专利名称：来氟米特一种新适应症的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫抑制调节剂，更具体地说免疫抑制及调节剂来氟米特在治疗银屑病药物中应用。
银屑病(又称牛皮癣)是一种常见的慢性皮肤病，其发病病因尚未阐明，银屑病属于红斑鳞屑性皮肤病范围，是一种容易复发的皮肤病，它的表皮生长细胞的细胞周期是100小时比正常细胞生长周期快2倍，可采用抗肿瘤药物来抑制细胞核的有丝分裂，从而获得治疗效果。内服药主要为维生素D、E、C、及普鲁卡因封闭等治疗，病情严重者可酌情使用甲氨喋呤、氨基喋呤等。
外用疗法按病情轻重而定，进行期应用温和的药物，例3％-5％硼酸软膏，水杨酸软膏，稳定期或消退期可用浓度较高的外用药，例如0.05％-0.1％维生素A酸软膏；0.5-1％蒽林软膏等，中医疗法主要采用活血化瘀、散风软坚为治则，对银屑病进行了研究、发现免疫功能异常与银屑病发病有关，证实白介素-1活化的T淋巴细胞及其分泌的细胞因子在银屑病的损害中起重要作用，活动期病损皮肤的病理检查发现基底细胞超出正常10倍的速度过度角化，大量的淋巴细胞浸润，在银屑病的角化上皮和血管内皮各内皮粘附因子(ICAM-1)表达明显增加，ECAM-1和VCAM-1主要表达在真皮血管内皮上，虽然科学家对银屑病的病因、治疗等方面进行了大量研究，但目前对此病仍未能找到一种治疗效果好，副作用小的药物或其他治疗方法。
本发明目的是以银屑病发病与免疫系统有关，故从免疫抑制、调节剂中寻找出一种治疗银屑病效果好、副作用小的药物。
来氟米特为一种新型免疫抑制及免疫调节剂，它的化学结构如下 分子式C12H9F3N2O2化学命名为ααα三氟-5-甲基异噁-N-酰基-对甲苯胺，它为白色薄膜衣片。
来氟米特口服吸收后于肠壁和肝脏内迅速转化为活性代谢物，它在体内发挥所有主要的药理作用，来氟米特在血浆中的浓度非常低，在最初来氟米特药代动力学研究中，主要检测活性代谢物的血浆浓度。它达峰时间在0.558±0.506天，半衰期8.79±0.77天。多剂量给药(20mg，pd)连续30天，其活性代谢物血药浓度接近稳态。据文献报导，在临床应用中使用三天(100mg/天)负荷剂量可以快速达到稳态浓度。来氟米特口服的生物利用度80％，高脂饮食对活性代谢物血浆浓度不会产生大的影响。活性代谢物于肝、肾和皮肤组织内分布浓度较高，脑组织中含量低。游离浓度较低，并且广泛和血浆蛋白结合(99.3％)，结合蛋白量在治疗浓度时呈线性关系。来氟米特吸收后被代谢为主要活性代谢物及许多微量代谢物，这些微量代谢物中只有三氟甲基苯胺(TFMA)能被检测，在血浆中很少测到母体化合物。目前不知道来氟米特代谢的确切脏器，但在体内和体外试验中，发现肝脏和胃肠壁具有代谢作用。来氟米特初始代谢所需的酶也不清楚，但肝细胞质和细胞的微粒体已经被确定为是药物代谢的部位。活性代谢物，从肾肝排泄以及直接从肝汁排泄。43％从尿中排泄，48％从粪便中排泄，样品分析显示最初在尿中的代谢物是葡萄糖苷酸和活性代谢物的苯胺羰酸衍生物，粪便的主要代谢物是活性代谢物。在两个代谢途径中，最初96小时主要是肾脏排泄，以后粪便排泄占主导地位。文献报导，静脉给药研究中，清除率大约31ml/h。活性炭或消胆胺可促进药物代谢，使体内代谢物的半衰期从大于1周减少到大约1天，肠肝循环是导致活性代谢物半衰期较长的主要因素。血液透析和腹膜透析研究表明活性代谢物是不可透析的。
来氟米特的药理作用来氟米特通过活性代谢物在体内发挥其免疫调节作用，作用机制包括以下几方面抑制酪酸激酶的活性和细胞粘附来氟米特可抑制酪酸激酶的活性，而酪酸激酶是细胞生成和分裂中的信息传导的关键酶。此外，来氟米特可明显抑制激活的白细胞粘附到血管内皮上，减缓炎细胞进入关节，其作用机制尚不完全清楚，可能与影响粘附分子和细胞因子的信息传导有关。因此，来氟米特可以逆转已经发生的排斥反应而环孢酶素却无此作用，这点已在动物试验中证实。
