一种植物乳杆菌发酵豆粕的方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物乳杆菌发酵豆粕的方法，其包括，酶解，每100g豆粕中添加质量百分比为0.3％～0.7％的碱性蛋白酶、45％～55％的水，以及1％～5％的糖蜜原液，混合均匀后密封室温酶解20h～28h，得到酶解后的豆粕；发酵，向所述酶解后的豆粕中以4～6％的接种量接种对数期的乳酸菌菌液，混合均匀后密封置于35℃～40℃培养44h～52h，得到发酵后的豆粕。本发明中提供的菌种生长迅速，在与少量碱性蛋白酶配合使用条件下，能在28h内迅速增殖并大量产酸，发酵豆粕效率极高。
【专利说明】
一种植物乳杆菌发酵豆粕的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体说涉及一种植物乳杆菌发酵豆柏的方法。
【背景技术】
[0002] 豆柏是畜禽最重要的植物性蛋白源，其粗蛋白含量高，营养丰富并有较平衡的氨 基酸组成，但由于豆柏中存在多种抗原物质和抗营养因子，较大程度上，限制了豆柏营养作 用及充分发挥，同时也影响了动物的健康生长，这些物质已被确定为诱导幼龄动物消化道 疾病的最关键因素之一，影响了豆柏在饲料工业中的应用。如何消除抗原蛋白对动物生产 的影响一直是人们关注的焦点。目前为止，微生物发酵处理被认为是目前最安全、有效的处 理方法。
[0003] 在饲料发酵中，乳酸菌发酵是被公认的最传统、最安全的发酵菌种，并被称为益生 菌。Frias等研究指出，用乳酸菌发酵豆柏，乳酸菌能进一步降解，并把有效蛋白质作为营养 源，产生生物活性肽，发酵产生乳酸，导致pH降低，而且，产生保护剂，如酸和抗菌素类物质 (细菌素）。
[0004] 发酵豆柏的核心是降解大分子蛋白，使豆柏中的大分子蛋白降解为多肽、小肽和 游离氨基酸等小分子。大豆蛋白经蛋白酶酶解后，更易于消化吸收，并促进了乳酸菌等益生 菌的生理活性发挥和生长发育，然而，大豆蛋白酶解后，会产生一种令人难以接受的苦味。 乳酸菌发酵豆柏后，会产生酸甜的芳香气味，pH值下降，可以有效改善酶解豆柏的适口性。 有研究表明，从特定食物中分离出的乳酸菌是该食物进行乳酸发酵的最佳出发菌株，因为 它们比其它来源的乳酸菌具有更强的竞争，而且可以缩短发酵时间，目前已经存在混菌发 酵生产发酵豆柏的生产工艺，但发酵豆柏所采用的菌株往往不能在较短的时间内，全面，彻 底地降解抗营养因子，提高小肽的含量。
【发明内容】
[0005] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施 例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部 分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
[0006] 鉴于上述和/或现有植物乳杆菌发酵豆柏的方法中存在的问题，提出了本发明。
[0007] 因此，本发明的目的是提供一种植物乳杆菌发酵豆柏的方法，其采用了一株从青 贮中分离的植物乳杆菌的同时添加了适量的碱性蛋白酶并着重对其发酵工艺进行了改进， 在保证发酵豆柏质量的同时不仅大大减少了蛋白酶的使用量还缩短了发酵周期，提高了生 产率。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种植物乳杆菌发酵豆柏的 方法，其包括，酶解，每l〇〇g豆柏中添加质量百分比为〇. 3%~0.7%的碱性蛋白酶、45%~ 55 %的水，以及1 %~5%的糖蜜原液，混合均匀后密封室温酶解20h~28h，得到酶解后的豆 柏;发酵，向所述酶解后的豆柏中以4~6%的接种量接种对数期的乳酸菌菌液，混合均匀后 密封置于35°C~40°C培养44h~52h，得到发酵后的豆柏。
[0009] 作为本发明所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法的一种优选方案，其中：所述乳酸 菌来源自中国普通微生物菌种保藏中心，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，菌种保藏 号CGMCC8198。
[0010] 作为本发明所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法的一种优选方案，其中：所述酶解， 每100g豆柏中添加质量百分比为0.5%的碱性蛋白酶。
[0011] 作为本发明所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法的一种优选方案，其中：所述酶解， 每100g豆柏中添加质量百分比为50%的水。
