专利名称：尿激酶原突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及在血栓溶解治疗中使用的新型尿激酶原，特别是具血栓溶解活性的尿激酶原突变体。
尿激酶原是一种单链丝氨酸蛋白酶原，经纤维蛋白溶解酶(Plasmin)的激活而形成双链尿激酶(UK)。尿激酶原和尿激酶均能使纤维蛋白溶解酶原(Plasminogen)激活为纤维蛋白溶解酶，纤维蛋白溶解酶则可将血栓中的纤维蛋白及其它血浆蛋白降解，因此尿激酶原和尿激酶可用于血栓栓塞的治疗。
与其它丝氨酸蛋白酶原相比，尿激酶原的一个显著特点是其具有很高的内在活性(Intrinsic Activity)，表现为对小分子底物的水解能力以及对纤维蛋白溶解酶原的激活作用。尽管上述活性较尿激酶低250倍左右，但其内在活性仍比其它丝氨酸蛋白酶原(如胰蛋白酶原或糜蛋白酶原)高104.0～4.3倍。尿激酶原对纤维蛋白溶解酶原的激活作用存在较长的延迟，当反应系统中存在纤维蛋白降解的E片段时，则可使上述激活作用显著增强，纤维蛋白及其降解片段D对上述反应没有显著影响。
尿激酶原相对较高的内在活性，使其在临床使用时会产生一些不良的副作用。和尿激酶一样，尿激酶原也能引起非特异性的纤维蛋白溶解酶原活化，从而导致纤维蛋白原的降解以及血小板和血管壁的部分溶解，产生系统性的纤溶状态，引发出血或中风等并发症。在低剂量使用时，尿激酶原比尿激酶更具有选择性，这是因为尿激酶对游离的或与纤维蛋白结合的纤维蛋白溶解酶原的激活作用均很强。而尿激酶原的内在活性仅为尿激酶的0.2％～0.5％，在低浓度时它对结合了纤维蛋白的纤维蛋白溶解酶原优先激活而对游离的纤维蛋白溶解酶原的激活作用则很弱。但是，为了确保血栓溶解的疗效而使用高剂量时，尿激酶原就丧失了其低剂量时的特异性。
本发明的目的就是为了解决上述问题，提出一种具有优良血栓溶解作用的尿激酶原突变体。
我们对尿激酶原溶解血栓的作用机理研究结果表明，尿激酶原或尿激酶对血栓表面的纤维蛋白溶解酶原的活化以及纤维蛋白溶解酶对血栓附近尿激酶原的激活，是血栓溶解过程的两个关键步骤。因此，与野生型尿激酶原相比，一个具有良好疗效的尿激酶原变体应具备①较低的内在活性，以保证临床使用的安全性；②对与血栓结合的纤维蛋白溶解酶原具有较高的激活作用，而对游离的纤维蛋白溶解酶原的活化能力很弱，这可通过改变尿激酶原的底物专一性而实现；③该变体被纤维蛋白溶解酶激活的速度应与野生型尿激酶原相当，且其对应的双链尿激酶激活纤维蛋白溶解酶原的能力应与野生型尿激酶相似本发明是基于下列发现天然尿激酶原分子中Lys300与Asp355之间的静电相互作用(盐键)是维持其高内在活性的必要条件，因此，任何削弱上述静电相互作用的氨基酸突变均可能使尿激酶原变体的内在活性下降。当Pro309被突变为其它氨基酸后，可以改变Lys300的空间位置，从而影响Lys300和Asp355之间的静电作用，并使突变体的内在活性降低。此外，该位点的突变不仅可以影响突变体双链尿激酶的活性，而且可以改变(单链)突变体的底物专一性，使其对游离纤维蛋白溶解酶原的激活作用下降，而对与纤维蛋白或其降解片段结合的纤维蛋白溶解酶原的激活能力上升。
与天然尿激酶原相比，该位点的一些尿激酶原突变体是优良的血栓溶解药剂，因为它们对纤维蛋白溶解酶原的激活作用受纤维蛋白促进的程度超过天然尿激酶原，因而，这些尿激酶原突变体对与纤维蛋白结合的纤维蛋白溶解酶原的激活作用表现出比天然尿激酶原更强的特异性，此外由于其低内在活性，因此在给患者施用这些尿激酶原变体时，可比天然尿激酶原使用更高、更有效验的剂量。