抑制嘧啶的从头合成途径来氟米特通过抑制二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)的活性，阻断嘧啶的从头合成途径。来氟米特对不同种类的细胞的抑制作用取决于该细胞利用补救途径合成嘧啶的能力，依赖从头合成途径的细胞(增生活跃的细胞，如活化的淋巴细胞，骨髓结构、肝细胞、上皮细胞等)是来氟米特作用的主要靶细胞。二氢乳清酸脱氢酶的活性被活性代谢物抑制，防止嘧啶的过度产生，使肿瘤抑制蛋白细胞翻译转录中的一种因子(P53)增加，活化的P53可调节P21WAF-1的转录，抑制细胞周期依赖蛋白酶(cdk(cyclin-dependent-kinase))的活性，防止成视网膜细胞瘤蛋白(Rb(retinoblastoma protein))的高磷酸化合失活。Rb是转录因子E2F的负性调节剂，而E2F是S期特异性基因表达所必需的因子，从而影响DNA和RNA的合成，使活化的细胞休眠在细胞周期的DNA合成前期G1S静止期交界处或S期。活性代谢物对细胞的抑制作用是可逆的，不会引起细胞凋亡。抑制作用解除后，休眠的细胞可以恢复正常，这种抑制作用可被外源性的嘧啶所逆转。
抑制抗体(免疫球蛋白)的产生，来氟米特抑制嘧啶的合成，可以阻断活化的B细胞增殖，从而减少抗体的生成；此外，来氟米特还可直接抑制抗体的分泌。 来氟米特可抑制非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫、淋巴因子分泌、抑制淋巴细胞再生、局部结缔组织增生、局部炎症及关节炎全身反应。来氟米特的活性代谢物对大鼠胸膜炎渗出液细胞分泌白三烯B4的产生有明显抑制作用，对非特异性(刀豆蛋白A(Con-A)诱导的小鼠脾细胞)T辅助细胞(Th细胞)有明显抑制作用，小鼠热板法及辐射甩尾法试验显示有明显抗炎镇痛作用。利用患先天性系统性红斑狼疮(SLE)MRL/lpr小鼠模型，来氟米特可抑制SLE的进展，防止肾小球肾炎的发生，降低抗双旋DNA抗体及类风湿因子(RF)的水平。来氟米特能预防治疗SLE及并发的肾小球肾炎，停药后观察，SLE及肾小球肾炎均无复发。在器官移植试验中来氟米特有效抑制大鼠、狗、猴等动物多种器官的急、慢性排异反应，并克服了异种移植排异反应，成功地延长了仓鼠至大鼠移植心脏存活时间。
来氟米特的毒理作用来氟米特小鼠单次灌胃或腹腔注射给药，观察14天测得LD50分别为258.9mg/kg及166.9mg/kg。SD大鼠6个月口服来氟米特(1.8、3.5、6.6mg/kg)长期毒性试验显示高剂量组有厌食、体重减轻现象，雌性大鼠丙氨酸转氨酶(ALT)及天门冬氨酸转氨酶(AST)有增高现象，高剂量组中7只(23％)于给药期死于感染。低、中剂量组无动物死亡。应用移植模型，口服高剂量来氟米特20mg/kg及30mg/kg治疗大鼠112天，显示其靶器官为再生活跃的器官如骨髓、脾脏、小肠粘膜，以及免疫器官如胸腺及脾脏，与国外资料吻合。Lewis大鼠出现肝功能损害及骨髓抑制。Beagle狗6个月口服来氟米特(2、10、16、20mg/kg)长期毒性试验显示，仅高剂量组使红系细胞总数略下降及血球压积降低。来氟米特的微生物回复突变试验，哺乳动物培养细胞染色体畸变试验，及啮齿动物微核试验结果均无致突变作用。来氟米特于中、高剂量10、20mg/kg有致畸作用。
来氟米特是一个新型免疫抑制剂，对器官移植及自身免疫性疾病有较好的治疗作用，来氟米特对T-淋巴细胞和白介素-1的作用进行了多种试验，具体方法如下1、来氟米特对T-淋巴细胞和白介素-1的作用实验采用雌性，体重19-21克，ICR小鼠50只，随机分为5组，即对照组、环磷酰胺组(120mg/kg)、来氟米特三个剂量组(2、9、45mg/kg)，每组10只。各组小鼠灌胃给药5天，每鼠0.5ml每天一次，对照组给同容量的1％羧甲基纤维素钠溶液。于给药第三天，每鼠再腹腔注射0.25％淀粉液0.5ml，第五天给药后4小时，每鼠腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.5ml(无菌操作自鸡翼静脉采用，加5倍量阿氏液，4℃冰箱保存，使用前用无菌生理盐水离心洗涤三次，配成5％鸡红细胞生理盐水悬液)，间隔30分钟，颈惟脱臼处死，经腹腔注射Hank氏液2.5ml，经轻揉按小鼠腹部，使Hank氏液充分涮洗腹腔巨噬细胞。
