专利名称：利用生物物质从香烟烟气中除去有害的氧化剂和致癌的挥发性亚硝基化合物的制作方法
技术领域：
本发明提出了一种防止吸烟时吸入有害化合物，即氧化氮、自由基、醛、过氧化氢、一氧化碳、微量元素和致癌的挥发性亚硝基化合物的方法，这些物质迄今尚不能被常规的香烟滤嘴有效滤除。
国际期刊上的很多文章都提出，香烟烟气可分为两相；a)固相(焦油)；和b)气相。这种分离在使用典型的剑桥玻璃纤维时会发生，这种纤维能留住99.9％的粒度大于0.1μm的微粒。香烟焦油含有极高浓度的、非常稳定的自由基，这些自由基至少可分为四种不同的类型。与醌和羟醌平衡的半醌被认为是具有最有趣的化学特性的自由基。该醌系统将分子氧还原成超氧化物(O2)，后者通过自发歧化生成过氧化氢(H2O2)。在被吸入的气相中，每一口烟里面有1015个半衰期不足1秒的有机基团。看起来矛盾的是，尽管其半衰期很短，但它们在气相中维持较高活性的时间达10分钟以上。事实上，在靠近香烟滤嘴末端的地方，上述自由基的浓度明显提高了。对这种矛盾的一种解释是出现了持续的稳态情形；因为自由基不断产生(Pryor，W.A.，stone，K.，Ann.N.Y.Acad.Sci.68612-28，1993)。
氧化氮(NO)是吸烟时烟气气相中最重要的自由基，它参与生成二氧化氮、异戊二烯基、过氧化氢基和烷氧基的一系列反应。烟气中还含有构成其毒害作用的相当数量的醛类。已经证实，从烟气中提取出的微量醛类可导致蛋白质的分解代谢和血浆蛋白质巯基的氧化。醛类的这些特性是由于醛的羰基与血浆蛋白质的-SH基和-NH2基之间的反应导致的。例如，烟气中的丙烯醛快速同-SH基反应生成羰基化合物(Alving，K.，Forhem，C.，和Lundberg，J.M.，Br.J.Pharmacol.110739-746，199 3)。烟气焦油中含有微量元素，如铁、铜、锰和镉，它们涉及到很多的自由基产生反应，并导致极为活跃的二级基团的形成(例如，过氧化氢基、烷氧基、超氧化物、细胞毒性醛类等)。吸烟时进入肺部的微量元素会导致肺液和肺泡巨噬细胞的一系列氧化还原反应，这些反应会导致很活跃的羟基(OH-)的形成。这些羟基主要是在存在铁的条件下通过芬顿反应(Fento reaction)生成的。铜在肺部通过与过氧化氢反应也能生成羟基。低浓度的锰(10-7M)能激活肺内皮细胞的可溶性鸟苷酸环化酶，从而通过一个正反馈机制生成氧化氮和超氧化物(Youn，Y.K.Lalo-nde，C.，和Demling，R.，Free Rad.Biol.Med.12409-415，1992)。烟草燃烧时会产生一氧化碳，即使在吐出烟气以后仍有一定量的CO留在肺里，它在与肺组织的内皮细胞和其它细胞里的可溶性鸟苷酸环化酶的血红素部分反应之后将其激活。与正反馈机制相关的细胞中环GMP的较高含量会增加氧化氮和超氧化物的产生(Watson，A.，Joyce，H.，Hopper，L.，和Pride，N.B.，Thorax48119-124，1993)。NO气体可由多种细胞产生，包括维管内皮细胞和网状内皮细胞，能导致平滑肌松驰(Lowenstein，C.J.，Din-erman，J.L.，Snyder，S.H.Ann.Intern.Med.120227-237，1994)。还有被认为同样会损害血管和其它组织的外源NO。业已证实，仲胺和叔胺可与亚硝酸根和其它亚硝基化剂反应以生成N-亚硝胺(Low-enstein，C.J.，Dinerman，J.L.，Snynder，S.H.Ann.Intern.Med.120227-237，1994)。自1974年以来，很多研究都证实，在收获、烟草加工和吸烟时，生物碱被亚硝基化成烟草专一性N-亚硝胺(TSNA)。在烟草和/或其烟气中鉴定的TSNA中，N-亚硝基去甲烟碱(NNN)，4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)和4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)是强动物致癌物。NNN会诱发家鼠肺部肿瘤，仓鼠气管肿瘤和大鼠鼻腔和食管肿瘤。NNK会诱发家鼠、仓鼠和大鼠的肺癌，以及大鼠肝癌、鼻腔癌和胰腺癌。口腔内拭抹NNN和NNK混合物能诱发大鼠口腔癌和肺癌。生流烟气中NNK和NNN的一般含量为200ng/支烟(Hecht，S.S.，Spr-att，T.E.，和Trushin，N.Carcinogenesis，9161-165，1988)。
发明人目前有关烟气对肺组织的影响的研究业已揭示出NO与超氧化物反应生成强氧化基团过亚硝酸盐(ONOO-)，它会导致重要生物分子的次级损坏反应。在我们的实验室中通过体外和体内实验研究了NO在细胞中的代谢和破坏作用。
当存在氧气时，NO被氧化成二氧化氮(NO2)。其氧化速度取决于氧的浓度和NO浓度的平方。已清楚二氧化氮的细胞毒性，当它进入水溶液中时会转变成亚硝酸根和硝酸根。而且，NO可与微量元素和/或金属蛋白，如血红蛋白形成配合物(Wink，D.A.，Darbyshire，J.F.，Nims，R.W.，Saavedra，J.E.，和Ford，P.E.，Chem.Res，Toxicol.623-27，1993)。
NO与超氧化物反应生成有害化合物ONOO-，可证实几种超氧化物毒性。就其强氧化电势(+1.4V)而言，ONOO-异常稳定。在其分解过程中，它会生成强氧化衍生物，包括羟基、二氧化氮和硝鎓离子。因此，组织对NO和超氧化物产生的任何改进都会导致强次级氧化基团的生成(Deliconstantinos，G.，Villiotou，V.，Stavrid-es，J.C.，Cancer Mol.Biol.177-86，1994)。最终，ONOO-及其酯(RO-ONO或RO-ONO2)能导致α-1-蛋白酶抑制剂(α1PI)失活。这一点可由以下事实证实a)仅有过氧化氢还不能使α1PI快速失活，只有在存在NO时才发生作用，生成ONOO-并使α1PI快速失活，b)叔丁基过亚硝酸盐(RO-O-O-NO2)或ONOO-溶液本身就能使α1PI失活，以及c)胺和氨基酸能防止α1PI蛋白酶快速失活(Mor-eno，J.J.，和Pryor，W.A.，Chem.Res.Toxicol.5425-431，1992)。除烟气中所含的自由基以外，对吸烟者来说被激活的肺泡巨噬细胞是另一个重要的自由基产生源。被烟气激活的肺泡巨噬细胞发生呼吸爆发，导致更多的有氧自由基(主要是O2-，NO和H2O2)的产生。吸烟者有更大数量的肺泡巨噬细胞和循环中性白细胞。烟气中的有氧自由基也与肺癌的发生有关。吸入的烟气使得肺细胞氧化应力提高，导致细胞内抗氧化剂浓度下降。H2O2通过羟基的产生与细胞中DNA生反应，并导致双链断裂。