含有荚膜红细菌及芽孢杆菌菌株的对虾饲料添加剂及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种含有荚膜红细菌和芽孢杆菌菌株的对虾饲料添加剂，其特征在于它是由对虾饲料、荚膜红细菌菌株发酵液、芽孢杆菌菌株发酵液及海藻酸钠组成，其中每100g对虾饲料中添加10g海藻酸钠，添加培养至OD600=0.6的荚膜红细菌菌株发酵液及芽孢杆菌发酵液共20mL，至终浓度为3~6×107个/g。本发明利用荚膜红细菌和芽孢杆菌为饲料添加剂制作对虾食用饲料，饲喂结果显示食用添加荚膜红细菌和芽孢杆菌饲料的对虾相对于食用普通饲料的对虾生长速度大幅提高且免疫力增加明显，利用荚膜红细菌和芽孢杆菌制作饲料，生产周期短，生产成本低，易于控制生长条件，抗菌活性高且可明显增强免疫力，完全具有工业化生产的潜力，具有较好的生产应用前景。CGMCC No：1175320151127 CGMCC No：1175220151127
【专利说明】
含有荚膜红细菌及芽孢杆菌菌株的对虾饲料添加剂及其应用
[0001] 本发明得到973项目"对虾白斑综合征防治的免疫学途径和关键技术原理"，项目 号2012CB114405以及天津师范大学生物学优秀青年教师资助项目，项目号ZX110QN008的资 助。
技术领域
[0002] 本发明属于生物工程技术领域，涉及具有抗菌及产消化酶活性的菌株及其筛选方 法和应用，更具体的说是一种含有荚膜红细菌及芽孢杆菌菌株的对虾饲料及其应用。
【背景技术】
[0003] 凡纳滨对奸(/^(〇/7&〇3郎5 ra/ioa?ei)，又称南美白对奸（/fAiie Prar/?)，凡纳滨对 虾肉质鲜美，并且与中国明对虾和斑节对虾并称为世界三大虾，在我国的对虾养殖业中占 有极其重要的作用。但是随着凡纳滨对虾集约化养殖的发展，对虾疾病的爆发已经对凡纳 滨对虾的养殖构成严重的危害。为解决这一问题，人们最初采用抗生素来控制对虾疾病，但 是抗生素的使用只能起到暂时控制，随着使用时间的增长，大量病原菌产生了抗药性，更加 难以控制。抗生素的使用还会对凡纳滨对虾肠道及周围水环境中的的有些微生物造成损 害，破环微生态的平衡，而且会产生由抗生素残留导致的食品安全问题，从而对人类造成潜 在的危害。鉴于细菌在自然界生物类群中的地位和作用，许多学者开始相关的研究，将细菌 以活的微生物添加剂即益生菌添加到饲料中，通过改善与动物相关的或其周围的微生物群 落，确保增加饲料的利用或增强其营养价值，增强动物对疾病的应答或改善其周围环境的 水质从而有益于动物生长，并有望替代抗生素成为一个重要的研究方向。
【发明内容】
[0004] 本发明为了解决现有的水产高密度养殖模式容易导致养殖病害频发及养殖水体 严重恶化等诸多问题，提供一种含有荚膜红细菌及芽孢杆菌菌株的对虾饲料。饲喂结果显 示食用添加荚膜红细菌和芽孢杆菌饲料的对虾相对于食用普通饲料的对虾生长速度大幅 提高且免疫力增加明显，利用荚膜红细菌和芽孢杆菌制作饲料，生产周期短，生产成本低， 易于控制生长条件，抗菌活性高且可明显增强免疫力等诸多优点，完全具有工业化生产的 潜力，具有较好的生产应用前景 为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容： 一种含有荚膜红细菌菌株的对虾饲料添加剂，其特征在于它是由对虾饲料、荚膜红细 菌菌株发酵液、芽孢杆菌菌株发酵液及海藻酸钠组成，其中每l〇〇g对虾饲料中添加 l〇g海藻 酸钠，添加培养至0D6QQ=0.6(细胞浓度3X108个/mL)的荚膜红细菌菌株发酵液及芽孢杆菌 发酵液共20mL(荚膜红细菌及芽孢杆菌发酵液的体积比为7:3)，至终浓度为3~6 X 107个/g; 所述的荚膜红细菌菌株为你 oc/oAacier R3菌株，保藏编号为CGMCC No: 11753， 所述的芽孢杆菌菌株为B1菌株，保藏编号为CGMCC No:11752。
[0005] 本发明进一步公开了含有荚膜红细菌菌株及芽孢杆菌菌株的对虾饲料添加剂在 提高对虾生长速度方面的应用。以及在制备产消化酶活性方面的应用，其中所述的消化酶 指的是:蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶。特别是对虾饲料在增强对虾免疫力提高其对致病菌的抵 抗力方面的应用。所述的增强对虾免疫力指的是:对虾受到病原菌鳗弧菌感染72h内的累计 死亡率。
[0006] 本发明的两株菌株分别为T?Aoc/o/7ac ier属的荚膜红细菌（T?Aoc/o/7ac ier ，命名为T?Aoc/o/7acie_r caj〇st/_/a it/s R3，已于2015年11 月27 日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为061〇：如：11753;以及及^^仏5印. 属的芽孢杆菌feciDus B1菌株，已于2015年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No: 11752。保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
