凝集素）），和^乙酰-0-葡糖胺和^乙酰-D_甘露糖胺(例如，Hansen et al，J. Immunol. 169:5726(2002))的免疫调节受体。还已经鉴 定了双链RNA的TLR(例如，Bell et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:10976(2005))，以及 具有不同于内源DNA的甲基化模式的DNA(Huang et al，J.Immunoll75:3964(2005); Nonnemacher et al，Infect·Immun.71:850(2003))〇
[0058] 虽然这些分子模式与病原微生物(例如，细菌、病毒、真菌和原生动物)相关联，它 们也由某些非致病分子例如动物饲料成分展示。对展示这些分子模式的非致病分子的先天 免疫应答使得动物不必要地经历免疫应激，并且可能不利地影响动物的饲料效率，减缓动 物的体重增加速率或引起重量损失，使得动物对感染更加敏感，提高动物的体温，或者对动 物的健康或食物能量(卡路里)利用效率有消极影响。例如由MBL(结合甘露糖的凝集素)功 能引起的先天免疫应答诱导了强反应。显示的是，在小鼠中甘露糖结合蛋白的基因之一的 突变反而容许通常致命的急性脓毒性腹膜炎攻击下的存活（Takahashi，K.et al.， Microbes Inf ect. 4(8): 773-784，2002)。在这种情况下，来自攻击性先天免疫应答的免疫 应激是比感染更加致命的。
[0059] β-甘露聚糖是大豆制品和基于大豆的动物饲料的成分。在动物饲料中存在的高分 子量形式的甘露聚糖可以触发"不必要的和对抗产生的"先天免疫应答，从而使动物经历 免疫应激。本发明人发现，这种免疫应激可以使用β-甘露聚糖酶型半纤维素酶，即内-1，4-β-D-甘露聚糖酶来减少或防止，所述所述酶降解β_甘露聚糖(例如，β_半乳甘露聚糖、β_葡 甘露聚糖），从而减少或防止对甘露聚糖的免疫应答。如在下文实施例中显示的，免疫应 激的减少反映于血清ΑΡΡ浓度的降低。
[0060] 根据本发明，降解α-甘露聚糖的α-甘露聚糖酶作为减少免疫应激的酶是有用的。 甘露聚糖不被认为是半纤维素，因为它不享有半纤维素的特征性质。
[0061 ]在工业酶的领域，术语"半纤维素酶"已经被用作β-甘露聚糖酶的商品名。同样地， 发明人合著的专利和公开物使用了术语"半纤维素酶"来指代甘露聚糖酶，包括内-1，4-B-D-甘露聚糖酶。参见，例如，美国专利Ν〇.6，162,473。在其他环境中，术语"半纤维素酶"可 以更广义，除了甘露聚糖酶之外包括葡聚糖酶和木聚糖酶，如以下所解释的。
[0062]术语"半纤维素"被用于描述通过用稀碱性溶液提取获得的、比纤维素更容易水解 的碳水化物植物材料。参见，例如，5(：1111126 4.，1361'；[(31^6(16106此8(31161113(^&11丨8(311611 Gesellschaf，24:2277( 1891);Schulze，R，Z.Physiol Chem. 16:387( 1892)。从那时起，"半 纤维素"开始表示除了植物汁液中的果胶和淀粉和多糖之外的、与纤维素相关的不溶于水 的植物多糖，它们是在稀碱溶液中可溶的。参见，例如，Whisler et al.，〃 Hemicelluloses/'in IV POLYSACCHARIDE CHEMISTRY 112(Academic Press，1953)。木聚 糖、β-甘露聚糖和半乳聚糖一般被认为是半纤维素，虽然某些β-甘露聚糖，如刺槐豆胶和瓜 耳胶半乳甘露聚糖是容易溶解的。软木具有与它们的纤维素相关的大量β-甘露聚糖，而硬 木具有大量木聚糖。
[0063] 与半纤维素相比，α-甘露聚糖与真菌细胞壁，例如糖酵母相关，而不是木材的结构 成分，并且在一般可溶于水的真核糖蛋白中均匀地存在。因而，α-甘露聚糖不被认为是半纤 维素，并且α_甘露聚糖酶不是半纤维素酶。根据本发明，α_甘露聚糖酶作为减少免疫应激的 酶是有用的，因为它降解动物的免疫系统识别的、但不是病原体相关的α_甘露聚糖。先天免 疫系统对于甘露聚糖是敏感的，因为含有甘露糖的聚合物在许多病原体的表面存在。
[0064] 可以被动物的免疫系统识别的其他饲料成分包括β-1，3_葡聚糖(植物材料的常见 结构成分）、Ν-连接的糖蛋白复合物(例如，在大豆制品中存在）、来自植物、动物或微生物的 双链RNA，和来自微生物、植物或动物的具有外源(非内源）甲基化模式的DNA。因而，根据一 个实施方式，本发明提供了包含降解一种或多种这些或其他饲料成分的一种或多种减少免 疫应激的酶的组合物。在相关的实施方式中，本发明提供了减少动物中的免疫应激的方法， 其包括向所述动物施用包含有效量的这样的酶的组合物。在以下的表格中阐述了减少免疫 应激的酶和它们降解的抗原的具体实例。本发明包括组合物，其包含降解相同或不同抗原 的其他减少免疫应激的酶，以及这些其他的酶来减少免疫应激的用途。
[0065] 根据某些实施方式，本发明提供了包含两种或更多减少免疫应激的酶的组合物。 在一个实施方式中，所述两种或更多酶的至少一种不是1，4-β-甘露聚糖酶或1，3-β-葡聚糖 酶。在另一个实施方式中，所述组合物包含1，4-β-甘露聚糖酶和1，3-β-葡聚糖酶。
[0066] 在一个特定的实施方式中，所述组合物是动物饲料，其包含1，4-β_甘露聚糖酶和 至少约20IU的1，3-β-葡聚糖酶/kg饲料，例如至少20IU/kg饲料、至少25IU/kg饲料、至少 30IU/kg饲料、至少35IU/kg饲料、至少40IU/kg饲料、至少45IU/kg饲料、至少50IU/kg饲料、 或更多的1，3-β-匍聚糖酶。
[0067] 在另一个特定的实施方式中，所述组合物是除动物饲料之外的液体组合物，其包 含1，4-β-甘露聚糖酶和至少约155,000IU 1，3-β-葡聚糖酶/L，例如至少155,000IU/L、至少 230,000IU/L、至少 300,000IU/L、至少 380,000IU/L 或更多的1，3-β-葡聚糖酶。
[0068] 在另一个特定的实施方式中，所述组合物是除动物饲料之外的固体组合物，其包 含1，4-β-甘露聚糖酶和至少约300,000IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg，例如至少300,000IU/kg、至 少450,000IU/kg、至少600,000IU/kg、至少 750,000IU/kg、至少900,000IU/kg 或更多的 1，3_ 葡聚糖酶。
[0069] 在另一个实施方式中，组合物包含1，4-β_甘露聚糖酶和木葡聚糖酶。在另一个实 施方式中，组合物包含1，3-β_葡聚糖酶和木葡聚糖酶。在另一个实施方式中，组合物包含1， 4-β-甘露聚糖酶和几丁质酶。在另一个实施方式中，组合物包含1，3-β_葡聚糖酶和几丁质 酶。在另一个实施方式中，组合物包含1，4-β-甘露聚糖酶和阿拉伯聚糖酶。在另一个实施方 式中，组合物包含1，3-β-葡聚糖酶和阿拉伯聚糖酶。在另一个实施方式中，组合物包含1，4_ β-甘露聚糖酶、1，3-β-葡聚糖酶和阿拉伯聚糖酶。
[0070] 要理解的是，这些组合仅是示范性的，本发明包括包含其他减少免疫应激的酶组 合的组合物。例如，本发明包括包含以上列出的和/或以下讨论的任何一种或多种减少免疫 应激的酶以及1，4-β-甘露聚糖酶的组合物。
