一种木耳多糖功能性食品的制作方法
【专利摘要】本发明属于保健食品领域，具体涉及一种木耳多糖功能性食品。该功能性食品由以下重量份数的原料组成：黑木耳多糖20?50份，银耳多糖20?50份，灵芝多糖10?20份，牛磺酸1?10份，L?精氨酸3?5份，低聚果糖2?10份，茶多酚0.01?0.02份，麦精10?80份，植物乳杆菌粉剂10?20份。本发明所提供的多糖提取方法使得多糖提取率得到提高，使产品具有较好的提高免疫力的效果，并且获得的产品具有较好的降解胆固醇的功效。CGMCC NO.1176320151130
【专利说明】
一种木耳多糖功能性食品
技术领域：
[0001] 本发明属于营养保健食品领域，具体涉及一种木耳多糖功能性食品。
【背景技术】：
[0002] 木耳多糖是从木耳中提取的多糖成分，具有降血脂降低胆固醇的功效。有一定的 调节机体免疫功能的作用，其作用是多途径、多环节、多靶点的，如促进免疫细胞增殖与分 化，分泌各种淋巴因子，调节神经-内分泌-免疫调节网络(ΝΠΟ的平衡等。
[0003] 研究表明，黑木耳多糖具有多种生物活性，而且不同化学结构和不同构象的黑木 耳多糖组分表现不同的生理活性。经研究发现，黑木耳多糖对细胞免疫和体液免疫功能具 有良好的促进作用，具有抗白细胞降低、抗肿瘤、抗辐射、抗突变、抗炎症等细胞保护作用； 具有降低血脂、胆固醇、血液粘度，抗血栓形成作用;具有降低血糖、抗糖尿病以及降低脂褐 质含量，增强S0D活力，减少有害物质自由基产生的功能；同时还能促进核酸、蛋白质的生物 合成和防治多种老年性疾病。
[0004] 银耳（Treme 1 la f uc if ormi sBerk)，俗称白木耳，子实体中得到银耳多糖 (Tremellam)是一种酸性杂多糖，具有改善机体免疫功能及提升白细胞的作用。可显著提高 实验动物网状内皮细胞的吞噬功能，有促进非特异性免疫作用，提高免疫球蛋白、血清总补 体的水平。可预防和治疗由放射与抗肿瘤药物(如CTX)引起的骨髓抑制，也能促进肝脏内蛋 白质的合成。
[0005] 灵芝多糖是由三股单糖链构成的、具有螺旋状立体构形(三级结构）的葡聚糖，其 立体构形与脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)相似，是一种大分子化合物，其分子量从数 千到数十万，它是一种从灵芝孢子粉或灵芝中提取的物质。灵芝多糖是灵芝的最有效成分 之一，因此，也特别受到药科技工作者的重视，对它的研究报道也最多。已分离到的灵芝多 糖有200多种，其中有数十种的结构已被搞清，分子量已被测定。
[0006] 灵芝多糖有多方面的药理活性:能提高机体免疫力，加速血液微循环，提高血液供 氧能力，降低机体静止状态下的无效耗氧量，消除体内自由基，提高机体细胞膜的封闭度， 抗放射，提高肝脏、骨髓、血液合成DNA，RNA，蛋白质的能力，延长寿命等。灵芝的多种药理活 性大多和灵芝多糖有关。
[0007] 现代科技表明，真菌多糖是食用菌中所含的最重要的药效成分。是一种β-型的多 糖，具有广泛的药理活性。灵芝、冬虫夏草、木耳、银耳、香菇、猴头菇、白灵菇、竹黄、云芝、鸡 腿蘑、松茸、桑黄等食用菌，都含有真菌多糖。
[0008] 中国发明专利201110407414.2公布了一种具有保健作用的真菌营养液，该营养液 以香菇、灰树花、猴头菇、云芝等真菌为主要原料，辅以低聚木糖、异麦芽酮糖醇、牛磺酸、赖 氨酸、维生素 Ε、黄原胶和水等营养素加工而成，原料配伍科学，协同作用，具有提高人体免 疫力和促进机体胃粘膜损伤修复双功能保健作用。
[0009]益生菌，是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产 生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。其广 泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。
[0010]调节肠胃功能紊乱是益生菌最广为人知的功能之一，除此之外，益生菌还具有产 生营养物质、抵抗细菌病毒的感染以及预防治疗某些疾病的功能。本发明将提供一种添加 有益生菌的复合木耳多糖组合物，兼具真菌及多糖提高免疫力的功能以及益生菌的保健功 效，改善目前保健品效果单一、复合功能不理想的问题。
【发明内容】
：
[0011] 为了解决上述问题，本发明提供一种木耳多糖功能性食品，由以下重量份数的原 料组成：
[0012] 黑木耳多糖20-50份，银耳多糖20-50份，灵芝多糖10-20份，牛磺酸1-10份，L-精氨 酸3-5份，低聚果糖2-10份，茶多酚0.01-0.02份，麦精10-80份，植物乳杆菌粉剂10-20份。
[0013] 所述黑木耳多糖的制备方法如下：
[0014] (1)取黑木耳，装入有0.3-0.5%碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于2001、401(抱清 洗5-10min，然后于-21--25°C冷冻10_30min，立即进行粉碎；
[0015] (2)粉碎后的黑木耳与水以1: 3-5 (m: v)的比例混合，调整温度为40-60 °C，pH为 5.0-7.0，加入黑木耳子实体质量0.1-0.3%的纤维素酶酶解1-2.5小时后调整温度到80-95 °C保持2-5分钟，调整温度到50°C、随后添加黑木耳子实体质量0.1-0.3%风味蛋白酶进行 酶解，酶解温度40-50°C、pH值6-7，酶解时间1-2小时，离心分离获得上清液；
[0016] (3)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95 %乙醇，4°C下醇析24h，弃 去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3 次，喷雾干燥，即得黑木耳多糖；
[0017] 所述黑木耳子实体粉碎至粒径在0.5_以下；
[0018] 所述银耳多糖提取方法同黑木耳多糖；
[0019] 所述灵芝多糖提取方法如下：
[0020] (1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
