专利名称：一种卤地菊多糖及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物多糖领域，具体涉及一种卤地菊多糖及其制备方法和应用。
背景技术：
齒地菊Wedelia prostrata (Hook. Et Am. ) Hems I.为菊科膨蜞菊属植物，在浙江有广泛分布，全草药用，具有清热凉血、祛痰止咳的作用。目前主要是对卤地菊的二萜、倍半萜、黄酮类、有机酸类化合物的研究，对其多糖的研究及应用报道还没有出现。多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成的高分子聚合物，糖类化合物的分离和纯化是糖类研究中的难点之一，不同的提取纯化方法不仅会直接影响提取的多糖的性质不同，也可能导致活性结构的变化，因此选择合适的方法是至关重要的，应在尽可能少 的破坏原有多糖的结构构象的基础上得到较高的提取效率，又需要尽可能的分离纯化得到较均匀的单一多糖组分。现有的多糖制备方法较多，其中以提取法居多。如中国专利ZL200410020591. 5中公开了一种木耳多糖的提取方法，它是以木耳为原料，采用醇提、微波或超声波处理，并结合复合酶法酶解，将木耳中的多糖物质充分溶解出来，提高了木耳多糖的得率，保持了多糖物质的生物活性，有利于人体的吸收；同时，利用木耳多糖加工过程中剩余的残渣提取碱性木耳多糖，最大限度地利用了原料、节约了资源，从而降低了成本；该方法对多糖结构破坏小，多糖得率高，能最大程度地发挥出抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖等功效。中国专利申请CN201110236229. I中公开了一种西洋参多糖的提取方法，按下述步骤进行的一、将西洋参在水中浸泡，煎煮，趁热过滤；二、再用水煎煮两次，合并水煎液后浓缩，放置冷却；三、醇沉，过滤，滤渣挥发至无醇味，在60 90°C条件下烘干，粉碎，即得西洋参多糖；该方法采用水提取西洋参多糖，降低成本，提取西洋参多糖的纯度高且收率高，多糖纯度在38. 8%以上，多糖收率在4. 7%以上，解决了现有工艺中经醇提后再水提制备西洋参多糖而存在的纯度低、成本高、收率低的技术问题。可见，不同的多糖应对应适合的制备方法进行制备。多糖的化学结构是其生物活性的基础，也是多糖化学研究的难点和关键。多糖化学结构复杂，单糖可以多重连接位点连接，构成不同构型的直链和支链，还可以通过硫酸化、乙酰化、磷酸化、甲基化等衍生形式形成糖衍生物。多糖的结构分类可分为一级结构和高级结构(包括二级、三级和四级结构)，这种分类是沿用蛋白质结构的分类方法。鉴于多糖结构的复杂性，目前对多糖具体结构的研究也较少。
发明内容
本发明提供了一种具有优良保湿效果的卤地菊多糖，可作为卷烟烟丝的保湿剂。本发明还提供了一种卤地菊多糖的制备方法，该方法操作简单、工艺环保，适于工业化生产。—种卤地菊多糖，其主要结构为以2 —6连接的β-D-果聚糖为主链，以与主链I —2连接的a-D-葡萄糖为端基。即所述的卤地菊多糖的主要结构为a-D-Glc-(I —2)-[β-D-Fru-(6 —2)-β-D-Fru-]n，其中，β-D-Fru 为 β-D-果聚糖，a-D-Glc 为 a-D-葡萄糖。所述的卤地菊多糖的制备方法，包括步骤a.将干燥的卤地菊样品粉碎，得到卤地菊粉体；b.将卤地菊粉体在水中提取，得到提取液，其中，卤地菊粉体与水的质量比为I :15-50 ；c.提取液冷却后经离心和真空抽滤得到滤液，滤液真空浓缩至提取液体积的三十分之一至十分之一，得到浓缩液；
d.向浓缩液中加入体积分数为95%_100%的乙醇，使体系中乙醇体积分数达到50%-70%，搅拌，静置8h-12h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖；e.将粗多糖用水溶解，上二乙氨乙基琼脂糖凝胶离子交换柱，以水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，再用水溶解，上凝胶柱层析，以水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，得到卤地菊多糖。步骤a中,所述的卤地菊样品选用卤地菊全株。为进一步保证提取的效果，优选步骤a中，卤地菊粉体的目数为20目-100目。