利用超高压处理提高胶原热稳定性能的方法

利用超高压处理提高胶原热稳定性能的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用超高压处理提高胶原热稳定性能的方法，该方法包括以下步骤：1)用醋酸水溶液溶解天然胶原得胶原溶液；2)将胶原溶液置于软性包装材料中进行抽真空密封包装；3)将密封包装的软性包装材料置于超高压容器中，进行超高压处理；4)取出胶原溶液，冷冻干燥即得热稳定性能得以改善的胶原产品。本发明通过超高压物理处理方法，有效改善了胶原分子的热稳定性能。与现有的化学改性和化学交联等方法相比，具有不改变胶原分子基本结构组成、不引入新的化学成分、胶原独特的生物活性和生物安全性不发生改变、处理手段简便易行等优点。
【专利说明】
利用超高压处理提高胶原热稳定性能的方法
技术领域
[0001]本发明属于医学生物材料技术领域，具体涉及一种利用超高压处理提高胶原热稳定性能的方法。
【背景技术】
[0002]胶原是一类广泛存在于多细胞生物中的结构蛋白，其典型特征是蛋白分子由3条肽链组成，并且存在3条肽链缠绕形成的超螺旋分子构造(胶原域)。由于天然胶原具有优异的生物相容性、可降解性和良好的机械性能，其在生物医学材料、组织工程和医学美容等领域得以广泛的应用。
[0003]保持完整的三螺旋分子构造是天然胶原维持其生物功能和生物活性的结构基础。经过受热处理后，天然胶原的三螺旋结构破坏，肽链解离并由螺旋缠绕转变为无规卷曲分子形态，这一过程称之为胶原的热变性。研究发现，胶原热变性后，其诸多生物功能和生物活性明显降低或丧失。如，胶原的成纤维能力、耐酶降解能力和机械力学性能等。因此，在胶原提取、制造和应用过程中，采取合适的工艺条件以确保其三螺旋结构的完整性是胶原和胶原基生物材料制造和应用领域的关键。组织胶原经人工提取后，它们的体外热稳定性均不理想，当环境温度超过40°C后，大部分种类的胶原就已出现热变性行为。特别是对于来自于鱼类、两栖动物类的新兴胶原资源，它们的热变性阀值温度更低，在提取和加工过程中极容易发生热变性，从而在很大程度上抑制了这些胶原资源在生物材料领域的应用。因此，如何提高胶原的体外热稳定性成为胶原领域的一项重要课题。
[0004]化学交联处理是提高胶原热稳定性的常用方法。经醛类等化合物处理后，在胶原分子内或分子间形成的化学键合能有效提高胶原的热变性阀值温度。但是，这种化学处理方法需要在天然胶原中引入新的化学物质，产品的生物安全性显著降低。
[0005]超高压加工技术(ultra high pressure processing,UHPP)是一种新兴的加工技术。其加工处理过程为，将目标物料密封包装后，置于高压容器中，以水或其他液体作为传压介质，施加10MPa以上的压力(一般为10MPa?100MPa)—段时间，以达到对物料的加工、处理目的。超高压处理技术是一种单纯的物理加工手段，其主要原理是利用超高压环境下物料中生物大分子的分子结构、分子间相互作用形式发生改变而引起物料性质的变化，从而达到加工目的。该技术不需要引入其他的化学成分，且处理温度一般较低，因此在食品、生物产品的加工领域具有明显的优势。目前，超高压处理技术主要应用在以下几个方面:一是利用超高压对蛋白和酶类的破坏作用，应用于食品或生物产品的低温灭菌处理，如食品的超高压灭菌保鲜处理(发明专利，养殖大黄鱼超高压脱脂保鲜方法，201410063615.9；超高压、高温食品保藏方法，99811016.7; —种保持鲜莲品质的超高压保鲜方法，201210146582.5;—种超高压蔬菜食品的加工方法，201010553244.4)); 二是利用超高压对组织结构和细胞结构的破坏作用，应用于生物活性物质的提取(发明专利，一种利用超高压提取香菇多糖的方法，200810150533.2);三是利用超高压对物料成分性能的影响作用，用于改善食品物态性能或组织结构(发明专利，一种超高压低脂乳化肠产品的生产方法，201310406018.7)。

【发明内容】

[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种利用超高压处理提高胶原热稳定性能的方法，该方法通过物理手段，调节胶原的分子构造，提高天然胶原的热稳定性能，以满足医用材料应用领域对胶原热稳定性能的要求。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案:
[0008]I)在冰浴条件下，用醋酸水溶液溶解天然胶原得胶原溶液；