因此本发明的特征在于一种有溶解血栓活性的尿激酶原突变体，它具有天然尿激酶原的氨基酸序列，但对其第309位的脯氨酸进行突变，该突变可使其内在活性比天然尿激酶原低2.5倍以上，并使其对纤维蛋白溶解酶原的激活作用可被纤维蛋白及其降解片段所促进。
当给患者施用时，该突变使其可以诱导出比天然尿激酶原更低的纤维蛋白原溶解作用和非特异性纤维蛋白溶解酶原激活作用，并使其表现出较高的纤维蛋白特异性。
本文中使用的术语“天然”是指一种天然存在或野生型形式的蛋白质，或者指天然存在的蛋白质中的一种天然存在或野生型形式的氨基酸。一种“新”氨基酸是指天然蛋白质内通常不定位于给定位点上的氨基酸，具体地说，在尿激酶原第309位除脯氨酸之外的其它氨基酸。
本发明的特征还在于一种DNA分子，例如，一种重组DNA分子，该分子编码本文中描述的任何突变型尿激酶原。本发明还包括一种用上述的DNA分子转化的细胞，例如一种哺乳动物、细菌或酵母细胞。本发明的特征还在于一种制备本文中描述的突变型尿激酶原的方法，该方法包括用编码一种突变型尿激酶原的DNA分子转化一种细胞，培养该细胞，以及表达该突变体，并分离该突变体(蛋白)。
实施例尿激酶原突变体的制备适用于制备本文中描述的尿激酶原突变体的一种方法是寡聚核苷酸定点突变，这种方法可使天然尿激酶原的核苷酸序列在特定位点发生改变，并可导致其编码的氨基酸序列在相应位点改变为其它氨基酸。编码天然尿激酶原的基因序列已被完全鉴定，并可从例如Dr.David Dichek(NIH)和Dr.Paolo Sarmientos(Primm，Milano，Italy)处得到。在ATCC的保藏号为DNA 57329或细菌/噬菌体57328。用UKHU名称可在NIH计算机数据库Protein Identity Resource中检索其核酸和氨基酸序列。天然尿激酶原的氨基酸序列见
图1。
目前用于进行核苷酸定点突变的技术已非常成熟，本文以Stratagene的突变试剂盒(试剂目录号#200518)为例，说明尿激酶原基因在对应于Pro309密码子处的定点突变，见图2。
用包含尿激酶原(cDNA)基因并具有甲基化修饰的质粒为模板，以含有突变序列的寡核苷酸为引物，在经变性和退火处理后，使寡核苷酸引物与质粒模板配对，并以具有高复制保真度的pfu DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸以合成含有尿激酶原突变基因并与质粒模板互补配对的DNA。该反应可在PCR仪器上完成，在经过大约15次左右的变性—退火—延伸反应后，所得产物已足够用于转导感受态细菌。
取上述合成产物2μl，加入DpnI酶，该酶可以选择性地降解含甲基化的DNA链，而使用作模板的含野生型尿激酶原基因的质粒DNA被降解，并失去转导感受态细菌的能力，而用Pfu DNA聚合酶在体外合成的含有尿激酶原定点突变的DNA则因不存在甲基化而不能被降解，并可互补配对为含有缺口(nick)的双链DNA。该双链DNA可有效地转导至大肠杆菌感受态细胞中。挑选阳性克隆并对其质粒DNA中的尿激酶原基因序列进行鉴定，从而获得含有定点突变的尿激酶原基因。
