专利名称：日本柳杉cor基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种日本柳杉COR (CjCOR)基因及其用途。
背景技术：
扩增共有序列遗传标记(AmplifiedConsensus Genetic Markers, ACGM),是建立在亲缘关系比较近的物种之间存在着编码序列的高度保守，而非编码序列具有潜在多态性的基础上的一种标记体系。通过在编码序列的保守区内设计引物，就可以开发出近缘物种 的ACGM标记。这种标记最大的优点是不需要被开发植物任何基因组序列信息，且克隆得到的片段为基因编码区的一部分，有利于快速的进行基因克隆。抗冻蛋白最早发现于极区生长的鱼类的血清中，以后相继在昆虫、植物、微生物中展开了相关研究。有关鱼类抗冻蛋白抗冻机制已经提出多种假说，就目前研究来看，吸附抑制机制比较合理，得到大多数学者赞同。其机制的模型为一般晶体生长垂直于晶体表面，假如杂质分子吸附于冰晶生长通途的表面，那么需要外加推动力促使冰在杂质间生长。抗冻蛋白的吸附使曲率增大，促使边缘的表面积也增加。由于表面张力的影响，增加表面积将使体系的平衡状态发生改变，从而冰点下降。植物中的第一个afp基因是Worrall等于1998年在胡萝卜中发现的，对于植物的抗冻研究具有重要意义。最近几年相继在多种植物中发现了 AFP。但是，绝大多数已经研究过的植物材料中AFP的活性大大低于鱼类AFP的活性。胚胎发育后期富集蛋白是一些在种子(胚胎)发育后期产生的小分子多肽，一般认为，LEA蛋白的生理功能与种子耐脱水性形成有关。通常它们伴随种子成熟过程而形成，在种子萌发时很快消失，受发育阶段、脱落酸和脱水信号调节。LEA蛋白分子量较小，约10 30KDa,富含甘氨酸和其它亲水氨基酸，疏水氨基酸含量很少，具有高亲水性和热稳定性。其高级结构由非周期性无规线团和少量兼性α螺旋构成，无热力学优势态。LEA蛋白最初发现于棉花胚成熟后期，后来发现正生长的植物在逆境的条件下也会诱导类似蛋白质表达。Dure等(1989)将LEA蛋白根据其结构分为三类第一类是成熟蛋白的基因产物(Em);第二类是RAB (responsive to ΑΒΑ)和脱水素(dehydrin)基因的产物；第三类包括其它基因产物。目前研究较多的是脱水素(蛋白)。脱水蛋白区别于其它蛋白质的最主要特征在于其保守性。首先，它有一个富含赖氨酸的片段，即EKKGMDKIKEKLPG，称为K片段(K segment)。由K片段可以形成一个兼性的(amphypathiC)a螺旋。不同的脱水蛋白具有I 11个K片段拷贝。其次，许多脱水蛋白有一个丝氨酸束(track),称为S片段(S segment)。最后,脱水蛋白还有一个保守的Y片段(V/T)DEYGNP，它存在于多数脱水蛋白氨基酸序列C端。通过K片段形成的兼性α螺旋，为脱水蛋白的亲脂性提供了结构基础，所以脱水蛋白的K片段的一个功能也许在于可以与部分变性蛋白质及膜的疏水键相互作用，防止蛋白质和膜进一步变性。大多数脱水蛋白富含甘氨酸及其它带电荷极性氨基酸。用圆二色谱分析G50 (17.80ku)得出其无序化部分占了 75%。这也许可以用来解释脱水蛋白的热稳定性和高溶解性，因其内部缺少折叠区，受热也就难使其凝聚，这样脱水蛋白就可以利用K片段兼亲性特性与其它的蛋白质结合进而保护其它蛋白质。Close等(1990)认为，从代谢和进化的角度来看，脱水蛋白是植物对干旱脱水胁迫的一种适应性保护反应。首先脱水蛋白的产生需要mRNA的转译，这需要能量和氨基酸，而不仅仅是某种蛋白质降解的残余产物；其次，脱水蛋白的合成出现在大多数蛋白质降解的时期，其合成的优先性表明它很可能起一种积极作用；另外各种不同植物脱水蛋白氨基酸序列具有高度的保守性并有着类似的表达调控，因此脱水蛋白很可能在植物干旱脱水适应上起积极作用。已有的研究表明，脱水素是一种低分子量无规则多肽，是植物在胚胎发生晚期或受到干旱、高盐、低温等失水环境胁迫时大量表达的一类蛋白。脱水素是一种低分子量无规则多肽，是植物在胚胎发生晚期或受到干旱、高盐、低温等失水环境胁迫时大量表达的一类蛋白。迄今研究表明转脱水素基因发现牵牛花的保水和抗低温能力增强，转基因烟草的抗低温能力明显高于野生型。杉科植物是古老的孑遗物种，而且经历了第四纪冰期，因此低温相关基因与其它植物相关基因在进化上经历了重大的低温变迁，因此低温相关基因可能对低温胁迫有更重要的意义。