步骤b中，卤地菊粉体在100°C沸水中提取2小时-3小时。步骤b中，卤地菊粉体在水中提取2次-5次，每次卤地菊粉体与水的质量比为I :15-50。所述的体积分数为95%_100%的乙醇可采用市售产品。所述的离心的条件优选为转速为lOOOOrmp，时间为15min，温度为25°C。在此条件下，沉淀比较完全。步骤e中，所述的二乙氨乙基琼脂糖凝胶离子交换柱可选用市售产品，如DEAE-Sepharose Fast Flow 离子柱,柱型为)(K 26 X 100cm。所述的凝胶柱可选用市售产品，如为S^hacryl S-200系列柱，柱型为XK26XIOOcm0所述的卤地菊多糖可作为卷烟烟丝保湿剂应用于卷烟中，应用时不需要改变卷烟原有的加工工艺。所述的卤地菊多糖的用量优选为卷烟烟丝质量的0. 02%。-0. 2%0。所述的卤地菊多糖在卷烟中的应用方法包括将所述的卤地菊多糖经水溶解，配制成0. 08mg/ml-0. 8mg/ml的溶液喷加到卷烟烟丝上,制备卷烟。卷烟的制备采用现有的卷烟的制备方法如经混丝、平衡、卷烟等工序后，将含卤地菊多糖的烟丝制成卷烟。本发明结构鉴别时采用以下仪器高效液相为Waters 1525高效液相仪，红外全扫描采用Nicolet 6700型傅立叶红外光谱仪，气相采用Agilent7890A气相色谱，气质联用采用 Finnigan Trace Ultra-DSQ II 气-质联用色谱仪,核磁采用 AVANCE III (500MHz)傅立叶超导核磁共振谱仪。与现有技术相比，本发明具有如下优点本发明卤地菊多糖具有优良的保湿性能，实验证明，卤地菊多糖对卷烟有较好的保湿性。
本发明卤地菊多糖的制备方法，提取步骤包括样品干燥、粉碎一浸提一离心、过滤一浓缩一醇沉一冻干一粗多糖，分离纯化步骤包括粗多糖一离子交换柱层析一收集一冻干一凝胶柱层析一收集一冻干一纯多糖，操作简单，无污染，分离纯化效果好，杂质去除率高。结构分析运用多重手段，确保结果的准确性。对卷烟运用研究也具有实际生产意义和价值。附图
表说明图I为实施例2中成品的高效液相谱图；图2为实施例2中成品的红外全扫描谱图；
图3为实施例2中成品的气相分析谱图；图4为实施例2中成品的气质联用分析谱图；图5为实施例2中成品的1H核磁谱图；图6为实施例2中成品的C谱核磁谱图；图7为实施例4中成品卤地菊多糖、蒸馏水及丙二醇的保湿率随时间变化图。
具体实施例方式本发明结合以下实施例做进一步描述。保湿率(％)=M/M0 X 100% ；其中，Μ。为样品放置前水溶液重量，M为某时刻样品的即时重量。实施例I将干燥的卤地菊全株样品粉碎至40目，按料液比(质量比)I 20加入一定量的蒸馏水，100°C沸水提取2次，每次3小时，合并2次提取液得到总提取液；总提取液冷却后经25°C高速(10000转/分)离心15min和真空抽滤后，真空浓缩至原总提取液体积的1/10，向浓缩液中加入体积分数95%的乙醇水溶液，使体系中乙醇体积分数达50%，搅拌，静置10h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖；将粗多糖用水溶解,上DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱(柱型为XK 26 X IOOcm的二乙氨乙基琼脂糖凝胶离子交换柱)，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，再用水溶解，上S印hacryl S-200系列凝胶柱(柱型为XK 26 X 100cm)层析，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干得成品卤地菊多糖。采用高效液相、红外全扫描、气相分析、气质联用及核磁分析成品结构高效液相出峰时间为10. 502分钟；红外全扫描显示几个特征峰均为β -D-果聚糖特征峰；气相分析显示该糖单糖组成为果糖；气质联用显示了果聚糖的连接方式为2 — 6连接；核磁数据与表I 一致。表明该卤地菊多糖的主要结构为以2 — 6连接的β -D-果聚糖为主链，以与主链 I —2连接的 a-D-葡萄糖为端基，S卩 a-D-Glc-(l —2)_[β-D-Fru-(6 — 2)-β-D-Fr