[0021] (2)超声热水浸提:按过筛后的灵芝与水质量体积比1-3:20的比例加入纯净水，在 PH7条件下，400W超声波，105°C水浴浸提0.5h;
[0022] (3)热蒸汽浸提:将上述提取体系置于灭菌锅，12rC，5min;
[0023] (4)循环重复步骤(2)、（3)4次；
[0024] (5)离心分离获得上清液；
[0025] (6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95 %乙醇，4°C下醇析24h，弃 去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3 次，喷雾干燥，即得灵芝多糖。
[0026] 所述植物乳杆菌粉剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj_2015制备， 该菌已于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 06110：)，保藏号为0610：^).11763，保藏地址为 ：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研究所，邮编：100101;
[0027]所述植物乳杆菌粉剂中活菌含量为:7 X 1012_9 X 1012cfu/g;
[0028]所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：
[0029] (1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO. 11763-环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 脂）（葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12-16h，使菌体处于 对数生长中期；
[0030] (2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为10-15 %，35-38 °C下100-200rpm 培养8-12小时，溶氧控制10 % (通气0.5L/min)，之后再厌氧培养60-70小时;发酵完毕发酵 液静置沉淀、离心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50 °C流化床干燥 即得植物乳杆菌粉剂，载体重量份数组成为:酸奶粉25份，糊精12份。
[0031] 所述发酵培养基组成如下：蛋白胨10-12g，牛肉膏10-12g，酵母膏5-8g，柠檬酸氢 二铵2-4g，葡萄糖20-25g，吐温80 l-2mL，乙酸钠5-7g，磷酸氢二钾2-3g，硫酸镁0· 58-0.6g， 硫酸猛0.25-0.38，胆固醇100-12011^，中草药粉剂5-88，蒸馏水1 0001111^，口!16.2~6.6;
[0032]所述胆固醇的添加方法为：先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为10-12mg/mL的 胆固醇溶液，然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为100-120yg/mL;
[0033]所述中草药粉剂的制备方法如下：
[0034] 称取五味子10-20份;党参10-15份；山楂10-20份;分别将上述中草药粉碎至粒径 为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度45-60°C保持2~4h， 加入混合酶制剂进行酶解，调节pH值为6-7，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇 和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取0.5~1.5h，过滤;滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中 草药粉剂；
[0035] 所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10% ;
[0036] 所述混合酶的重量份数组成为:木聚糖酶15-20份，β-淀粉酶10-15份，果胶酶ΙΟ-? 5份， 酸性蛋白酶10-15份 ，酸性磷酸酶 5-10份；
[0037]所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1-2。
[0038]所述木耳多糖功能性食品的制备方法为:按本领域常规方法加工为片剂、粉剂、颗 粒剂、软胶囊、硬胶囊等，直接服用，也可以作为食品原料使用。
[0039] 有益效果：
[0040] 1、本发明所提供的木耳多糖功能性食品中除含有黑木耳多糖、银耳多糖、灵芝多 糖外还含有植物乳杆菌CGMCC NO. 11763，该菌株①降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到 10.9mg/h/kg，可有效的分解人们由于饮食不当而摄入的亚硝酸盐;②该菌对胆固醇降解率 高，可达到64.76%，尤其适用于肥胖人群及三高患者;③该菌黏附能力高，测定的自凝集率 为95.71 %，可有效地定植于胃肠道系统中，充分发挥其生理活性作用。
[0041] 2、本发明所提供的植物乳杆菌培养方法中，发酵培养基中添加有中药成分五味 子、党参和山楂，这三种重要成分的添加可有效提高植物乳杆菌的耐酸耐胆盐能力，从而提 高其在人体肠道中发挥的作用。
[0042] 3、本发明所提供的植物乳杆菌培养方法中，发酵培养基中以可溶性形式添加有胆 固醇，发酵完成后可有效提高菌株降解胆固醇的能力。由于本发明提供的产品中添加有所 述植物乳杆菌，使得本发明除了具有提高人体免疫力能力外，还具有较好的降解胆固醇的 能力。
【具体实施方式】：
[0043] 实施例1: 一种木耳多糖功能性食品