然后，吸取腹腔洗液，滴于二张载玻片上，放入垫有湿纱布的盒内，于37℃孵育30分钟，孵毕，于生理盐水中漂洗，除去未贴片的细胞。凉干，甲醇固定，吉姆萨斯染剂(Giemsa Wright)染液染色，蒸馏水漂洗、凉干，用油镜计数100个巨噬细胞，计算百分率和吞噬指数。
实验结果表明，来氟米特能明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，与对照组比较，中、高剂量组有显著性差异。
2、来氟米特对小鼠的细胞免疫功能的影响采用雌、雄各半、体重23±1g质量标准同上的ICR小鼠40只，随机分为4组，来氟米特二个剂量组，口服环磷酰胺和溶媒作对照组。
将ICR小鼠随机分为4组，雌雄各半，来氟米特二个剂量组(9、45mg/kg/d×5d)，口服给药环磷酸胺(120mg/kg/d×5d)和溶媒对照组，各组每鼠每天腹腔注射0.2ml药液，连续5天，处死小鼠，按常规3HTdR掺入法定量测定T淋巴细胞转化程度。
T淋巴细胞与植物凝素(PHA)一起体外培养时，可转化成淋巴母细胞，并出现旺盛的分裂现象。细胞内蛋白质和核酸合成增加，以反映DNA合成速率的3H-胸腺嘧啶核苷(3HTdR)掺入值为指标，可定量表示淋巴细胞转化程度，从而反映T淋巴细胞的免疫功能。从实验结果可见，来氟米特高低剂量组(9、45mg/kg/d×5d)的小鼠(3HTdR)掺入值明显低于对照组(P＜0.05)，表明来氟米特对小鼠淋巴细胞转化功能有明显的抑制作用，即抑制小鼠T细胞的免疫功能。
巨噬细胞产生白细胞介素1(IL-1)试验健康纯系雌性小鼠80只，体重18-20g，米氟米特按不同剂量分成各组，脂多糖(LPS)和环磷酰胺作为对照组，将药物用1640培养液(补上)在无菌条件下配制成不同浓度同等容量的溶液备用。
IL-1诱导产生在无菌操作室内取纯系小鼠70只，随机分成以上七个试验组，每组10只，脱臼处死，用75％乙醇浸泡片刻，仰卧固定，剪开腹部表皮，注射5ml Hank氏液，挪动腹部，回收腹腔液，离心(500rpm×3min)弃去上清液，沉淀物加1640培养液至3ml，混均离心(2000rpm×10min)，计数Mφ，用10％小牛血清(FCS)细胞保存液(RPMI)1640培养液稀释至2×106/ml细胞数。加入24孔培养板中(1ml孔)，置37℃5％CO2培养2小时，弃去非粘附细胞，获Mφ单层，在Mφ单层中，加入不同浓度的受试物，每孔终容积为1ml，置37℃5％CO2培养48小时，收集上清液(4000rpm×8min)过滤，20℃保存。
胸腺细胞制备在无菌操作室内另取纯系小鼠10只，眼球放血致死，75％乙醇浸泡片刻，仰卧固定，取出胸腺，剥尽周围组织，用撕碎法撕碎胸腺至10ml刻度离心管中，离心(500rpm×5分)弃去上清液，沉淀物(胸腺细胞)加少量1640培养液，混均，匀浆液加1640培养液至70ml，加210μl刀豆素A(conA)溶液，充分混匀，分别另取不同浓度的药液至96孔培养板中，每孔100μl，然后加入con-A胸腺细胞悬液100μl，(conA终浓度3μg/ml)胸腺细胞终浓度1.87×108/ml)，置37℃5％CO2培养箱培养48小时。培养结束前6小时，每孔加入3H-TdR20μl(0.2uci/孔)。收集细胞于49型纤维滤纸上，用LKB自动液体闪烁计数器测定放射活性强度(cpm)。结果以三分复管的cpm均值±DS表示，根据IL-1活性记录样品在不同浓度时刺激小鼠胸腺细胞增殖而掺入3H-TdR的量(cpm±DS)，进行统计学处理，评价来氟米特抑制Mφ产生IL-1的作用。