[0012] 作为本发明所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法的一种优选方案，其中：所述酶解， 每100g豆柏中添加质量百分比为3%的糖蜜原液。
[0013] 作为本发明所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法的一种优选方案，其中：所述酶解， 混合均匀后密封室温酶解24h，得到酶解后的豆柏。
[0014] 作为本发明所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法的一种优选方案，其中：所述发酵， 向所述酶解后的豆柏中以5%的接种量接种对数期的乳酸菌菌液。
[0015] 作为本发明所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法的一种优选方案，其中：所述发酵， 混合均匀后密封置于37°C培养48h，得到发酵后的豆柏。
[0016] 作为本发明所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法的一种优选方案，其中：在所述酶 解前，还包括，风干，将豆柏风干至水分质量百分比为原质量的5%~15%。
[0017] 本发明的有益效果:本发明中提供的菌种生长迅速，在与少量碱性蛋白酶配合使 用条件下，能在28h内迅速增殖并大量产酸，经检测，除常见的乳酸，乙酸，丙酮酸，丙酸外还 有柠檬酸和苹果酸等常用食品添加剂，故本发明在保证降解了豆柏中大分子蛋白，抗营养 物质的同时大大改善了酶解豆柏的适口性。故本发明中的用乳酸菌和蛋白酶联合发酵豆柏 是一种非常简便实用，高效的发酵豆柏生产方法。
【具体实施方式】
[0018] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对 本发明的【具体实施方式】做详细的说明。
[0019] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以 采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的 情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0020] 其次，此处所称的"一个实施例"或"实施例"是指可包含于本发明至少一个实现方 式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的"在一个实施例中"并非均指 同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0021 ]在本发明中，如果没有特殊说明，百分数（％ )都指相对于风干豆柏的重量百分数。 [0022]在本发明中，如果没有特别说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形 成新的技术方案。
[0023]在本发明中，如果没有特殊说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式 可以相互组合形成新的技术方案。
[0024]在本发明中，如果没有特殊说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以 相互组合形成新的技术方案。
[0025] 在本发明中，若果没有特别指出，本说明书所用的术语"一种"指"至少一种"。
[0026] 在本文中，除非另有说明，各反应都在常温常压下进行。
[0027] 菌株
[0028] 本发明的发明人经过多次试验，优选了一株从青贮中分离的乳杆菌。购买自中国 普通微生物菌种保藏中心，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，菌种保藏号CGMCC8198。 用该乳酸菌发酵豆柏，乳酸菌能进一步降解，并把有效蛋白质作为营养源，产生生物活性 肽，另外发酵可产生保护剂如，酸和抗菌素类物质(细菌素)等。结合少量碱性蛋白酶使用， 不仅能将低聚糖，抗原蛋白TI等抗营养因子降解殆尽，还能显著提高酸溶蛋白含量，使发酵 豆柏品质明显改善。在畜禽养殖中，利用该乳酸菌发酵来提高豆柏的抗氧化具有许多优点：
[0029] 首先，研究表明该乳酸菌具有抗氧化活性，乳酸菌作为肠道常驻菌群，可以直接在 机体氧化损伤的重点部位一肠道发挥抗氧化作用，维持肠道处于氧化还原平衡状态。并且 乳酸菌在肠道定植后还能不断增殖，产生更多能够发挥抗氧化作用的乳酸菌，源源不断地 在肠道扮演R0S清道夫的角色。