[0044] -种木耳多糖功能性食品，由以下重量份数的原料组成：
[0045]黑木耳多糖20份，银耳多糖20份，灵芝多糖20份，牛磺酸1份，L-精氨酸3份，低聚果 糖2份，茶多酚0.01份，麦精10份，植物乳杆菌粉剂10份；
[0046]按照上述配方比例称取各组分，粉碎，过80目筛，然后混合lOmin，得粉剂。
[0047]所述黑木耳多糖的制备方法如下：
[0048] (1)取黑木耳子实体，装入有0.3%碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、40KHz 清洗5min，然后于-21°C冷冻lOmin，立即进行粉碎；
[0049] (2)粉碎后的黑木耳与水以l:3(m:v)的比例混合，调整温度为40°C，pH为5.0,加入 黑木耳子实体质量〇. 1 %的纤维素酶酶解1小时后调整温度到80°C保持2分钟，调整温度到 50 °C、随后添加黑木耳子实体质量0.1 %风味蛋白酶进行酶解，酶解温度40 °C、pH值6，酶解 时间1小时，离心分离获得上清液；
[0050] (3)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95 %乙醇，4°C下醇析24h，弃 去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3 次，喷雾干燥，即得黑木耳多糖；
[0051 ] 所述黑木耳子实体粉碎至粒径在0.5_以下；
[0052]所述银耳多糖提取方法同黑木耳多糖；
[0053]所述灵芝多糖提取方法如下：
[0054] (1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
[0055] (2)超声热水浸提:按过筛后的灵芝与水质量体积比1:20的比例加入纯净水，在 PH7条件下，400W超声波，105°C水浴浸提0.5h;
[0056] (3)热蒸汽浸提:将上述提取体系置于灭菌锅，12?Γ，5π?η;
[0057] (4)循环重复步骤(2)、（3)4次；
[0058] (5)离心分离获得上清液；
[0059] (6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95%乙醇，4°C下醇析24h，弃 去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3 次，喷雾干燥，即得灵芝多糖。
[0060]所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：
[0061 ] (1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO. 11763-环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 脂）（葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h，使菌体处于对 数生长中期；
[0062] (2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为10%，35°C下lOOrpm培养8小时， 溶氧控制10% (通气〇.5L/min)，之后再厌氧培养60小时;发酵完毕发酵液静置沉淀、离心得 到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50°C流化床干燥即得植物乳杆菌粉 剂，载体重量份数组成为:酸奶粉25份，糊精12份。
[0063]所述发酵培养基组成如下:蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡 萄糖20g，吐温80 lmL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸猛0.25g，胆固醇100mg， 中草药粉剂5g，蒸馏水1 000mL，pH6.2;
[0064]所述胆固醇的添加方法为:先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为10mg/mL的胆固 醇溶液，然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为l〇〇yg/mL;
[0065] 所述中草药粉剂的制备方法如下：
[0066] 称取五味子10份;党参10份；山楂10份;分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以 下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度45°C保持2h，加入混合酶制剂进 行酶解，调节pH值为6，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功 率下超声萃取〇. 5h，过滤;滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
[0067] 所述混合酶添加量为混合物料总重量的5% ;
[0068] 所述混合酶的重量份数组成为:木聚糖酶15份，β-淀粉酶10份，果胶酶10份，酸性 蛋白酶10份，酸性磷酸酶5份；
[0069]所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1。
[0070]实施例2-种木耳多糖功能性食品
[0071 ] -种木耳多糖功能性食品，由以下重量份数的原料组成：
[0072]黑木耳多糖50份，银耳多糖50份，灵芝多糖20份，牛磺酸10份，L-精氨酸5份，低聚 果糖10份，茶多酚〇. 02份，麦精80份，植物乳杆菌粉剂20份；
[0073]按照上述配方比例称取各组分，粉碎，过80目筛，然后混合lOmin，得粉剂。
[0074]所述黑木耳多糖的制备方法如下：