由于这种断裂可通过添加过氧化氢酶得以避免，这就间接证实了H2O2和羟基对细胞DNA的破坏作用(Leanderson，P.，Ann.N.Y.Acad.Sci.686249-261，1993)。此外，H2O2能导致肺部气管上皮的变化，并同吸烟者支气管癌的发病有关。因此，H2O2(烟气中所含)对肺细胞的损害作用和对肺癌发病的作用得到了有力的证实。烟气焦油既含有半醌基，又含有铁，因而形成了一种羟基产生系统。烟气焦油中所含的各种微量元素(Fe、Cu、Mn、Cd)既可作用于细胞内，又可作用于细胞间。Fe2+能发生已知的芬顿反应通过羟基可导致多种氧化反应。类似地，Cd2+也可导致羟基产生。Mn2+是可溶性鸟苷酸环化酶的代表性激活剂。烟气中所含的Cd2+对肺的危害尤其大。吸烟者肺中Cd2+的含量为正常浓度的2倍。这表明，Cd2+取代了肺管上皮中正常存在的Zn2+(Kostial，K.，见.“TraceElements in Human and Animal Nutrition(ed.W.Mertz)第五版，Vol.2319-345，Academic Press，Inc.Orlando，Fl.，1986)。存在于烟气中的醛与蛋白质中的-SH和-NH2基反应，最终变成惰性的。烟气中所含的丁烯醛(α，β不饱和醛类)能降低-SH基浓度，并提高羰基蛋白质的浓度(Stadtman，E.R.，Science 2571220-1224，1991)。
今天，香烟上的滤嘴备受推崇。在香烟上加装滤嘴的终极目标是能最大限度地留住气相和固相烟气中的有害化合物。对吸烟者的流行病学研究业已证实，无论是以气相、固相或混合相摄入烟气，发病都与剂量正相关(Surgeon General of the U.S.Public Hea-lth Service.The health Consequences of using smokelesstobacco，N.H.Publ.No 862874，Bethesda，MD，1986)。业已证实，对烟草进行改进本身就是减少烟气中有害化合物含量的实用途径。起初是这样实现的；采用普通过滤嘴，然后通过化学处理改变烟草的组成。还可以通过采用多孔纸或由烟叶制成的纸对香烟生产加以改进。在过去15年里，已做出减少吸烟对健康危害的很多尝试，有以下措施减少每支香烟的烟量改变香烟直径；以及采用多孔过滤嘴。多孔过滤嘴能够用空气把烟气稀释50％。活性炭也与多孔过滤嘴结合在一起使用。这样可以显著减少烟气中的焦油和尼古丁。该技术尤其在发达国家像奥地利、加拿大、法国、德国、瑞典、英国和美国得到采用。美国香烟中焦油和尼古丁的含量分别从1955年时的38mg和2.7mg降至1991年时的13mg和1mg。在欧共体，这种降低烟气中焦油和尼古丁含量的趋势仍在继续。1993年1月时焦油的允许上限为15mg，到1998年1月初，这一上限将下降到12mg。但在其它国家，烟气中焦油含量为22mg(Mitacek，E.J.，Brunne-man，K.D.，Pollednak，A.P.，Hoffman，D.，和Suttajit，M.，Prev.Med.20764-773，1991)。香烟生产中所作的改进导致特导性地除去烟气中的一些有毒物质；更具体地说，引入了乙酸纤维素滤嘴，因而可以部分地除去半挥发性的酚和挥发性N-亚硝胺(Bru-nnemann，K.D.，Hoffman，d.，Recent.Adv.Tobacco Res.1771-112，1989)。采用多孔过滤嘴，可选择性地减少CO。采用富含亚硝酸盐的烟草，可选择性地降低致癌的多核芳烃(PAH)的浓度。但是，通过高浓度的亚硝酸盐来降低烟草的PAH会导致不希望的致癌N-亚硝胺的增加，因此，必须用其它方法来减少PAH(Hoffman，D.，Hoffman，I.，Wynder，E.L.，Lung Cancer and the ChangingCigarette in Relevance to Human Cancer of N-Nitroso-comp-ounds，Tobacco Smoke and Mycotoxins(eds.O′Neil，I.K.，Chen，J.，和Bartsch，H.)Vol.105449-459，1991)。
通过以上说明可清楚地看到，有必要制造一种能留住有害NO，自由基，H2O2，醛类和致癌的亚硝基化合物的过滤嘴，这些物质都对烟气对呼吸系统和心血管系统的损害作用负责。为了鉴定烟气中的有害化合物，我们做了化学、生物学实验。进行的化学实验有
a)用一种新的化学和生物学方法(该方法是由我们的实验室创立的)鉴定并定量测定NO和NOx。
b)采用依赖于光泽精的化学发光方法鉴定自由基。
c)通过激活荧光素-荧光素酶酶促系统鉴定醛类和醌类(该方法也是由我们实验室创立的)。
d)在存在ATP的条件下，通过由荧光素酶实现的氧化荧光素的方法鉴定并定量测定微量元素(该方法由我们实验室创立)。
e)采用依赖于异鲁米诺微过氧化物酶(isoluminolmicroperox-idase)的化学发光方法鉴定并定量测定H2O20f)通过鲁米诺增强的化学发光方法对ONOO-进行分光光度鉴定和定量测定。
g)通过鲁米诺增强的化学发光鉴定致癌的亚硝基化合物。
所进行的生物学实验如下a)用提取的可溶性鸟苷酸环化酶活性作为功能参数鉴定NO。
b)通过对由ONOO-引起的人血红细胞氧化应力(oxidativestress)的测定鉴定ONOO-。
c)用提取的可溶性鸟苷酸环化酶活性作为功能参数鉴定CO。
此外，我们还做了以下体外实验a)从大鼠肺部提取肺泡巨噬细胞。
b)测定由叔丁基过氧化氢(t-BHP)引起的肺泡巨噬细胞的氧化应力。
c)测定由肺泡巨噬细胞产生的NO/NO2-/ONOO-。
d)测定由肺泡巨噬细胞产生的H2O20e)外源H2O2对由肺泡巨噬细胞产生NO的作用。
为了测定以下化合物，用人类志愿者做体内实验a)测定不吸烟者吐出的空气中的NO。
b)测定吸烟者吐出的空气中的NO。
c)测定吐出的烟气中的NO。
d)测定吐出的烟气中的ONOO-。
e)测定吐出的烟气中的自由基。
f)测定吐出的烟气中的醛类。
为了测定a)烟气中的，b)在用烟气攻击以后由肺泡巨噬细胞释出的和c)由志愿者吐出的烟气中所含的NO，NOx，我们用一个直径为2.5cm的透明有机玻璃实芯棒设计并制造了一个腔室，用机床将实芯有机玻璃棒的一端镂空，在每根有机玻璃棒上制造出相同的锥形腔。然后对开口端作进一步的机加工和抛光，以制成匹配的楔形结合，在两个锥形腔之间形成非常紧的结合。将一个薄的特氟隆(te-flon)片(厚O.0015英寸的聚四氟乙烯)夹在上述组件之间，通过蝶形螺钉将其再压在一起。膜两侧的两个可用管进入部分可在生物反应期间在膜的任意一侧注入、抽出或修饰生物活性样品和活性物质。
