专利名称：一种烟叶浸提液培养基及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种培养基，尤其涉及一种培养烟碱降解微生物的烟叶浸提液培养基 及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术：
烟碱是烟草中的生物碱，它对人的中枢神经有强烈的刺激和麻痹作用，少量使人 兴奋，大量会引起眩晕、呕吐甚至中毒死亡。烟叶中烟碱含量过高，就会严重危害烟民的健 康。另外烟碱也是一种环境有毒物质，在烟草制品的生产加工过程中会产生大量的固体、液 体和气体废弃物，这些废弃物如果不加处理就投放到环境中，会严重破坏生态环境，危害人 类健康。微生物法降解烟碱因具有针对性、快速有效性的优点，受到越来越多的重视。至今， 国内外研究者已经从环境中分离了多种烟碱降解菌。目前所报道的培养烟碱降解菌株的培养基成分复杂，例如添加Na2HPCV KH2PO4, K2SO4^MgCl2 · 6H20、MnCl2 · 4H20、FeCl3 · 6H20、CaCl2 等基础离子成分后，再添加一定含量的 烟碱，不仅制备繁琐，而且烟碱价格昂贵，成本较高，因而迫切需要寻找简单廉价的替代培
养基配方。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种简单廉价适合培养烟碱降解微生物的培养 基及其应用。发明概述本发明所述的烟叶浸提液培养基中添加了烟叶浸提液，采用该培养基培养烟碱降 解类微生物可以获得更大的生物量，而且该烟叶浸提液培养基不需要额外添加各种微量元 素和无机盐，使该培养基配制简单、使用方便、成本低、适合工业化应用。发明详述一种烟叶浸提液，其特征在于，由如下步骤制得将烟叶碎片和水按照质量体积比10 80 1的比例混合，煮沸25 35分钟，过 滤除去沉淀，定容，即得烟叶浸提液；所述的质量体积比单位为g/L。经检测，烟叶碎片与水按照10 1比例混合时，烟叶浸提液含有烟碱1. 3 1. Sg/ L，烟叶碎片与水按照20 1比例混合时，烟叶浸提液含有烟碱1.9 2. 5g/L，烟叶碎片与 水按照40 1比例混合时，烟叶浸提液含有烟碱3.9 4. 5g/L，烟叶碎片与水按照60 1 比例混合时，烟叶浸提液含有烟碱6. 2 6. 8g/L，烟叶碎片与水按照80 1比例混合时，烟 叶浸提液含有烟碱9. 2 9. 8g/L。一种烟叶浸提液培养基，其特征在于，组分如下烟叶浸提液1L，牛肉膏3 5g、蛋白胨5 10g、NaCl 5 10g、琼脂18 22g， ρΗ7· 0 7· 5。
优选的，烟叶浸提液培养基成分如下烟叶浸提液1L，牛肉膏3g、蛋白胨10g、 NaC15g、琼脂20g，pH7. 0 7. 5，所述的烟叶浸提液由烟叶碎片与水按照20 1的比例混合.一种烟叶浸提液培养基，其特征在于，组分如下烟叶浸提液1L，葡萄糖3 7g、蛋白胨3 7g、酵母粉3 7g、琼脂18 22g，pH 自然。优选的，烟叶浸提液培养基成分如下烟叶浸提液1L、葡萄糖3g、蛋白胨5g、酵母 粉3g、琼脂20g，pH自然，所述的烟叶浸提液由烟叶碎片与水按照20 1的比例混合。一种烟叶浸提液培养基，其特征在于，组分如下烟叶浸提液1L，酵母粉0. 5 lg，pH7. 0 7. 5或pH自然。当pH7. 0 7. 5时适 合培养细菌类烟碱降解微生物，当PH为自然时适合培养真菌类烟碱降解微生物。优选的，烟叶浸提液培养基成分如下烟叶浸提液1L，酵母粉0. 5g，pH7. 0 7. 5 或PH自然，所述的烟叶浸提液由烟叶碎片与水按照20 1或80 1的比例混合。本发明还提供上述烟叶浸提液培养基在培养烟碱降解微生物方面的应用。优选的，所述烟碱降解微生物为米曲霉(Aspergillus oryzae)CGMCC NO. 3687、假单胞菌(Pseudomonas sp.) CCTCC Ν0· M207083、烟草假单胞菌(Pseudomonas nicotianae)CGMCC N0. 0757、根癌土 壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CCTCC N0.M206131、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) CGMCC Ν0· 0674 之一。