[0075] (1)取黑木耳子实体，装入有0.5%碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、40KHz 清洗5-10min，然后于-25°C冷冻30min，立即进行粉碎；
[0076] (2)粉碎后的黑木耳与水以1:5(m: v)的比例混合，调整温度为60°C，pH为7.0，加入 黑木耳子实体质量〇. 3 %的纤维素酶酶解2.5小时后调整温度到95°C保持5分钟，调整温度 到50 °C、随后添加黑木耳子实体质量0.3 %风味蛋白酶进行酶解，酶解温度50°C、pH值7，酶 解时间2小时，离心分离获得上清液；
[0077] (3)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95 %乙醇，4°C下醇析24h，弃 去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3 次，喷雾干燥，即得黑木耳多糖；
[0078] 所述黑木耳子实体粉碎至粒径在0.5_以下；
[0079] 所述银耳多糖提取方法同黑木耳多糖；
[0080] 所述灵芝多糖提取方法如下：
[0081 ] (1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
[0082] (2)超声热水浸提：按过筛后的灵芝与水质量体积比3:20的比例加入纯净水，在 PH7条件下，400W超声波，105°C水浴浸提0.5h;
[0083] (3)热蒸汽浸提:将上述提取体系置于灭菌锅，12rC，5min;
[0084] (4)循环重复步骤(2)、（3)4次；
[0085] (5)离心分离获得上清液；
[0086] (6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95 %乙醇，4°C下醇析24h，弃 去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3 次，喷雾干燥，即得灵芝多糖。
[0087]所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：
[0088] (1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC N0.11763-环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 脂）（葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养16h，使菌体处于对 数生长中期；
[0089] (2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为15 %，38 °C下200rpm培养12小 时，溶氧控制10 % (通气〇 . 5L/min)，之后再厌氧培养70小时;发酵完毕发酵液静置沉淀、离 心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50°C流化床干燥即得植物乳杆 菌粉剂，载体重量份数组成为:酸奶粉25份，糊精12份。
[0090] 所述发酵培养基组成如下:蛋白胨12g，牛肉膏12g，酵母膏8g，柠檬酸氢二铵4g，葡 萄糖25g，吐温80 2mL，乙酸钠7g，磷酸氢二钾3g，硫酸镁0.6g，硫酸猛0.3g，胆固醇120mg，中 草药粉剂8g，蒸馏水1000mL，pH 6.6;
[0091] 所述胆固醇的添加方法为:先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为12mg/mL的胆固 醇溶液，然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为WOyg/mL;
[0092] 所述中草药粉剂的制备方法如下：
[0093]称取五味子20份;党参15份；山楂20份;分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以 下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度60 °C保持4h，加入混合酶制剂进 行酶解，调节pH值为7，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率 下超声萃取1.5h，过滤;滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
[0094]所述混合酶添加量为混合物料总重量的10% ;
[0095]所述混合酶的重量份数组成为:木聚糖酶20份，β-淀粉酶15份，果胶酶15份，酸性 蛋白酶15份，酸性磷酸酶10份；
[0096]所述乙醇和丙醇的质量比例为1:2。
[0097]实施例3: -种木耳多糖功能性食品
[0098] -种木耳多糖功能性食品，由以下重量份数的原料组成：
[0099]黑木耳多糖35份，银耳多糖35份，灵芝多糖15份，牛磺酸5份，L-精氨酸4份，低聚果 糖5份，茶多酚0.015份，麦精40份，植物乳杆菌粉剂15份；
[0100] 按照上述配方比例称取各组分，粉碎，过80目筛，然后混合lOmin，得粉剂。
[0101] 所述黑木耳多糖的制备方法如下：
[0102] (1)取黑木耳子实体，装入有0.4 %碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、40KHZ 清洗5-10min，然后于-23°C冷冻20min，立即进行粉碎；
[0103] (2)粉碎后的黑木耳与水以l:4(m:v)的比例混合，调整温度为50°C，pH为6.0,加入 黑木耳子实体质量〇. 2 %的纤维素酶酶解1.5小时后调整温度到85°C保持3分钟，调整温度 到50 °C、随后添加黑木耳子实体质量0.2 %风味蛋白酶进行酶解，酶解温度45 °C、pH值6.5， 酶解时间1.5小时，离心分离获得上清液；
