专利名称：一种以节杆菌as－2菌株制备的生物制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以节杆菌AS-2菌株制备的生物制剂及其应用，属微生物技术领域。
背景技术：
烟草作为人们吸食的一种嗜好品，烟碱在燃烧过程中挥发使烟气呈碱性而产生刺激性气味，刺激性对烟叶质量有负面效应。烟碱含量的高低对烟草产品的质量起着相当重要的作用，烟叶烟碱含量的高低直接影响到品质的好坏，但不同类型烟叶的烟碱含量均有一个适中的指标。烟碱含量增加，对烟叶质量产生负面影响，这就是高品质烟叶需要化学成分协调的原因之一。
好的烤烟上部叶在现代混合型卷烟和低焦油烤烟型卷烟叶组配方中起着主导作用，对卷烟香味及其风格具有很大贡献，在国际市场上十分畅销。相比之下，那些质量水平不高、风格不突出或不利工业降本增效的上部烟叶，对烟草工商业永远都没有吸引力。人们也已经看到，在WTO和WHO的影响下，烤烟上部叶将大有用武之地。上部烟叶在可用性上存在的问题首要问题是烟叶烟碱含量过高。因此降低烟叶烟碱含量，有助于提高上部烟叶的可用性、提高吸食安全性、提高国内烟叶的市场竞争能力有重要意义。
不同类型烟草、同一类型烟草不同土壤和施肥、灌溉条件等栽培技术水平对烟叶烟碱的影响不同，烟碱含量也随叶片着生部位的变化而变化，叶位由下而上烟碱含量逐步提高。目前降低烟碱的途径为1.调整烟草生长的环境条件，应用有效的综合农业措施如适量施用氮磷肥、增加钾肥的使用量、用石灰和适当使用饼肥，调节pH值、按烟株生长发育规律浇水、适时移栽、依据实际情况，适时打顶、适当留叶、应用生长调节剂、适熟采收，优化调制条件和利用陈化及发酵等来综合降低烟碱含量，该方法存在年度间降烟碱效果不稳定、操作环节过多、农户分散不易操作等缺点。2.在卷烟中通过提高过滤效率，稀释烟气等，这些措施虽然可以任意调节烟气中烟碱，但往往没有合适的选择性，使消费者难以接受。3.利用陈化和发酵降解烟碱以及利用微生物降解仓储期烟叶烟碱已有报道，已经报道能够降低烟碱的微生物包括Alcaligenes paradoxus争论产碱菌，Arthrobacter globiformils球形节杆菌，Arthrobacter nicotianae烟草节杆菌，Arthrobacter nicotinovoran噬烟碱节杆菌，Arthrobacter oxydans氧化节杆菌，Bac illus megaterium巨大芽孢杆菌，Bacillus mycoides蕈状芽孢杆菌，Bacilluspumilus短小芽孢杆菌，Bacillus subtilis枯草芽孢杆菌，Cellulomonas sp.纤维单胞菌，Corynebacterium sp.棒杆菌属，Enterobacter cloacae阴沟肠杆菌，Micrococcusnicotianae烟草微球菌，Pseudomonas sp.假单胞杆菌，Pseudomonas nicotianae烟草假单胞菌，Pseudomonas putida恶臭假单胞杆菌，Deharyomyces nicotianae，Cunninghamella echinulata刺孢小克汗霉菌，Pellicularia filamentosa丝核薄膜草菌，yeast酵母。但该措施难以解决菌株的使用时期、施用后烟叶水分含量提高容易引起烟叶霉变等问题，工厂中一直没有采用。随着人们对烟气中有害成分的日益关注，降低烟碱的同时香味仍能为消费者接受，是烟草业多年来面临的技术难题。
发明内容
本发明的目的是基于微生物代谢产物降解烟碱的机理，研究和发现了一种可以降解烟叶烟碱，提高烟叶品质的节杆菌AS-2菌株，采用该菌株经过试管种培养、菌种摇床扩大培养、种子罐、发酵罐液体发酵后，制备成一种能降低烟草烟碱含量但并不影响烟叶感官质量的生物制剂。
本发明的生物制剂，由生产菌株经液体发酵生产方法制备。其中1、生产菌株为节杆菌(Arthrobacter sp.)AS-2，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.1282、保藏日为2004年12月28日；该菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，G+，好氧，不形成芽孢，接触酶阳性，不分解纤维素，认为该菌株属于节杆菌属。
节杆菌(Arthrobacter sp.)AS-2系本发明人于2004年发现的一个菌株。该菌株从云南玉溪采集烟田土样，经过常规的系列稀释涂布于NA培养基上分离得到，该菌株经常规的体外烟碱测定，发现能够显著降低烟碱的含量，使含烟碱的培养基由白色变为蓝色。
2、液体发酵生产制备生物制剂的过程为菌剂的制备(1)试管培养采用NA培养基，将该菌种接种在试管斜面培养基上，28℃C培养1-2天。
(2)摇瓶培养采用NA液体培养基，将上述试管中培养菌接种在灌装液体培养基的锥形瓶中，于摇床30℃振荡培养1-2天。
液体发酵生产过程包括试管种培养、菌种摇床扩大培养、种子罐、发酵罐液体发酵制备生物制剂；其中a.试管种培养为将Arthrobacter sp.AS-2的菌体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为1000毫升蒸馏水中添加牛肉膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，控制pH6.8-7.2，在28-30℃下培养1-2天，获得试管种；b.菌种摇床扩大培养为将斜面种子接种到三角瓶液体培养基中，培养基配方为1000毫升蒸馏水中添加牛肉膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，控制pH6.8-7.2，在28-30℃、转速200-300rpm的摇床培养16-20小时；c.液体种子罐发酵为将摇床扩大的菌种按0.5-2％的比例接种于不同容量的发酵罐中，培养基配方为摇床扩大培养的培养基配方，培养温度为28-30℃，培养时间为16-20小时；d.液体发酵罐制备生物制剂为将经种子罐发酵逐级扩大的菌种按1-3％的比例接种于不同容量的发酵罐中，培养基配方为菌种摇床扩大培养的培养基配方，培养温度为28-30℃，pH7.0-7.2，培养时间为24-48小时，当发酵液中细菌数量达到7.0×108个/ml时，得到生物制剂。