A、通过化学发光测定NO按照文献制备标准NO溶液(Deliconstantinos，G.，Villiotou，V.，Fassitsas，C.，(1992)J.Cardiovasc.Pharmacol.12，S63-S65)和(Deliconstantinos，G.，Villiotou，V.，Stavrides，J.C.，(1994)见“Biology of Nitric Oxide”，eds.Feelish，M.，Busse，R.，Moncanda，S.，Portland Press，印刷中)。反应溶液由汉克氏平衡盐溶液(HBSS)pH 7.4；H2O2(500μM)；鲁米诺(30μM)组成，总体积为500μl。剧烈搅拌小瓶，然后在Bedrthold Auto-Lumat LB953发光计上记录发光。
B、NO/NO2-的化学测定。
NO的化学测定是基于酸性pH下NO对磺胺的重氮化作用以及随后莨菪亭的氧化作用。如上所述，可通过发光方法对其进行测定(De-liconstantinos，G.，Villiotou，V.，Fassitsas，C.，J.Cardi-ovasc.Pharmacol 12S63-S65，1992)。将存在于HBSS中的肺泡巨噬细胞(106细胞/ml)与100μl的由溶解在20％H3PO4中的20％的磺胺和25μM莨菪亭组成的试剂混合。在室温条件(22℃)下用一台Amin-co SPF-500型荧光分光光度计监测荧光的衰变。连续监测荧光，直到线的斜度可测(大约8分钟)。然后用由各种纯NO浓度构成的标准曲线将斜度测量值转换成NO的nmol浓度。基于其在所培养的细胞上清液中的积累，通过与格瑞斯试剂的反应测量NO合成的最终产物亚硝酸根(NO2-)。
C、过亚硝酸根(ONOO-)的分光光度测定ONOO-按前述方法合成、滴定并保存(Deliconstantinos，G.，Villiotou，V.，Stavrides，J.C.，见“Biology of nitric Oxi-de(eds.Feelish，M.，Busse，R.，和Moncada，S.)Portland Pre-ss(印刷中))。由于ONOO-在pH 7.4时的不稳定性，在H2O2和NO溶液混合后马上记录UV光谱。根据1670 M-1Cm-1的ε302nm值测定ONOO-的浓度。减去H2O2相应浓度的基础UV光谱，就得到UV光谱。
D、自由基的测定自由基的测定是按上述方法，采用由光泽精/DAMCO(1，4二氮杂二环-[2，2，2]辛烷)诱发的化学发光进行的(Deliconstantinos，G.，Krueger，G.R.F.，J.Viral Dis.122-27，1993)。反应混合物由HBSS，pH 7.4；光泽精(30μM)；DAMCO(100μM)组成。剧烈搅拌试剂瓶，并在一台Bedrthold AutoLumat LB953型发光计上记录发光。采用有氧自由基的清除剂(SOD，甘露糖醇，组氨酸，蛋氨酸)。
E、微量元素和醛类的测定这一测定是基于在有ATP-镁盐的条件下由荧光素酶催化的D-荧光素氧化作用，根据下面的反应进行的 微量元素Cd2+，Cu2+，Fe2+可提高荧光素酶的活性，而且最大化学发光响应根据微量元素的浓度成比例提高，直至10μg。该反应在pH 7.4的HBSS中进行，总体积为0.5ml。
为了测定醛类，采用了同样的酶促系统荧光素/荧光素酶，但缺乏ATP。在没有ATP的条件下醛与该酶促系统反应产生化学发光。所用试剂取自ATP试剂盒(Calbiochem-Novabiochem CA，U.S.A.)。
F、肺泡巨噬细胞的提取简而言之，通过静脉注射戊巴比妥杀死大鼠，切开胸腔，并用无Ca2+的冷(4℃)磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4)洗去肺里的血，将肺从胸腔完整地取出。大鼠肺匀浆是这样获得的用注射器反复吸抽肺组织，然后在衡定的Finkelstein平衡盐溶液(FBSS；pH 7.4)流下使其顺序地通过越来越细的不锈钢筛，分别为每英寸32孔、62孔和68孔的筛。收集肺泡巨噬细胞的最终悬浮液，过滤并以300×g离心10分钟，使细胞沉淀。包括98％以上的巨噬细胞的细胞沉淀被洗涤，并再悬浮于Ringer′s溶液中。再将以上过程重复两次。每只大鼠可提取大约10×108的巨噬细胞。通过锥虫蓝排除法估测其存活性。
F、亚硝基化合物的鉴定亚硝基化合物是在用H2O2对其进行处理以后通过氧化氮(NO)的释放进行鉴定的。反应溶液由二甲基亚硝胺和/或二乙基亚硝胺(1μM)；H2O2，(500μM)；鲁米诺(30μM)，溶于HBSS中，pH 7.4组成，总体积为0.5ml。剧烈搅动试剂瓶，在一台Bedrthold AutoLumatLB953型发光计上记录发光。甘露糖醇(100mM)；DMSO(100mM)和半胱氨酸(3.0mM)被用于证实ONOO-的生成。
G、肺泡巨噬细胞的分离简而言之，通过静脉注射戊巴比妥杀死大鼠，切开胸腔，并用无Ca2+的冷(4℃)磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4)洗去肺里的血，将肺从胸腔完整地取出。大鼠肺匀浆是这样获得的用注射器反复抽吸肺组织，然后在稳定的Finkelstein平衡盐溶液(FBSS；pH 7.4)流下使其顺序地通过越来越细的不锈钢筛，分别为每英寸32孔、62孔和68孔的筛。收集肺泡巨噬细胞的最终悬浮液，过滤并以300×g离心10分钟；使细胞沉淀。包括98％以上的巨噬细胞的细胞沉淀被洗涤，并再悬浮于Ringer′s溶液中。再将以上过程重复两次。每只大鼠可提取大约10×108个巨噬细胞。通过锥虫蓝排除法估测其存活性。
H、由叔丁基过氧化物(t-BHP)诱发的肺泡巨噬细胞的氧化应力通过鲁米诺化学发光法测定由t-BHP(2.5mM)诱发的肺泡巨噬细胞有氧自由基的产生。如上所述，在一台Bedrthold AutolumatLB 953发光计上记录化学发光响应(Deliconstantinos，G.，krue-ger，G.R.F.，J.Viral Dis.1，22-27，1993)。
I、过氧化氢(H2O2)的测定制备异鲁米诺/微过氧化物酶混合液(100mM硼酸钠，1mM异鲁米诺，溶于70％的水和30％甲醇中的0.01mM微过氧化物酶pH8)。将50μl上述试剂与提取的肺泡巨噬细胞(106个细胞)在HBSS中混合，总体积为0.5 ml。利用由各种纯H2O2浓度构成的标准曲线将化学发光转换成H2O2的nmol数。
