专利名称：：一种用于烟草发酵的发酵剂及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于烟草发酵的发酵剂配方及应用，特别涉及一种能够利用烟草废次物或烟草生产天然烟用香料及用于烟叶发酵的发酵剂。
背景技术：
：在烟草制品中，烟草的香气和吸味是至关重要的，吸烟与健康也一直是人们关注的热点。随着巻烟中焦油和烟碱的含量的不断降;f氏，这往往会导致巻烟烟味不足和香味减弱。因此，在降低焦油和烟碱的前提下，如何弥补香味的损失和提高烟气香味质量是烟草行业的重要任务。目前，巻烟工业中使用的香料有化学合成和天然香料，后者多为香料植物的精油或浸膏类物质。我国烟草中添加的烟用香料大多是采用传统的方法配制的，即以天然提取物单体和合成单体混合调配而成，这样所制得的烟用香料虽然生产操作简单，但存在香气单调、对烟草改善性不足，容易被模仿，而且改善巻烟抽吸品质效果不明显等缺点。利用微生物发酵、酶解等生物技术制备的烟用香料以其安全性，香气自然丰富等特点，正逐渐成为近年来研究的热点。Inglixy(1999)报道用枯草杆菌(B.sutills)的三个菌和芽孢杆菌(B.sp)另一种的一个菌株，采用单独接种或混合接种于贮藏期烟叶，烟叶香气明显提高。Wentiligy(1999)等人研究发现，酵母菌(Yeast)有些菌株接种至烤烟储藏期烟叶上，3d后可诱发烟叶产生诱人的香气。微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下形成醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚类、呋喃类、吡嗪类、吡啶类和萜烯类等香味物质。朱大恒等以烟末、秸杆、顶芽、腋芽和豆粕为原料，接种烟叶上分离的产香菌，经发酵、萃取、浓縮得烟草生物香料，可用于中高档巻烟加香。不同的微生物组成、不同的发酵原料可制备不同风格的天然烟用香料。因此，利用适宜的微生物发酵制备高品质的烟用香料，具有诱人的市场前景。烟叶发酵是指烟叶通过烘烤(或晾晒)后经过自然发酵或人工发酵达到吸食品质明显增强的一个过程。自然发酵后的烟叶品质改善较大，效果好，但时间长，发酵成本高。人工发酵可大大縮短发酵时间，但发酵后烟草品质改善效果不如自然发酵。越来越多的研究表明，微生物在烟草发酵过程中起重要作用。国内外烟草工作者在烟草微生物分离和利用微生物发酵改善烟草品质、改进烟叶发酵进程、縮短烟叶发酵周期等方面做了较多工作，特别是通过施加微生物制剂于烟叶中增加烟草吃味、提高烟草质量等研究。Koller最早在雪茄烟中接种酵母菌，可大大加快发酵进程，使发酵更为彻底，但同时也会促进细菌和霉菌的生长。韩锦峰等将分离筛选到的几株优势菌混合配制成生物制剂，喷洒于复烤后未发酵烤烟烟叶上，可加速烤烟发酵，提高发酵烟叶品质。谢和等从烤烟上分离一株枯草芽孢杆菌，将其喷酒于烟叶上发酵，发酵后的烟叶青杂气基本消除，刺激性降低。邱立友等从烤烟烟叶表面分离选出3株菌株接种于烟叶表面进行人工发酵，加快发酵过程中烟叶内物质的分离与转化，提高烟叶品质是有利的。周瑾等将从烤烟叶上分离筛选得到的微生物菌悬液接种于低次烤烟碎片上，发酵后的烟叶可溶性还原糖含量明显降低，有机酸成分增多。雷丽萍等选用4个自选菌株在白肋烟晾制初期喷洒在烟草表面，结果表明，菌剂对烟叶化学成分和评吸品质均有影响。上述研究表明微生物制剂组成对改善烟叶整体品质的影响较大。而目前微生物制剂的作用效果较单一，在烟叶大分子化合物消耗、改善吸食品质方面有较大的突破而香气改善不大，较少存在一种在改善烟叶吸食品质縮短发酵时间的同时，提高香气，降低杂气提高烟叶品质的微生物制剂。'
发明内容为解决现有技术不足，本发明旨在提供一种利用烟草废次物或烟叶发酵制备天然烟用香料及用于烟叶发酵，縮短发酵时间、提高烟叶品质的发酵剂。本发明的目的在于发酵剂在烟用香料制备中的应用，并提供发酵剂在烟叶发酵中的应用。为达到本发明的目的，本发明提供的用于烟草发酵的发酵剂，其特征在于包含枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌，其活菌数比例为1050:230:230。本发明发现，利用自然发酵的烟叶表面优势菌株枯草芽孢杆菌与产香菌株乳酸菌、酵母菌三种菌株组成的发酵剂应用到烟草发酵上，具有明显改善烟叶质量、提高香气的特点。