[0030] 其次，该乳酸菌作为最广泛使用的益生菌，一方面能够产生乳酸、乙酸等物质降低 肠道pH值，从而不利于在碱性环境中生长的腐败菌的增殖;另一方面，大多数乳酸菌在代谢 过程中都能合成乳酸菌素，它具有抑制和杀死多数革兰氏阳性致病菌和腐败菌的作用，部 分乳酸菌素对革兰氏阴性菌有效，并通过抑制肠道病原菌的增殖进一步实现抗氧化、保护 肠粘膜、改善肠道微环境的功能。
[0031] 最后，微生物发酵豆柏制备出的发酵豆柏，不但可以提高豆柏的营养价值和适口 性，还可以有效缓解早期断奶对幼龄动物造成的氧化应激和腹汚，可以作为配制幼龄动物 饲粮的一种优质蛋白营养源，对保持幼龄动物的生长发育和健康，有效地实施幼龄动物早 期断奶技术，提高动物生产水平和生产效率具有重要意义。
[0032]在本发明的下述实施例中，
[0033] 抑菌试验:牛津杯抑菌试验，牛津杯外径8mm。
[0034] 发酵豆柏中各种有机酸的含量:参考GBT 5009.157-2003食品中有机酸的测定，高 效液相色谱法。
[0035]抗原蛋白的降解程度:采用聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳。
[0036] 实施例2:植物乳杆菌Lactobacilus plantarum CGMCC8198的抑菌性实验
[0037] 2.1:指示菌菌悬液的制备大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等致病菌甘油管 接种于培养基中，在37°C摇床200r/min培养16-18小时。
[0038] 2.2:乳酸杆菌菌悬液的制备无菌条件下称取相当于约10亿CFU量的乳酸菌菌粉 (如果是包衣产品需要在称样前无菌条件下研磨释放乳酸菌），接种于100mL MRS液体培养 基中，37°C静置培养24~48h。
[0039] 2.3:双层平板的制备取直径约90mm的平板，分别倾注加热融化的营养琼脂培养基 18~20mL，使其在平板内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取半固体营养琼 脂培养基(琼脂含量为1 % )适量加热融化后，放冷至48-50°C，没50-100mL培养基加入指示 菌菌悬液0.1-0.2mL，在每1个平板中分别加入5mL，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。放置 在水平台面上冷却后，在每1平板中以等距离均匀安置牛津杯4个备用。
[0040]其中营养琼脂培养基配方如下：胰蛋白胨l〇g，酵母提取物5g，NaCl lOg用去离子 水定容至1L.固体培养基需添加15~20g琼脂，半固体培养基需添加10g琼脂。
[0041 ] 2.4:抑菌实验取2.2步骤中准备的抑菌物质，每个双层平板中的牛津杯中分别滴 装200yL，37 °C培养18h后，测量各抑菌圈直径(或面积）以作出评价。选取典型平皿拍照片。
[0042] 备注：1)牛津杯的放置一定要平稳、到位，确保底部准确插到两层平板之间；2)抑 菌物质添加时确保全部加到牛津杯内部，不要洒在牛津杯外壁或外部，如果洒在外面会形 成乳酸菌在抑菌圈的生长;3)如果无法控制乳酸菌在牛津杯外面的生长，可以将乳酸菌在 无菌离心管中离心，取其上清加入牛津杯中做抑菌实验。
[0043] 2.5抑菌性能评价如下表表1，抑菌性:抑菌圈〈10mm为无抑菌作用，10mm〈抑菌圈〈 15mm的为中度抑菌，抑菌圈>15mm的为高度抑菌。
[0044] 备注:1)抑菌圈越大说明抑菌效果越好;2)抑菌圈是指圆形透明圈的整个直径。
[0045]
[0046]
[0047]
[0048] 如表1所不，植物乳杆菌Lactobacilus plantarum CGMCC8198。对大肠杆菌、金黄 色葡萄球菌和沙门氏菌明显的抑菌作用。
[0049] 实施例3:几种豆柏发酵工艺效果比较
[0050] 方式1:配比为每100g豆柏中添加：50 %水，3 %未经稀释的糖蜜原液，混合均匀于 自封袋中封口放置24h后加入5%的处于对数期的菌液。混合均匀，放回自封袋，封口置于37 °C培养箱中发酵48h。
[0051] 方式2:现将原料豆柏风干至水分含量占原质量的5%~15%，而后按照配比为每 100g豆柏中添加 :0.5 %的碱性蛋白酶粉末，50 %水，3 %未经稀释的糖蜜原液，混合均匀于 自封袋中封口放置24h后加入5%的处于对数期的菌液。混合均匀，放回自封袋，封口置于37 °C培养箱中发酵48h。
[0052] 方式3:配比为每100g豆柏中添加：1 %的碱性蛋白酶粉末，50 %水，3%未经稀释的 糖蜜原液，混合均匀于自封袋中封口放置24h后加入5%的处于对数期的菌液。混合均匀，放 回自封袋，封口置于37 °C培养箱中发酵48h。
[0053] 方式4:配比为每100g豆柏中添加 :2%的碱性蛋白酶粉末，50 %水，3%未经稀释的 糖蜜原液，混合均匀于自封袋中封口放置24h后加入5%的处于对数期的菌液。混合均匀，放 回自封袋，封口置于37 °C培养箱中发酵48h。