[0071] 饲料成分引起的免疫应激不总是先天免疫系统反应。公知的是，某些小百分比的 喂养婴儿的基于大豆蛋白质的人乳替代配方发展出强烈有害的基于免疫的肠反应(参见美 国儿科学院、营养委员会的报告，Pediatrics 101(1) :ρ 148,（1998))。大豆中Ν-连接的糖 蛋白，例如β-伴大豆球蛋白（conglycinin)，有时称为7S球蛋白（Ogawa Τ，etal， Biosci.Biotechnol.Biochem.59(5) ：831-833 , 1995；Burks Aff,et a 1 , JPediatr.Gastroenterol .Nutr. 8(2): 195-203，1989)可以是强抗原，被认为具有抗营养性 质。β-伴大豆球蛋白尽管对总蛋白有贡献，也被有意地从用于营养补充剂的大豆蛋白分离 制品中除去。水解作用破坏抗原性。此外，我们发现用于喂饲公鸡的富集的7S大豆糖蛋白级 分与另一种较少糖基化的大豆蛋白质级分相比不太好被消化。
[0072] 用于降解Ν-连接的糖蛋白中的碳水化物的适合的酶的实例包括α-岩藻糖苷酶，例 如α-l，2-岩藻糖苷酶和α-l，3-1，4-岩藻糖苷酶，α-甘露糖苷酶，例如α-l，6-甘露糖苷酶、α-1，2-甘露糖苷酶和α-l，3_甘露糖苷酶、β-l，4_半乳糖苷酶、内-β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶F (endoF)、肽-Ν-(Ν-乙酰-β-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶F (PNG酶F)、PNG酶A、内-β-Ν-乙酰氨 基葡糖苷酶H(endoH)、endo D、endo C、a-N_乙酰氨基半乳糖苷酶、β-l，3_半乳糖苷酶、内_ Ν-酰基-神经氨酸酶(endoN)、α-2,3_神经氨酸酶、α-2,6_神经氨酸酶、α-2,8_神经氨酸酶、 β-Ν-乙酰氨基己糖苷酶、内-β-Ν-半乳糖苷酶、内-α-Ν-乙酰氨基半乳糖苷酶、内-α-l，6-D-甘露聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、β_半乳糖苷酶。
[0073]这些酶是本领域已知的，某些可以从商业来源获得。做为选择，减少免疫应激的酶 可以从产生酶的微生物，例如细菌、真菌和酵母获得。另外，酶可以使用本领域已知的重组 技术方法获得，例如，通过将宿主细胞遗传工程化来产生酶，例如引起编码酶的基因的转录 和翻译。以上所列许多酶的氨基酸序列是本领域已知的。使用这些序列或编码这些序列的 已知核苷酸序列，本领域技术人员可以设计用于酶的重组表达的适合的基因。另外地或作 为选择，编码已知的减少免疫应激的酶的核苷酸序列可以用于探测DNA库，从而鉴定编码减 少免疫应激的酶的其他核苷酸序列。如本领域已知的，这种DNA库可以来源于确定的生物体 或生物体的群体，或可以从天然来源获得，从而提供来自难以培养的微生物的DNA。
[0074] 在所述组合物包含酶的组合的实施方式中，所述酶可以分别地由独立的生物体产 生，或者两种或更多种酶可以由单一生物体产生。例如，单一生物体可以通过本领域已知的 方法被重组工程化来产生两种或更多的酶。
[0075] 如以上讨论的，动物的免疫系统识别病原微生物展示的许多不同的分子模式，包 括脂多糖(与例如革兰氏阴性细菌相关）、含有保守的蛋白，即鞭毛蛋白的细菌鞭毛、肽聚糖 (与例如革兰氏阳性细菌相关）、C型凝集素 L-纤维胶凝蛋白（Ficolin)结合的脂磷壁质（与 例如革兰氏阳性细菌相关）（Lynch，N.J.，et al ·，J. Immunology 172:1198-1202，2004)、酰 胆碱(与例如革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌相关）、DNA(例如具有CpG非甲基化基序的细菌 DNA，参见Van Uden and Raz，J Allergy Clin Immunol.l04(5):902-10，1999)、和双链RNA 和3pRNA(Hornung，et.al，Science 314:994-997，2006)。针对这些分子的免疫应答包括血 清APP的提高。
[0076]其他病原性分子模式包括含有N-乙酰葡糖胺的分子和含有N-乙酰甘露糖胺的分 子。所有胶原凝素的确切的结合特异性(结合甘露糖的凝集素是胶原凝素或C型凝集素））可 能是未知的，但是通过例如H-纤维胶凝蛋白、表面活性剂相关蛋白A(SP-A)和共凝集素观察 到了对许多不同的细菌性病原体的结合。化合物如N-乙酰葡糖胺和N-乙酰甘露糖胺可以抑 制结合，因而推测是模式识别结合特异性的部分(Haurum，J.S.，et al·，BiochemicalJ.293 (3):873-878，1993)。
[0077] 根据本发明可以被靶向进行酶降解的其他抗原和分子模式的实例包括细菌脂蛋 白（Hacker，H.et al · J.Exper.Med. 192(4) :595-600,2000);胶原凝素 Dectin-Ι结合的β-1，3_葡聚糖（Adachi，Y.，et al，Infection and Immunity 72(7):4159_4171，2004);鞭毛 蛋白（其结合 TLF5)(Honko，A.N.，and Mizel，S.B.，Immunol Res.33(l):83-101，2005);岩 藻糖基糖缀合物;α-Gal-神经酰胺;纤维蛋白原；硫酸肝素;硫酸化的gal-糖;脱乙酰壳多 糖、N-乙酰葡糖胺;脱唾液酸糖蛋白；和β-半乳糖苷。
[0078] 称为清除受体(SR)的受体种类在结构上与某些先天免疫应答受体相关，因而可以 产生免疫应激。相信的是，SR涉及凋亡或其它方式损伤的细胞的再循环和清除。巨噬细胞和 树突状细胞表达的清除受体(SR)也是先天免疫系统的受体。此外，某些SR识别病原体，某些 先天免疫受体显示了对于凋亡是重要的。因而，根据本发明的一个实施方式，SR的分子模式 结合目标是酶降解的目标。
[0079] 一种这样的SR分子模式结合目标是氧化的低密度脂蛋白（LDL)。称为L0X-1 (Peiser,L.,et al,Current Opinion in Immunologyl4：123-128,2002)nSR-PSOX/CXCL-16(Fukumoto，N.，et al ·，J. Immunol·173(3):1620-1627，2004)和CD36((Bruni，F.，et al， Clin.Appl.Thromb.Hemost. 119(4) :417-28,2005)的受体结合氧化的LDL，其可能在某些饲 料中、特别是含有动物副广品粗粉例如血粉的饲料中存在。
[0080]另一种SR分子模式结合目标是磷脂酰丝氨酸（PS)和溶血磷脂酰丝氨酸（lyso ?5)。卩5的51?包括51?-?5(^/^父(^-16和其他？5受体（5(*16861，1?.厶.311(1町11丨31118〇11，？.，〇611 Death Differ. 8(6): 545-548，2001)。磷脂酰丝氨酸磷脂的暴露可能引起炎症反应，磷脂酰 丝氨酸磷脂被认为以一定水平存在于大多数饲料中。
[0081]乙酰透明质酸在动物的细胞外液中是丰富的，但是也被先天免疫/清除系统机制 识别，例如在伤口愈合中。参见，例如，加11168〇11，6七31，】上1。1:.]\^(1;[(3；[116 210(8):1269-1279，2005。鸡冠是乙酰透明质酸的商业来源，一般用于透明质酸的纯化形式。因而，从肉类 加工的副产物制得的家禽粗粉可含有乙酰透明质酸，通常是丰富量的。降解乙酰透明质酸 和透明质酸的透明质酸酶(EC 3.2.1.35)，作为根据本发明的减少免疫应激的酶是有用的， 特别是在喂饲家禽粗粉的动物的环境中。例如，透明质酸酶在降低与喂饲家禽粗粉相关的 免疫应激方面是有用的。