[0009]2)将上述胶原溶液置于软性包装材料中，抽真空密封包装；
[0010]3)将装有胶原溶液的软性包装材料置于超高压容器中，进行超高压处理;处理条件为:压力10MPa?400MPa，保压处理时间5?120分钟，传压液体介质温度4°C?30°C;
[0011]4)超高压处理完毕后，取出胶原溶液，经冷冻干燥处理即得热稳定性能得以改善的胶原产品。
[0012]进一步地，所述步骤I)中，所述天然胶原是从哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、跟腱组织中提取并分离纯化的具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。
[0013]进一步地，所述步骤I)中，胶原溶液的浓度为0.1?20mg/mL。
[OOM]进一步地，所述步骤2)中，软性包装材料为聚乙稀袋和聚丙稀袋。
[0015]进一步地，所述步骤3)中，传压液体介质为水。
[0016]本发明的发明人经过长期研究发现，不同于其他结构的蛋白质，三螺旋构造的胶原在一定的压力范围内经过超高压处理后，构成胶原分子的三条肽链间距缩小、螺旋构造变得更加紧密，肽链间键合作用得到加强。基于该发现，本发明提供了一种利用超高压处理提高天然胶原热稳定性能的方法。该方法利用超高压处理技术的基本物理原理，同时结合了天然胶原特有的三螺旋分子构造，在合适的超高压环境下，实现胶原三螺旋分子构造的紧密化处理过程，从而提高胶原分子构造的坚固性和热稳定性，有效改善胶原分子的热稳定性能。与现有的化学改性和化学交联等方法相比，具有不改变胶原分子基本结构组成、不引入新的化学成分、胶原独特的生物活性和生物安全性不发生改变、处理手段简便易行等优点。
【附图说明】
[0017]图1为本发明实施例1、2和对比例I的DSC分析结果。
[0018]图2为本发明实施例3和对比例2的DSC分析结果。
[0019]图3为本发明实施例4和对比例3的DSC分析结果。
[0020]图4为本发明实施例5和对比例4的DSC分析结果。
[0021 ]图5为本发明实施例1和对比例I的⑶分析结果。
[0022]图6为本发明超高压处理对天然胶原蛋白分子结构影响的机制示意图。
【具体实施方式】
[0023]以下结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0024]实施例1
[0025]选择牛蛙皮为原料，采用乙酸结合胃蛋白酶处理方法提取天然胶原，提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到牛蛙酶溶性胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和圆二色谱(CD)分析，证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。在冰浴条件下，用醋酸水溶液溶解该胶原(得浓度为3mg/mL的胶原溶液)后将胶原溶液置于聚乙烯袋中，采用真空包装机进行抽真空密封包装。将该包装袋置于超高压容器中，以水为传压液体介质，进行超高压处理。处理条件为:压力300MPa，保压处理的时间为15分钟，传压液体介质温度为10°C。超高压处理完毕后，取出胶原溶液，冷冻干燥得到超高压处理的胶原产品。经检测，所得胶原的热变性峰值温度为36.77°C，热变性焓为1.88J/g。
[0026]实施例2
[0027]选择牛蛙皮为原料，采用乙酸结合胃蛋白酶处理方法提取天然胶原，提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到牛蛙酶溶性胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和圆二色谱(CD)分析，证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。在冰浴条件下，用醋酸水溶液溶解该胶原(得浓度为2mg/mL的牛蛙皮胶原溶液)后将牛蛙皮胶原溶液置于聚丙烯袋中，采用真空包装机进行抽真空密封包装。将该包装袋置于超高压容器中，以水为传压液体介质，进行超高压处理。处理条件为:压力200MPa，保压处理的时间为25分钟，传压液体介质温度为10°C。超高压处理完毕后，取出牛蛙皮胶原溶液，冷冻干燥得到超高压处理的胶原产品。经检测，所得胶原的热变性峰值温度为36.79 °C，热变性焓为1.97J/g。
[0028]实施例3