我们将Pro309随机突变为其它19种氨基酸，以比较各突变体的内在活性及其对纤维蛋白溶解酶原激活的特导性。我们设计以下寡核苷酸引物用于尿激酶原Pro309密码子的随机突变引物1.ACAG TCA TTT TCA GCT GCT CNN NAT AGA GAT AGTCGG TAG AAT TC引物2.GAA TTC TAC CGA CTA TCT CTA TNN NGA GCA GCTGAA AAT GAC TGT其中N代表A，T，C，G尿激酶原突变体DNA的表达根据用于蛋白表达的宿主细胞类型，将含有突变的尿激酶原基因克隆到合适的表达载体中，然后将含有尿激酶原基因的表达载体转导(例如化学转导或电穿孔转导等)至宿主细胞(例如细菌、酵母或哺乳动物细胞)中，以便表达尿激酶原突变体。若采用分泌型表达载体，尿激酶原突变体蛋白可以从培养基中回收，若不采用分泌型表达载体，尿激酶原蛋白则可从宿主细胞中回收。如果宿主细胞为真核细胞，则可直接对其进行分离纯化。如果宿主细胞为原核细胞，则必须先对其表达产物(以包涵体形式存在)进行活化处理。尿激酶原突变体蛋白在经分离纯化后(纯化方法包括离子交换、亲和层析及凝胶过滤等)可对其生化特性进行鉴定。
尿激酶原的突变分析以大肠杆菌生产的重组尿激酶原为参照，研究比较尿激酶原突变体的生化性质。检测指标主要包括尿激酶原突变体的内在活性、天然尿激酶或突变体尿激酶对(Glu-型)血纤维蛋白溶解酶原的激活作用，纤维蛋白溶解酶对尿激酶原突变体的激活作用，纤维蛋白及其降解产物E片段和D片段对尿激酶原或其突变体激活(Glu-型)纤维蛋白溶解酶原的促进作用，以及在血浆环境中对血纤维蛋白凝块的溶解速度和血浆中纤维蛋白原的残留量。
内在活性检测根据突变体尿激酶原及其(对应的)尿激酶对化学合成的生色底物S2444的水解作用，来比较各尿激酶原突变体的内在活性。在25℃以及活性测定缓冲液(0.05 M Tris-HCl，0.1 M NaCl，0.1％BSA及0.01％吐温80，pH7.4)中，将2.5μM的尿激酶原或尿激酶原突变体与一定浓度范围(0.03，0.06，0.12，0.18，0.24，0.3，0.6，1.2，1.8和2.4mM)的S2444加入一个微量滴定板(96孔板)中，在酶标测定仪上以490nm作参照波长，根据测出的在410nm(410/490nm)波长处光密度(ΔOD)值随时间(t)的增加(ΔOD/t)而计算出反应动力学常数。结果表明，尿激酶原突变体Pro309→Ala，Pro309→Gly，Pro309→Leu，Pro309→Ser，Pro309→Thr，Pro309→Val的内在活性(对S2444)分别为重组尿激酶原的10.5±2.0％，10.8±2.4％，8.5±1.8％，9.6±2.2％，11.2±2.5％，18.4±3.6％。
尿激酶及尿激酶突变体对S2444的活性检测在活性测定缓冲液中，将1μM的尿激酶原或尿激酶原突变体与20nM的纤维蛋白溶解酶混合置37℃反应1小时，并根据还原型SDS-凝胶电泳证实尿激酶原或尿激酶原突变体完全转化为对应的尿激酶，取10nM的尿激酶或突变体尿激酶按上述方法测定其对S2444的活性，结果表明尿激酶突变体，Pro309→Ala，Pro309→Gly，Pro309→Leu，Pro309→Ser，Pro309→Thr，Pro309→Val对S2444的活性分别为重组尿激酶的75±2.8％，38±2.4％，24±1.5％，89±3.6％，92±4.8％，68±2.7％。