因此克隆杉科植物脱水素基因并用于基因工程研究，有助于培育抗低温植株，具有潜在的市场应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种日本柳杉COR基因及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种日本柳杉COR基因，该COR基因为SEQ IDNO: I所示的序列。本发明还同时提供了编码日本柳杉COR基因的蛋白质，该蛋白质为SEQ ID NO: 2所示的序列。本发明还同时提供了日本柳杉COR基因的克隆方法利用模式植物拟南芥的数据库与日本柳杉的EST序列数据库进行大规模序列联配，根据联配结果设计引物，然后进行电子PCR过程设计出杉科的ACGM标记；在设计出的ACGM标记中选择出能够扩增日本柳杉COR基因保守区片段的引物，弓丨物序列为TA41F 5' GGACGCCAAGAGAAGAAAGA 3’TA41R 5' ACACACCACGCATACAATCC 3’进行PCR反应，扩增出250bp左右的片段，扩增产物于1%琼脂糖凝胶上电泳，确定产物单一明亮后,测序(例如送往南京金斯瑞生物科技有限公司测序)；以获得的序列为靶序列，用3’ RACR和5’ RACE试剂盒(Takara)分别对其3’和5’末端未知序列进行扩增，测序，根据测序结果设计全长引物，扩增出基因全长；引物序列如下表I所示表I
权利要求
1.日本柳杉COR基因，其特征是该COR基因为SEQID NO: I所示的序列。
2.编码如权利要求I所述日本柳杉COR基因的蛋白质，其特征是该蛋白质为SEQIDNO:2所示的序列。
3.如权利要求I所述的日本柳杉COR基因的克隆方法利用模式植物拟南芥的数据库与日本柳杉的EST序列数据库进行大规模序列联配，根据联配结果设计引物，然后进行电子PCR过程设计出杉科的ACGM标记； 在设计出的ACGM标记中选择出能够扩增日本柳杉COR基因保守区片段的引物，引物序列为TA41F :5’ GGACGCCAAGAGAAGAAAGA 3’TA41R :5’ ACACACCACGCATACAATCC 3’ 进行PCR反应，扩增出250bp左右的片段，扩增产物于1%琼脂糖凝胶上电泳，确定产物单一明売后，测序； 以获得的序列为靶序列，用3’ RACR和5’ RACE试剂盒分别对其3’和5’末端未知序列进行扩增，测序，根据测序结果设计全长引物，扩增出基因全长；引物序列如下 3GSP1 AGGAAGATTACGGTCATGG 3’ RACE 3GSP2 TGAGAAGAAGGGCCTGATG 3’ RACE 5GSP1 CCATGACCGTAATCTTCCT5’ RACE 5GSP2 CATCAGGCCCTTCTTCTC5’ RACE QCF ATGGCGGAAGAAAATGCACC 全长 QCR TCAGTCTTTCCATGACCGTA 全长。
4.一种阳性重组质粒pCAMBIA-2300-CajC0R，其特征是将日本柳杉COR基因(回收的CjCOR基因片段)插入pCAMBIA-2300质粒中，阳性重组质粒命名为pCAMBIA-2300_CajC0R。
5.如权利要求I所述的日本柳杉COR基因的用途，其特征是增强植物的耐低温能力。
6.如权利要求I所述的日本柳杉COR基因的用途，其特征是通过转基因获得具有耐低温能力的植物。
7.根据权利要求5或6所述的日本柳杉COR基因的用途，其特征是所述植物为水稻、玉米、棉花、大豆、烟草、油菜、大麦、小麦或高粱。
全文摘要
本发明公开了一种日本柳杉COR基因，该COR基因为SEQ ID NO:1所示的序列。本发明还同时公开了编码上述COR基因的蛋白质，该蛋白质为SEQ ID NO:2所示的序列。本发明还同时公开了上述日本柳杉COR基因的克隆方法。本发明还同时公开了一种阳性重组质粒pCAMBIA-2300-CajCOR，将日本柳杉COR基因(回收的CjCOR基因片段)插入pCAMBIA-2300质粒中，阳性重组质粒命名为pCAMBIA-2300-CajCOR。本发明还同时公开了上述日本柳杉COR基因的用途，通过转基因获得具有耐低温能力的植物，从而增强植物的耐低温能力。
文档编号C12N15/63GK102965380SQ20121045491
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者卢泳全, 贾庆, 童再康 申请人:浙江农林大学