[0007] 本发明的7?Aoc/o/7acier caj〇st/_/ait/s R3菌株的生物学特性如下： 荚膜红细菌（j?A〇c/〇6acier caj〇st/_/ait/s)，命名为TiAoc/oAacier caj〇st/_/ait/s R3的菌落 菌落不透明，表面湿润粘稠，呈橘黄色，正反面颜色一致，菌落轮廓清晰，菌体易挑起，其菌 落形态见图1，显微镜下菌体呈球状，有固定形态的荚膜，细胞形态见图SJAoc/oAacier caAst/^ait/s菌株属于革兰氏阴性菌，最适生长温度28°C，最适生长pH值在7-8之间。其生理 生化特性如下:能分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇，不分解木糖及阿拉伯糖，不利用尿素、丙 二酸盐，能液化明胶，硝酸盐还原酶及过氧化氢酶阳性，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、氧化 酶、吲哚试验均为阴性。不产溶血毒素。对常用抗生素美洛西林、阿洛西林、头孢噻肟、杆菌 肽、庆大霉素、四环素、罗美沙星、氯霉素呋喃妥因、利福平等敏感，药敏试验采用纸片琼脂 扩散法，抗菌药物纸片购于杭州微生物试剂有限公司。
[0008] 所述油oc/o/?acier caAst/^ait/s R3菌株具有抗菌活性的能力。本发明的菌株对暢 弧菌（KiArio a/^ui^ar?)具有较好的抑制效果，抑菌效果见图3。
[0009] 另外，本发明所述菌株Tttoc/oAacier caAst/2ait/s R3还具有较强的产消化酶的活 性，其中蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶的活性均较高，其三种消化酶活性见图4。
[0010] 本发明的B1菌株的生物学特性如下： 芽孢杆菌邓.），命名为B1的菌落不透明且有皱褶和隆起，表面 湿润粘稠，呈灰白色，菌落轮廓清晰，菌体易挑起，其菌落形态见图1，显微镜下菌体呈杆状， 芽孢着生于营养体细胞中间，细胞形态见图2 jaciDus B1菌株属于革兰氏阴性菌，最适生 长温度28 °C，最适生长pH值为7。其生理生化特性如下:能分解葡萄糖、果糖、鹿糖，不分解木 糖、甘露醇、阿拉伯糖，不利用尿素、丙二酸盐，能液化明胶，硝酸盐还原酶及过氧化氢酶阳 性，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、氧化酶、吲哚试验均为阴性。不产溶血毒素，对常用抗生 素美洛西林、阿洛西林、头孢噻肟、头孢吡肟、杆菌肽、庆大霉素、红霉素、麦迪霉素、四环素、 氯霉素等均敏感，药敏试验采用纸片琼脂扩散法，抗菌药物纸片购于杭州微生物试剂有限 公司。
[0011] 所述caAst/^ait/s R3菌株具有抗菌活性的能力。本发明的菌株对暢 弧菌（KiArio a/^ui^ar?)具有较好的抑制效果，抑菌效果见图3。
[0012] 另外，本发明所述菌株T?Aoc/o/7acie_r caj〇st/_/ait/s R3及B1 均具有较强 的产消化酶的活性，其中蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶的活性菌较高，其三种消化酶活性见图4。
[0013] 本发明进一步公开了具有抗菌及产消化酶活性的菌株的筛选方法，所述的菌株为 T?Aoc/o/7acier capsR3及B1 菌株，该方法包括以下步骤： A、无菌条件下取对虾的全肠于匀浆器中，冰浴研磨，用九盐溶液进行梯度稀释，将各稀 释液取0. lmL分别涂布在2216E培养基及芽孢杆菌分离培养基上，28°C恒温培养后，挑取单 菌落于2216E固体培养基上反复划线进行纯化获得单菌落纯培养物。
[0014] B、将得到的单菌落纯培养物接种在含有指示菌的2216E培养基上进行培养，筛选， 得到具有抗菌活性的油〇c/〇6acier caj〇st/_/ait/s R3菌株。
[0015] C、在上述的具有抗菌活性的菌株的筛选方法中，所述的2216E培养基采用海水配 制。采用海水配置培养基因渗透压没有发生变化，从而保证了海源微生物菌株在筛选中不 会丢失。
[0016] D、将得到的单菌落分别点种于脂肪培养基、脱脂牛乳琼脂培养基和淀粉培养基 上，根据菌落能否产生红斑、蛋白水解圈以及淀粉水解圈筛选能分泌脂肪酶、蛋白酶及淀粉 酶的他capsR3及5aB1 菌株。
[0017] E、在上述的具有产消化酶活性的菌株的筛选方法中，所述的脂肪培养基、脱脂牛 乳琼脂培养基和淀粉培养基均采用九盐溶液配制。采用海水配制培养基因渗透压没有发生 变化，从而保证了海源微生物菌株在筛选中不会丢失。