以三菌株活菌数之比为1050:230:230。优选活菌数之比为2040:1030:1030。其中乳酸菌可为保加利亚乳杆菌、德氏乳酸杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、乳酸链球菌、丁二酮乳酸链球菌、乳酪链球菌、嗜热链球菌和肠膜状明串珠菌中的一种或多种。酵母菌为生香酵母或酿酒酵母。上述用于烟用香料及烟草发酵的发酵剂的制备分别将菌株在各自适宜的液体培养基中培养至对数生长期晚期，直接离心后收集菌泥，按三株菌活菌数的比例混合菌泥，加入保护剂进行冷冻干燥制得粉末状发酵剂。本发明还提供上述发酵剂在天然烟用香料及烟叶发酵上的应用。(1)在制备天然烟用香料的应用。由烟草废料、烟草组成的单一或混合基质经粉碎加水、灭菌后，加入0.1-5%上述的发酵剂，15-60'C下发酵1-30d。发酵醪经萃取浓縮后即得天然烟用香料成品。-上述烟草废料包括烟叶碎片、烟丝、烟梗、废烟渣，烟草包括烤烟、香料烟、白肋烟、马里兰烟。一般完全以烟草废料为原料较经济，也可根据需要加入少许粮食作物及一些具有特色香气的植物原料。原料配置好后，在加入发酵剂之前或同时加入一些酶制剂，如纤维素酶、蛋白酶、j定粉酶或果胶酶，可加速发酵和提高原料的利用率。'发酵醪经以水或水与乙醇的混合物为溶剂萃取，将萃取液浓縮，用醇沉淀，除去沉淀物，蒸发回收醇得膏状烟用香料成品或经萃取后直接浓縮得膏状烟用香料；或用石油醚、乙酸乙酯等脂溶性溶剂萃取发酵醪，将萃取液浓縮得流体状烟用香料成品。(2)在烟叶发酵的应用将上述发酵剂用无菌水混匀后，按0.05-5%喷雾在经烘烤(或晾晒)后的烟叶上或发酵过程中的烟叶上，打包后在自然或15—6(TC，相对湿度40%—70%的恒温恒湿条件下醇化ld730d。烟叶可以为任意需发酵醇化的烟叶品种，如烤烟、香料烟、白肋烟、马里兰烟。本发明的发酵剂由自然醇化烟叶表面上的优势菌及产香菌组成，对烟叶人工发酵及烟叶自然发酵均有明显的增质、增香的效果，能明显縮短发酵时间。本发明具有如下优点本发明提供的发酵剂由自然发酵烟叶上的优势菌株及产香菌株组成，能直接发酵烟草废次物或烟草制备天然烟用香料，使用方便，所制备的烟用香料用于巻烟中可明显增加香气、降低杂气、降低刺激性、烟气绵长顺畅。同时应用到烟叶发酵中能明显縮短烟叶醇化时间，经发酵剂处理的烟叶香气增加，杂气降低及消除，吸食品质提高。具体实施例方式以下通过实施例更详细的介绍本发明的实施。但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。实施例1将枯草芽孢杆菌(购自山东轻工业学院，菌种编号1007)接种至牛肉膏蛋白胨培养基，经充分活化后培养至对数生长期晚期。培养液经离心后弃去上清液收集菌泥，加入10%离心前培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂1。将100g烟叶碎片粉碎至100目，加入4倍烟叶重量的水，混合后9(TC灭菌30min，冷却后加入2%烟叶重量的发酵剂1，3(TC恒温箱中发酵4d，发酵醪加入6倍烟叶重量的水回流萃取1.5h，萃取液经减压浓縮得天然烟用香料l。实施例2将德氏乳杆菌(购自山东轻工业学院，菌种编号1026)在MRS培养基中充分活化后培养至对数生长期晚期。培养液经离心后弃去上清液收集菌泥，加入10%离心前培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂2。按实施例1制备天然烟用香料的方法加入发酵剂2制得天然烟用香料2。实施例3将生香酵母(购自山东轻工业学院，菌种编号2041)在麦芽汁培养基中充分活化后培养至对数生长期晚期。培养液经离心后弃去上清液收集菌泥，加入10%离心前培养液体积的l挑蔗糖溶液作保护剂冷冻干燥至粉状即得发酵剂3。按实施例1制备天然烟用香料的方法加入发酵剂3制得天然烟用香料3。实施例4按实施例1、2的方法分别制备枯草芽孢杆菌、德氏乳杆菌的菌泥。按两株菌活菌数之比为50:30混合菌泥，加入10%离心前总培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂4。按实施例1制备天然烟用香料的方法加入发酵剂4制得天然烟用香料4。实施例5按实施例1、3的方法分别制备枯草芽孢杆菌、生香酵母的菌泥。