U_] η。称取卤地菊多糖2mg，配成O. 8mg/ml水溶液，均匀喷洒到平衡好的烟丝20g中，以等量蒸馏水及丙二醇做对照，将烟丝放入恒温恒湿箱中，平衡。检测保湿率。保湿率结果显示等量的卤地菊多糖、蒸馏水及丙二醇用于烟丝保湿剂时，卤地菊多糖的保湿效果最好，37小时后保湿率仍高于丙二醇，其比目前常用的保湿效果显著的丙二醇的保湿效果还要好，且明显高于蒸馏水的保湿效果。表明卤地菊多糖具有优良的保湿效果。
实施例2将干燥的卤地菊全株样品粉碎至40目，按料液比(质量比)I 30加入一定量的蒸馏水，100°C沸水提取2次，每次3小时，合并2次提取液得到总提取液；总提取液冷却后经25°C高速(10000转/分)离心15min和真空抽滤后，真空浓缩至原总提取液体积的1/20，向浓缩液中加入体积分数95%的乙醇水溶液，使体系中乙醇体积分数达60%，搅拌，静置10h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖；将粗多糖用水溶解,上DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱(柱型为XK 26 X 100cm)离子交换柱，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，再用水溶解，上Sephacryl S-200系列凝胶柱(柱型为XK 26 X 100cm)层析，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干得成品卤地菊多 糖。采用高效液相、红外全扫描、气相分析、气质联用及核磁分析成品结构高效液相出峰时间为10. 502分钟；红外全扫描显示几个特征峰均为β -D-果聚糖特征峰；气相分析显示该糖单糖组成为果糖；气质联用显示了果聚糖的连接方式为2 — 6连接；核磁数据见表I。表明该卤地菊多糖的主要结构为以2 —6连接的β-D-果聚糖为主链，以与主链I —2 连接的 a-D-葡萄糖为端基，S卩 a-D-Glc-(l —2) _[β-D-Fru-(6 — 2)-β-D-Fru-]
n°称取卤地菊多糖2mg，配成O. 08mg/ml水溶液，均匀喷洒到平衡好的烟丝20g中，以等量蒸馏水及丙二醇做对照，将烟丝放入恒温恒湿箱中，平衡。检测保湿率。保湿率结果显示等量的卤地菊多糖、蒸馏水及丙二醇用于烟丝保湿剂时，卤地菊多糖的保湿效果最好，37小时后保湿率仍高于丙二醇，其比目前常用的保湿效果显著的丙二醇的保湿效果还要好，且明显高于蒸馏水的保湿效果。表明卤地菊多糖具有优良的保湿效果。表I实施例2中成品的核磁谱图数据
残基化学位移，ppm
Ta~I Ib 12 3 [4 [5 Υβη 6b^2)-P-D-Fru-(6^ (a)| H 3.69 3.914.24 4.08 3.853J53^82
C 60.92 103.24 77.01 74.31 81.08 62.13~α-D-Glc (b)if 5.44 3J33.76 3.45 81 4AS403
C 93.63 71 78 76.4 70.48 72.40 60.41实施例3将干燥的卤地菊全株样品粉碎至80目，按料液比(质量比)I 40加入一定量的蒸馏水，100°C沸水提取2次，每次3小时，合并2次提取液得到总提取液；总提取液冷却后经25°C高速(10000转/分)离心15min和真空抽滤后，真空浓缩至原总提取液体积的1/10，向浓缩液中加入体积分数95%的乙醇水溶液，使体系中乙醇体积分数达65%，搅拌，静置10h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖；将粗多糖用水溶解,上DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱(柱型为XK 26 X IOOcm)离子交换柱，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，再用水溶解，上Sephacryl S-200系列凝胶柱(柱型为XK 26 X IOOcm)层析，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干得成品卤地菊多糖。采用高效液相、红外全扫描、气相分析、气质联用及核磁分析成品结构高效液相出峰时间为10. 502分钟；红外全扫描显示几个特征峰均为β -D-果聚糖特征峰；气相分析显示该糖单糖组成为果糖；气质联用显示了果聚糖的连接方式为2 — 6连接；核磁数据与表I 一致。表明该卤地菊多糖的主要结构为以2 — 6连接的β -D-果聚糖为主链，以与主链 I —2连接的 a-D-葡萄糖为端基，S卩 a-D-Glc-(l —2)_[β-D-Fru-(6 — 2)-β-D-Fr