[0018] 在上述的具有抗菌及消化酶活性的菌株的筛选方法中，所述的2216E培养基采用 常规的2216E培养基即可。作为优选，所述2216E培养基包括以下成分的重量配比：蛋白胨 5g/L，酵母提取物1 g/L，磷酸铁0 · 1 g/L，琼脂20g/L pH7 · 6~7 · 8。
[0019] 在上述的具有抗菌活性的菌株的筛选方法中，作为优选，步骤B中所述指示菌为 mrio a/^uiDar? (暢弧菌，购买于中国科学院微生物研究所，在天津师范大学水生生 物实验室保存）。
[0020] 在上述的具有消化酶活性的菌株的筛选方法中，所述的芽孢杆菌分离培养基采用 常规的芽孢杆菌培养基即可。作为优选，所述芽孢杆菌分离培养基包括以下成分的重量配 比：蛋白胨 l〇g/L，酵母膏 5g/L，葡萄糖 3.5g/L，NaCl 5g/L，K2HP〇4 0.5g/L，MgS〇4 3g/L， MnS〇4 0.025g/L,琼脂 15g/L ρΗ7·4~7.6。
[0021] 在上述的具有抗菌及消化酶活性的菌株的筛选方法中，步骤E中所述脂肪培养基 采用本领域常规的原料配比即可。作为优选，所述的脂肪培养基采用九盐溶液配制，且所述 脂肪培养基包括以下成分的重量配比：营养琼脂l〇〇〇ml，花生油10g，l.6%的中性红lml。
[0022] 在上述的具有抗菌及消化酶活性的菌株的筛选方法中，步骤E中所述脱脂牛乳琼 脂培养基采用本领域常规的原料配比即可。作为优选，所述的脱脂牛乳琼脂培养基采用九 盐溶液配制，且所述脱脂牛乳琼脂培养基包括以下成分的重量配比：营养琼脂l〇〇〇ml，脱脂 牛乳 100ml，pH7.4。
[0023] 在上述的具有抗菌及消化酶活性的菌株的筛选方法中，步骤E中所述淀粉培养基 采用本领域常规的原料配比即可。作为优选，所述的淀粉培养基采用九盐溶液配制，且所述 淀粉培养基包括以下成分的重量配比：可溶性淀粉l〇g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， K2HPO4 lg/L，MgS〇4*7H20 0.2g/L，NaCl 10g/L，琼月旨 18g/L〇
[0024] 本发明更进一步公开了荚膜红细菌菌株Tttoc/oAacier caj〇st/_/ait/s R3在制备抑菌 活性方面的应用;所述的抑菌活性指的是对暢弧菌（a/^uiDar?)的抑制。以及荚 膜红细菌菌株油〇c/〇/?acier R3及芽孢杆菌feciDus B1在制备产消化酶活性 方面的应用，其中所述的消化酶指的是:蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶。实验结果显示:本发明的 舊M^hRhodobactercapsulatusRSj^BacillusWi^J^^ffi^Rhodobactercapsulatus R3及B1菌株用于制备水产动物的微生物混合制剂。由于TPAoc/oAacier caAsuiait/s R3及BaciDus B1菌株具有较强的抗菌活性及产脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶的活 性。因此，可以用于制备水产动物养殖的饲料添加剂及改善养殖水体的微生态制剂。
[0025]本发明公开的含有荚膜红细菌菌株及芽孢杆菌菌株的对虾饲料添加剂与现有技 术相比所具有的积极效果在于： 本发明的菌株他〇c/〇6acie_r caj〇st/_/ait/s R3和feciWus B1，是本发明人从对4下肠道 中筛选的两株新的菌株，其中油〇t/o/?acier caAst/Jaius R3菌株具有较强的抗菌活性及产 消化酶活性，B1菌株具有较强的产消化酶的活性，本发明提供了一种新的具有抗 菌活性及提高消化能力的海源动物肠道微生物混合制剂，为利用动物内源性活性菌株用于 水产动物养殖中的病害防治、提高水产动物对饲料的消化吸收率以及改善水质等方面提供 新方法，促进水产养殖业的良性发展。
[0026]【附图说明】： 图1(a)是本发明荚膜红细菌菌落形态图，图1(b)是本发明芽孢杆菌菌落形态图； 图2(a)是本发明荚膜红细菌菌株的显微（100X)照片图，图2(b)是本发明芽孢杆菌菌 株的显微(100 X)照片图； 图3是本发明荚膜红细菌菌株的鳗弧菌拮抗图； 图4是本发明荚膜红细菌菌株的3种消化酶活性图；其中（a)蛋白酶阳性，（b)淀粉酶阳 性，（c)脂肪酶阳性； 图5 (图5,1-1到1-3)是对虾血细胞中相关免疫基因的的定量测定结果;其中（a)超氧 化物气化酶基因相对表达量图，（b)酚氧化酶原基因相对表达量图，（c)抗菌肽基因相对表 达量图，（d)溶菌酶基因相对表达量图，（e)细胞粘附因子基因相对表达量图； 图6(图6,1-1到1-3)是对虾血浆相关免疫相关酶活力测定结果;其中(a)酸性磷酸酶活 力图，（b)过氧化氢酶活力图，（c)溶菌酶活力图，（d)过氧化物酶活力图，（e)超氧化物歧化 酶活力图，（f)酚氧化酶活力图； 图7(图7，1-1到1-2)是对虾肠道消化酶活力的测定结果;其中（a)蛋白酶活力图，（b) 淀粉酶活力图，（c)脂肪酶活力图； 图8对虾体重增加率图； 图9是攻毒试验后对虾死亡率统计结果。