所述烟叶碎片可由普通卷烟厂获得。在本发明制备的适合培养烟碱降解微生物的培养基方法中，采用烟叶碎片，经煮 沸后，烟叶碎片中的营养成分释放溶解于水中，为培养微生物提供了丰富的微量元素及营 养物质，同时也提供了烟碱降解微生物的选择营养物质——烟碱。本发明将烟叶碎片用来 制备培养烟碱降解微生物的培养基，可以达到节约烟碱降解菌株培养基的配制成本。由于 本发明方法不需要额外添加各种微量元素和无机盐，因此，培养基的制备简便、快速。利用 本发明培养基培养的烟碱降解菌生长量高，降解烟碱能力强，同时本发明的方法还解决了 现有技术中纯品烟碱添加的高成本问题，具有广阔的工业应用前景。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不仅限于此。实施例中所述的试剂均为市售产品，烟叶碎片由山东济南将军集团购得，所述操 作方法如无特别说明均为本领域通用操作方法。实施例1烟叶浸提液的制备将烟叶碎片和水按照质量体积比(g/L) 20 1和80 1的比例混合，煮沸30分 钟，抽滤除去沉淀，加水定容至1L，分别制得2%的烟叶浸提液和8%的烟叶浸提液；经检 测，2%的烟叶浸提液含有烟碱2. 2g/L，8%的烟叶浸提液含有烟碱9. 5g/L。(1)烟叶浸提液培养基的制备①菌种活化培养基(细菌)的组分2%的烟叶浸提液1L，牛肉膏3g、蛋白胨10g、 NaCl 5g、琼脂 20g;
菌种活化培养基(真菌)的组分2%的烟叶浸提液1L，葡萄糖3g、蛋白胨5g、酵 母粉3g、琼脂20g。②种子培养液的组分2%的烟叶浸提液1L，酵母粉0. 5g。③发酵培养基的组分8%的烟叶浸提液1L，酵母粉0. 5g。按照上述组分混合，pH自然(真菌)，或者，用lmol/L的NaOH调pH7. 0 7. 5 (细 菌)，在115°C高温下灭菌30分钟，即可。(2)对比实验1 ①菌株活化培养基的制备在无机盐培养基中加入烟碱，使其终浓度为2g/L。②种子培养基的制备在无机盐培养基中加入烟碱，使其终浓度为2g/L。③发酵培养基的制备在无机盐培养基中加入烟碱，使其终浓度为9. 5g/L。上述无机盐培养基的制备=K2HPO4·3Η20 13. 3g/L,KH2PO4 4g/L、MgS04 ·7Η20 0. 2g/ L、0. 5ml微量元素溶液，蒸馏水配制。上述微量元素溶液的制备=CaCl2·2Η20 0. 05g/L,CuCl2 ·2Η20 0. 05g/L,MnSO4 ·Η20 0. 008g/L、FeS04 ·7Η20 0. 004g/L,ZnSO4 0. lg/L,Na2MoO4 ·2Η20 0. lg/L,Na2WO4 ·2Η20 0. 05g/ L，0. lmol/LHCl 配制。上述培养基pH7. 0 7. 5，用于培养细菌。上述培养基使用前都在115 °C高温下灭菌30分钟。上述培养基中，烟碱单独经0. 22 μ m滤膜过滤除菌步骤后加入。(3)对比实验2①菌株活化培养基的制备牛肉膏3. Og/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5. Og/L、琼脂20g/ L0②种子培养基的制备牛肉膏3. Og/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5. 0g/L。③发酵培养基的制备在基础培养基中加入烟碱，使其终浓度为9. 5g/L。上述基础培养基的制备=NH4NO31. 00g/L、MgSO4 · 7H20 0. 50g/L、(NH4)2SO4 0. 50g/ L、KH2PO4 0. 50g/L、NaCl 0. 50g/L、酵母粉 0. 05g/L、K2HPO4 1. 50g/L。上述培养基均为蒸馏水配制，pH7. 0 7. 5，用于培养细菌。上述培养基使用前都在115°C高温下灭菌30分钟。所述步骤③中，烟碱单独经0. 22 μ m滤膜过滤除菌步骤后加入。(4)对比实验3①菌株活化培养基的制备=K2HPO4·3Η20 13g/L, (NH4)2SO4 lg/L,KH2PO4 4g/L、酵母 粉 lg/L、烟碱 2g/L、琼脂 20g/L。②种子培养基的制备=K2HPO4· 3H20 13g/L、(NH4)2SO4 lg/L、KH2PO4 4g/L、酵母粉 lg/L、烟碱 2g/L。③发酵培养基的制备=K2HPO4· 3H20 13g/L、(NH4)2SO4 lg/L、KH2PO4 4g/L、酵母粉 lg/L、烟碱9. 5g/L、ImL微量元素溶液。上述微量元素溶液的制备=MgSO4·7Η20 10g/L、MnS04 ·4Η20 4g/L、CaCl2 · 2H20 2g/ L、FeSO4 · 7H20 2g/L，0. lmol/L HCl 配制。上述培养基均为蒸馏水配制，pH7. 0 7. 5，用于培养细菌。上述培养基使用前都在115 °C高温下灭菌30分钟。