[0054]发酵豆柏制备及检测
[0055] 对发酵前后豆柏品质进行分析，结果如表2所示。
[0056]
[0057]由表2可以看出发酵28h时以上述方式2发酵工艺发酵得到的发酵豆柏总酸已达最 尚。
[0058] 本发明利用植物乳杆菌Lactobacilus plantarum CGMCC8198发酵来生产发酵豆 柏可以提高豆柏的抗氧化具有许多优点，首先，研究表明乳酸菌具有抗氧化活性，乳酸菌作 为肠道常驻菌群，可以直接在机体氧化损伤的重点部位一肠道发挥抗氧化作用，维持肠道 处于氧化还原平衡状态。其次，乳酸菌作为最广泛使用的益生菌，一方面能够产生乳酸、乙 酸等物质降低肠道pH值，从而不利于在碱性环境中生长的腐败菌的增殖;另一方面，大多数 乳酸菌在代谢过程中都能合成乳酸菌素，它具有抑制和杀死多数革兰氏阳性致病菌和腐败 菌的作用，并通过抑制肠道病原菌的增殖进一步实现抗氧化、保护肠粘膜、改善肠道微环境 的功能。大豆蛋白经酶解后，会产生一种枯味。乳酸菌发酵豆柏后，会产生酸甜的芳香气味， 可以有效改善霉解豆柏的适口性。另外，本发明着重对发酵豆柏的工艺进行了改进，在采用 植物乳杆菌的同时配合碱性蛋白酶的使用，使得豆柏中的抗营养因子基本降解殆尽。同时， 糖蜜的添加为植物乳杆菌的生长提供了营养，使得发酵豆柏中植物乳杆菌的量明显增加， 产酸量也明显增加。综上，用乳酸菌和蛋白酶联合发酵豆柏，是非常简便，实用，高效的发酵 处理方式。可有效降低饲料成本。
[0059] 应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳 实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术 方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发 明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种植物乳杆菌发酵豆柏的方法，其特征在于:包括， 酶解，每l〇〇g豆柏中添加质量百分比为0.3%~0.7%的碱性蛋白酶、45%~55%的水， 以及1 %~5 %的糖蜜原液，混合均匀后密封室温酶解20h~28h，得到酶解后的豆柏； 发酵，向所述酶解后的豆柏中以4~6%的接种量接种对数期的乳酸菌菌液，混合均匀 后密封置于35°C~40°C培养44h~52h，得到发酵后的豆柏。2. 根据权利要求1所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法，其特征在于:所述乳酸菌来源自 中国普通微生物菌种保藏中心，植物乳杆菌Lactobaci 1 lus plantarum，菌种保藏号 CGMCC8198〇3. 根据权利要求1或2所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法，其特征在于：所述酶解，每 100g豆柏中添加质量百分比为0.5%的碱性蛋白酶。4. 根据权利要求1或2所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法，其特征在于：所述酶解，每 100g豆柏中添加质量百分比为50%的水。5. 根据权利要求1或2所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法，其特征在于：所述酶解，每 100g豆柏中添加质量百分比为3%的糖蜜原液。6. 根据权利要求1或2所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法，其特征在于:所述酶解，混合 均匀后密封室温酶解24h，得到酶解后的豆柏。7. 根据权利要求1或2所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法，其特征在于:所述发酵，向所 述酶解后的豆柏中以5%的接种量接种对数期的乳酸菌菌液。8. 根据权利要求7所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法，其特征在于:所述发酵，混合均 匀后密封置于37°C培养48h，得到发酵后的豆柏。9. 根据权利要求1、2或8任一所述的植物乳杆菌发酵豆柏的方法，其特征在于:在所述 酶解前，还包括， 风干，将豆柏风干至水分质量百分比为原质量的5%~15%。
【文档编号】A23K10/12GK106071103SQ201610399010
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】邓禹, 张晓娟, 邹宗胜, 周彤
【申请人】江南大学