J.用于CO测定的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的制备和纯化通过GTP-琼脂糖色谱法纯化从人体内皮细胞中提取的sGC。将细胞溶质(10mg蛋白质)加入GTP琼脂糖柱(1.8×9cm)中，该柱是用含有250mM蔗糖和10mM MnCl2的25mM Tris·HCl缓冲液(pH7.6)预平衡过的。然后用添加了10mM GTP的5ml平稳缓冲液将sGC从柱上洗脱下来。
K、环GMP的测定在用乙酐对样品作乙酰化处理以后，通过放射免疫测定法测定cGMP的浓度(Delikonstantinos，G.，和Kopeikina，L.，AnticancerRes.9753-760，1989)。反应混合物中含有三乙醇胺/HCl(50mM)；磷酸肌酸(5mM)；MgCl2(3mM)；异丁基甲基黄嘌呤(1mM)；肌酸激酶(0.6单位)；GTP(1mM)；可溶性鸟苷酸环化酶(1μg蛋白质)，总体积为150μl。通过添加GTP启动反应，并在37℃温育10分钟。吸出上述温育液，并通过加入冰镇HCl(0.1M)提取cGMP。10分钟以后，将样品转移到一个新的皿上，干燥，并再溶解在5mM乙酸钠(pH 4.75)中用于cGMP测定。用cGMP试剂盒(Amersham)测定生成的cGMP。
本发明的目的是提出并应用采用了生物物质的方法，该生物物质能与吸烟时吸入的下列物质反应，并将其清除
a)NO和NOx，b)CO，c)H2O2，d)自由基，e)醛-醌类，f)致癌的亚硝基化合物，g)留住微量元素镉、铜、锰、铁等。
本发明很大程度上有赖于这样的概念a)有可选择的合适清除剂，如血红蛋白或红细胞溶解产物或含有立体专一地结合的铁的物质b)有可供选择的含有带铁的卟啉环(如原卟啉)的清除剂c)有可供选择的含有不一定带铁的卟啉环的清除剂d)有可供选择的含有与其它金属，如Mg2+、Cu2+配合的卟啉环的清除剂e)将设计一种生物技术方法，用于加强目前用于香烟过滤嘴生产的普通的常规材料，以使其含有上述生物物质-清除剂。
本发明的关键在于这样的理论浸渍普通的常规香烟过滤嘴和/或含有活性炭的过滤嘴，可用生物物质对其加强，其特征在于具有与卟啉环配合的Fe2+、Cu2+、Mg2+，以及与蛋白质分子立体专一地结合的Fe2+，这样，可以使吸烟者在吸入烟气之前留住香烟中所含的有害化合物。这一事实是本发明的主要特征，并且构成了具有很大的工业应用前景的无可辩驳的革新。工业应用的方法本发明是以其应用于工业生产的角度以下述方法进行准备的
制备溶于磷酸缓冲溶液(PBS)(pH 7.4)中的1mg/ml的血红蛋白和/或红细胞溶解产物，并在溶液中加入100mg活性炭。在室温下将其温育30分钟，并用S&S Carl Schleicher&Schuell Co U.S.A.生产的滤纸过滤。通过分光光度法测定滤液中未被吸收的血红蛋白量。在室温下干燥用血红蛋白加强的炭。将200mg由血红蛋白加强的干炭夹在两个普通过滤嘴之间，以使所有抽吸通过的烟气接触该分子的活性基团(Fe2+，Fe3+、-SH，-NH2)(图2)。这种亲和材料将用于新型香烟过滤嘴的生产，从现在起，这种过滤嘴将被称为生物过滤嘴。
另外，血红蛋白可以用含有与卟啉环配合的金属离子Fe2+，Cu2+，Mg2+以及与蛋白质分子立体专一地结合的Fe2+的生物物质取代，如转铁蛋白、过氧化氢酶、原卟啉、细胞色素C、叶绿素。
另外，制备一种溶于磷酸缓冲溶液(PBS)(pH 7.4)中的5mg/ml血红蛋白和/或红细胞溶解产物溶液，并在25℃用一台Acta Beck-man记录分光光度计进行扫描。在540nm和575nm处重复地观察到吸收峰(Smith，R.P.，Kruszyma，H.J.Pharmacol.Exper.Ther.191，557-563，1974)。用该溶液浸泡普通的常规香烟过滤嘴，并在25-35℃将其风干。这样的亲和材料即可用于制造新型的香烟过滤嘴，从现在起我们称之为生物过滤嘴。这种新的生物过滤嘴能保证被吸入的烟气与过滤嘴中血红蛋白分子和/或溶解产物的活性基团发生全面接触，同时又不会改变烟气的物理特性或口味。出于美观，可将一小部分(3mm)的常规过滤嘴用在生物过滤嘴的可见到的一端。其它的工业生产方法包括以下内容将原卟啉溶于缓冲液(PBS，pH 7.4)中制备成浓度为5mg/ml的溶液，并在25℃用一台Acta Backman记录分光光度计进行扫描。用紫外线(498-408)激发原卟啉能产生橙红色荧光(620-630nm)。然后用上述溶液浸渍(浸泡)常规过滤嘴，并用热风(25-35℃)干燥。
另外，用Acta Beckman记录分光光度计扫描溶于PBS(pH 7.4)中的5mg/ml转铁蛋白溶液。该转铁蛋白表现出470nm的特征光谱。采用上述浸渍目前被使用的浸渍常规过滤嘴的方法。
另外，制备溶于PBS(pH7.4)中的5mg/ml过氧化氢酶溶液。
接下来采用上述用于制备生物过滤嘴的方法。
另外，制备溶于PBS(pH7.4)中的5mg/ml细胞色素C溶液。接下来采用上述制备生物过滤嘴的方法。
另外，制备溶于PBS(pH7.4)中的5mg/ml叶绿素溶液。采用上述制备生物过滤嘴的方法。
另外，将上述生物物质以固体形式夹在两个普通过滤嘴之间，使所有从该过滤嘴中抽吸通过的烟气都能接触该分子的活性基团(Fe2+、Fe3+、-SH、-NH2)。结果分析如下表所示，用于加强常规过滤嘴的各种生物物质被证实能不同程度地留住烟气中的有毒化合物(NO，CO，自由基，H2O2，醛类，微量元素和亚硝基化合物)。清除剂 NO CO 自由基 H2O2醛类 亚硝基化合物 微量元素％％％％％％％血红蛋 90909080909095白转铁蛋 85906060607550白过氧化 85909090808080氢酶原卟啉 85907080707580细胞色 85807080606070素C叶绿素 15104015101080获取了对烟气中高度有害物质的滞留程度，并将从生物过滤嘴中滤过的香烟烟气(20ml)同从常规过滤嘴中滤过的烟气(20ml)进行比较。仅将1ml从常规过滤嘴中滤过的烟气同40ml从生物过滤嘴中滤过的烟气作比较。结果表明，生物过滤嘴留住微量元素的能力为常规过滤嘴的40倍。
在下面详细的实验说明中给出了具代表性的结果，以便更好地理解这种生物物质的活力。
a)用化学发光方法鉴定烟气中所含的NO采用在实验部分所述的鲁米诺加强的化学发光方法鉴定NO。图3和4表示NO鉴定和测定、及烟气从生物过滤嘴中通过后NO被清除情况的典型实验。结果显示，90％以上的NO被血红蛋白留住。在留住和中和NO方面，生物过滤嘴的作用是显著的，NO与肺细胞和肺液中的有毒反应有关，特别是当它参与强氧化剂ONOO-的形成时。