尿激酶突变体对Glu-型血纤维蛋白溶解酶原的激活作用在25℃以及活性测定缓冲液中，将0.2nM的尿激酶或尿激酶突变体与一定浓度范围(1.0，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，7.5和10μM)的Glu-型纤维蛋白溶解酶原及1.5mM的S2251加入一个微量滴定板中，用酶标测定仪以490nm作参照波长，根据测出的在410nm(410/490nm)波长处光密度(ΔOD)值随时间平方(t2)的增加(ΔOD/t2)而计算出反应动力学常数。结果表明，尿激酶突变体Pro309→Ala，Pro309→Gly，Pro309→Leu，Pro309→Ser，Pro309→Thr，Pro309→Val对纤维蛋白溶解酶原的活性为重组尿激酶的72±4.2％，36±2.5％，18±1.5％，96±6.8％，75±5.4％，23±1.6％。
纤维蛋白溶解酶(Plasmin)对尿激酶原突变体的激活作用在25℃以及活性测定缓冲液中，将0.1nM的纤维蛋白溶解酶与一定浓度范围(0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，2.5，3.5和5.0μM)的尿激酶原或尿激酶原突变体及1.2mM的S2444加入一个微量滴定板中，用酶标测定仪以490nm作参照波长，根据测出的410nm波长处光密度(ΔOD)值随时间平方(t2)的增加(ΔOD/t2)而计算出反应动力学常数，结果表明纤维蛋白溶解酶对野生型尿激酶原和尿激酶原突变体的激活能力相近，纤维蛋白溶解酶激活尿激酶原突变体Pro309→Ala，Pro309→Gly，Pro309→Leu，Pro309→Ser，Pro309→Thr，Pro309→Val的速度分别是其激活重组尿激酶原速度的106±5％，87±6％，84±8％，104±3％，109±8％，85±7％。
纤维蛋白及其降解产物E片段和D片段对尿激酶原突变体激活纤维蛋白溶解酶原的促进作用在25℃以及活性测定缓冲液中，将0.5nM的尿激酶原或尿激酶原突变体与2.0μM的Glu-型纤维蛋白溶解酶原及1.5nM的S2251混合置于微量滴定板中，用酶标测定仪测定不加入或加入可溶性纤维蛋白(0.2μM)、纤维蛋白降解D片段(0.4μM)及纤维蛋白降解E片段(5μM)时，反应混合物在410nm波长处光密度(ΔOD)随时间(t)的变化值(ΔOD/t)，并以此值(ΔOD/t)评估尿激酶原突变体对纤维蛋白溶解酶原激活作用受纤维蛋白及其降解片段的影响。结果表明纤维蛋白降解产物E片段对重组尿激酶原及尿激酶原突变体激活纤维蛋白溶解酶原具有相似的促进作用。纤维蛋白及其降解产物D片段对重组尿激酶原激活纤维蛋白溶解酶原没有影响，纤维蛋白(0.2μM)对尿激酶原突变体Pro309→Ala，Pro309→Gly，Pro309→Leu，Pro309→Ser，Pro309→Thr，Pro309→Val激活纤维蛋白溶解酶原的促进作用分别为3.8倍，8.4倍，9.2倍，4.4倍，4.7倍，5.4倍。纤维蛋白降解产物D片段(0.4μM)的促进作用分别为5.4倍，10.6倍，12.4倍，5.9倍，6.5倍，6.8倍。
血浆纤维蛋白原溶解活性检测将尿激酶原(0～10μg/ml)或尿激酶原突变体(0～100μg/ml)与1ml血浆混和并置37℃保温6、16或24小时后，加入0.2ml的抑肽酶(aprotinin，10,000 KIU/ml)，采用凝血酶—凝块方法测出在给定时间之后留下的血浆纤维蛋白。其中重组尿激酶原在6小时内使9μM的纤维蛋白原降解50％所需的用量为1.0μg/ml，而导致同样程度的纤维蛋白原降解时，尿激酶原突变体Pro309→Ala，Pro309→Gly，Pro309→Leu，Pro309→Ser，Pro309→Thr，Pro309→Val的用量分别为6μg/ml，9.8μg/ml，12μg/ml，8.4μg/ml，6.9μg/ml，15.5μg/ml。