[0082]降解任何这些分子模式的酶因而抑制或减少免疫应答，从而减少动物的免疫应 激。例如，已知DNA酶和非特异性核酶降解双链RNA和细菌DNA。特异于非哺乳动物DNA中的甲 基化CG基序的限制性内切酶是已知的。降解磷酸胆碱的酶包括磷酸胆碱水解酶、碱性磷酸 酶、酸性磷酸酶、磷酸胆碱酯酶和磷酸胆碱磷酸酶。
[0083]这种应激减少可以通过测量血清APP的水平来鉴定和监视，降低的血清APP浓度反 映了减少的免疫应激。
[0084] 如上所述，所述组合物包含有效降低动物中急性期蛋白的水平的量的减少免疫应 激的酶。这种量在动物和动物、酶和酶之间是不同的，但是可以由本领域技术人员容易地测 定，例如，如上所述通过测量APP水平。例如，可以在施用所述酶之前或之后测量动物的血清 APP水平，或者可以比较处理的动物和对照动物的血清APP水平。在施用酶之前和之后测量 血清APP水平来评定有效量的实施方式中，之后的测量可以在初次施用所述酶之后的至少 约一天到至少约几天或更久来进行。与所述酶的施用相关的血清APP浓度的降低表明施用 了有效量的酶。然而要理解的是，随着动物的适应性免疫应答起作用，APP水平一般会降低。
[0085] 根据某些实施方式，本发明提供了组合物，其包含有效降低所述动物中阳性急性 期蛋白的水平、提高所述动物中阴性急性期蛋白的水平、和/或改善动物生长表现的量的1， 3-β-葡聚糖酶。在一个特定的实施方式中，所述组合物是动物饲料，其包含至少约20IU的1， 3-β-葡聚糖酶/kg饲料，例如至少20IU/kg饲料、至少25IU/kg饲料、至少30IU/kg饲料、至少 35IU/kg饲料、至少40IU/kg饲料、至少45IU/kg饲料、至少50IU/kg饲料、或更多的1，3-β-葡 聚糖酶。在另一个特定的实施方式中，所述组合物是除动物饲料之外的液体组合物，其包含 至少约 155,000IU 1，3-β-葡聚糖酶/L，例如至少 155,000IU/L、至少 230,000IU/L、至少 300， 000IU/L、至少380,000IU/L或更多的1，3-β-葡聚糖酶。在另一个特定的实施方式中，所述组 合物是除动物饲料之外的固体组合物，其包含至少约300，000IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg，例如 至少 300，000IU/kg、至少450，000IU/kg、至少 600，000IU/kg、至少 750，000IU/kg、至少900， 000IU/kg或更多的1，3-β-葡聚糖酶。
[0086]在所述酶包含1，3-β_葡聚糖酶的某些动物饲料实施方式中，所述酶可以以每吨饲 料至少约ιοο,οοοιυ的量存在。
[0087]这些量远高于商业的饲料酶添加剂和商业上可获得的饲料的1，3-β-葡聚糖酶含 量，本发明人分析了这些饲料并发现提供了最多约10，000IU/吨饲料、约72，500IU/L非饲料 液体组合物、或约150，000IU/kg非饲料固体组合物。本发明人不认为10，000IU/吨饲料的1， 3-β-葡聚糖酶将能有效降低APP，并在实验上确认了这种观点。本发明人实验上确定了商品 例如Avizyme(Danisco A/S，Langebrogade 1，Dk_1001，Copenhagen，Denmark)和Rovobio (Adisseo France SAS，42，Avenue Aristide Briand，BP100,92164Antony Cedex，）和包含 标准量的β-1，3_1，4-葡聚糖酶（Brewzyme BG plus，Dyadic International， 140Intracoastal Pointe Drive，Suite 404，Jupiter，Florida 33477-5094)、木聚糖酶 (Multifect XL，Genencor International，Inc.，925Page Mill Road，PaloAlto，CA)、PI_ PLC(ChemGen Corp.，21 IPerry Parkway，Gaithersburg，MD)和淀粉酶（淀粉酶 FRED， Genencor International，Inc.，925Page Mill Road，Palo Alto，CA)的商品饲料不降低 APP。参见以下的实施例3和附图3。在存在1，3-β-葡聚糖酶活性的情况下，它处在以上指明 的低范围之内，并且对于降低AGP是无效的。
[0088] 在另一个实施方式中，作为组合物的成分提供了减少免疫应激的酶，所述组合物 也包含被所述酶降解的、含有抗原或分子模式的化合物。例如，本发明包括包含β-1，3_葡聚 糖和1，3-β-葡聚糖酶的动物饲料;包含DNA或双链DNA和DNA酶或非特异性核酸酶的动物饲 料;包含Ν-连接的糖蛋白和内-或外糖酶、Ν-聚糖酶、或PNG酶或任何以上阐述的其他酶的动 物饲料。其他适合的抗原和减少免疫应激的酶的组合对于本领域技术人员将是显而易见 的，并且被本发明涵盖。
[0089] 在这种实施方式中，预计的是血清ΑΡΡ水平将保持提高，只要施用了所述组合物。 因而，如果在施用所述酶之前或之后通过测量血清ΑΡΡ水平评定了减少免疫应激的酶的有 效量，随后的测量可以在初次施用所述酶的数天或数周后进行。
[0090 ]如上所述，本发明包括减少动物中免疫应激的方法，包括向所述动物施用组合物， 所述组合物包含有效减少所述动物中急性期蛋白的水平的量的减少免疫应激的酶。所述组 合物可以是如上所述的任何组合物，包括口服组合物，例如动物饲料，动物饲料之外的液体 组合物、或动物饲料之外的固体组合物。所述动物可以是任何动物，包括人类，可以是健康 动物或患有感染或其他疾病或状况的动物。
[0091 ]本发明还包括改善动物生长表现的方法，包括向所述动物施用包含减少免疫应激 的酶的组合物。在某些实施方式中，所述组合物包含有效改善动物生长表现的量的减少免 疫应激的酶。所述组合物可以是如上所述的任何组合物，包括口服组合物、动物饲料、动物 饲料之外的液体组合物、或动物饲料之外的固体组合物。所述动物可以是任何动物，包括人 类，可以是健康动物或患有感染或其他疾病或状况的动物。
[0092] 在一个实施方式中，所述酶被动物饲料中使用的植物表达。例如，玉米可以被遗传 工程化来表达减少免疫应激的酶，产生的遗传修饰的玉米产物可以用于饲料中。
[0093] 在一个实施方式中，所述动物被施用于所述减少免疫应激的酶，并且被施用于抗 原（例如，含有被所述酶降解的模式的分子）。所述酶和抗原可以作为同一或不同组合物的 部分被分开地或同时地施用。在一个实施方式中，所述动物被施用了包含抗原或含模式的 分子的饲料，并且被单独地施用包含所述减少免疫应激的酶的组合物。在另一个实施方式 中，所述动物被施用了包含抗原或含模式的分子的饲料，和包含所述酶的饲料补充剂。在另 一个实施方式中，所述动物被施用了包含所述抗原和所述酶的饲料。
[0094] 本发明的另一个方面提供了通过预防和治疗病原微生物引起的感染来减少免疫 应激的组合物和方法。有时，动物消耗了包含病原微生物(例如，细菌、病毒、真菌和原生动 物)的组合物，例如水或动物饲料，或以其它方式暴露于这些病原体。本发明提供了组合物， 其包含降解病原微生物的关键成分（即，〃致病成分〃）、有效减少感染并因而减少动物中响 应于感染而表达的ΑΡΡ水平的量的酶。所述组合物对于通过防止或最小化感染从而减少病 原体直接引起的免疫应激来减少免疫应激是有用的。在这个实施方式的一个特定的方面， 本发明提供了预防和治疗消化道感染的方法。