b)用化学发光方法鉴定烟气中所含的自由基通过化学发光响应鉴定烟气中的自由基。发光响应是在光泽精/DAMCO系统与自由基反应以后造成的。图5表示，在化学发光响应2秒内出现的特征光谱，在烟气从生物过滤嘴中通过以后被100％地抑制。生物过滤嘴留住自由基意味着由常规香烟烟气导致的肺泡巨噬细胞里的氧化应力被减弱。
c)用化学发光方法鉴定烟气中所含的H2O2通过由异鲁米诺/微过氧化物酶系统所产生的化学发光响应测定H2O20图6表示由于H2O2在烟气中的存在所导致的化学发光的特征峰。在存在过氧化氢酶(100单位/ml)时，化学发光响应被抑制大约90％。当烟气从生物过滤嘴中通过以后，可见到化学发光响应被抑制80％。该异鲁米诺/微过氧化物酶系统是专门用于H2O2鉴定的。烟气中所含的自由基在同异鲁米诺作用以后能引起微弱的化学发光响应。由于过氧化氢酶抑制了最大发光响应的近90％，该微弱的化学发光看来仅占存在自由基时由H2O2引起的化学发光的约10％。H2O2的留住显著降低了由肺泡巨噬细胞所产生的氧化应力和NO。
d)用荧光素/荧光素酶酶促系统鉴定烟气中所含的微量元素和醛类。
烟气中所含的微量元素是通过其激活荧光素酶活性的能力进行鉴定的。图7表示1)在存在ATP时由荧光素氧化所引起的化学发光响应，2)存在Cd2+离子(0.5mg)时被增强了的化学发光响应，3)存在Cu2+离子(0.5mg)时被增强的化学发光响应，4)由烟气(1ml)引起的增强的化学发光响应和5)当40ml烟气通过生物香烟过滤嘴后所导致的化学发光抑制(与由烟气引起的化学发光相比)。很明显，由常规烟气中所含微量元素引起的化学发光响应比由从生物过滤嘴中通过的烟气所引起的化学发光响应高40倍。生物过滤嘴对微量元素的滞留既有短期效果又有长期效果。短期效果表现为对发生于肺部氧化还原反应的抑制(Fe，Mn)，长期效果表现为对血液中的组分和物质的损害的抑制(Cd)。
烟气中所含醛类的鉴定和测定是在无ATP的条件下用同样的荧光素/荧光素酶酶促系统做的。醛类能导致荧光素氧化。图8表示一个可持续1小时以上的特征化学发光响应。当所用的烟气通过生物过滤嘴以后，化学发光响应被抑制了100％，这表明，生物过滤嘴留住有毒的醛类的作用是显著的。
e)烟气中亚硝基化学物的鉴定烟气所含亚硝基化合物的鉴定是在用H2O2处理以后通过测定NO从亚硝基化合物中的缓慢释放获得的。如图9所示，大约900秒时得到一个化学发光响应高峰。烟气在通过生物过滤嘴以后，可见其化学发光响应被抑制90％，其高峰在约1200秒时出现。还示出了在用H2O2处理硝普酸钠(SNP)以后NO的缓慢释放。
图10表示亚硝基化合物二乙基亚硝胺和二甲基亚硝胺的NO缓慢释放；以及用H2O2处理的富集了烟气中的亚硝基化合物的血红蛋白的NO缓慢释放。很明显，与血红蛋白形成了加合物的烟气亚硝基化合物的NO释放，遵循与亚硝基化合物二乙基亚硝胺和二甲基亚硝胺的NO释放相同的模式。图11表示在用UVB照射(100mJ/cm2)血红蛋白-亚硝基化合物加合物1分钟以后，已与血红蛋白形成加合物的烟气亚硝基化合物的NO释放。在存在H2O2条件下测定NO释放，并给出1秒时的化学发光响应。图11中所见到的逐渐上升是由于H2O2对血红蛋白的作用(芬顿反应)。
f)由肺巨噬细胞产生NO体外实验是借助于我们实验室发明的特殊腔室进行的，如图1所示。分开该腔室的两个部分的特氟隆膜可通过NO，但不能通过NO2-和ONOO-。按实验部分所述方法提取的未受刺激的肺巨噬细胞被悬浮于HBSS缓冲液(1×106细胞/ml)中，并将其放在上述腔室的A部分。在腔室的B部分放置2.5ml格瑞斯试剂或磺胺/莨菪亭试剂。A部分中的巨噬细胞释放的NO通过特氟隆膜扩散到B部分，并与留在B部分的格瑞斯试剂和/或磺胺/茛菪亭试剂结合。这表明肺巨噬细胞能产生NO气体。然后通过分光光度法或荧光光度法测定存在于B部分的NO量。A部分所含的ONOO-和NO2-量也用格瑞斯和/或磺胺/茛菪亭试剂测定。用在被放入A部分之前烟气刺激过的巨噬细胞重复以上实验。图12所示结果表明，烟气能减少肺巨噬细胞中NO产生量，同时增加ONOO-的产生，这间接地证明大量产生的NO和O2-相互作用生成了ONOO-。
用生物过滤嘴重复以上实验(即烟气通过生物过滤嘴抽吸)证实，所采用的生物物质与未用烟气刺激的巨噬细胞一样，在A部分产生相同数量的NO2-和ONOO-，并在B部分产生相同数量的NO。在本申请中，格瑞斯反应的成分也被用于对在生理pH下的水溶液中NO/O2反应所生成的中间物的亚硝化动力学进行检测。将烟气(50ml)加入含有25mM磺胺和2.5mM N-(1-萘基乙二胺二氢氯化物(NEDD)的100mM磷酸缓冲液(pH7.4)中会在λmax＝496mm处产生一个吸收峰，证实了硝化所产生的特征偶氮化合物。值得通过比较相关生理条件下的NO预期的反应性来考虑以上观察结果的含意，据估计，NO在细胞微环境中的最大浓度为0.5-10μM。在吸烟时NO浓度急剧增加，对肺细胞造成损害作用。
g)肺巨噬细胞的氧化应力图13中给出了烟气对肺巨噬细胞氧化应力影响的结果。用t-BHP测定氧化应力表明，烟气导致的氧化应力为未受剌激的巨噬细胞的2倍。当烟气从生物过滤嘴中通过以后，所观察到的氧化应力与未受刺激的肺巨噬细胞的类似。这清楚地表明了它对烟气在巨噬细胞上引起的氧化应力的消除作用。现在的烟气中不再有导致肺巨噬细胞氧化应力的物质。
h)由肺巨噬细胞产生的H2O2由经烟气刺激过的巨噬细胞所产生的H2O2，其产率为未受刺激的巨噬细胞的10倍以上。与常规过滤嘴相比，采用生物过滤嘴可使H2O2的产生降低90％(图14)。很明显，如烟气能诱发巨噬细胞的氧化应力一样，它可以提高这些细胞对H2O2的产生。
i)重建实验用图1所示的腔室测定通过肺泡巨噬细胞释放的NO所生成的环GMP的量，其中，可溶性鸟苷酸环化酶被放在A部分，而肺巨噬细胞被放在B部分。在有和没有用烟气刺激过的细胞的条件下，在50分钟时间里测定由巨噬细胞所产生的NO量。用烟气(10ml)处理过的巨噬细胞所释放的NO量比未经处理的细胞约低10倍，因此，表现为环GMP的产量少10倍。用从生物过滤嘴中通过的烟气重复上述过程。结果表明，与未刺激过的巨噬细胞(对照)(图15)相比，没有统计学上的显著差异。如图16所示，当肺泡巨噬细胞用H2O2(5mM)处理时，B部分所积累的NO增加5倍以上。这表明H2O2通过一个正反馈机制促进NO的产生。巨噬细胞中的L-精氨酸/NO途径是与烟气导致NO/ONOO-释放的理论相一致的。
k)烟气中一氧化碳(CO)的鉴定采用基于CO对可溶性鸟苷酸环化酶的激发的生物学方法测定存在于烟气中的CO。