[0027]
【具体实施方式】
[0028] 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段 均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的 范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本 发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也 属于本发明的保护范围。
[0029]本发明所用到的原料来源如下：
实施例1 本实施例中所用的凡纳滨对虾取自天津市汉沽区鑫永丰对虾养殖场； 本实施例中所用的2216E培养基采用九盐溶液配制； 本实施例中所用的2216E培养基包括以下成分的重量配比：蛋白胨5g/L，酵母提取物 lg/L，磷酸铁0 · lg/L，琼脂20g/L pH7 · 6~7 · 8。
[0030] 本实施例中所述的指示菌为暢弧菌（mrio 购买于中国科学院微 生物研究所，在天津师范大学水生生物实验室保存。
[0031 ]本实施例的T?Aoc/o/7acier caj〇st/_/ait/s R3菌株的筛选方法： 菌株的分离纯化:无菌条件下取对虾的全肠于匀浆器中，冰浴研磨，用九盐溶液对研磨 液进行ΠΓ1~10-8的梯度稀释;选取梯度为10-3~10- 7的稀释液各O.lmL涂布在2216E培养基 上；28 °C恒温培养24~48h;取单菌落在2216E培养基上进行3~5次连续划线分离纯化，获得 的纯化后的菌株分别在4°C及_80°C下进行短期及长期保存。
[0032] 对纯化后的菌株进行抑菌活性试验：将指示菌鳗弧菌接种于TSB液体培养基中， 37°C恒温摇床16~18h;将活化后的指示菌用分光光度计测定其0D600的值，当0D值在0.6~ 0.8之间浓度为宜;取指示菌悬液150yL均匀涂布于TSA固体培养基中，将平板划分成不同的 区域并标记;将纯化后的菌株转接液体培养基中振荡培养过夜，用无菌的镊子夹取无菌滤 纸片置于培养液中浸透菌液，放置在培养皿的相应位置，28°C恒温培养24h，观察记录拮抗 斑的产生情况对有抑菌活性的菌株进行筛选，得到有抗菌活性的菌株仙oc/okc ter 。3/75^/^3如5 1?3，该菌株已于2015年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏编号为CGMCC No:11753。
[0033] 实施例2 本实施例具有产消化酶活性的油oc/oAacier R3菌株及ifeciDus B1菌株 的筛选方法，其分离纯化方法同实施例1中，区别仅在于将实施例1中的2216E培养基改为芽 孢杆菌分离培养基，这里不再赘述。其中芽孢杆菌分离培养基包括以下成分的重量配比：蛋 白胨 10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖3.5g/L，NaCl 5g/L，K2HP〇4 〇.5g/L，MgS〇4 3g/L，MnS〇4 0.0258/1，琼脂158/1口!17.4~7.6。
[0034] 对纯化后的菌株进行消化酶活性试验： A、将纯化后的菌株转接液体培养基中28 °C恒温振荡培养过夜，用无菌的镊子夹取无菌 滤纸片置于培养液中浸透菌液，放置在制备好的脱脂牛乳培养基的对应位置上，28°C恒温 培养24h，对能分解蛋白质而产生透明圈的菌株进行筛选。
[0035] B、将纯化后的菌株转接液体培养基中28°C恒温振荡培养过夜，用无菌的镊子夹取 无菌滤纸片置于培养液中浸透菌液，放置在制备好的淀粉培养基的对应位置上，28°C恒温 培养24h，碘液覆盖后对能分解淀粉而产生透明圈的菌株进行筛选。
[0036] C、将纯化后的菌株转接液体培养基中28°C恒温振荡培养过夜，用无菌的镊子夹取 无菌滤纸片置于培养液中浸透菌液，放置在制备好的脂肪培养基的对应位置上，28°C恒温 培养24h，对能分解脂肪而形成红色的菌株进行筛选。
[0037] 本实施例中所用的脱脂牛乳培养基包括以下成分的重量配比：营养琼脂1000ml， 脱脂牛乳100ml，pH7.4。
[0038] 本实施例中所用的淀粉培养基包括以下成分的重量配比：可溶性淀粉10g/L，蛋白 胨 10g/L，酵母提取物5g/L，K2HP〇4 lg/L，MgS〇4.7H20 0.2g/L，NaCl 10g/L，琼脂 18g/L。
[0039] 本实施例中所用的脂肪培养基包括以下成分的重量配比：营养琼脂1000ml，花生 油10g，l.6%的中性红lml。经上述方法筛选，最终得到具有产三种消化酶活性的菌株 Rhodobacter capsulatus