上述培养基中，烟碱单独经0. 22 ym滤膜过滤除菌步骤后加入。(5)对比实验4①菌株活化培养基的制备在无机盐培养基中加入烟碱，使其终浓度为2g/L。②种子培养基的制备在无机盐培养基中加入烟碱，使其终浓度为2g/L。③发酵培养基的制备在无机盐培养基中加入烟碱，使其终浓度为9. 5g/L。上述无机盐培养基的制备Na2HP045. 57g/L、KH2P04 2 . 44g/L、K2S04 lg/L、 MgCl2 6H20 0. 2g/L、MnCl2 4H20 0. 0004g/L、FeCl3 6H20 0. 001g/L、CaCl2 0. 001g/L。上述培养基均为蒸馏水配制，pH7. 0 7. 5，用于培养细菌。上述培养基使用前都在115°C高温下灭菌30分钟。上述培养基中，烟碱单独经0. 22 ym滤膜过滤除菌步骤后加入。⑶对比实验5①菌株活化培养基的制备在基础培养基中加入烟碱，使其终浓度为2g/L。②种子培养基的制备在基础培养基中加入烟碱，使其终浓度为2g/L。③发酵培养基的制备在基础培养基中加入烟碱，使其终浓度为9. 5g/L。上述基础培养基的制备:KH2P040 . 65g/L、K2HP04 1. Og/L、MgS04 7H20 0. 5g/ L、(NH4)2S04 0.5g/L、NaCl 0. 5g/L、CaCl2 2H20 0. lg/L、NaMo04 0 . 00 5g/L、FeS04 7H20 0. 005g/L、MnS04 0 . 01g/L、酵母粉 0. 05g/L、0. 5mL 微量元素溶液。上述微量元素溶液成分为CuCl2 2H20 0. 05g/L、ZnS04 0. lg/L。上述培养基均为蒸馏水配制，pH7. 0 7. 5，用于培养细菌。上述培养基使用前都在115°C高温下灭菌30分钟。上述培养基中，烟碱单独经0. 22 ym滤膜过滤除菌步骤后加入。(7)对比实验6①菌株活化培养基的制备大豆粉5g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、NaCl 5g/L、 K2HP045g/L、琼脂 20g/L。②种子培养基的制备大豆粉5g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、NaCl 5g/L、 K2HP045g/L。 ③发酵培养基的制备大豆粉5g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、NaCl 5g/L、 K2HP045g/L、烟碱 9. 5g/L。上述培养基均为蒸馏水配制，pH6. 5 7. 0，用于培养真菌。上述培养基在115°C高温下灭菌30分钟，所述步骤③中，烟碱单独经0. 22 ym滤膜过滤除菌步骤后加入。⑶对比实验7①菌株活化培养基的制备马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、自然pH。马 铃薯去皮，切成块煮沸30分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1L，115°C 灭菌30分钟。②种子培养基的制备麦芽浸粉3g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L， pH6. 5。③发酵培养基的制备:KH2P04lg/L、MgS04 0. 5g/L、FeS04 0 . 00 3g/L、CaCl2 0. 003g/L、MnS04 0 . 001g/L、烟碱 9. 5g/L, pH6. 5。