按两株菌活菌数之比为50:30混合菌泥，加入10%离心前总培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂5。按实施例1制备天然烟用香料的方法加入发酵剂5制得天然烟用香料5。实施例6按实施例2、3的方法分别制备德氏乳杆菌、生香酵母的菌泥。按两株菌活菌数之比为30:30混合菌泥，加入10%离心前总培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂6。按实施例1制备天然烟用香料的方法加入发酵剂6制得天然烟用香料6。''实施例7按实施例1、2、3的方法分别制备枯草芽孢杆菌、德氏乳杆菌、生香酵母菌泥，按三株菌活菌数之比为50:2:2混合菌泥，加入10%离心前总培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂7。按实施例1制备天然烟用香料的方法加入发酵剂7制得天然烟用香料7。实施例8按实施例l、2、3所述方法分别制备枯草芽孢杆菌〗德氏乳杆菌、生香酵母的菌泥，按活菌数之比为50:10:10混合菌泥，加入10%离心前总培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂8。按实施例l制备天然烟用香料的方法加入发酵剂8制得天然烟用香料8。实施例9按实施例l、2、3所述方法分别制备枯草芽孢杆菌、德氏乳杆菌、生香酵母的菌泥，按活菌数之比为50:30:30混合菌泥，加入10%离心前总培养液体积的l鄉蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂9。按实施例l制备天然烟用香料的方法加入发酵剂9制得天然烟用香料9。实施例10按实施例l、2、3所述方法分别制备枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌(购自山东轻工业学院，菌株编号1022)、酿酒酵母(购自山东轻工业学院，菌株编号2029)的菌泥。按活菌数之比为40:30:30混合菌泥，加入10%离心前总培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂10。按实施例1制备天然烟用香料的方法加入发酵剂10得天然烟用香料10。实施例11按实施例l、2、3所述方法分别制备枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌(购自山东轻工业学院，菌株编号1023)、酿酒酵母(购自山东轻工业学院，菌株编号2029)的菌泥，按活菌数之比为40:30:30混合菌泥，加入10%离心前总培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂10。加入10%离心前总培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂加入发酵剂10得天然烟用香料10。实施例12按实施例1所述方法分别制备枯草芽孢杆菌的菌泥。按实施例2所述的方法分别制备丁二酮乳链球菌(菌种编号为ATCC13675)、肠膜明串珠球菌(菌株编号为ATCC19254)的菌泥。按实施例3所述的方法制备生香酵母的菌泥。按活菌数之比为40:15:15:30混合上述菌泥，加入'10%离心前总培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂12。按实施例1制备天然烟用香料的方法加入发酵剂12制得天然烟用香料12。实施例13按实施例1所述方法分别制备枯草芽孢杆菌的菌泥。按实施例2所述的方法分别制备植物乳杆菌(购自山东轻工业学院，菌株编号1023)、丁二酮乳链球菌(菌种编号为ATCC13675)、肠膜明串珠球菌(菌株编号为ATCC19254)的菌泥。按实施例3所述的方法制备酿酒酵母的菌泥。按活菌数之比为40:10:10:10:30混合上述菌泥，加入10%离心前总培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂13。按实施例1制备天然烟用香料的方法加入发酵剂13制得天然烟用香料13。