[0040] 实施例3 选取上述实施例得到的本发明具有抗菌活性及产消化酶活性的仙〇 (6/ ο a c ? e r R3菌株进行鉴定和分析，具体鉴定和分析方法以及相应的鉴定结果如下所示。 [0041]采用上述实施例的方法筛选得到的具有抑菌活性及产消化酶活性的油oc/ofecier ca/xsdatos R3菌株接种到2216E培养基平板上，在28°C条件下倒置培养24h，观察其菌落的 生长状态，菌株形态及生理生化试验参照工业微生物试验技术手册(诸葛健、王正祥，工业 微生物试验技术手册[M]，中国轻工业出版社，1994年)和伯杰氏细菌鉴定手册(R.E布坎南， N.E吉本斯，伯杰氏细菌鉴定手册[M]，科学出版社，北京，1984年）。在恒温培养箱中观察其 在4°O50°C间的生长情况。
[0042] 上述7?Aoc/o/7acier cajOst/Jait/s R3菌株形态学及生理生化特征的鉴定结果表明： 如图1所示，本发明的油oc/o/jacier cajOsWait/s R3菌株的菌落不透明，表面湿润粘稠， 呈橘黄色，正反面颜色一致，菌落轮廓清晰，菌体易挑起，其菌落形态见图1，显微镜下菌体 呈球状，有固定形态的荚膜，细胞形态见图SJAoc/oAacier caAst/^ait/s菌株属于革兰氏阴 性菌，最适生长温度28°C，最适生长pH值在7-8之间。能分解葡萄糖、果糖、鹿糖、甘露醇，不 分解木糖及阿拉伯糖，不利用尿素、丙二酸盐，能液化明胶，硝酸盐还原酶及过氧化氢酶阳 性，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、氧化酶、吲哚试验均为阴性。不产溶血毒素。对常用抗生 素美洛西林、阿洛西林、头孢噻肟、杆菌肽、庆大霉素、四环素、罗美沙星、氯霉素呋喃妥因、 利福平等敏感。
[0043] 实施例4 选取上述实施例得到的本发明具有产消化酶活性的B1菌株进行鉴定和分 析，具体鉴定和分析方法同实施例3,此处不再赘述，相应的鉴定结果如下所示。
[0044] 上述ifeciDus B1菌株形态学及生理生化特征的鉴定结果表明： 如图1所示，本发明的B1菌株菌落不透明且有皱褶和隆起，表面湿润，呈灰白 色，菌落轮廓清晰，菌体易挑起，显微镜下菌体呈杆状，芽孢着生于营养体细胞中间细胞形 态见图2 JaciDus S/7.B1菌株属于革兰氏阳性菌，最适生长温度28°C，最适生长pH值为7。 能分解葡萄糖、果糖、鹿糖，不分解木糖、甘露醇、阿拉伯糖，不利用尿素、丙二酸盐，能液化 明胶，硝酸盐还原酶及过氧化氢酶阳性，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、氧化酶、吲哚试验均 为阴性。不产溶血毒素，对常用抗生素美洛西林、阿洛西林、头孢噻肟、头孢吡肟、杆菌肽、庆 大霉素、红霉素、麦迪霉素、四环素、氯霉素等敏感。
[0045] 实施例5 本发明的你〇〇?〇/^<^61· caj〇st/_/ait/s R3及B1菌株的生产应用研究。
[0046] 所述仙oc/o/jacier ca/7st/_/ait/s R3及 B1 菌株在生产中的应用是将 Rhodobacter capsulatus Wi及Bacillus W[麗株按一定比例混合添加到饲料原粉中，喂 食给凡纳滨对虾一定时期，观察并测定其生长状态和自身免疫力的相对变化。具体方法如 下： 本发明的他oc/oAacier caj0st/_/ait/s R3及B1菌株分别于液体2216E培养基 及芽孢杆菌分离培养基中进行逐级扩大培养，制备大量菌株的发酵液，同时测定发酵液的 细胞浓度。
[0047] 其中逐级扩大培养，制备大量菌株的发酵液的方法如下： 首先将斜面保存他oc/oAacier caj〇st/_/ait/s R3及B1菌种分别接种于2216E 及芽孢杆菌液体培养基中（培养基配方见实施例1)，28°C恒温摇床振荡培养16~18h，按1%接 种量分别转接于50mL相应液体培养基中，500mL三角瓶中装液体培养基50mL，摇床转速 200rpm，28°C恒温摇床振荡培养16h，再按2%接种量分别转接于10L发酵罐中放大培养，以 70%的罐装量，初始pH设定为7.0-7.2，培养温度28 °C，通风1:0.8，当培养至0D600为0.8时结 束发酵，所得菌液用于制备对虾饲料。
[0048] 将扩大培养的发酵液添加到对虾饲料原粉中制作饲料，制作饲料的方法如下： 将制备的菌株的发酵液进行混合按照7:3的比例混合并添加到饲料原粉中，使饲料中 细菌的终浓度为3~6 X 107个/g，在饲料的制备过程中按照每100g饲料中添加10g海藻酸钠 的比例添加海藻酸钠，利于饲料成型。使饲料原粉与菌液和海藻酸钠充分混合均匀。
[0049] 饲料加工的方法如下： 将混合好的饲料揉成团状，用颗粒剂机制直径为2mm的颗粒。饲料每7天制备一次，制备 量随凡纳滨对虾的生长而不断增加。