[0104] (3)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95 %乙醇，4°C下醇析24h，弃 去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3 次，喷雾干燥，即得黑木耳多糖；
[0105] 所述黑木耳子实体粉碎至粒径在0.5_以下；
[0106] 所述银耳多糖提取方法同黑木耳多糖；
[0107] 所述灵芝多糖提取方法如下：
[0108] (1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
[0109] (2)超声热水浸提:按过筛后的灵芝子实体与水质量体积比1:10的比例加入纯净 水，在pH7条件下，400W超声波，105 °C水浴浸提0 · 5h;
[0110] (3)热蒸汽浸提:将上述提取体系置于灭菌锅，12?Γ，5π?η;
[0111] (4)循环重复步骤(2)、（3)4次；
[0112] (5)离心分离获得上清液；
[0113] (6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95%乙醇，4°C下醇析24h，弃 去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3 次，喷雾干燥，即得灵芝多糖。
[0114] 所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：
[0115] (1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC N0.11763-环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 脂）（葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12-16h，使菌体处于 对数生长中期；
[0116] (2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为12 %，37 °C下150rpm培养10小 时，溶氧控制10 % (通气〇 . 5L/min)，之后再厌氧培养65小时;发酵完毕发酵液静置沉淀、离 心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50°C流化床干燥即得植物乳杆 菌粉剂，载体重量份数组成为:酸奶粉25份，糊精12份。
[0117]所述发酵培养基组成如下:蛋白胨llg，牛肉膏llg，酵母膏6g，柠檬酸氢二铵3g，葡 萄糖22g，吐温80 1.5mL，乙酸钠6g，磷酸氢二钾2.5g，硫酸镁0.6g，硫酸锰0.25g，胆固醇 llOmg，中草药粉剂6g，蒸馏水1 000mL，pH 6.5;
[0118] 所述胆固醇的添加方法为:先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为Ilmg/mL的胆固 醇溶液，然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为1 l〇yg/mL;
[0119] 所述中草药粉剂的制备方法如下：
[0120] 称取五味子15份;党参12份；山楂15份;分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以 下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度50°C保持3h，加入混合酶制剂进 行酶解，调节pH值为6.5，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功 率下超声萃取lh，过滤;滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
[0121 ]所述混合酶添加量为混合物料总重量的8% ;
[0122] 所述混合酶的重量份数组成为:木聚糖酶18份，β-淀粉酶12份，果胶酶12份，酸性 蛋白酶12份，酸性磷酸酶8份；
[0123] 所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1.5。
[0124] 实施例4效果实验
[0125] 1、植物乳杆菌061〇：从).11763的培养
[0126] (1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC Ν0.11763-环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 脂）（葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处 于对数生长中期。
[0127] (2)将对数期的菌种接入装有发酵培养基的5L发酵罐中。接种量为10%，37°C下 lOOrpm培养8小时，对数前期溶氧控制10% (通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。
[0128] 发酵培养基：
[0129] ①：蛋白胨llg，牛肉膏llg，酵母膏6g，柠檬酸氢二铵3g，葡萄糖22g，吐温80 1.5mL，乙酸钠6g，磷酸氢二钾2.5g，硫酸镁0.6g，硫酸锰Ο . 25g，胆固醇1 lOmg，中草药粉剂 6g，蒸馈水 1 OOOmL，pH 6.5;
[0130] ②:删去①中的胆固醇；
[0131] ③:删去①中的中草药粉剂；
[0132] 2、降解胆固醇能力测定