[0095] 通过降解病原体成分，酶也可以治疗或预防感染。也就是说，由于致病成分被降 解，病原体可能丧失它感染宿主的能力。实际感染的这种减少将通过与以上所述不同的机 制引起减少的免疫应激和血清APP的降低，但实际上就观察到的APP降低而言是不能辨别 的。至少存在着三种酶处理可以具有阳性结果的情况。如果被酶降解的病原体分子结构涉 及感染所需的第一步、病原体与宿主细胞的结合，或成功的感染所必需的任何其他关键步 骤，则酶处理可能有帮助。做为选择，宿主细胞上的结合结构可以被修饰。例如，许多细菌和 原生动物病原体已经显示了与真核宿主细胞表面的蛋白多糖、特别是硫酸化的蛋白多糖相 互作用（Flekenstein，J.M.et al，Infection and Immunity 70(3) :1530_1537,2002)。酶 例如肝素酶和N-乙酰葡糖胺-4-硫酸酯酶或芳基硫酸酯酶的应用可以降低相互作用和感 染。
[0096] 在第二种情况中，降解的病原体分子结构可以是破坏目标细胞的代谢功能的毒 素。在第三种情况中，酶降解的致病成分可以涉及病原体逃避宿主免疫应答的机制。很多免 疫应答逃避机制已经在病原体中进化，从模拟宿主细胞外观到抑制免疫应答，例如补体反 应或细胞凋亡。感染的减少或防止也可以通过测量血清APP来评定，更高的APP水平与感染 相关。
[0097]降解致病成分的酶，例如如上所述的那些，是本领域已知的。例如，来自噬菌体的 内皮唾液酸酶显示了通过降解细菌表面的PSA(聚唾液酸)荚膜防止大鼠的大肠杆菌K1全身 感染的致死性。虽然降解荚膜碳水化物对于大肠杆菌体外的存活力是无影响的，体内荚膜 的损失容许消灭致死性的宿主免疫系统对感染的识别和控制（Mush taq，N.，et al. Antimicrobial Agents and ChemoTherapy 48(5) :1503-1508 JOOdSA荚膜容许大 肠杆菌表面看起来像宿主细胞从而逃避宿主先天免疫应答。在本发明中有用的另一种已知 的酶是肝素酶I (Neutralase，Ibex Technologies，Canada)。许多酶可以从商业的来源获 得，或可以从产生酶的微生物，例如细菌、真菌包括酵母获得，或可以重组地产生，如以上讨 论的。
[0098]当编码酶的基因是已知的时候，期望的酶可以通过重组DNA技术产生。快速DNA测 序方法的进步已经产生了很大的蛋白质和它们的基因编码序列的公众数据库，例如NCBI Genbank。使用来自例如454Life Sciences(454Life Sciences，20Commercial Street， Branford，CT 06405)的快速测序技术，可以在四个小时内测序典型的细菌基因组。通过利 用可容易获得的计算机程序例如Blast、使用例如来自商业或公众数据库中描述的相同类 型或相似类型的酶的先前鉴定的编码序列来探测基因组，可以获得来自基因组的新的期望 的酶的先前未知的基因。本领域的技术人员可以鉴定基因组中具有与已知序列的阈值水平 的同源性和基因编码区的其他性质的DNA，然后利用例如聚合酶链式反应(PCR)技术来分离 和扩增所述基因。然后基因可以在宿主中表达，可以确认它的期望的蛋白质酶学性质。
[0099] 如果期望的酶活性不是先前已知的，则可以使用标准的微生物学富集技术选择在 底物上的生长来对其定位。利用底物作为唯一碳或氮源的微生物必需表达能够降解目标化 合物的酶。为了开发经济的生产，人们可以选择使用经典突变/选择或富集方法，采用生产 微生物，或通过本领域公知的重组DNA表达方法来改善酶的生产。
[0100] 包含降解病原微生物的减少免疫应激的酶的组合物可以是适合于向动物施用的 任何组合物，包括适合于向动物口服施用的组合物，如上所述。如上所述，组合物可以包含 有效降低动物中阳性急性期蛋白的水平(或提高阴性急性期蛋白的水平)和/或改善动物生 长表现的量的酶。这种量可以在动物和动物之间、酶和酶之间不同，但是可以由本领域技术 人员容易地测定，例如，如上所述和如本领域已知的通过测量APP水平和/或监视动物生长 表现。
[0101 ]在一个实施方式中，靶向致病抗原的所述减少免疫应激的酶作为动物饲料的成分 来提供。在这个实施方式的一个实例中，酶的量是至少约100,000IU/吨饲料。
[0102] 在另一个实施方式中，靶向致病抗原的减少免疫应激的酶作为也包含致病抗原的 组合物的成分来提供。例如，本发明包括动物饲料，其包含(Α)展示抗原例如脂多糖、肽聚 糖、脂磷壁质、磷酸胆碱、双链RNA和DNA的病原微生物，和(Β)降解抗原的酶。由于在生产地 点动物的稠密生长产生的不卫生条件的固有性质，病原生物可以找到途径进入饲料中。
[0103] 如上所述，本发明包括减少动物中免疫应激的方法和/或改善动物的生长表现的 方法，包括向所述动物施用包含减少免疫应激的酶的组合物。在一个实施方式中，所述动物 被施用降解致病抗原的减少免疫应激的酶，并且还被施用所述致病抗原。所述酶和抗原可 以作为同一或不同组合物的部分被分开地或同时地施用。在一个实施方式中，所述动物被 施用包含抗原饲料，并且被分开地施用包含所述酶的组合物。在另一个实施方式中，所述动 物被施用包含所述抗原的饲料和包含所述酶的饲料补充剂。在另一个实施方式中，所述动 物被施用了包含所述抗原和所述酶的饲料。
[0104] 以下实施例进一步说明本发明，但本发明不局限于这些特别例证的实施方式。 实施例1
[0105] 制备包含半纤维素酶（内-1，4_β-甘露聚糖酶）的动物饲料，并施用给鸡，测量AGP 水平，如以下的更详细描述。
[0106] 总共4000只一日龄雄性Cobb X Cobb小鸡随机分配到8个实验处理中，每种处理重 复10次： 实验设计： 8种处理 围栏的总数： 80 处理的总数： 8 每个围栏的禽类数： 50 每种处理的围栏数： 10 每种处理的禽类数： 500
[0107] 八种处理的两种包含根据本发明的减少应激的酶:处理3(在基础饮食中以大约 100MU/吨施加的、迟缓芽孢杆菌发酵物的蒸发的完整细胞培养液形式的甘露聚糖酶），和处 理6(在基础饮食中以大约30MU/吨施加的、迟缓芽孢杆菌发酵培养液的无细胞的离心上清 液形式的甘露聚糖酶）。处理8是没有添加酶的对照。（1MU = 4000IU)
[0108] 基础的粗粉饲料批次平均分配到八个部分中，每一份用合适量的测试材料喷雾。 初始饲料(Starter feeds)和生长期饲料(Grower feeds)含有90g/吨Cobon( -种离子载体 型的抗球虫药物)加50g/吨BMD(抗生素）。终末期饲料(Finisher feed)是非药物的。
[0109]初始期饮食（Starter Diets)向1日龄直到21日龄的所有禽类提供，生长期饮食 (Grower diets)从22-25天，终末期饮食(Finisher Diets)从36-42天。饮食和水不限量地 提供。饮食在所有喂饲期期间作为碎粒/颗粒来向禽类提供。自来水用作饮用水，通过内部 水系统网络提供。 基础实验饮食的组合和分析
[0110] 从处理3、6和8中的每十个围栏随机选择两只禽类用于在称重之后42天末进行血 液分析，这是针对每种处理500只中的总共20只禽类。在含有抗凝剂肝素的血液采集管中的 冰上收集样品，通过离心获得血浆。
[0111] 使用来自Cardiotech Services，Inc· (Louisville，KY)的基于免疫扩散的分析试 剂盒分析血浆样品的鸡α-1-酸性糖蛋白。采自两只禽类/围栏的血清样品添加到测试平板 (每孔5μ1)中，向某些孔中添加浓度范围最高达1000ng/mL的标准纯AGP。使用沉淀素环测量 计来测量沉淀素环，直到〇. 1mm的最近直径。