实施例14按实施例l、2、3所述方法分别制备枯草芽孢杆菌、丁二酮乳链球菌(菌种编号为ATCC13675)、肠膜明串珠球菌(菌株编号为ATCC19254)、酿酒酵母(购自山东轻工业学院)的菌泥，按活菌数之比为40:15:15:30混合菌泥，加入10%离心前总培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，，冷冻干燥至粉状即得发酵剂14。按实施例1的方法加入发酵剂14制得天然烟用香料14。实施例15按实施例1所述方法分别制备枯草芽孢杆菌的菌泥。按实施例2所述方法制备保加利亚乳杆菌(购自山东轻工业学院，菌株编号1021)菌泥，按实施例3制备酿酒酵母的菌泥。按活菌数之比为30:15:20混合菌泥，加入10%离心前总培养液体积的18%蔗糖溶液作保护剂，冷冻干燥至粉状即得发酵剂14。将烟叶碎片、烟梗、废烟渣、薯粉干燥后粉碎至IOO目，加入8份烟叶重量的水，混合后9(TC灭菌30min后冷却，按原料重量加入2%发酵剂15，30°C恒温箱中发酵3d，发酵醪加入6份烟叶重量的水回流萃取1.5h，萃取液减压浓縮得膏状天然烟用香料15。按烟丝重量的0.2%分别称取实施例1-15制备的天然烟用香料1-15号样品，加水溶解，喷加到烟丝上，在80'C下烘干，控制烟丝含水率为12%左右(用手感觉)打成烟支，放入恒温恒湿箱(温度:25'C，相对^度:6(F。)平衡水分48h注丰富性根据添加的保润剂或香料单体经燃吸后对巻烟香气特性的影响程度，分为变差、不明显、变好。，香气质巻烟香气的质越好分值越高，香气的质越差分值越低。香气质分为五由12位专家评吸。以原料未经发酵制得的浸膏为对照，评级结果如表l所示。表l天然烟用香料l-7号样品评吸结果样品^12345678910111213<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>个档次l即为差，2为较差，3为中等，4为较好，5为好。香气量巻烟香气的量越足分值越高，香气的量越少分值越低。香气量分为五个档次l即为少，2为较少，3为中等，4为较足，5为充足。透发性巻烟香气越透发分值越高，香气越沉闷分值越低。香气的透发性分为五个档次l为沉闷，2为较沉闷，3为中等，4为较透发，5为透发。细腻柔和程度巻烟烟气越细腻柔和分值越高，烟气越粗糙分值越低。烟气细腻柔和程度分为五个档次l为粗糙，2为较粗糙，3为中等，4为较细腻柔和，5为细腻柔和。剌激程度巻烟的刺激性越小分值越高，刺激性越大分值越低。剌激性程度分为五个档次l为大，2为较大，3为中等，4为较小，5为小。由表l可以看出，经枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌单独发酵制得的烟草香料加香评吸与未发理处理制得的浸膏相比，香气变化不明显，刺激性和杂气改善效果不明显。以上述三种菌株两两混合发酵制得的烟草香料与未发酵处理的浸膏相比，香气、刺激性、杂气稍有改善。以上述三株菌活菌数1050:230:230比例混合发酵制备的烟草香料与未发酵处理的浸膏相比，香气丰富、质优，杂气、刺激性改善效果较好。以三菌株活菌数之比2040:1030:1030发酵制备的烟草香料经评吸香气丰富、质优，烟气细腻，杂气、刺激性改善效果最佳。实施例15分别取lg实施例1-10制备的发酵剂1-10，用50mL无菌水混匀后，分别均匀喷雾至1000g同一等级皖南BTFF打叶复烤烟叶并编号为B1-B10,打包放入仓库之中进行自然醇化。180天后取出经发酵剂处理的样品Bl-B10与未处理自然醇化样品(对照)，分别切丝巻制样品烟，在相对湿度为60%条件下平衡水分24小时，进行感官评吸。评级结果如表2所示，经发酵剂8、9、10处理的烟叶样品品质较好，以发酵剂IO处理样品的品质最佳，表现为香气丰富、质优，烟气细腻，刺激性、杂气降低，烟叶品质提高。表2发酵剂处理烟叶样品B1-B10与对照评吸结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例16取烤烟打叶复烤烟叶1000g，取lg实施例10制备的发酵剂10，用50mL无菌水混匀后，均匀喷雾至烤烟叶上，然后打包并放入仓库之中进行自然醇化。12个月后取出经发酵剂处理的样品与未处理自然醇化2年的同一等级样品，分别切丝巻制样品烟，在相对湿度为60%条件下平衡水分24小时，进行感官评吸。评吸结果表明发酵剂处理的样品烟气品质优于对照，表现为香气丰富，烟气细腻，刺激性和杂气消除。