[0029]选择草鱼皮为原料，采用乙酸为溶剂提取天然胶原，提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到草鱼酸溶性胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和圆二色谱(CD)分析，证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。在冰浴条件下，用醋酸水溶液溶解该胶原(得浓度为3mg/mL的草鱼皮胶原溶液)后将草鱼皮胶原溶液置于聚乙烯袋中，采用真空包装机进行抽真空密封包装。将该包装袋置于超高压容器中，以水为传压液体介质，进行超高压处理。处理条件为:压力300MPa，保压处理的时间为15分钟，传压液体介质温度为10°C。超高压处理完毕后，取出草鱼皮胶原溶液，冷冻干燥得到超高压处理的胶原产品。经检测，所得胶原的热变性峰值温度为36.96°C，热变性焓为1.67 J/g ο
[0030]实施例4
[0031 ]选择青鱼皮为原料，采用乙酸结合胃蛋白酶处理方法提取天然胶原，提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到青鱼酶溶性胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和圆二色谱(CD)分析，证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。在冰浴条件下，用醋酸水溶液溶解该胶原(得浓度为2mg/mL的青鱼皮胶原溶液)后将青鱼皮胶原溶液置于聚乙烯袋中，采用真空包装机进行抽真空密封包装。将该包装袋置于超高压容器中，以水为传压液体介质，进行超高压处理。处理条件为:压力400MPa，保压处理的时间为30分钟，传压液体介质温度为20°C。超高压处理完毕后，取出青鱼皮胶原溶液，冷冻干燥得到超高压处理的胶原产品。经检测，所得胶原的热变性峰值温度为36.3°C，热变性焓为1.28 J/g ο
[0032]实施例5
[0033]选择新鲜猪皮为原料，采用乙酸结合胃蛋白酶处理方法提取天然胶原，提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到猪皮酶溶性胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和圆二色谱(CD)分析，证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。在冰浴条件下，用醋酸水溶液溶解该胶原(得浓度为3mg/mL的猪皮胶原溶液)后将猪皮胶原溶液置于聚乙烯袋中，采用真空包装机进行抽真空密封包装。将该包装袋置于超高压容器中，以水为传压液体介质，进行超高压处理。处理条件为:压力300MPa，保压处理的时间为15分钟，传压液体介质温度为10°C。超高压处理完毕后，取出猪皮胶原溶液，冷冻干燥得到超高压处理的胶原产品。经检测，所得胶原的热变性峰值温度为41.6°C，热变性焓为1.87J/g。
[0034]对比例I
[0035]选择牛蛙皮为原料，采用乙酸结合胃蛋白酶处理方法提取天然胶原，提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到牛蛙酶溶性胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和圆二色谱(CD)分析，证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。经检测，所得胶原的热变性峰值温度和热变性焓分别为35.37°C和1.26 J/g ο
[0036]对比例2
[0037]选择草鱼皮为原料，采用乙酸为溶剂提取天然胶原，提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到草鱼酸溶性胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和圆二色谱(CD)分析，证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。经检测，所得胶原的热变性峰值温度和热变性焓分别为36.12 °C和I.22 J/g ο
[0038]对比例3