上述培养基均为蒸馏水配制，用于培养真菌。上述培养基在115°C高温下灭菌30分钟。所述步骤③中，烟碱单独经0. 22 ym滤膜过滤除菌步骤后加入。由以上比较可以看出，本专利提供的培养基配方配制更加方便，成本低，适宜于工 业化应用。实施例2利用烟叶浸提液培养基培养具有烟碱降解能力的米曲霉CGMCC NO. 3687本实施例中的菌株活化培养基(真菌)、种子培养液、发酵培养基的配制同实施例 1。(1)选择米曲霉CGMCC NO. 3687，接种至菌株活化培养基(真菌)活化40小时，培 养温度为28°C，然后，取活化后的米曲霉CGMCC NO. 3687接种于种子培养液，培养30小时， 培养温度为28°C，得初级培养液；将初级培养液，按体积比5% (v/v)的接种量转接于发酵 培养基中，培养温度为28°C，摇床转速为150转/分。培养40小时后，抽滤收集菌丝体，测 定菌体生长量，并分析发酵液上清中烟碱残留量。其40小时生物量达到8. lg/L，烟碱降解 量为 7. 8g/L。上述生物量的测定方法为抽滤菌丝体，用蒸馏水洗涤3次，将菌丝体冷冻干燥至
恒重，称量。烟碱降解量的测定方法为初始烟碱含量(g/L)与培养40小时后测得的烟碱剩余 含量(g/L)之差。上述烟碱含量分析所用设备及条件分析型高压液相色谱仪(Agilent 1 lOOSeries)，美国安捷伦公司；样品经煮沸5分钟、12000转/分离心10分钟后，用 同体积甲醇稀释，4°C冰箱静置30分钟，0.22i!m Millipore膜过滤待检测。分析柱为 TC-C18 (150X4. 6mm)，流动相为体积比为15 85的甲醇甲酸(浓度0. 05 % )，流速 0. 5mL/min,柱温30°C，紫外检测波长254nm。(2)对比实验1参照实施例2(1)，所不同的是①米曲霉CGMCC NO. 3687在发酵培养基中培养40小时后生物量为5. lg/L，烟碱降 解量为3. 8g/L。②菌株活化培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1 (7)所述。(3)对比实验2参照实施例2(1)，所不同的是①米曲霉CGMCC NO. 3687在发酵培养基中培养40小时后生物量为4. 9g/L，烟碱降 解量为3. lg/L。②菌株活化培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1 (8)所述。以上对比实验表明，利用本专利提供的培养基培养米曲霉CGMCC NO. 3687，获得的 生物量更多，烟碱降解量更高。实施例3利用烟叶浸提液培养基培养具有烟碱降解能力的巨大芽孢杆菌CGMCC NO. 0674。本实施例中的菌株活化培养基(细菌)、种子培养液、发酵培养基的配制同实施例1。(1)选择巨大芽孢杆菌CGMCC NO. 0674，接种至菌株活化培养基(细菌)活化18小 时，培养温度为37°C，然后，取活化后的巨大芽孢杆菌CGMCC NO. 0674接种于种子培养液， 培养20小时，培养温度为37°C，得初级培养液；将初级培养液，按体积比5% (v/v)的接种 量转接于发酵培养基中，培养温度为37°C，摇床转速为150转/分。培养20小时后，测定菌 体生长量，并分析发酵液上清中烟碱残留量。其20小时生物量达到0D_ = 3. 1，烟碱降解 量为 1. 8g/L。上述菌体生物量的测定方法为细菌发酵液5mL经过12000转/分离心10分钟后 获得菌体，用蒸馏水洗涤3次，然后用5mL蒸馏水重新悬浮，在600nm处测定其0D值。上述烟碱含量分析所用设备及条件同实施例2(1)所述。(2)对比实验1参照实施例3(1)，所不同的是①巨大芽孢杆菌CGMCC NO. 0674在发酵培养基中培养20小时后生物量为0D6(1(1 = 2. 1，烟碱降解量为1. lg/L。②菌株活化培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1 (2)所述。(3)对比实验2参照实施例3(1)，所不同的是①巨大芽孢杆菌CGMCC NO. 0674在发酵培养基中培养20小时后生物量为0D6(1(1 = 1.9，烟碱降解量为0. 6g/L。②菌株活化培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1 (3)所述。(4)对比实验3参照实施例3(1)，所不同的是①巨大芽孢杆菌CGMCC NO. 0674在发酵培养基中培养20小时后生物量为0D6(1(1 = 1.6，烟碱降解量为0. 