[0112] 多项式方程被用于提高与数据的最佳曲线拟合，来容许血浆样品中AGP浓度的快 速计算，如附图1所示。
[0113] 对所有回收的鸡血清样品的沉淀素环直径的测量值和为每只禽类计算的AGP浓度 在以下的表格中显示。相比对照禽类，喂饲甘露聚糖酶的禽类平均地具有在平均AGP浓度方 面统计学上非常显著的降低。 42天血液样品(y=AGPyg/ML; X =按mm的环测量值）
实施例2
[0114] 进行了利用半纤维素酶（内-1，4_β-甘露聚糖酶)的另一个实验。在这个实验中，鸡 的组(每组10个围栏，每围栏50只禽类)喂饲四种饮食之一：
[0115] 处理1(对照）：包含颗粒化后喷雾的BMD抗生素和对照制剂、以及35%山梨醇和褐 色食用染料的饲料，以l〇〇ml/吨饲料施加。
[0116] 处理2(对照）：不含颗粒化后喷雾的BMD的饲料，含有对照制剂、包含35%山梨醇和 褐色食用染料的饲料，以200ml/吨饲料施加。
[0117]处理3:用包含来自迟缓芽孢杆菌的半纤维素酶（内-1，4_β-甘露聚糖酶)的制剂进 行颗粒化后喷雾的饲料，以l〇〇ml/吨饲料施加。
[0118] 处理4:用包含来自迟缓芽孢杆菌的半纤维素酶（内-1，4_β甘露聚糖酶）的粉未组 合物(在颗粒化之前添加到混合器中）配制的饲料，添加454g组合物/吨饲料，来提供100MU/ 吨饲料。（1MU = 4000IU)
[0119] 在实验开始时鸡是1日龄。
[0120] 饮食不限量地提供。具有以下组合物的初始期(0-21天）、生长期(21-35天)和终末 期(35-42天)饲料被用作基础饲料：
[0121] 在第21天，从每个围栏3只禽类采集大约3ml血液(每组30只）。血液置入肝素化的 试管中并轻轻地混合。试管慢慢地离心，然后取出血清。血清样品置于具有帽的试管中，用 围栏编号标记。血清被冷冻用于随后的AGP分析，如以上的实施例1描述的。用于测定鸡的α-1-酸性糖蛋白的免疫扩散环被容易地测量，是高度重现性的，展现了4%或更低的变异系 数。
[0122] 每种处理的30只禽类的21天平均结果在以下的表格中显示，并且在附图2中图形 地显示。可以看出，使饮食中不含抗生素(BMD)，产生了血浆AGP水平的大的和显著的提高 (比较处理1和处理2)。添加任一半纤维素酶（内-1，4-β-甘露聚糖酶）制剂到无 BMD饮食(处 理3和4)中恢复AGP到使用抗生素所见的水平，表明免疫应激的显著减少。
[0123] 还评定了鸡的生长表现，结果在以下的表格中概述。 生长表现
中〇?=饲料转化 2Wt.Adj .FCR =重量调整的饲料转化 3ID的CV =个体重量的变异系数
[0124] 因而，饲料转化和重量调整的饲料转化在接受β-甘露聚糖酶的鸡中在21天时统计 显著性地改善了。这表明，血清AGP方面的降低可以翻译为动物生长的实际显著性。 实施例3
[0125] 在对AGP的可能的影响方面，评定了通常用于动物饲料中的其他酶的能力。商业类 型的鸡初始期配给量(低代谢能）与美国通常使用的饲料混合。这些配给量(捣碎或碎粒形 式）不限量地喂饲，从小鸡直到研究的第21天。从这些基础初始期饲料制备实验的处理饲 料。混合处理饲料来确保各个测试目标的均匀分布。 基础实验饮食的组成和分析
向所有饲料添加 BMD 50g/t和盐霉素60g/t。 酶制剂
ChemGen MU = 4000IU;AXC-Adisseo定义的木聚糖酶单位； AGL-Adisseo定义的葡聚糖酶单位;*-通过还原糖分析由ChemGen Corp.测量的近似的 水平
[0126] 在整个试验中饲料和水可不限量地获得。在第15天，在处理17、18、19、20和21中的 禽类口服接种含有大约每只禽类30,000个堆型艾美球虫卵囊、每只禽类2,500个百型艾美 球虫卵囊、和每只禽类25,000个禽艾美球虫卵囊的混合的接种物。球虫卵囊接种操作在SPR SOP: INI.002 中描述。
[0127] 测定了笼重量增加、饲料消耗和饲料转化的平均值。结果在以下列出。仅接受样品 17的动物受到感染。
[0128] 我们发现，包含标准量的淀粉酶、1，3-葡聚糖酶、1，4-葡聚糖酶、木聚糖酶和PI-PLC的商品饲料不降低AGP水平。实际上，仅半纤维素酶（内-1，4-β-甘露聚糖酶）显示了对 AGP水平的显著影响。另外，比较处理1和17清楚地显示，在鸡中AGP是高度响应性的ΑΡΡ，因 为感染使AGP水平提高了 82μg/ml。还参见附图3。 实施例4
[0129] 包含1，3-β_葡聚糖的测试动物饲料被配制来包括浓度为每吨饲料400,000IU (lOOChemGen MU)的1，3-β-葡聚糖酶。将测试动物饲料施用给测试鸡，而对照鸡接受不含1， 3-β-葡聚糖酶的相同的动物饲料(包含1，3-β-葡聚糖）。在这种方案的21天和42天后，如上 所述评定血清AGP水平。与对照动物相比，接受酶配制的动物饲料的鸡具有显著更低水平的 AGP。与对照鸡相比，测试鸡也展现了更高的饲料效率和改善的重量增加。 实施例5
[0130] 包含细菌dna的来源的测试动物饲料(例如，含有细胞产物的Biolys?赖氨酸或其 他发酵产品）被配制来包括来自于Cyanobacterium Anabaena sp. 7120(NucA)的非特异性 核酸酶，这是一种已知最具活性的非特异性核酸酶(Meiss，G. et al，Eur. J.Biochem. 251 (3) :924-934,1998)。所述酶以1 X 107Kunitz单位酶/kg饲料或每公斤饲料大约lmg(纯的基 础上)的浓度添加。测试动物饲料被施用给测试鸡，而对照鸡接受没有非特异性核酸酶的相 同的动物饲料(包含细菌DNA)。在这种方案的21天或42天后，如上所述评定血清AGP水平。与 对照动物相比，接受酶配制的动物饲料的鸡具有显著地更低的AGP水平。 实施例6
[0131] 配制包含肉和骨粉、血粉或其他动物来源的副产物的测试动物饲料来包括400， 000IU/吨饲料的浓度的磷脂酰丝氨酸脱羧酶。测试动物饲料被施用给测试鸡，而对照鸡接 受不含磷脂酰丝氨酸脱羧酶的相同的动物饲料。在这种方案的21天或42天后，如上所述评 定血清AGP水平。与对照动物相比，接受酶配制的动物饲料的鸡具有显著地更低的AGP水平。 实施例7
[0132]配制测试动物饲料大豆粉或其他植物来源的粗粉来包括α-甘露聚糖酶和/或来自 迟缓芽孢杆菌的1，3-β-葡聚糖酶，各自浓度为400，000IU/吨饲料。测试动物饲料被施用给 测试鸡，而对照鸡接受不含α-甘露聚糖酶或1，3-β_葡聚糖酶的相同的动物饲料。在这种方 案的21天或42天后，如上所述评定血清AGP水平。与对照动物相比，接受酶配制的动物饲料 的鸡具有显著地更低的AGP水平。 实施例8
[0133]在这个实施例中，添加到饲料(常规的玉米-大豆饮食)的Hemicell?甘露聚糖酶 显示了降低火鸡血清中的α-I-酸性糖蛋白（AGP)，而也改善了存活生长表现。实验包括48个 围栏的各11只tom火鸡(初始位置）。以8个区块重复六种处理，每个处理在六个围栏的区块 内随机化。 禽类数/处理 88 重复数/处理 S 总处理 6 总围栏数 48 总禽类数 528
[0134] 分析了包含根据本发明的减少应激的酶的一种处理，即处理1(具有100MU/吨饲料 的商业的HemiceU⑧）的agpJimi^^ooiu)处理2是没有添加酶的对照饲料。
[0135] 混合饲料以确保在处理之中基础饲料的均匀分布。混合所有的酶(喷雾)来确保测 试酶的均匀分布，并确保处理之间相似的饲料条件。每次制造处理饲料时，混合来自每个处 理饲料的起初、中间和末期的样品来形成复合样品。对于每个处理从所述复合样品取一个 样品，用于酶水平验证。