[0133] 步骤1中分别以发酵培养基①和②为发酵培养基完成发酵后，分别取lml发酵液离 心并用无菌水洗涤2遍后重悬于lml无菌水中，分别接种于10mL的MRS胆固醇液体培养基(胆 固醇含量0.1mg/ml，pH 6.2)中，37°C的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，取以上培养不 同时间的菌液样品各11111，900(^/ 1^11，4°(：下离心101^11，得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测 定上清液中胆固醇含量(具体为:取各上清液0. lml于相应的试管中，加冰醋酸0.3ml，lmg/ ml的邻苯二甲醛0.15ml，缓缓加入浓硫酸1.0ml，混合均匀。室温静置lOmin，于550nm下测吸 光值）。每一处理3个重复，以同样方法制作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降 解率，结果见表1。可知，CGMCC NO. 11763对胆固醇有很好的降解作用，60h小时后，降解率可 达到64.76 %。并且，添加有胆固醇的培养基所培养出的CGMCC NO. 11763降解胆固醇的能力 显者提尚。
[0134] 表1对胆固醇的降解情况。
[0135]
[0136] 3、耐胆盐实验
[0137] 步骤1中分别以发酵培养基①和③为发酵培养基完成发酵后，分别取lml发酵液离 心并用无菌水洗涤2遍后重悬于lml无菌水中，分别接种于含有不同胆盐（含量梯度为 0.0%、0.4%、0.6%、1%)的1011^]\?5液体培养基化!1=6.4)，置于37°(：下分别培养0、2、411， 每个处理3个重复。各取lml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释 液于MRS中涂布，于37°C生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平 板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1 %处理4h后菌的生长量依然达到 0.51 ±0.92 X107(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力，而采用添加有中草药成分的培养基，其 耐胆盐能力有效提尚。
[0138] 表2耐胆盐能力检测（X107cfu/ml)
[0139]
[0140]
[0141] 4、耐酸实验
[0142] 步骤1中分别以发酵培养基①和③为发酵培养基完成发酵后，分别取lml发酵液离 心并用无菌水洗涤2遍后重悬于lml无菌水中，分别接种于不同pH值(pH梯度为1.5、2.0、 2.5、3.0、3.5、4.0)的10mL MRS液体培养基，置于37°C下分别培养0、2、4h，每一处理3个重 复。各取lml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0. lml稀释液于MRS中涂布， 于37°C生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结 果见表3。说明该菌具有很强的耐酸能力，且添加有中草药成份的培养基能有效提高该菌的 耐酸性。
[0143] 表3耐酸能力检测（X107cfu/ml)
[0144]
[0145] 5、亚硝酸盐分解实验
[0146] 步骤1中以①培养基，发酵过程中根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠 溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌CGMCCN0.11763对亚硝酸钠的降解 速率。结果发现:在该条件下，CGMCC从).11763对亚硝酸钠的降解速率可以达到65311^/11/1。
[0147] 6、黏附能力测定
[0148] 培养CGMCC NO. 11763(MRS液体培养基）、大肠杆菌DH5a(LB液体培养基)24h得发酵 液，分别置于3000r/min、4°C下离心10min，收集菌泥，分别用pH = 7.0的无菌磷酸盐缓冲液 (PBS)洗涤菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4°C下离心 lOmin，收集菌体）。自凝集率（％ :用无菌的roS将菌泥CGMCC NO. 11763制成在波长600nm处 的吸光值为〇. 4±0.1 (A0)的悬浮菌液及菌悬液，静置24h后测定吸光值A24，自凝集率（％ ) 公式为(A0 - A24)/A0。测定结果见表5，可知CGMCCN0.11763的自凝集率为95.71 %，有很强 的黏附能力。
[0149] 表5黏附能力表
[0151] 实施例5本发明益生性试验
[0152] 将本发明实施例3制备的产品，用无菌水制备成活菌数为2X101()CFU/mL的益生菌 溶液，于4°C保存备用；
[0153] 1、模拟胃液及肠液的耐受试验：
[0154] 取100g/L的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为1.5、2.5和3.5，取100mL稀盐 酸溶液，分别加入lg胃蛋白酶，使其充分溶解，得模拟胃液，微孔滤膜除菌(〇.22μπι)备用。
[0155] 取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1 moL/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8; 另取胰蛋白酶l〇g，加水100mL使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，得模拟肠液，微孔 滤膜除菌(〇·22μπι)备用。
[0156] 取lmL保存好的益生菌溶液加入到9mL的模拟胃液中（即十倍逐级稀释），并迅速在 振荡器上充分混匀，然后置于30-45°C静置培养2-4h。分别在111、211、311、411的时候取出培养 液并立即计数残存活菌数，与原活菌数进行比较，结果表明，活菌存活率为97%。然后取在 人工胃液中消化不同时间的培养液各lmL，分别接种于9mLpH值为6.8的人工肠液中，置于 30-45Γ静置培养2-4h，并分别在0、3、6、24h取样，测定其活菌数，与原活菌数进行比较，结 果表明活菌存活率为99 %。