[0050] 饲喂的方法如下： 将制备好的饲料喂食对虾，分为试验组和对照组，每组投放600尾重约3.5g的凡纳滨对 虾。按凡纳滨对虾体重的5%投放饲料，每天投喂4次。记录水质的变化，并及时换水，防治残 饵在水中时间过长引起水质变化影响凡纳滨对虾的生长和健康。
[0051] 取样与处理:每7天为一个周期，进行一次取样，取样时每组随机取30~40尾凡纳滨 对虾并记录凡纳滨对虾的体重;从凡纳滨对虾围心腔处抽取血淋巴，按照1:1的比例加入抗 凝剂，并在4°C，800g离心10min，获得血细胞和血清。将血细胞中加入lmL Trizol置于-80°C 保存，血清置于4°C待用;取凡纳滨对虾的肠道，去除粪便后用试剂盒中的酶提取缓冲液，研 磨制备组织样品。
[0052] 本实施例中所用的抗凝剂包括以下成分的配比： KC1:10 mM;NaCl:450 mM;HEPES:10 mM;EDTA(Na2):10 mM;PH:7.45。
[0053] 试验组对虾各项生理指标的测定：用取样所得的血细胞提取RNA，反转为cDNA，以 其为模板运用实时荧光定量的方法测定对虾相关免疫基因酚氧化酶原基因、超氧化物歧化 酶基因、溶菌酶基因、细胞黏附因子基因和抗菌肽基因的定量表达，具体测定方法见实施例 8。对试验组对虾及对照组对虾的血液及肠道进行取样，所得的血清和肠道组织研磨液，用 试剂盒(苏州科铭试生物试剂有限公司）测定试验组对虾非特异性免疫相关酶活性，具体包 括:酚氧化酶、过氧化物酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶及溶菌酶活力的 测定，测定方法见实施例9。对试验组对虾及对照组对虾的肠道进行取样，所得的肠道组织 研磨液，用试剂盒(苏州科铭试生物试剂有限公司）测定试验组对虾肠道蛋白酶、淀粉酶及 脂肪酶活力的变化，具体测定方法见实施例10。此外，还测定了试验组对虾及对照组对虾的 体重变化差异，以及在受到病原菌刺激的情况下死亡率的差异，具体测定方法分别见实施 例11和实施例12。
[0054] 实施例6 喂食TiAoc/oAacier R3及B1菌株后，对奸相关免疫基因表达量 的变化： RNA的提取:将上述取样的对虾血细胞，加入lmL Trizol; 4°C，12000g离心10 min;取 上清，静置5分钟，使其完全裂解。然后加200yL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置 12000g，离心15min，离心后分三相：下层浅红色酸，氯仿相是蛋白质，中间相是DNA，上层无 色水相是RNA。取无色水相，加500yL异丙醇，轻轻混匀，静置15min，沉淀1?祖。4°(：，12000 8离 心10 min，弃上清倒置控干；加入lmL75%的乙醇，用枪头轻揉吹打使RNA漂浮起来；4°C、 7500g离心6 min，弃上清倒置控干约15 min;加入适量的DEPC水，在55°C中水浴5 min后置 于-80°C冰箱中保存。提取的血细胞总RNA经1%甲醛琼脂糖凝胶电泳与NAN0Drop2000进行定 性和定量检测，确认RNA完整性后用于cDNA的合成。
[0055] 第一链cDNA的合成：以2yg凡纳滨对虾血细胞总RNA为反转录模板401^(5'_ GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T) 16-3 '）为反转引物，根据以下反应合成第一链cDNA: 表1第一链cDNA反应体系
相关免疫基因的定量测定:将上述得到的cDNA作为Real-time PCR的模板，以#actin 作为内参引物，Real-time PCR的反应体系为:95°C预变性30s，一个循环；95°C变性5s，60 °C退火30s，40个循环;最后经60°C升温到95°C，每个循环上升0.5°C进行融解曲线分析。所 获得的数据经统计分析后使用2_AACt法计算，采用t检验分析目的基因显著性差异，所用 不同免疫基因的引物序列如下。
[0056]表2实验用引物
表3实时定量PCR反应体系
试验结果显示，喂食添加本发明的他〇c/〇6acier caj〇st/_/ait/s R3及ifeciDus B1混合 菌株饲料的试验组对虾的免疫基因的表达量呈上调趋势，同时试验组比对照组的免疫基因 表达量明显增加，具体结果见图5，从分子的水平证明了喂食添加本发明的5aciDus s/7. B1 菌株饲料的对虾的免疫力明显提高。
[0057] 实施例7 养殖对虾相关免疫酶活的测定:所取样本中蛋白含量测定用购于苏州科铭试生物试剂 有限公司的考马斯亮蓝试剂盒。
[0058] 蛋白质含量(yg/mL)=标准蛋白质浓度X (A测定-A空白）/(A标准-A空白）。
[0059] 酚氧化酶活力的测定：酚氧化酶活力的测定使用苏州科铭生物有限公司的试剂 盒，按照试剂盒说明书进行操作。本试验定义每mg蛋白在反应体系中使525nm处吸光值变化 0.01为一个酶活力单位。