将用烟气饱和的HBSS引入腔室的A部分，其中存在超氧化物，以便中和NO；并将可溶性鸟苷酸环化酶引入B部分，由于CO从A部分扩散到B部分导致环GMP产量的增加。烟气在从生物过滤嘴中通过以后能使环GMP的产生量减少近80％(图17)。上述结果表明，烟气中的有害物质NOx和CO被生物过滤嘴留住并中和了。体内实验a)我们首先证实NO和ONOO-在呼出的烟气中的存在。由志愿者吸一支带有常规过滤嘴的香烟，在把呼出的烟气引入酸性溶液(50ml)(pH 4)中后鉴定呼出的烟气中存在的NO。用实验部分所讲述的鲁米诺增强的化学发光方法测定NO的浓度，采用由商品NO制成的标准曲线。所得NO浓度为0.045mM。用生物过滤嘴重复上述实验，与常规过滤嘴相比，吸入的烟气中NO浓度降低近70％(图18)。用1.2M的NaOH溶液测定ONOO-浓度，在303nm(图19)处表现一个吸收的增加(ε303nm＝1670 M-1cm-1)。我们的实验表明，吸烟时吐出的烟气中含有大量的ONOO-(将50ml吐出的烟气通入5ml 1.2M NaOH中产生0.9mM ONOO-的溶液)。测得吐出烟气中NO/ONOO-比为1∶20。
因此，看起来肺里的NOx在与超氧化物反应以后被转变成ONOO-。超氧化物是由巨噬细胞和吸烟时肺里所发生的氧化还原反应所释放的。用泵抽吸的烟气中不合有ONOO-，但有一定量的NOx与超氧化物或氧反应生成亚硝酸根离子(NO2-)。烟气只有在进入肺里时才生成ONOO-。生物过滤嘴的采用可使吐出的NO和ONOO-量减少70％。
b)ONOO-根据下面的反应式与人体红细胞中的碳酸氢根反应碳酸氢根能氧化鲁米诺以及芳族和杂环分子。另外，ONOO-可以使碳酸氢根过氧化以生成过碳酸氢根，另一种强氧化剂。另一方面，超氧化物歧化酶(SOD)催化ONOO-和多种酚，包括蛋白质里酪氨酸的硝化。
因此，存在几种潜在的机制，碳酸氢根和SOD可通过这些机制影响ONOO-在细胞中的总反应性。由于吸入烟气而引起的在肺中产生ONOO-，表现为红细胞氧化应力的急剧增加，这是通过发生在5秒之内的化学发光响应检测到的。用生物过滤嘴做相同的实验，结果是几乎能100％地抑制人体红细胞的氧化应力(图20)。血红蛋白或红细胞溶解产物接触ONOO-(含于吐出的烟气中)后会使其失去正常情况下可见到的血红蛋白在54Onm和575nm处的两个吸收峰。在12个志愿者中实施与上述一个实验类似的代表性实验，结果如图21所示。当血红蛋白和/或裂解产物接触少量的吐出烟气(10ml)后，可见到吸收峰从540和575偏移到525和555nm，这与亚硝酰血红蛋白的生成相符合。用生物过滤嘴重复以上实验。所观察到的吸收峰维持了其特征波长。
d)通过其特征化学发光峰鉴定由志愿者吐出的烟气中的醛类。用生物过滤嘴重复上述实验，可见其化学发光响应与采用常规过滤嘴的所观察到的最大化学发光响应减少了90％(图22)。很明显，生物过滤嘴能留住并中和烟气中的醛类，同时留住氧化剂，从而显著地抑制了肺里所发生的氧化还原反应，这样的反应会导致内源醛类的产生。
e)通过其特征化学发光峰鉴定由志愿者吐出的烟气中的自由基。自愿者所使用的香烟带有常规过滤嘴和生物过滤嘴。志愿者被告知将烟气吐入酸性溶液(0.01N HCl)(50ml，pH6)中，并在5分钟和60分钟后测得化学发光响应。当pH＝6时，吐出的ONOO-自动分解。与从生物过滤嘴中通过的烟气相比，所吐出的从常规过滤嘴通过的烟气的化学发光响应在5分钟内提高了160％(图23)。当用吐出的烟气饱和的酸性溶液放置1小时之后，化学发光响应的差别从160％提高到250％(图24)。这与烟气中持续地通过醌发生氧化还原反应的理论相符合，这样的反应能产生一系列活性有氧物质，这些物质能造成生物损害。讨论我们的研究证实，肺泡巨噬细胞与其它细胞一样具有内源性NO合成酶，在接触烟气以后能长时间地释放NO/ONOO-。另外，这些细胞一旦开始释放NO，NO的产生就变成自主支持的了，即使在去掉激发源以后也是如此。这样的反应能说明烟气里的NO能激发肺泡巨噬细胞释放NO和ONOO-，并在去掉激发源后能持续几个小时时间。当用烟气激发肺泡巨噬细胞时，肺里所产生的H2O2也能启动这样的反应。H2O2能激发肺细胞NO合成酶的活性，从而在去掉激发源后NO和ONOO-的产生持续1小时以上。我们的实验确实证明了烟气从生物过滤嘴中通过能使大鼠巨噬细胞中的氧化应力下降(与常规滤嘴比较)90％。在肺中生成的ONOO-基有可能攻击α1-蛋白酶抑制剂(α1PI)并使其失活。人肺中α1PI的抑制通常会导致气肿，从而使肺活量减少。统计结果表明，吸烟会使人倾向于发生肺气肿(Southon，P.A.，Pwis，G.，Free Radicals in Medicine.Invovement in humanDisease.Mayo Clin.Proc.63390-408，1988)。在由12个自愿吸烟者所做的体内试验中，当吸入的烟气通过生物过滤嘴时，吐出的NO/ONOO-减少90％。
有氧自由基也参与了由IgA抗原抗体复合体引起的小泡炎发病。用超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、铁螯合剂-去铁胺、或羟基清除剂(DMSO)对动物进行预处理，可抑制对肺部损害的发生。相反，未处理过的正对照动物的肺以出现较多的肺泡巨噬细胞为特征。还会出现间质水肿和出血。另外，在这种类型的肺损伤中，L-精氨酸具有很强的保护作用，已证实其可以减少血管通透性；血管出血；和对血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的损害。上述发现表明，巨噬细胞是由NO，O2-，H2O2和OH化合物引起的损害的根源(Mullingan，M.S.，Johnson，K.J.，Ward，P.A.，见“Biological OxidantsGeneration and Injurious Consequences”(eds.COchrane，C.G.，和Gilbrone，M.A.，Jr.Academic Press 157-172，1992)。