血纤维蛋白凝块溶解分析按照Gurewich等人J.Clin Invest；731731(1980)的描述，从0.3ml血浆中制备125I标记的凝块。在3ml血浆中加入一定浓度的重组尿激酶原或尿激酶原突变体(1、1.25、1.5、2.0、3.0、5.0、7.5、10.0、20.0μg/ml)进行纤维蛋白凝块溶解试验。根据特定时间释放出的放射性活性对纤维蛋白溶解反应进行定量(以特定时间内已释放出的放射性活性占纤维凝块溶解前125I的总放射性活性的百分数表示)。当血浆中的纤维蛋白凝块消失后，立即取出0.5ml血浆加入0.1ml 10,000 KIU/ml的抑肽酶以及5IU/ml的凝血酶以测定血浆中残留的纤维蛋白原百分含量(以未加尿激酶原的血浆为对照，设定其纤维蛋白原百分含量为100％)，结果表明在4小时内使血浆凝块完全溶解所需的重组尿激酶原或突变体尿激酶原的用量分别为2μg/ml，其血浆中纤维蛋白原的残留量为72％。Pro309→Ala尿激酶原突变体1.5μg/ml，其血浆中纤维蛋白原的残留量为80％；Pro309→Gly突变体10μg/ml，其血浆中纤维蛋白原的残留量为89％；Pro309→Leu突变体20μg/ml，其血浆中纤维蛋白原残留量为95％；Pro309→Ser突变体1.25μg/ml，其血浆中的纤维蛋白原残留量为76％；Pro309→Thr突变体1.5μg/ml，其血浆中纤维蛋白原残留量为78％；Pro309→Val突变体7.5μg/ml，其血浆中纤维蛋白原的残留量为92％。
权利要求
1.一种具有血栓溶解活性的尿激酶原(pro-UK)突变体，它基本上是由天然尿激酶原的氨基酸序列组成，其中所述序列含有突变。该突变使尿激酶原变体的内在活性(即单链活性)比天然尿激酶原低2.5～20倍。当给患者使用时，该变体可产生比天然尿激酶原更低的血纤维蛋白原溶解活性以及非特异性血纤维蛋白溶解酶原激活作用。
2.根据权利要求1所述的尿激酶原突变体，其特征在于对纤维蛋白溶解酶原的激活作用不仅可被纤维蛋白降解的E片段，而且可被纤维蛋白及其降解的D片段所促进。当给患者使用时，该突变体可以比天然尿激酶原更快地激活纤维蛋白溶解酶原，从而加快血栓的溶解作用。
3.根据权利要求书2所述的尿激酶原突变体，其中天然尿激酶原的氨基酸序列中第309位的脯氨酸(Pro309)，被其他氨基酸所代替。
4.根据权利要求书3所述的尿激酶原突变体，其特征在于第309位的脯氨酸，或者是用丝氨酸代替，或者是用苏氨酸代替，或者是用丙氨酸代替，或者是用缬氨酸代替，或者是用甘氨酸代替。
5.一种编码权利要求书2所述的尿激酶原突变体的DNA分子。
6.用权利要求书5所述的重组DNA分子转化的细胞。
全文摘要
本发明涉及具血栓溶解活性的尿激酶原突变体,它由天然尿激酶原的氨基酸序列组成,但对其309位的脯氨酸进行定点突变,该突变使尿激酶原变体的内在活性(即单链活性)比天然尿激酶原低2.5～20倍,表现为血纤维蛋白原溶解活性以及非特异性血纤维蛋白溶解酶原激活作用的下降。与天然尿激酶原相比,该突变体对纤维蛋白溶解酶原的激活作用不仅可被纤维蛋白降解的E片段,而且可被纤维蛋白降解的D片段所促进。
文档编号A61K38/43GK1277262SQ00109829
公开日2000年12月20日 申请日期2000年7月10日 优先权日2000年7月10日
发明者孙自勇, 刘建宁 申请人:刘建宁