[0060] 酸氧化酶活力(U/mg prot)=反应总体积/样本体积/反应时间/0.01 X (A测定-A对 照)/蛋白质浓度(mg/mL )。
[0061] 过氧化物酶活力的测定:过氧化物酶活力的测定使用苏州科铭生物有限公司的试 剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。本试验定义每mL血清在反应体系中没分钟A470变化 0.01为一个酶活力单位。
[0062] 过氧化物酶活力(U/mL)=反应总体积/样本体积/0 · 01 X Δ A 酸性磷酸酶活力的测定：酸性磷酸酶活力的测定使用苏州科铭生物有限公司的试剂 盒，按照试剂盒说明书进行操作。本试验定义37°C中每毫升血液每分钟催化产生Ιμπιο?酚为 一个酶活力单位。
[0063]酸性磷酸酶活力(U/mL)= [C标准品X (Α测定管-Α对照管）+ (Α标准管-Α空白管） ><￥反总]+￥样><￥样总+ 1'。
[0064]超氧化物歧化酶S0D活力的测定:超氧化物歧化酶活力的测定使用苏州科铭生物 有限公司的试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。本试验定义在黄嘌呤氧化酶偶联反应体 系中抑制率为50%时，反应中的S0D酶活力为一个酶活力单位。
[0065] 抑制百分率=(A对照管-A测定管)/A对照管X 100% S0D活性(U/mL )=抑制百分率八1 -抑制百分率） 过氧化氢酶活力的测定:过氧化氢酶活力的测定使用苏州科铭生物有限公司的试剂 盒，按照试剂盒说明书进行操作。本试验定义每毫升血清每秒分解lymol的过氧化氢的量为 一个活力单位。
[0066] 过氧化氢酶活力(U/mL)=(A对照-Α测定）Χ271/(60Χ取样量）Χ样本测试前稀释 倍数。
[0067] 溶菌酶活力的测定：以溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus)冻干粉(南京建 成生物工程研究所生产）为底物，用0.1M pH6.4的磷酸钾缓冲液配制底物悬液，使0D570nm ~0.3~0.5。在96孔板中加入血清和菌悬液，血清：均血液=1:10，测定570nm出的吸光值即 为初始吸光值A0。37 °C水浴15min，冰浴3min，测定570nm出的吸光值即为A。溶菌酶活力(U/ mL)=(A0_A)/A〇
[0068] 试验结果显不，喂食添加本发明的T?Aoc/o/7acie_r caj〇st/_/ait/s R3及 B1 菌株混合饲料的试验组对虾的酚氧化酶、过氧化物酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶SOD、过 氧化氢酶及溶菌酶活力等特异及非特异免疫酶活相对于对照组对虾均有不同程度的提高， 具体结果见图6,从酶活的水平证明了喂食添加本发明的仙oc/o/?acier caAst/Jaius R3及 B1菌株饲料的对虾的免疫力明显提高。
[0069] 实施例8 养殖对虾肠道消化酶活力的测定方法如下： A、蛋白酶活力的测定:蛋白酶活力的测定使用苏州科铭生物有限公司的试剂盒，按照 试剂盒说明书进行操作。本试验定义30°C每毫克蛋白每分钟水解产生lwnol酪氨酸为一个 活力单位。
[0070] 蛋白酶活力(U/mg prot)=C标准品X (A测定-A空白）/(A标准-A空白）X稀释倍数/ (蛋白质含量X待测物的体积）。
[0071] B、淀粉酶活力的测定:淀粉酶活力的测定使用苏州科铭生物有限公司的试剂盒， 按照试剂盒说明书进行操作。本试验定义每mg组织蛋白每分钟催化产生lmg还原糖为一个 酶活力单位。
[0072] 淀粉酶活力(U/mg prot)=89.4X(A测定管-A对照管+0.022)/蛋白质含量 C、脂肪酶活力的测定:脂肪酶活力的测定使用苏州科铭生物有限公司的试剂盒，按照 试剂盒说明书进行操作。本试验定义37°C中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成Ιμπιο?脂肪 酸为一个酶活力单位。
[0073] 脂肪酶活力(U/mg prot)=[C标准品XV标准品X (Α测定管-Α空白管)/(Α标准关-Α 空白管）V(蛋白含量X上清总体积/加入到反应体系的上清体积)/反应时间. 试验结果显示，喂食添加本发明的他0c/06acier caj0st/_/ait/s R3及ifeciDus B1混合 菌株饲料的试验组对虾肠道的蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活力相对于对照组对虾均有不同程 度的提高，具体结果见图7,表明喂食添加本发明的仙ot/o/?acier capst/Jait/s R3及 ifeciDus B1混合菌株饲料的对奸对饲料的消化吸收能力明显提高。