[0157] 2、模拟胆盐的耐受试验:用胰液素制成lg/L的溶液，并在溶液中加入0.8%的猪胆 盐，用10 %的NaOH调整pH为8.0，然后用0.45μπι微滤膜过滤并除菌。将0.5mL保存好的益生菌 溶液接种到4.5mL模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，计数残存的活菌数。将培养液在灭菌 生理盐水中十倍逐级稀释至10-8,并用MRS倾注，然后置于35°C静置培养24h。
[0158] 结果表明活菌存活率为99%。
[0159] 以上试验结果表明，本发明营养保健食品中的益生菌益生性(耐pH性、耐胆盐)较 强，非常适合人体胃肠环境，在模拟胃肠环境中存活率大，可有效改善胃肠功能。
[0160]需要说明的是:本发明实施例1-3制备的营养保健食品同样具有上述实验效果，各 实施例之间及与上述实验效果差异性不大。
[0161] 实施例6本发明对降胆固醇效果实验
[0162] 1.实验材料
[0163] 1.1实验动物及饲料
[0164] 昆明种小鼠生，体重(20±2)g，由广州中医药大学实验动物中心提供；
[0165] 普通饲料为市售小鼠饲料；高脂饲料由为60 %普通饲料+10 %猪油+ 10 %奶粉+ 10%蛋黄粉+7%白糖+2%花生+0.5%盐+0.5%麻油；
[0166] 1.2 试剂
[0167] 总胆固醇试剂盒(TCH，浙江东欧诊断产品有限公司）
[0168] 饲喂试剂配置：
[0169] 样品液①:2g实施例3产品加入50mL超纯水，振荡混匀，即得；
[0170] 样品液②:实施例3产品制备过程中CGMCC NO. 11763发酵培养基去除胆固醇，其他 条件不变制备的产品2g加入50mL超纯水，振荡混匀，即得
[0171] 对照液:纯水；
[0172] 2.方法
[0173] 2.1小鼠的分组与饲养
[0174] 小鼠适应性喂养5天后，随机分为2组:空白组、实验组，每组20只；饲喂75天；
[0175] 空白组:高脂饲料，给纯水，体积与样品液溶液体积相同；
[0?76]实验组①:高脂饲料，给样品液① 800mg/kg · d;
[0177]实验组②:高脂饲料，给样品液②800mg/kg. d;末次给药后，禁食不禁水12小时，眼 眶取血制备血清，依试剂盒说明书方法测定总胆固醇(TC);实验结果如下：
[0180] 由实验结果可知，实验前后，实验组和对照组小鼠血清中胆固醇差异显著，本发明 所述产品对降低血清中胆固醇含量具有明显的效果。
[0181] 实施例7本发明产品提高免疫力的效果实验
[0182] 本产品实施例3产品在冬季选择北京地区100位年龄在60-75岁体弱易感冒的老年 人连续食用1月，每日食用5克，以食用前和食用后效果比较，结果见表1，结果表明本产品对 提高老年人抵抗力、增强身体免疫力有明显效果，产品有良好的食用和营养滋补功效。同时 能够显著提高睡眠质量，改善率达到70% (以有质量睡眠时间为评估依据)许多连续食用本 产品老人反映久服效果更佳，全年不感冒，身体状况更好.
[0183] 表6食用效果对照表
[0185] 实施例8灵芝多糖提取效果对比试验
[0186] 方法1:灵芝多糖提取方法如下：
[0187] (1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
[0188] (2)超声热水浸提:按3:20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105 °C水 浴浸提〇.5h;
[0189] (3)热蒸汽浸提:将上述提取体系置于灭菌锅，12rC，5min;
[0190] (4)循环重复步骤(2)、（3)4次；
[0191] (5)离心分离获得上清液；
[0192] (6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95%乙醇，4°C下醇析24h，弃 去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3 次，喷雾干燥称重，即得灵芝多糖。
[0193] 方法2:灵芝多糖提取方法如下：
[0194] (1)取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛；
[0195] (2)超声热水浸提:按3:20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105 °C水 浴浸提140min;
[0196] (3)离心分离获得上清液；
[0197] (4)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95 %乙醇，4°C下醇析24h，弃 去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3 次，喷雾干燥称重，即得灵芝多糖。
[0198] 灵芝多糖粗提取率（％ )=(粗多糖干重/灵芝子实体烘干后干重）X 100
[0199] 根据上述公式计算上述两种提取方法对灵芝多糖粗提取率的影响，方法1灵芝多 糖粗提取率为10.12%，方法1灵芝多糖粗提取率为8.25%，可见，间歇热蒸汽浸提能有效提 尚超声热水浸提对灵芝多糖的粗提取率。
【主权项】
1. 一种木耳多糖功能性食品，由以下重量份数的原料组成：黑木耳多糖20-50份，银耳 多糖20-50份，灵芝多糖10-20份，牛磺酸1-10份，L-精氨酸3-5份，低聚果糖2-10份，茶多酚 0.01-0.02份，麦精10-80份，植物乳杆菌粉剂10-20份； 所述植物乳杆菌粉剂由植物乳杆菌(LactobaciIlus plantarum)tlj-2015制备，保藏 号为CGMCC NO .11763。2. 