U_] η。称取齒地菊多糖2mg,配成O. 5mg/ml水溶液,均勻喷洒到平衡好的烟丝20g中，以等量蒸馏水及丙二醇做对照，将烟丝放入恒温恒湿箱中，平衡。检测保湿率。保湿率结果显示等量的卤地菊多糖、蒸馏水及丙二醇用于烟丝保湿剂时，卤地菊多糖的保湿效果最好，37小时后保湿率仍高于丙二醇，其比目前常用的保湿效果显著的丙二醇的保湿效果还要好，且明显高于蒸馏水的保湿效果。表明卤地菊多糖具有优良的保湿效果。实施例4将干燥的卤地菊全株样品粉碎至80目，按料液比(质量比)I 15加入一定量的蒸馏水，100°C沸水提取2次，每次3小时，合并2次提取液得到总提取液；总提取液冷却后经25°C高速(10000转/分)离心15min和真空抽滤后，真空浓缩至原总提取液体积的1/20，向浓缩液中加入体积分数95%的乙醇水溶液，使体系中乙醇体积分数达60%，搅拌，静置10h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖；将粗多糖用水溶解,上DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱(柱型为XK 26 X 100cm)离子交换柱，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，再用水溶解，上Sephacryl S-200系列凝胶柱(柱型为XK 26 X 100cm)层析，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干得成品卤地菊多糖。米用高效液相、红外全扫描、气相分析、气质联用及核磁分析成品结构高效液相出峰时间为10. 502分钟；红外全扫描显示几个特征峰均为β -D-果聚糖特征峰；气相分析显示该糖单糖组成为果糖；气质联用显示了果聚糖的连接方式为2 — 6连接；核磁数据与表I 一致。表明该卤地菊多糖的主要结构为以2 — 6连接的β -D-果聚糖为主链，以与主链 I —2连接的 a-D-葡萄糖为端基，S卩 a-D-Glc-(l —2)_[β-D-Fru-(6 — 2)-β-D-Fr
U_] η。称取卤地菊多糖2mg，配成O. 2mg/ml水溶液，均匀喷洒到平衡好的烟丝20g中，以等量蒸馏水及丙二醇做对照，将烟丝放入恒温恒湿箱中，平衡。检测保湿率，如图7。图7显示，等量的卤地菊多糖、蒸馏水及丙二醇用于烟丝保湿剂时，卤地菊多糖的保湿效果最好，37小时后保湿率仍高达44%，其比目前常用的保湿效果显著的丙二醇的保湿效果还要好，且明显高于蒸馏水的保湿效果。实施例5将干燥的卤地菊全株样品粉碎至100目，按料液比(质量比)1 :50加入一定量的蒸馏水，100°C沸水提取5次，每次2小时，合并2次提取液得到总提取液；总提取液冷却后经25°C高速(10000转/分)离心15min和真空抽滤后，真空浓缩至原总提取液体积的1/30，向浓缩液中加入体积分数100%的乙醇水溶液，使体系中乙醇体积分数达70%，搅拌，静置8h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖；将粗多糖用水溶解,上DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱(柱型为XK 26 X 100cm)离子交换柱，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，再用水溶解，上Sephacryl S-200系列凝胶柱(柱型为XK 26 X 100cm)层析，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干得成品卤地菊多糖。采用高效液相、红外全扫描、气相分析、气质联用及核磁分析成品结构高效液相出峰时间为10. 502分钟；红外全扫描显示几个特征峰均为β -D-果聚糖特征峰；气相分析显示该糖单糖组成为果糖；气质联用显示了果聚糖的连接方式为2 — 6连接；核磁数据与表I 一致。表明该卤地菊多糖的主要结构为以2 —6连接的β-D-果聚糖为主链，以与 主链 I —2连接的 a-D-葡萄糖为端基，S卩 a-D-Glc-(l —2)_[β-D-Fru-(6 — 2)-β-D-Fr