生物过滤嘴对烟气中所含氧化剂的阻留和中和作用，在降低直接关系到肺细胞的氧化应力的氧化还原酶的活性方面有明显作用。生物过滤嘴可大幅度降低由吸入的烟气所引起的氧化应力。烟气中所含的NO、NOx、有氧自由基和/或醛类可诱发肺巨噬细胞和肺血管上皮细胞的氧化应力。另外，生物过滤嘴对醛类和微量元素(尤其是Cd)的阻留，在保存细胞质抗氧化剂和抑制关节硬化的发展方面具有相当长时间的作用。血红蛋白有几个嗜中性中心，它可与亲电子体发生共价反应。上述中心可引诱α-和β-链的N-末端缬氨酸残基，组氨酸残基的N1和N3原子，以及半胱氨酸残基的巯基基团。在香烟燃烧过程中，烟草中的致癌亚硝基化合物4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)被转移到烟气中，其在每支香烟的主流烟气中的含量在4-1700ng范围内波动。NNK可与血红蛋白形成加合物(Hecht，S.S.，Karan，S.，和Carmella，S.G.，见“Humam Carcinogen expose”(eds.Garmer，R.C.，Farmer，P.B.，steel，G.I.，和Wricht，A.S.)IRL Press pp267-274，1991)。很清楚，避免与烟草有关的疾病的唯一途径是戒掉咀嚼和抽吸烟草。然而，对现有吸烟者的统计表明，可采取的重大步骤是减少接触烟草致癌物并改进其作用方式。实现这一目标的主要途径是1)烟草制品的改进，2)通过某些小营养成分和大营养成分以及化学抑制剂抑制烟草致癌物的代谢激活作用及其内源生成作用，3)使用能适用于烟草的特殊过滤嘴，留住烟草致癌物。我们的发明，用生物物质来生产生物过滤嘴，最终涉及这样的发现被吸入的烟气中的亚硝基化合物被生物物质留住，这不仅保护了吸烟者的健康，而且也保护了不吸烟者的健康。
权利要求书按照条约第19条的修改1、一种用于过滤香烟烟气的过滤嘴，其特征在于它包括一种用生物物质加强的纤维基质。该生物物质选自含有与卟啉环配合的铁、铜和/或镁和含有与蛋白质分子立体专一地结合的铁的一种或多种物质。
2、如权利要求1所述的过滤嘴，其特征在于它包括用该生物物质加强的活性炭。
3、如权利要求1或2所述的过滤嘴，其特征在于所述加强过的纤维基质的前后是未用所述生物物质加强的纤维基质。
4、如权利要求1-3中任一项所述的过滤嘴，其特征在于该生物物质包括血红蛋白和/或红细胞裂解产物。
5、如权利要求1-3中任一项所述的过滤嘴，其特征在于该生物物质选自立体专一地结合着Fe2+的转铁蛋白、过氧化氢酶、原卟啉、细胞色素C和叶绿素中的一种或多种。
6、如权利要求1-5中任一项所述的过滤嘴，其特征在于所述生物物质是固体形式的。
7、一种香烟，其特征在于它带有权利要求1-6中任一项所述的过滤嘴。
8、一种制造如权利要求1-6中任一项所述的香烟过滤嘴的方法，包括用一种或多种所述生物物质浸泡常规香烟过滤嘴。
9、如权利要求8所述的方法，其特征在于所述过滤嘴包括活性炭。
10、如权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述生物物质包括血红蛋白和/或红细胞裂解产物。
11、如权利要求8-10中任一项所述的方法，其特征在于所述生物物质是以溶于pH 7.4的磷酸缓冲的盐溶液中的1-10mg/ml的溶液提供的。
12、一种过滤烟草烟气的方法，包括提供一个如权利要求1-6中任一项所述的过滤嘴，并让烟草烟气从其中通过。
13、如权利要求12所述的方法，其特征在于所述过滤嘴能留住在通过过滤嘴之前烟草烟气中所存在的15-90％NO；10-90％CO；40-90％自由基；10-90％醛类；10-90％致癌亚硝基化合物；15-90％H2O2和50-95％的微量元素。
14、如权利要求13所述的方法，其特征在于所述过滤嘴能留住在通过过滤嘴之前烟草烟气中所存在的85-90％NO；80-90％CO；60-90％自由基；60-90％H2O2；60-90％醛类；60-90％致癌亚硝基化合物；和70-95％的微量元素。
权利要求
1.开发了一种阻留并中和香烟烟气中的有害化合物(NO，NOx，自由基，醛类、H2O2、CO、微量元素和致癌的亚硝基化合物)的方法，常规香烟过滤嘴不能充分阻留这些有害化合物。该方法的特征是，用生物物质加强由纤维基质或活性炭制成的普通的常规香烟过滤嘴，所述生物物质中单独地或以组合方式含有与卟啉环配合的铁、铜和/或镁，以及蛋白质分子中立体专一地结合的铁。用上述物质加强常规过滤嘴或活性炭既不会改变烟气的物理特性(气味、口味和外观)，又不会改变过滤嘴自身的物理特性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用磷酸缓冲液(PBS)制备血红蛋白和/或裂解产物溶液，5-10mg/ml(这一用量取决于烟草质量及卷烟质量)，pH7.4。将普通的常规香烟过滤嘴浸入上述生物溶液中。然后在25-35℃将浸泡过的生物过滤嘴风干。该方法能保证至少留住90％的NO，90％的CO，90％的自由基，90％的醛类，90％的致癌亚硝基化合物，80％的H2O2和95％的微量元素。
3.如权利1和2所述的方法，其特征在于采用固体形式的血红蛋白和/或裂解产物。将5-10mg(这一用量取决于烟草质量及卷烟质量)血红蛋白和/或裂解产物夹在两部分普通的常规香烟过滤嘴之间。该方法能确保在吸烟时具有在权利要求2中所描述的效果。
4.如权利要求1和2所述的方法，其特征在于用磷酸盐缓冲液(PBS)制备1mg/ml(仅为指示性的用量)血红蛋白和/或红细胞裂解产物溶液，pH7.4。将100mg(仅为指示性的)活性碳加入该溶液中并将该混合物在室温下温育约30分钟。将200mg(仅为指示性的)用血红蛋白加强的干活性炭夹在两部分普通的常规过滤嘴之间，使得通过该过滤嘴抽吸的所有烟气都能接触上述分子的活性基团(Fe2+，Fe3+，-SH，-NH2)。该方法也能确保在吸烟时具有在权利要求2中所描述的效果。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于用磷酸缓冲液(PBS)制备5-10mg/ml的(该用量取决于烟草质量及卷烟质量)转铁蛋白溶液，pH7.4。将普通的常规过滤嘴浸入上述生物溶液中。然后用25-35℃的热风干燥浸泡过的生物过滤嘴。该方法能确保至少留住85％的NO，90％的CO，60％的自由基，60％的醛类，75％的致癌亚硝基化合物，60％的H2O2和50％的微量元素。
6.如权利要求1和5所述的方法，其特征在于采用固体形式的转铁蛋白。将5-10mg(该用量取决于烟草质量及卷烟质量)转铁蛋白夹在两部分普通的常规香烟过滤嘴之间。该方法能确保在吸烟时具有权利要求5所描述的效果。
7.如权利要求1和5所述的方法，其特征在于用磷酸缓冲的盐溶液(PBS)制备1mg/ml(仅为指示性的)的转铁蛋白溶液，pH7.4。将100mg(仅为指示性的)活性炭加进该溶液中并在室温下温育约30分钟。将200mg(仅为指示性的)用转铁蛋白加强的干炭夹在两部分普通的常规过滤嘴之间，使得所有通过该过滤嘴抽吸的烟气都能接触所述分子的活性基团(Fe2+，Fe3+，-SH，-NH2)。该方法能确保在吸烟时具有权利要求5所描述的效果。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于用磷酸缓冲液(PBS)制备5-10mg/ml(用量取决于烟草质量及卷烟质量)的过氧化氢酶溶液，pH7.4。将普通的常规过滤嘴浸入上述生物溶液中。然后在25-35℃风干浸泡过的生物过滤嘴。该方法能确保留住至少85％的NO，90％的CO，90％的自由基，80％的醛类，80％的致癌亚硝基化合物，90％的H2O2和80％的微量元素。