如权利要求1所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述黑木耳多糖的制备 方法如下： (1) 取黑木耳，装入有0.3-0.5%碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于2001、401(他清洗5- IOmin，然后于-21--25°C冷冻10_30min，立即进彳丁粉碎； (2) 粉碎后的黑木耳与水以1: 3-5 (m: V)的比例混合，调整温度为40-60°C，pH为5.0-7.0，加入黑木耳子实体质量0.1-0.3%的纤维素酶酶解1-2.5小时后调整温度到80-95°C保 持2-5分钟，调整温度到50°C、随后添加黑木耳子实体质量0.1-0.3%风味蛋白酶进行酶解， 酶解温度40-50°C、pH值6-7，酶解时间1-2小时，离心分离获得上清液； (3) 上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95 %乙醇，4°C下醇析24h，弃去上 清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷 雾干燥，即得黑木耳多糖； 所述黑木耳子实体粉碎至粒径在〇. 5_以下； 所述银耳多糖提取方法同黑木耳多糖。3. 如权利要求1所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述灵芝多糖提取方法 如下： (1) 取市售的灵芝子实体烘干粉碎后过80目筛； (2) 超声热水浸提:按过筛后的灵芝子实体与水质量体积比1-3:20的比例加入纯净水， 在pH7条件下，400W超声波，105°C水浴浸提0 · 5h; (3) 热蒸汽浸提:将上述提取体系置于灭菌锅，121°C，5min; (4) 循环重复步骤(2)、（3)4次； (5) 离心分离获得上清液； (6) 上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95 %乙醇，4°C下醇析24h，弃去上 清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷 雾干燥，即得灵芝多糖。4. 如权利要求1所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述植物乳杆菌粉剂中 活菌含量为:7xl012-9xl0 12cfu/g。5. 如权利要求1所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述植物乳杆菌粉剂的 制备方法如下： (1) 取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO. 11763-环，接入装有50mL培养基MRS培养基的 250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12-16h，使菌体处于对数生长中期； (2) 将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为10-15 %，35-38 °C下100_200rpm培养 8-12小时，溶氧控制10 %，之后再厌氧培养60-70小时;发酵完毕发酵液静置沉淀、离心得到 沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50°C流化床干燥即得植物乳杆菌粉剂， 载体重量份数组成为:酸奶粉25份，糊精12份。6. 如权利要求5所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述发酵培养基组成如 下：蛋白胨l〇_12g，牛肉膏10_12g，酵母膏5-8g，柠檬酸氢二铵2-4g，葡萄糖20-25g，吐温80 l-2mL，乙酸钠5-7g，磷酸氢二钾2-3g，硫酸镁0.58-0.6g，硫酸锰0.25-0.3g，胆固醇100-12〇11^，中草药粉剂5-88，蒸馈水100〇1111^，口!16.2~6.6。7. 如权利要求6所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述胆固醇的添加方法 为:先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为10-12mg/mL的胆固醇溶液，然后按一定比例添加 到培养基中，使胆固醇最终浓度为100_120yg/mL。8. 如权利要求6所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，所述中草药粉剂的制备 方法如下： 称取五味子10-20份;党参10-15份；山楂10-20份;分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫 米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度45-60°C保持2~4h，加入 混合酶制剂进行酶解，调节PH值为6-7，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙 醇的混合物，IIOW功率下超声萃取0.5~1.5h，过滤;滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药 粉剂； 所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10 % ; 所述混合酶的重量份数组成为:木聚糖酶15-20份，β-淀粉酶10-15份，果胶酶10-15份， 酸性蛋白酶10-15份，酸性磷酸酶5-10份； 所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1-2。9. 如权利要求1所述的一种木耳多糖功能性食品，其特征在于，由以下重量份数的原料 组成:黑木耳多糖35份，银耳多糖35份，灵芝多糖15份，牛磺酸5份，L-精氨酸4份，低聚果糖5 份，茶多酚0.015份，麦精40份，植物乳杆菌粉剂15份灵芝。10. 权利要求1所述一种木耳多糖功能性食品在保健领域的应用。
【文档编号】A23L33/135GK105901698SQ201610235506
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】邵素英
【申请人】邵素英