[0136] 在该项研究中喂饲处理1和2的火鸡饮食在以下的表格中详细描述。表格显示了成 分组成，计算的营养物水平和最后用返回的饲料测量的营养物的值。所述饮食是商业的火 鸡生长操作中使用的那些代表性的饮食，因而所述饮食在20周时间中被调整几次。在6、9、 12、15和18周改变饮食组成。
[0137] 对于处理1和2,在每个时期的饮食组成稍有不同。公知的是，Hemiceli?甘露聚 糖酶具有提高饲料的有效能量含量的效果(参见美国专利6,162，473)。为此，处理1的饮食 被配制为具有比处理2的饮食较少的卡路里，为了这项研究的目的，来最小化处理1和2之间 的生长差异。 成分组成和计算的营养物水平，0-9周
糖蛋白测量：
[0138] 在试验末从处理1、2和5随机选择的每个围栏四只禽类获得血液。将血液收集到含 有EDTA抗凝血剂的试管中，混合，然后离心来沉淀完整细胞。
[0139] 火鸡 AGP 测试平板从 Cardiotech Services (Louisville，KY)获得。AGP 测试是基于 免疫扩散的测试。根据厂家的建议，将等体积的测试样品或血清样品添加到免疫扩散平板 孔中，在室温下孵育两天后，测试产生的免疫沉淀环的直径。
[0140]用试剂盒中提供的纯化的火鸡AGP标准物的样品在几个浓度下测试来产生如附图 4所示的标准曲线。从标准物发展出的多项式曲线拟合方程式被用于计算测试样品中火鸡 血浆AGP水平。 AGP水平的计算和斯氏T检验的统计分析
偏离值 >平均值的2倍标准差，被除去
[0141] 酶处理组的平均血浆AGP显著地低于未处理的对照。对于这项分析，从每个组的分 析中除去了一个偏离值。这些可能是由于禽类由于损伤或感染经历了异乎寻常量的应激。 由酶喂饲引起的降低的AGP与统计学上显著改善的活禽类表现相关，如以下在处理1(甘露 聚糖酶)对比处理2中所显示的。 140天生长结果
[0142] 接受具有甘露聚糖酶的饲料的禽类具有更高的平均体重增加，增加3.7%，饲料转 化减少2.3%，和体重均匀性的CV(变异系数=标准差/平均值)减少。通过降低AGP血清水平 所指示的免疫应激的减少与几个生长改善的测量值相关。 实施例9
[0143] 在这个实施例中，来自迟缓芽孢杆菌的1，4-β_甘露聚糖酶、来自迟缓芽孢杆菌的 1，3-β-葡聚糖酶、以及两种酶的组合被添加到饲料中（常规的玉米-大豆饮食）。在6周龄 Nicholas 700雌性火鸡中每种酶处理改善了活生长表现，通过组合实现的结果出人意料地 大于仅使用一种酶的处理实现的结果。
[0144] 实验使用了80个围栏，各40只雌性火鸡。处理在十个（10)区块中重复，八种处理 (七种酶处理和一种阴性对照)在每个区块中随机化。
[0145] 处理3使用了包含根据本发明的减少免疫应激的酶，即1，4-β_甘露聚糖酶100MU/ 吨饲料的组合物。处理6也使用了包含根据本发明的减少免疫应激的酶，即1，3-β-葡聚糖酶 60MU/吨饲料的组合物。处理8使用了包含根据本发明的组合组合物，其中包含100MU/吨饲 料的1，4-β-甘露聚糖酶和60MU/吨饲料的1，3-β-葡聚糖酶。处理1是没有添加酶的对照饲 料。（1MU = 4000IU)
[0146] 混合饲料以确保在处理之间基础饲料的均匀分布。混合所有的酶(喷雾)来确保测 试酶的均匀分布，并确保处理之间相似的饲料条件。每次制造处理饲料时，混合来自每个处 理饲料的起初、中间和末期的样品来形成复合样品。对于每个处理从所述复合样品取一个 样品，用于酶水平验证。
[0147] 这项研究中的火鸡饮食饲料是典型商业火鸡饲料。所述饮食是商业的火鸡生长操 作中使用的那些的代表性的，因而所述饮食在3周后被调整。处理1、3、6和8的生长结果在以 下表格中不出。
(1MU = 4000IU)
[0148] 注释1:饲料转化是死亡率校正的。
[0149] 注释2:每个处理的重量调整的饲料转化如下计算：（a)处理的平均活重量减去整 个测试的平均活重量，得到量A; (b)量A除以6，得到量B; (C)从饲料转化减去量B，得到该处 理的重量调整的饲料转化。显示的统计值是LSD检验的值得;P<0.05。
[0150] 与处理1(对照)相比，接受处理3(具有1，4-β_甘露聚糖酶的饲料)的母火鸡具有数 字上改善的平均活重量和数字上改善的（降低的）饲料转化。类似地，接受处理6 (具有3-β-葡聚糖酶的饲料）的母火鸡具有统计学上显著改善的平均活重量和统计学上显著改善的 (降低的)饲料转化。
[0151] 令人惊讶地，接受处理8(具有1，4-β_甘露聚糖酶和1，3-β_葡聚糖酶的组合的饲 料)的母火鸡具有不寻常大的统计学上显著改善的平均活重量和不寻常大的统计学上显著 改善的（降低的）饲料转化。使用处理8观察到的结果大于分别施用两种酶的叠加效应所能 够解释的。因而，包含1，4-β-甘露聚糖酶和1，3-β-葡聚糖酶的组合处理产生了生长表现方 面出乎意料大的改善。 实施例10
[0152]在这个实施例中，来自迟缓芽孢杆菌的1，4-β_甘露聚糖酶、来自迟缓芽孢杆菌的 木葡聚糖酶、以及两种酶的组合被添加到饲料中（常规的玉米-大豆饮食）。在35日龄雄性肉 仔鸡中每种酶处理改善了活生长表现，通过组合实现的结果大于仅使用一种酶的处理实现 的结果。
[0153] 该实验使用了49个围栏，各44只Cobb X Cobb雄性鸡。处理在七个区块中重复，七 种处理(六种酶处理和一种阴性对照)在每个区块中随机化。
[0154] 处理4使用了包含根据本发明的减少免疫应激的酶，即1，3-β_葡聚糖酶70MU/吨饲 料的组合物。处理5也使用了包含根据本发明的减少免疫应激的酶，即木葡聚糖酶100MU/吨 饲料的组合物。处理6使用了包含根据本发明的组合组合物，其中包含100MU/吨饲料的木葡 聚糖酶和6 0 M U /吨饲料的1，3 - β -葡聚糖酶。处理1是没有添加酶的对照饲料。（1M U = 4000IU)。
[0155] 混合饲料以确保在处理之间基础饲料的均匀分布。混合所有的酶(喷雾)来确保测 试酶的均匀分布，并确保处理之间相似的饲料条件。每次制造处理饲料时，混合来自每个处 理饲料的起初、中间和末期的样品来形成复合样品。对于每个处理从所述复合样品取一个 样品，用于酶水平验证。
[0156] 这项研究中的饮食饲料是典型的肉仔鸡饲料。所述饮食是商业的肉仔鸡生长操作 中使用的那些的代表性的，因而所述饮食在3周后被调整。处理1、4、5和6在生长35天后的生 长结果在以下的表格中显示：
[0157] 注射1:饲料转化是死亡率矫正的。
[0158] 注释2:每个处理的重量调整的饲料转化如上所述地计算。显示的统计值是LSD检 验的统计值;P<〇.〇5。
[0159] 与处理1(对照)相比，接受处理4(1，3-β_葡聚糖酶)的鸡具有数字上改善的平均活 重量和数字上改善的（降低的)饲料转化。类似地，接受处理5(具有木葡聚糖酶的饲料)的鸡 具有数字上改善的平均活重量和数字上改善的（降低的)饲料转化。
[0160]接受处理6(1，3-β_葡聚糖酶和木葡聚糖酶的组合）的鸡实现了它们的平均活重量 和饲料转化上的改善，其大于当分别施加所述酶时所观察到的效果。因而，包含1，3-β-甘露 聚糖酶和木葡聚糖酶的组合实现了生长表现方面显著的改善。 实施例11
[0161 ]通过在饲料中应用酶的导致兔疫血清ΑΡΡ的降低
[0162]肉仔鸡从1到14天生长，并喂饲添加了各种酶(如以下的酶表格中概述的）典型的 玉米-大豆初始期饮食(如以下的饮食组成表格所示的）。每种酶类型的样品大小包括每笼 八只禽类的三个笼子。