本发明的优点在于1.发酵周期短，节约能源、生产成本低；2.微生物来自烟田土壤，对植物和人畜无害，易生产、耐储存，易于产业化开发，可操作性强；3.能降碱增香，提高烟草的品质，且降烟碱效果并不影响烟叶感官质量。
具体实施例方式实施例1(用于烤烟烟叶)本发明的生物制剂，由生产菌株(Arthrobacter sp.)AS-2菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同。
本发明的生物制剂的应用将成熟好的烟叶按部位(中、上部)采收，进入烤房前用本发明的生物制剂按5％的量(生物制剂在稀释液中的含量)均匀喷淋在烟叶的中、上部，然后编杆入炉，按常规方法烘烤。烘烤后的烟叶经测定表明，本发明的生物制对上部烟叶的烟碱降解率达31.68％，对中部烟叶的烟碱降解率达33.86％。
烤烟烟叶感官质量评吸结果表明，采用本发明的生物制剂处理后，烟叶劲头明显下降，香气量明显提高，香气质有所改善，刺激性明显减弱，杂气明显减轻(枯焦气、粉杂气)，口感好于对照。
实施例2(用于白肋烟烟叶)本发明的生物制剂，由生产菌株(Arthrobacter sp.)AS-2菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同。
本发明的生物制剂的应用将砍收好的烟株进入晾房，晾制一周后，用本发明的生物制剂按5％的量(生物制剂在稀释液中的含量)均匀喷淋在白肋烟上、中、下部位，按常规方法晾制。晾制后的白肋烟经测定表明，本发明的生物制剂对上部白肋烟叶的烟碱降解率达43.56％、对中部白肋烟叶的烟碱降解率达50.22％，对下部白肋烟叶的烟碱降解率达53.02％。
白肋烟烟叶感官质量评吸结果表明，采用本发明的生物制剂处理后，烟叶劲头明显下降，香气量明显提高，香气质有所改善，刺激性明显减弱，感官评吸质量好于CK对照。
权利要求
1.一种以节杆菌AS-2菌株制备的生物制剂，由生产菌株按液体发酵生产方法制备，其特征在于该生物制剂的生产菌株为节杆菌(Arthrobacter sp.)AS-2菌株，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.1282；液体发酵生产制备生物制剂的过程为(1).液体发酵生产过程包括试管种培养、菌种摇床扩大培养、种子罐发酵、发酵罐液体发酵制备生物制剂；其中a.试管种培养为将Arthrobacter sp.AS-2的菌体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为1000毫升蒸馏水中添加牛肉膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，控制pH6.8-7.2，在28-30℃下培养1-2天，获得试管种；b.菌种摇床扩大培养为将斜面菌种接种到三角瓶液体培养基中，培养基配方为1000毫升蒸馏水中添加牛肉膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，控制pH6.8-7.2，在28-30℃、转速200-300rpm的摇床培养16-20小时；c.液体种子罐发酵为将摇床扩大的菌种按0.5-2％的比例接种于不同容量的发酵罐中，培养基配方为摇床扩大培养的培养基配方，培养温度为28-30℃，培养时间为16-20小时；d.液体发酵罐制备生物制剂为将经种子罐发酵逐级扩大的菌种按1-3％的比例接种于不同容量的发酵罐中，培养基配方为菌种摇床扩大培养的培养基配方，培养温度为28-30℃，pH7.0-7.2，培养时间为24-48小时，当发酵液中细菌数量达到7.0×108个/ml时，得到生物制剂。
2.权利要求1所述的以节杆菌AS-2菌株制备的生物制剂，用于烟草降碱增香、提高烟草的品质。
全文摘要
本发明涉及一种以节杆菌AS－2菌株制备的生物制剂及其应用，属微生物技术领域。本生物制剂的生产菌株为节杆菌(Arthrobacter sp.)AS－2菌株，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.1282；该生物制剂由试管种培养、菌种摇床扩大培养、种子罐、发酵罐液体发酵工序制备。菌种接种量为0.5－2％，采用的培养基配方为(W/V)牛肉膏0.3％，酵母浸膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，pH6.8－7.2。控制发酵温度在28－30℃，pH7.0－7.2，种子罐发酵为16－20小时，发酵罐发酵时间为24－48小时，当发酵液中细菌数量达到7.0×10
文档编号A24B15/00GK1654633SQ20041007965
公开日2005年8月17日 申请日期2004年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者李梅云, 雷丽萍, 崔国民, 高家合, 邓建华, 杨树军, 李云华 申请人:云南省烟草科学研究所