[0074] 实施例9 养殖对虾体重增加率的测定:试验开始前，每组养殖池中随机取出50尾凡纳滨对虾，测 定其体重，并进行记录M0，饲喂试验结束后，每组养殖池中随机取50尾测定其体并进行记录 M。通过计算得出每组对虾的体重增加率:体重增加率(WGR，％)=(M-M0)/M0X100%。
[0075] 试验结果显不，喂食添加本发明的T?Aoc/o/7acie_r caj〇st/_/ait/s R3及 B1 混合菌株饲料的试验组对虾的体重与比对照组相比较显著增加，具体结果见图8。
[0076] 实施例10 养殖对虾攻毒试验后死亡率的测定:在饲喂试验结束后，每组取90尾大小均匀的凡纳 滨对虾进行攻毒试验，每组的90尾对虾随机分成三个平行。将制备好的致病菌鳗弧菌，通过 在对虾的第二腹节进行肌肉注射进行攻毒试验，注射菌的浓度为3.58X107cell/mL，注射 量为15yL。攻毒完成后，观察对虾存活情况，记录对虾的死亡数量，计算出72h内的对虾死亡 率。
[0077] 试验结果显示:对经过饲喂的对虾随机取样测定其在受到病原菌鳗弧菌感染72h 内的累计死亡率，结果见图9所示，可以得出喂食添加本发明的T?Aoc/o/7acier cajOst/Jait/s R3及B1混合菌株饲料的试验组对虾，其累计死亡率明显低于空白组，说明添加 混合菌株的饲料在提高对奸免疫力进而提高其对致病菌的抵抗能力起到一定的作用。
[0078] 实施例11 含有荚膜红细菌菌株的对虾饲料添加剂，它是由对虾饲料、荚膜红细菌菌株发酵液、芽 孢杆菌菌株发酵液及海藻酸钠组成，其中每l〇〇g对虾饲料中添加 l〇g海藻酸钠，添加培养至 0D6qQ=0.6(细胞浓度3X108个/mL)的荚膜红细菌菌株发酵液及芽孢杆菌发酵液共20mL(荚 膜红细菌及芽孢杆菌发酵液的体积比为7 : 3)，至终浓度为3 X 107个/g;所述的荚膜红细菌 菌株为油oc/oAacier R3菌株，保藏编号为CGMCC No: 11753,所述的芽抱杆菌菌 株为feciDus B1菌株，保藏编号为CGMCC No: 11752。
[0079] 将混合好的饲料揉成团状，用颗粒剂机制直径为2mm的颗粒。饲料每7天制备一次， 制备量随凡纳滨对虾的生长而不断增加。
[0080] 实施例12 一种含有荚膜红细菌和芽孢杆菌菌株的对虾饲料添加剂，它是由对虾饲料、荚膜红细 菌菌株发酵液、芽孢杆菌菌株发酵液及海藻酸钠组成，其中每l〇〇g对虾饲料中添加 l〇g海藻 酸钠，添加培养至0D6(X)=0.6，细胞浓度3 X 108个/mL的荚膜红细菌菌株发酵液及芽孢杆菌发 酵液共20mL，其中荚膜红细菌及芽孢杆菌发酵液的体积比为7: 3，至终浓度为6 X 107个/g; 所述的荚膜红细菌菌株为你 oc/oAacier R3菌株，保藏编号为CGMCC No: 11753， 所述的芽孢杆菌菌株为B1菌株，保藏编号为CGMCC No:11752。
[0081] 本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神做举例说明，本发明所属技术领域的 技术人员可以对所描述的具体实施例做相应的修改和补充或采用类似的方式替代，但并不 会偏离本发明的精神或者超越所者所附权利要求书所定义的范围。尽管本发明已作出详细 的说明书并引证了一些具体实施例，但是对本领域所熟练技术人员来说，只要不离开本发 明的精神和范围可做相应变化或修正是显然的。
【主权项】
1. 一种含有荚膜红细菌和芽孢杆菌菌株的对虾饲料添加剂，其特征在于它是由对虾饲 料、荚膜红细菌菌株发酵液、芽孢杆菌菌株发酵液及海藻酸钠组成，其中每l〇〇g对虾饲料中 添加 l〇g海藻酸钠，添加培养至0D6()()=0.6，细胞浓度3 X 108个/mL的荚膜红细菌菌株发酵液 及芽孢杆菌发酵液共20mL，其中荚膜红细菌及芽孢杆菌发酵液的体积比为7:3，至终浓度为 3~6X10 7个/g;所述的荚膜红细菌菌株为caAst/2ait/s R3菌株，保藏编号为 CGMCC No: 11753,所述的芽孢杆菌菌株为feciDus B1菌株，保藏编号为CGMCC No: 11752。2. 权利要求1所述含有荚膜红细菌菌株及芽孢杆菌菌株的对虾饲料添加剂在提高对虾 生长速度方面的应用。3. 权利要求1所述含有荚膜红细菌菌株及芽孢杆菌菌株的对虾饲料添加剂在制备产消 化酶活性方面的应用，其中所述的消化酶指的是:蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶。4. 权利要求1所述含有荚膜红细菌菌株及芽孢杆菌菌株的对虾饲料添加剂在增强对虾 免疫力提高其对致病菌的抵抗力方面的应用。5. 权利要求3所述的应用，其中的增强对虾免疫力指的是:对虾受到病原菌鳗弧菌感染 72h内的累计死亡率。
【文档编号】A23K50/80GK105935108SQ201610363254
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】左志晗, 孙金生, 窦春萌, 李艳红, 邵迎春
【申请人】天津师范大学