U_] η。称取卤地菊多糖O. 4mg，配成O. 4mg/ml水溶液，均匀喷洒到平衡好的烟丝20g中，以等量蒸馏水及丙二醇做对照，将烟丝放入恒温恒湿箱中，平衡。检测保湿率。保湿率结果显示等量的卤地菊多糖、蒸馏水及丙二醇用于烟丝保湿剂时，卤地菊多糖的保湿效果最好，37小时后保湿率仍高于丙二醇，其比目前常用的保湿效果显著的丙二醇的保湿效果还要好，且明显高于蒸馏水的保湿效果。表明卤地菊多糖具有优良的保湿效果。本发明中，提取溶剂选用水，在水中提取可保证有效成分的提取，提取的次数并没有严格的限制，可适当增加或减少。本发明制备方法中参数的变化并不影响卤地菊多糖的制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现卤地菊多糖的制备。在此不再赘述。
权利要求
1.一种卤地菊多糖，其特征在于，所述的卤地菊多糖的主要结构为以2 —6连接的β -D-果聚糖为主链，以与主链I — 2连接的a -D-葡萄糖为端基。
2.根据权利要求I所述的卤地菊多糖的制备方法，其特征在于，包括步骤 a.将干燥的齒地菊样品粉碎，得到齒地菊粉体； b.将卤地菊粉体在水中提取，得到提取液，其中，卤地菊粉体与水的质量比为I:15-50 ； c.提取液冷却后经离心和真空抽滤得到滤液，滤液真空浓缩至提取液体积的三十分之一至十分之一，得到浓缩液； d.向浓缩液中加入体积分数为95%-100%的乙醇，使体系中乙醇体积分数达到50%-70%，搅拌，静置8h-12h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖； e.将粗多糖用水溶解，上二乙氨乙基琼脂糖凝胶离子交换柱，以水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，再用水溶解，上凝胶柱层析，以水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，得到卤地菊多糖。
3.根据权利要求2所述的卤地菊多糖的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述的卤地菊样品选用卤地菊全株。
4.根据权利要求2所述的卤地菊多糖的制备方法，其特征在于，步骤a中，卤地菊粉体的目数为20目-100目。
5.根据权利要求2所述的卤地菊多糖的制备方法，其特征在于，步骤b中，卤地菊粉体在沸水中提取2小时-3小时。
6.根据权利要求2或5所述的卤地菊多糖的制备方法，其特征在于，步骤b中，卤地菊粉体在水中提取2次-5次，每次卤地菊粉体与水的质量比为I : 15-50。
7.根据权利要求I所述的卤地菊多糖在卷烟中的应用，其特征在于，所述的卤地菊多糖作为卷烟烟丝保湿剂在卷烟中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的卤地菊多糖的用量为卷烟烟丝质量的 O. 02%。-O. 2%0。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的应用方法包括将所述的卤地菊多糖经水溶解，配制成O. 08mg/ml-0. 8mg/ml的溶液喷加到卷烟烟丝上,制备卷烟。
全文摘要
本发明公开了一种卤地菊多糖及其制备方法和应用，卤地菊多糖的主要结构为以2→6连接的β-D-果聚糖为主链，以与主链1→2连接的α-D-葡萄糖为端基。该多糖具有优良保湿效果的卤地菊多糖，可作为卷烟烟丝的保湿剂。本发明还公开了一种卤地菊多糖的制备方法，提取步骤包括样品干燥、粉碎→浸提→离心、过滤→浓缩→醇沉→冻干→粗多糖，分离纯化步骤包括粗多糖→离子交换柱层析→收集→冻干→凝胶柱层析→收集→冻干→纯多糖，操作简单，无污染，分离纯化效果好，杂质去除率高。
文档编号A24B15/40GK102964462SQ20121048868
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者杨君, 储国海, 黄芳芳, 蒋健, 张安强 申请人:浙江中烟工业有限责任公司