[0039]选择青鱼皮为原料，采用乙酸结合胃蛋白酶处理方法提取天然胶原，提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到青鱼酶溶性胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和圆二色谱(CD)分析，证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。经检测，所得胶原的热变性峰值温度和热变性焓分别为35.9°C和1.02 J/g ο
[0040]对比例4
[0041 ]选择猪皮为原料，采用乙酸结合胃蛋白酶处理方法提取天然胶原，提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到猪皮酶溶性胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和圆二色谱(CD)分析，证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。经检测，所得胶原的热变性峰值温度和热变性焓分别为40.9°C和1.35 J/g ο
[0042]针对实施例1-5和对比例1-4开展差示量热扫描分析(DSC)结果显示(图1-4)，超高压处理后胶原样品的热变性峰值温度和热变性焓比其对应的对比例样品均有了显著提高，确证了超高压处理对胶原热稳定性能的提升效应。从图5中针对实施例1和对比例I开展的CD测试结果可以看到，对比例I和实施例1胶原均具有天然胶原的特征性圆二色吸收峰(190nm处的负峰和220nm处的正峰)，说明两个胶原样品均具有完整的三螺旋分子结构。采用CD软件分析胶原分子二级结构组成发现，实施例1胶原分子中α螺旋构象比例为24.1%，比对比例I胶原明显提高(20.2%)，而无规卷曲构象比例(40.3%)比对比例I胶原(41.1%)有所降低，证实超高压处理后胶原三螺旋构造特征更加显著。
[0043]根据图1?5可以推断得出:超高压处理后，胶原分子的三条肽链间距缩小、螺旋构造变得更加紧密，肽链间键合作用应该得到加强。因此，本发明超高压处理对天然胶原蛋白分子结构影响的机制可以用图6进行示意。从图6可以看出，超高压处理时，三螺旋结构的肽链两端也受到压力，因此可推论:当压力过大时，三螺旋结构可能会从肽链两端进行解离而被破坏。按照上述思路，发明人对实施例3的条件进行了部分修改，在其他参数不变的情况下，操作压力由300MPa变为500MPa，进行胶原样品的超高压处理并冷冻干燥得到处理后的样品。经DSC检测，所得胶原的热变性峰值温度为36.12°C，与对比例2—致，但其热变性焓为
0.97J/g，相比对比例2样品有了显著降低，该结果证实了上述推论。
【主权项】
1.一种利用超高压处理提高胶原热稳定性能的方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: 1)在冰浴条件下，用醋酸水溶液溶解天然胶原得胶原溶液； 2)将上述胶原溶液置于软性包装材料中，抽真空密封包装； 3)将装有胶原溶液的软性包装材料置于超高压容器中，进行超高压处理;处理条件为:压力10MPa?400MPa，保压处理时间为5?120分钟，传压液体介质温度为4°C?30°C; 4)超高压处理完毕后，取出胶原溶液，经冷冻干燥处理即得热稳定性能得以改善的胶原广品O2.根据权利要求1所述的利用超高压处理提高胶原热稳定性能的方法，其特征在于:所述步骤I)中，天然胶原是从哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤或跟腱组织中提取并分离纯化的具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。3.根据权利要求1或2所述的利用超高压处理提高胶原热稳定性能的方法，其特征在于:所述步骤I)中，胶原溶液的浓度为0.1?20mg/mL。4.根据权利要求1或2所述的利用超高压处理提高胶原热稳定性能的方法，其特征在于:所述步骤2)中，软性包装材料为聚乙烯袋和聚丙烯袋。5.根据权利要求1或2所述的利用超高压处理提高胶原热稳定性能的方法，其特征在于:所述步骤3)中，传压液体介质为水。6.根据权利要求3所述的利用超高压处理提高胶原热稳定性能的方法，其特征在于:所述步骤3)中，传压液体介质为水。
【文档编号】A23L3/015GK105918761SQ201610256735
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】汪海波, 汪海婴
【申请人】武汉轻工大学