使用来氟米特5、10、15和20μg/ml时，对抑制Mφ产生IL-1均有较强的作用，其cpm均值分别为678.65±293.14、415.41±297.90、39.72±13.71和66.9±52.0，与Lps10μg/ml组比较均有显著性差异(P＜0.01)和(P＜0.001)。但使用来氟米特1μg/ml时，其cpm均值为1263.55±564.32、与Lps组比较无显著必差异(P＞0.05)。使用环磷酰胺10μg/ml时，其cpm均值为1199.3±193.3，与Lps组比较无显著性差异(P＞0.05)结果表明，来氟米特5、10、15、20μg/ml剂量组对Mφ产生IL-1有明显的抑制作用，作用强度呈剂量效应相关关系。从而可以证明来氟米特不仅能抑制T淋巴细胞的免疫功能，还能明显地抑制巨噬细胞的功能，对巨噬细胞产生IL-1有很强的抑制作用，作用强度与剂量呈一定的效应关系。
实施例1对小鼠腹腔巨噬鸡红细胞功能的影响实验材料ICR小鼠，雌性，体重19～21克，由浙江省实验动物中心提供，合格证号为浙实验动物质量准字[94]008号，饲养设施条件合格证为浙实验动物设施准字[94]201号。
鸡红细胞悬液制备无菌操作自鸡翼静脉采血，加5倍量阿氏液，4℃冰箱保存。使用前用无菌生理盐水离心洗涤三次，配成5％鸡红细胞生理盐水悬液。
0.25％淀粉生理盐水，煮沸消毒15分钟，备用。
对照品环磷酰胺受试药物来氟米特批号CK-95-SH1纯度＞99％上述实验材料由美国欣凯公司上海代表处提供实验方法取体重19～21克ICR小鼠50只，随机分为5组，即对照组、环磷酰胺组(120mg/kg)、来氟米特三个剂量(2、9、45mg/kg)，每组10只。各组小鼠灌胃给药5天，每鼠0.5ml每天一次，对照组给同容量的1％羧甲基纤维素钠溶液。于给药第三天，每鼠再腹腔注射0.25％淀粉液0.5ml，第五天给药后4小时，每鼠腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.5ml，间隔30分钟，颈惟脱臼处死，经腹腔注射Hank氏液2.5ml，轻轻揉按小鼠腹部，使Hank氏液充分涮洗腹腔巨噬细胞。
然后，吸取腹腔洗液，滴于二张载玻片上，放入垫有湿纱布的盒内，于37℃孵育30分钟。孵毕，于生理盐水中漂洗，除去未贴片的细胞，凉干，甲醇固定，Giemsa Wright染液染色，蒸馏水漂洗、凉干，用油镜计数100个巨噬细胞，计算百分率和吞噬指数。
实验结果见表1。结果表明，来氟米特能明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，与对照组比较，中、高剂量组有著性差异。
实施例2来氟米特对小鼠的细胞免疫功能的影响来氟米特对小鼠淋巴细胞转化试验(H-TdR掺入法)的影响实验材料ICR小鼠40只，雌雄各半，体重23±1g，质量标准同前。
RPM1640培养液(含20％小牛血清，青链霉素各100μ/ml，10mmol Hepes5×10-5M二硫基乙酸，2mmol谷氨酰胺)。
3HTdRlmci/ml中国科学院上海原子能研究所产品，批号960118。
PHA，广州医药工业研究所产品，规格10mg/支。
2％台酚蓝染液。
培养板实验方法将ICR小鼠随机分为4组，雌雄各半，来氟米特二个剂量(9、45mg/kg/d×5d)，口服给药环磷酰胺(120mg/kg/d×5d)和溶媒对照组，各组每鼠每天腹腔注射0.2ml药液，连续5天，处死小鼠，按常规3HTdR掺入法定量测定T淋巴细胞转化程度。
实验结果T淋巴细胞与植物血凝素(PHA)一起体外培养时，可转化成淋巴母细胞，并出现旺盛的分裂现象。细胞内蛋白质和核酸合成增加，以反映DNA合成速率的3H-胸腺嘧啶核苷(3HTdR)掺入值为指标，可定量表示淋巴细胞转化程度，从而反映T淋巴细胞的免疫功能。从表3结果可见，来氟米特高低剂量组(9、45mg/kg/d×5d)的小鼠(3HTdR)掺入值明显低于对照组(P＜0.05)，表明来氟米特对小鼠淋巴细胞转化功能有明显的抑制作用，即抑制小鼠T细胞的免疫功能。