4g/L。②菌株活化培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1 (4)所述。(5)对比实验4参照实施例3(1)，所不同的是①巨大芽孢杆菌CGMCC NO. 0674在发酵培养基中培养20小时后生物量为0D6(1(1 = 1.5，烟碱降解量为0. 3g/L。②菌株活化培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1 (5)所述。(6)对比实验5参照实施例3(1)，所不同的是①巨大芽孢杆菌CGMCC NO. 0674在发酵培养基中培养20小时后生物量为0D6(1(1 = 1.6，烟碱降解量为0. 4g/L。②菌株活化培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1 (6)所述。以上对比实验表明，利用本专利提供的培养基培养巨大芽孢杆菌CGMCC NO. 0674， 获得的生物量更多，烟碱降解量更高。
权利要求
一种烟叶浸提液，其特征在于，由如下步骤制得将烟叶碎片和水按照质量体积比10～80∶1的比例混合，煮沸25～35分钟，过滤除去沉淀，定容，即得烟叶浸提液；所述的质量体积比单位为g/L。
2.一种由权利要求1所述的烟叶浸提液配制的烟叶浸提液培养基，其特征在于，组分 如下烟叶浸提液1L，牛肉膏3 5g、蛋白胨5 10g、NaCl 5 10g、琼脂18 22g，pH 7. 0 7. 5。
3.如权利要求2所述的烟叶浸提液培养基，其特征在于，牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g，pH 7. 0 7. 5，所述的烟叶浸提液由烟叶碎片与水按照20 1的比例混合。
4.一种由权利要求1所述的烟叶浸提液配制的烟叶浸提液培养基，其特征在于，组分 如下烟叶浸提液1L，葡萄糖3 7g、蛋白胨3 7g、酵母粉3 7g、琼脂18 22g，pH自然。
5.如权利要求4所述的烟叶浸提液培养基，其特征在于，葡萄糖3g、蛋白胨5g、酵母粉 3g、琼脂20g，pH自然，所述的烟叶浸提液由烟叶碎片与水按照20 1的比例混合。
6.一种由权利要求1所述的烟叶浸提液配制的烟叶浸提液培养基，其特征在于，组分 如下烟叶浸提液1L，酵母粉0. 5 lg，pH7.0 7. 5或pH自然。
7.如权利要求6所述的烟叶浸提液培养基，其特征在于，酵母粉0.5g，pH7. 0 7. 5或 pH自然，所述的烟叶浸提液由烟叶碎片与水按照20 1或80 1的比例混合。
8.权利要求2、4或6所述的烟叶浸提液培养基在培养烟碱降解微生物方面的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述烟碱降解微生物为米曲霉 (Aspergi 1 lusoryzae) CGMCC NO. 3687、假单胞菌(Pseudomonas sp.) CCTCC NO. M207083, 烟草假单胞菌(Pseudomonas nicotianae) CGMCC NO. 0757、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaci ens) CCTCC NO. M206131、巨大芽孢杆菌(Bacillus me gat erium) CGMCC NO. 0674 之
全文摘要
本发明涉及一种培养基，尤其涉及一种培养烟碱降解微生物的烟叶浸提液培养基及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供的烟叶浸提液培养基，其主要成分含有烟叶浸提液，制备方法为将烟叶碎片和水按照质量体积比10～80∶1的比例混合，煮沸25～35分钟，抽滤定容，即得烟叶浸提液。本发明还提供烟叶浸提液培养基在培养烟碱降解微生物方面的应用，该培养基适用于多种烟碱降解微生物的培养，并且可以获得更大的生物量，同时提高烟碱降解能力。本发明所述培养基配制简单、使用方便、成本低、适合工业化应用。
文档编号A24B15/24GK101856143SQ20101017358
公开日2010年10月13日 申请日期2010年5月17日 优先权日2010年5月17日
发明者卢丽丽, 孟祥璟, 肖敏 申请人:山东大学