实施例17取晾晒后的白肋烟叶1000g，取lg实施例10制备fej发酵剂10，用50mL无菌水混匀后，均匀喷雾至烟叶上，然后打包并放入仓库之中进行自然醇化。8个月后取出经发酵剂处理的样品与未处理自然醇化2年的同一等级样品，分别切丝巻制样品烟，在相对湿度为60%条件下平衡水分24小时，进行感官评吸。评吸结果表明经发酵剂处理的样品烟气品质明显优于对照，表现为香气浓郁，吸味醇和，刺激性和杂气消除。实施例18取自然醇化3个月的烤烟叶1000g，取0.5g实施例10制备的发酵剂10，用50mL无菌水混匀后，均匀喷雾至烟叶中，继续醇化，8个月后取出加入发酵剂的烟叶样品与未处理自然醇化2年的同一等级样品进行对照，分别切丝制样品烟，在相对湿度为60%，温度25'C条件下平衡水^;24小时，进行感官评吸。评吸结果表明发酵剂处理的样品烟气品质优于对照，表现为烟气醇和，刺激性和杂气明显降低。实施例19取烤烟打叶复烤烟叶1000g，取lg实施例10制备的发酵剂10，用50mL无菌水混匀后，均匀喷雾至烤烟叶上，然后打包并放入恒温恒湿室中，45°C、相对湿度609TF醇化8d取出，以同一等级烟叶样品未经发酵剂处理，相同条件下人工发酵15d作为对照。分别切丝巻制样品烟，在相对湿度为60%条件下平衡水分24小时，进行感官评吸。评吸结果表明发酵剂处理的样品烟气品质优于对照，表现为香气变好，刺激性和杂气降低。权利要求1、一种用于烟草发酵的发酵剂，其特征在于包含枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌；枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌的活菌数比例为10～502～302～30。2、根据权利要求1所述的用于烟草发酵的发酵剂，其特征在于所述包含枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌的活菌数比例为2040:1030:1030。3、根据权利要求1或2所述的用于烟草发酵的发酵剂，其特征在于所述的乳酸菌为保加利亚乳杆菌、德氏乳酸杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、乳酸链球菌、丁二酮乳酸链球菌、乳酪链球菌、嗜热链球菌和肠膜状明串珠菌中的一种或多种。4、根据权利要求1或2所述的用于烟草发酵的发酵剂，其特征在于所述的酵母菌为生香酵母和/或酿酒酵母。.5、权利要求1或2所述的发酵剂在烟用香料制备中的应用，其特征在于由烟草废料和/或烟草组成的单一或混合基质，经粉碎后加入基质0.5-20倍重量的水，灭菌后，加入O.1_5%基质重量的权利要求1或2所述的发酵剂，15-60'C下发酵l-30d，发酵醪经萃取浓縮后即得天然烟用香料成品。6、根据权利要求5所述的发酵剂在烟用香料中的应用，其特征在于所述的烟草废料为烟叶碎片、烟丝、烟梗或废烟渣。7、根据权利要求5所述的发酵剂在烟用香料中的应用，其特征在于所述的烟草为烤烟、香料烟、白肋烟或马里兰烟。8、权利要求1或2所述的发酵剂在烟叶发酵中的应用，其特征在于称取烟叶重量0.01%-5%权利要求1或2所述的发酵剂，加入1%-10%烟叶重量的无菌水混均后，喷雾于烟叶表面，打包后在自然或15—6(TC，相对湿度40%—70%的恒温恒湿条件下醇化ld730d。9、根据权利要求8所述的发酵剂在烟叶发酵中的应用，其特征在于所述的烟叶为经烘烤、晾晒后的或发酵过程中的烤烟、香料烟、白肋烟或马里兰烟。全文摘要本发明公开了一种用于烟草发酵的发酵剂及其应用。该发酵剂特征在于包含枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌三种菌株，其活菌数之比为10～50∶2～30∶2～30。该发酵剂可发酵烟草废料或烟草生产天然烟用香料及用于烟叶发酵。利用本发明发酵剂制备的天然烟用香料香气醇和，用于卷烟中可明显增加香气、降低杂气、降低刺激性、烟气绵长顺畅。本发明发酵剂用于烟叶发酵可明显缩短醇化时间、改善烟叶品质。文档编号A24B3/18GK101416778SQ20081021964公开日2009年4月29日申请日期2008年11月30日优先权日2008年11月30日发明者于铁妹,博杨,王小宁,王永华申请人:华南理工大学