9.如权利要求1和8所述的方法，其特征在于采用固体形式的过氧化氢酶。将5-10mg(用量取决于烟草质量及卷烟质量)过氧化氢酶夹在两部分普通的常规过滤嘴之间。该方法能确保在吸烟时具有权利要求8所描述的效果。
10.如权利要求1和8所述的方法，其特征在于用磷酸缓冲的盐溶液(PBS)制备1mg/ml(仅为指示性的)的过氧化氢酶溶液，pH7.4。将100mg(仅为指示性的)活性炭加入该溶液中并在室温下温育约30分钟。将200mg(仅为指示性的)用过氧化氢酶加强的干炭夹在两部分普通的常规过滤嘴之间，使得所有通过该过滤嘴抽吸的烟气都能接触所述分子的活性基团(Fe2+，Fe3+，-SH，-NH2)。该方法能确保在吸烟时具有权利要求8所述的效果。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于用磷酸缓冲液(PBS)制备5-10mg/ml(用量取决于烟草质量及卷烟质量)的原卟啉溶液，pH7.4。将普通的常规过滤嘴浸入上述生物溶液中。然后在25-35℃将浸泡过的生物过滤嘴风干。该方法能确保至少留住85％的NO，90％的CO，70％的自由基，70％的醛类，75％的致癌亚硝基化合物，80％的H2O2和80％的微量元素。
12.如权利要求1和11所述的方法，其特征在于采用固体形式的原卟啉。将5-10mg(用量取决于烟草的质量及卷烟质量)的原卟啉夹在两部分普通的常规过滤嘴之间。该方法能确保在吸烟时具有权利要求11所描述的效果。
13.如权利要求1和11所述的方法，其特征在于用磷酸缓冲的盐溶液(PBS)制备1mg/ml(仅为指示性的)的原卟啉溶液，pH7.4。将100mg(仅为指示性的)活性炭加入该溶液中并将混合物在室温下温育约30分钟。将200mg(仅为指示性的)用原卟啉加强的干炭夹在两部分普通的常规过滤嘴之间，使得所有通过该过滤嘴抽吸的烟气都能接触所述分子的活性基团(Fe2+，Fe3+，-SH，-NH2)。该方法能确保在吸烟时具有权利要求11所描述的效果。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于用磷酸缓冲液(PBS)制备5-10mg/ml(用量取决于烟草质量和卷烟质量)的细胞色素溶液，pH7.4。将普通的常规过滤嘴浸入上述生物溶液中。然后将浸泡过的生物过滤嘴在25-35℃风干。该方法能确保至少留住85％的NO，80％的CO，70％的自由基，60％的醛类，60％的致癌亚硝基化合物，80％的H2O2和70％的微量元素。
15.如权利要求1和14所述的方法，其特征在于采用固体形式的细胞色素C。将5-10mg(用量取决于烟草质量和卷烟质量)的细胞色素C夹在两部分普通的常规过滤嘴之间，该方法能确保在吸烟时具有权利要求14所述的效果。
16.如权利要求1和14所述的方法，其特征在于用磷酸缓冲溶液(PBS)制备1mg/ml(仅为指示性的)的细胞色素C溶液，pH 7.4。将100mg(仅为指示性的)活性炭加入该溶液中，然后将混合物在室温下温育约30分钟。将200mg(仅为指示性的)用细胞色素C加强的干炭夹在两部分普通的常规过滤嘴之间，使得所有通过该过滤嘴抽吸的烟气都能接触所述分子的活性基团(Fe2+，Fe3+，-SH，-NH2)。该方法能确保在吸烟时具有权利要求14所描述的效果。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于用磷酸缓冲液(PBS)制备5-10mg/ml(用量取决于烟草质量及卷烟质量)的叶绿素溶液，pH7.4。将普通的常规过滤嘴浸入上述生物溶液中。然后在25-35℃用热风干燥浸泡过的生物过滤嘴。该方法能确保至少留住15％的NO，10％的CO，40％的自由基，10％的醛类，10％致癌亚硝基化合物，15％H2O2和80％的微量元素。
18.如权利要求1和17所述的方法，其特征在于采用固体形式的叶绿素。将5-10mg(该用量取决于烟草质量及卷烟质量)叶绿素夹在两部分普通的常规过滤嘴之间。该方法能确保在吸烟时具有权利要求17所描述的效果。
19.如权利要求1和17所述的方法，其特征在于用磷酸缓冲的盐溶液制备1mg/ml(仅为指示性的)的叶绿素溶液，pH7.4。将100mg(仅为指示性的)活性炭加入该溶液中，并在室温下温育该混合物约30分钟。将200mg(仅为指示性的)用叶绿素加强的干炭夹在两部分普通的常规过滤嘴之间，使得所有通过该过滤嘴抽吸的烟气都能接触所述分子的活性基团(Fe2+，Fe3+，-SH，-NH2)。该方法能确保在吸烟时具有权利要求17所描述的效果。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于制备溶液和/或固体生物物质，其共同特征是a)含有血红素铁的任何分子(血红素、羟高铁血红素等)。b)含有立体专一地结合的铁或铜的任何大分子(铁蛋白、血浆铜蓝蛋白等)。c)含有卟啉环的任何大分子，该卟啉环并不一定含有铁。d)含有与铁以外的金属(Mg，Cu)相配合的卟啉环的任何大分子。
21.本发明要针对的与肺和血液(成分和物质)损害有关的生化-致病生理学机制和技术上的对策。这些机制特别涉及肺的肺泡巨噬细胞和内皮细胞，它在受到香烟烟气刺激后会产生氧化应力，导致长时间大量产生NO/ONOO-和H2O20H2O2进一步刺激NO/ONOO-的产生，形成恶性循环。ONOO-基团能抑制肺组织里的重要的保护机构α1-蛋白酶抑制剂(α1PI)。另外，权利要求1所述的生产方法能够留住并中和烟气中所含的有害化合物，即NO，CO，醛类，自由基，H2O2，微量元素，致癌亚硝基化合物，从而在很大程度上保护主动吸烟者和被动吸烟者免受诸如肺气肿、肺癌、慢性支气管炎之类的疾病和心血管系统慢性疾病的折磨。
22.一种新的香烟过滤嘴，其特征在于或是用权利要求1和20所述的生物物质加强过滤嘴，或是将用权利要求1和20所述的生物物质加强过的活性炭放在新型过滤嘴的两端或一端。这种过滤嘴的两端或一端是由用于制造普通的常规过滤嘴的纤维基质制成的。
全文摘要
本发明涉及一种阻留烟气中的有害化合物(NO，NOx，致癌的亚硝基化合物，自由基，H
文档编号A24D3/14GK1133550SQ94193886
公开日1996年10月16日 申请日期1994年6月27日 优先权日1994年6月27日
发明者约安尼斯·斯塔夫里迪斯, 乔治·德里康斯坦丁诺斯 申请人:约安尼斯·斯塔夫里迪斯, 乔治·德里康斯坦丁诺斯