[0163] 处理J中的"酯酶"是来自迟缓芽孢杆菌基因的、与木聚糖酶相同操纵子内的未表 征的酶。这个酶的底物尚未被鉴定。它指定为"酯酶"是基于这个基因与其他已知的酯酶基 因的DNA序列的相似性。没有测定酯酶活性，但是如果两种蛋白质具有相似的比活性，将类 似于木聚糖酶的水平。
[0164] 1，4-β_半乳聚糖酶和1，3_半乳聚糖酶利用果胶底物使用还原糖分析来测量。
[0165] 在第14天，从所有禽类收集血清，如上所述分析样品的α-1-酸性糖蛋白（AGP)含 量。每个处理组的α-1-酸性糖蛋白的平均水平在上表中显示。
[0166] 如在表格中反映的，相对于处理Α(没有酶），处理Η、I和J引起了血清AGP的降低。
[0167] 处理Η(几丁质酶加1，4-β_甘露聚糖酶)在仅两周的生长之后产生了显著的结果。 虽然酶的量处于在其他的处理中不显示反应的水平（与具有可比较量的几丁质酶的处理G 和具有可比较量的1，4-β-甘露聚糖酶的处理Ε和F相比），几丁质酶和1，4-β-甘露聚糖酶的 组合引起了显著的AGP降低，这不能从当仅使用一种酶时获得的结果来预测。
[0168] 处理1(1，3-β_葡聚糖酶和1，4-β_甘露聚糖酶)产生了显著的结果，虽然在这个实 验中不是清楚地统计学上显著的（0.125的Ρ值）。在更长持续时间的其他测试中，用1，3-β-葡聚糖酶和1，4-β-甘露聚糖酶处理确实对AGP水平具有显著的影响。
[0169] 比较处理J (木聚糖酶、1，4-β-甘露聚糖酶、酯酶;与处理A对照的P = 0.083)和处理 F(木聚糖酶+1，4-β-甘露聚糖酶，没有"酯酶"）揭示了，处理J产生了显著的效果，其中处理F 不显示AGP降低。 实施例12
[0170] 这个实施例测试了以下假设，即，改变饲料组合物来包括刺激先天免疫系统的成 分将提高血清APP水平。
[0171] 使用基础的玉米-大豆饮食进行21天的肉仔鸡测试，大豆油高能饮食作为对照。为 了获得测试饮食，修改对照饮食来含有怀疑具有免疫刺激成分的实际材料，而保持相同的 近似相当的营养价值。测试饮食包括以下改变： 玉米/大豆/大豆油对照 包含AV共混油(动物植物共混油）； 包含大豆卵磷脂； 包含家禽粗粉； 包含5%的DDGS(酒糟和来自乙醇生产的可溶的副产物），具有大豆种皮； 包含15%的DDGS，有或无大豆种皮。
[0172] 饮食在以下的表格中更详细地描述。
[0173] AV共混物和大豆卵磷脂预计含有磷脂，所述磷脂包含先天免疫系统刺激物磷脂酰 丝氨酸。家禽粗粉可能含有磷脂酰丝氨酸、乙酰透明质酸和来自于废料和加工前可能发生 的二级微生物生长的各种的微生物刺激物。DDGS预计含有丰富的酵母残余物，包括包含α-甘露聚糖、1，3-β_葡聚糖和几丁质的细胞壁，以及来自原始发酵底物的潜在刺激性的非发 酵碳水化物聚合物。 饮食组成
a家禽BPM(副产品粗粉）；bDDGS(干酒糟和可溶物）； °AV共混物（动物植物共混油）；d添加大豆种皮到家禽粗粉饮食中使甘露聚糖含量相 同，从而补偿减少的大豆粗粉。
[0174] 对于每种饮食，肉仔鸡(Cobb X Cobb)在三个Petersime电池笼中生长，每个笼子 八只禽类(每只禽类0.631平方英尺）。在21天之后，如先前的实施例中描述的分析每只禽类 的血清AGP水平。
[0175] 如以下表格显示的，根据在21天时血清AGP的显著提高，修改的饮食显示了先天免 疫系统刺激的清楚的证据。数据还强调了减少由根据本发明的饮食成分引起的免疫应激的 可能性，例如，通过使用包含减少由成分诱导的免疫应激的酶的组合物。
实施例13
[0176] 这个实施例证明了包含1，3-β_葡聚糖酶的组合物在减少与1，3-β_葡聚糖酶相关 的免疫应激方面的效力，1，3-β_葡聚糖酶存在于饲料中，凭借它与真菌细胞壁的相关性，是 动物的先天免疫系统普遍地明显识别的分子模式。如1，4-β_甘露聚糖酶一样，结果显示了， 1，3-β-葡聚糖酶降低ΑΡΡ的血清水平并改善动物生长表现。
[0177] 肉仔鸡(Cobb X Cobb)以下表显示的典型低脂肪玉米/大豆粗粉饮食中从第1天生 长到第21天。在两种情况中，通过均匀地喷雾从迟缓芽孢杆菌发酵物制备的液体酶浓缩溶 液来施用400,000IU/吨1，4-β-甘露聚糖酶或264,000IU/吨1，3-β-葡聚糖酶来补充饮食(在 这种情况下，一吨代表20001bs.或907.4kg.)。 饮食组成
[0178] 对于每种饮食类型，禽类在三个Petersime电池笼中生长，每个笼子八只禽类(每 只禽类0.631平方英尺）。在21天之后，如先前的实施例中描述的分析每只禽类的血清AGP水 平。利用标准方法测定禽类体重和饲料消耗，计算饲料转化。结果在以下表格中示出。
[0179] WAFC(重量调整的饲料转化)如下计算： WAFC = FC-2.204*((ff-ffa)/3) 其中 FC =消耗的饲料重量/重量增加 Wa =试验中所有禽类的平均重量 W=每个笼子的平均活重量增加
[0180] 1，4-β_甘露聚糖酶和1，3-β_葡聚糖酶都降低α-1-酸性糖蛋白（AGP)的血清水平。 两种酶处理都降低了重量调整的饲料转化，1，3-β-葡聚糖酶饲料组中的降低是统计学上显 著的。 实施例14
[0181 ]使用以上实施例13中描述的饲料和方法在Petersine电池笼中进行肉仔鸡试验， 只是使用不同的酶处理，如以下的表格中概述的。
[0182] 溶细胞酶，即通过藤黄节杆菌的发酵获得的粗1，3-β-葡聚糖酶产物获自Sigma Chemical Company，St .Louis Mo。通过以下描述的还原糖方法测定溶细胞酶活性，并且施 用60MU/吨（相当于240，000IU/吨）。根据制造商的说明，这种产物还含有其他活性，包括几 丁质酶活性，其没有被测量。
(1MU = 4000IU)
[0183] 提高的1，3-β-葡聚糖酶水平引起了对AGP水平的提高的影响（例如，剂量反应)直 到约30MU/吨（120，000IU/吨）。提供具有约30MU/吨（120，000IU/吨）的1，3-β-葡聚糖酶的这 种类型的动物饲料预计减少免疫应激，如血清AGP的降低的水平和/或改善动物生长表现所 反映的。
[0184] 结果还显示了，木葡聚糖酶在降低血清AGP水平方面是有效的。木葡聚糖酶(EC 3.2.1.151)是具有对木葡聚糖的特异性的1，4-β-葡聚糖酶，木葡聚糖是在植物中的结构聚 合物。
[0185] 除了溶细胞酶之外，这个实施例中使用的所有的酶都由迟缓芽孢杆菌产生。溶细 胞酶是由藤黄节杆菌产生的，藤黄节杆菌被重新分类为纤维化纤维菌 (Cellulosimicrobium cellulans)。藤黄节杆菌的发酵已经显示了产生多种形式的1，3-β-葡聚糖酶。参见，例如，（Ferrer，P.Microb Cell Factories 5:10,2006,2006年 3 月 17 日在 线发表。doi : 10.1186/1475-2859-5-10)。以上的结果显示了，溶细胞酶至少与迟缓芽孢杆 菌1，3-β-葡聚糖酶制品一样好地降低鸡兔疫血清AGP，表明酶的来源不是重要的。也就是 说，来自任何来源的酶可以根据本发明使用。还可能的是几丁质酶(Sigma报导存在于溶细 胞酶中）可以改善溶细胞酶处理的性能。 实施例15
[0186] 以下分析可以用于评定酶活性 (I)木葡聚糖酶
[0187] 木葡聚糖酶活性可以使用以下方案来分析：
[0188] DNS试剂:每天制备10g/L Na0H、2g/L苯酚、10g/L二硝基水杨酸、1200g/L酒石酸钠 钾四水合物。在即将使用之前，添加〇. 5g/L无水亚硫酸钠。
[0189] 标准溶液和标准曲线:制备浓度范围0.1到0.5g/升的溶于水中的一系列D_( + )_甘 露糖标准溶液。〇 . 6mL每种甘露糖标准（一式两份或三份）添加到13 X 100mm玻璃管中的 1.5mL DNS工作溶液中。具有0.6mL等分量的水的样品可以用作试剂空白来调零分光光度 计。溶液在沸水浴中加热5分钟，冷却到环境温度，在550η读取吸光度。预期结果是在0.20和 1.20. D.单位之间的线性剂量反应。仅从曲线的直线段计算标准曲线的斜率(0. D 550/g/L 甘露糖）。根据这个斜率，还原糖的g/L的值在酶反应中测定。
[0190] 木葡聚糖底物:木葡聚糖(Tamarind)从Megazyme International Ireland Ltd., 8瓜7，(：〇.，1^1&11(1获得，以58/1溶解在?!1值7.5、具有0.05%葡萄糖的5011^1^8缓冲液中。
[0191] 反应条件:0.25mL的5g/L木葡聚糖底物与50mM Tris缓冲液中的0.05mL酶稀释物 一起使用，反应混合物在40°C孵育。添加0.75mL DNS试剂来停止反应，停止的反应混合物在 沸水浴中加热五分钟，然后在550nm读取吸光度之前冷却。酶溶液的零时间点被用于测定背 景水平。
[0192]计算:ChemGen木葡聚糖酶MU被定义为每分钟产生0.72克还原糖的能力(使用纯的 甘露糖，还原糖作为标准）。一个ChemGen MU相当于4000IU。换句话说，一个CG U相当于 250IU(IU=1.0毫摩尔/分钟）。 (ΙΙ)β-1，3-葡聚糖酶
[0193] β-l，3-葡聚糖酶活性可以使用以下方案分析：
[0194] 这种分析使用与以上对木葡聚糖酶分析描述的相同的DNS试剂、标准溶液、标准曲 线和酶单位计算以及稀释量。使用的缓冲液是pH 6.5的50mM M0PS(4-吗啉丙磺酸，FW = 209.26)缓冲液。
[0195] CM茯苓聚糖底物:羧甲基茯苓聚糖(CM茯苓聚糖，CMP)从Megazyme International Ireland Ltd.，Bray，Co.，Ireland获得。通过在大约90°C慢慢地添加 CMP到快速搅动的50mM MOPS缓冲溶液(pH 6.5)中来制备5g/L的CMP底物。酶粉未是良好分散的，容器紧密地盖好或 密封，而悬浮液缓慢加热来煮沸，在加热的搅动板上搅动慢煮30分钟，来获得良好水合凝 胶，在溶液中没有可见的非水合凝胶的小块。溶液冷却到室温，不使用时保存在4°C，在贮存 后的使用之前良好地混合。
[0196] 反应条件：0.25mL的5g/L CM茯苓聚糖底物与MOPS缓冲液中的0.05mL酶稀释物一 起使用，反应混合物在40°C孵育各种时间，最多至45分钟。添加0.75mL DNS试剂来停止反 应。停止的反应混合物在沸水浴中加热五分钟，然后冷却到环境温度，之后在550nm读取吸 光度。酶溶液的零时间点被用于测定背景水平。 (III)几丁质酶
[0197] 几丁质酶活性可以使用Thompson et al ·，Appl .Environ.Microbiol .67:4001- 008(2001)中描述的荧光几丁质底物4-甲基伞形酮-基0-〇4小^〃，^-四乙酰几丁四糖 苷。底物以2.5mM溶解在DMSO中。
[0198] 在示范性的分析中，20μ1 几丁质底物(2.5mM)与 150μ1 tris(20.0mM，pH 7.5)-起 使用。底物混合物置于黑色98孔微量滴定板中，预先加热到37Γ10分钟。通过添加30μ1稀释 的酶来启动多份反应，孵育在37°C继续。在2、4、6、8和10分钟用50μ1 3Μ Na2Ca03停止各个反 应。在微量滴定板读数器(Fluoroscan II)中使用激发355nm带滤光片和发射460nm带滤光 片波长来读取荧光。酶进行稀释，从而以对于反应来说和在标准曲线的范围内的线性速率 产生4-甲基伞形酮，所述标准曲线在相同于酶分析但不存在酶和底物的条件下产生。每分 钟一微摩尔4-甲基伞形酮的释放被定义为一个IU。在200μ1反应缓冲溶液中的零和1 X 10-4 微摩尔4-甲基伞形酮之间的几个浓度下产生标准曲线，随后添加50μ1 3Μ Na2Ca03。
[0199] 虽然为了本领域的技术人员进行和使用本发明而足够详细地描述和举例说明了 本发明，但各种选择、修改和改进应当是显而易见的，而不背离本发明的精神和范围。在此 提供的实施例是优选的实施方式的代表，是示范性的，而不意图限制本发明的范围。其中的 修改和其他用途将是本领域技术人员能想到的。这些修改被包括在本发明的精神之内，通 过权利要求的范围来定义。
[0200] 对于本领域的技术人员显而易见的是，可以对在此公开的方面进行各种替换和修 改而不背离本发明的范围和精神。
[0201] 说明书中提及的所有专利和公开物是本发明所属领域的普通技术人员的水平的 代表。所有专利和公开物在此通过引用来合并，其程度与特定的或单独的指示通过引用来 合并每个单独的出版物或专利申请相同。
【主权项】
1. 适合于向动物口服施用的组合物用于降低所述动物中阳性急性期蛋白的水平、提高 所述动物中阴性急性期蛋白的水平、或其组合的用途，其中所述组合物选自： (i) 包含1，4-β-甘露聚糖酶和1，3-β-葡聚糖酶的组合物； (ii) 包含1，4-β-甘露聚糖酶和几丁质酶的组合物； (i i i)包含1，4-β-甘露聚糖酶、木聚糖酶和酯酶的组合物;和 (iv)包含1，3-β-葡聚糖酶和木葡聚糖酶的组合物。2. 权利要求1的用途，其中所述组合物选自： (i) 包含1，4-β-甘露聚糖酶和至少20IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg饲料的动物饲料； (ii) 包含1，4-β-甘露聚糖酶和至少155,000 IU 1，3-β-葡聚糖酶/L的除了动物饲料 之外的液体组合物;和 (1^)包含1，4-0-甘露聚糖酶和至少3〇〇,〇〇〇11]1，3-0-葡聚糖酶/1^的除了动物饲 料之外的固体组合物。3. 权利要求1的用途，其中所述组合物选自： (i)包含1，4-β-甘露聚糖酶和至少30 IU 1，3-β-葡聚糖酶/kg饲料的动物饲料； (^)包含1，4-0-甘露聚糖酶和至少23〇,〇〇〇11]1，3-0-葡聚糖酶/1的除了动物饲料 之外的液体组合物;和 (1^)包含1，4-0-甘露聚糖酶和至少45〇,〇〇〇11]1，3-0-葡聚糖酶/1^的除了动物饲 料之外的固体组合物。4. 权利要求1的用途，其中所述组合物选自： (i) 包含至少5,000 IU/吨几丁质酶和至少200,000 IU/吨1，4-β-甘露聚糖酶的动物 饲料； (ii) 包含至少125,000 IU/吨1，3-β-葡聚糖酶和至少180,000 IU/吨1，4-β-甘露聚糖 酶的动物饲料;和 (iii) 包含至少100 MU/吨木葡聚糖酶和至少70 MU/吨1，3-β-葡聚糖酶的动物饲料。5. 权利要求1的用途，其中急性期蛋白选自：α-1-酸性糖蛋白（AGP)、血浆铜蓝蛋白 (Cp)、胶原凝素家族的蛋白、纤维蛋白原(Fb)、C-反应蛋白（CRP)、触珠蛋白、蛋白酶抑制物、 血清淀粉样蛋白-A(SAA)、脂多糖结合蛋白（LPB)、磷脂结合蛋白和主要急性期蛋白（MAP)。6. 权利要求1-4中任一项的组合物在制备用于预防或治疗与病原生物相关的感染的药 物中的用途。
【文档编号】A61K38/47GK105831428SQ201610203760
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2006年12月14日
【发明人】D.M.安德森, H.-Y.肖, L.刘
【申请人】美国礼来公司