实施例3巨噬细胞产生白细胞介素1(IL-1)试验健康纯系小鼠，80克，体重18～20g，雌性，由浙江省实验动物中心提供，合格证号为浙实验动物质量准字(94)008号，饲养设施条件合格证为浙实验动物设施准字(94)201。
供试品来氟米特(LEF，A771726)；白色粉末，无臭无味，溶于水，常温保存批号OT 25/2，由美国欣凯公司上海代表处提供。
Lps真空干燥，白色粉末，规格10mg/支，购自上海第二军医大学微生物教研组。
环磷酰胺(CY)白色粉末，购自浙江省肿瘤医院。
第一组来氟米特20mg/ml第二组来氟米特15μg/ml第三组来氟米特10μg/ml第四组来氟米特5μg/ml第五组来氟米特1μg/ml第六组Lps10μg/ml第七组cy10μg/ml
以上药物均用1640培养液，在无菌条件下配制成不同浓度同等容量的溶液，供实验用。
实验方法IL-1诱导产生在无菌操作室内取纯系小鼠70只，随机分成以上七个试验组，每组10只，脱臼处死，用75％乙醇浸泡片刻，仰卧固定，剪开腹部表皮，注射5mlHank氏液，挪动腹部，回收腹腔液，离心(500rpm×3min)弃去上清液，沉淀物加1640培养液至3ml，混均离心(2000rpm×10min)，计数Mφ单层，用10％FCS RPMI1640培养液稀释至2×106/ml细胞数。加入24孔培养板中(1ml/孔)，置37℃5％CO2培养2小时，弃去非粘附细胞，获Mφ单层，在Mφ单层中，加入不同浓度的受试物，每孔终容积为1ml，置37℃5％CO2培养48小时，收集上清液(4000rpm×8min)过滤，20℃保存。
在无菌操作室内另取纯系小鼠10只，眼球放血致死，75％乙醇浸泡片刻，仰卧固定，取出胸腺，剥尽周围组织，用撕碎法撕碎胸腺至10ml刻度离心管中，离心(500rpm×5′)弃去上清洗，沉淀物(胸腺组织)加少量1640培养液，混均，匀浆液加1640培养液至70ml，加210μlconA溶液，充分混匀，分别另取不同浓度的药液至96孔培养液中，每孔100μl，然后加入con-A胸腺细胞悬液100μl，(conA浓度3μg/ml)胸腺细胞终浓度1.87×108/ml)，置37℃5％CO2培养箱培养48小时。培养结束前6小时，每孔加入3H-TdR20μl(0.2uci/孔)。收集细胞49型纤维滤纸上，用LKB自动液体闪灼计数器测定放射活性强度(cpm)。结果以三分复管的cpm均值±DS表示，根据IL-1活性记录样品在不同浓度时刺激小鼠胸腺细胞增殖而掺入3H-TdR的量(cpm±SD)，进行统计学处理，评价来氟米特抑制Mφ产生IL-1的作用。
实验结果使用来氟米特5、10、15和20μl/ml时，对抑制Mφ产生IL-1均有较强的作用，其cpm均值分别为678.65±293.14、415.41±297.90、39.72±13.71和66.9±52.0与Lps10μg/ml组比较均有显著性差异(P＜0.01)和(P＜0.001)。但使用来氟米特1μg/ml时，其cpm均值为1263.55±564.32、与Lps组比较无显著性差异(P＞0.05)。使用环磷酰胺10μg/ml时，其cpm均值为1199.3±193.3，与Lps组比较无显著性差异(P＞0.05)。
结果表明来氟米特5、10、15、20μg/ml剂量组对Mφ产生IL-1有明显的抑制作用，作用强度呈剂量效应相关关系，而来氟米特1μg/ml剂量对MφIL-1没有抑制作用。
权利要求
1.来氟米特一种适应症，其特征在于在治疗银屑病药物中应用。
全文摘要
本发明提供来氟米特新适应症,来氟米特是一种新型免疫抑制、调节剂、利用它的免疫抑制、调节作用对由免疫系统故障问题引起的银屑疾病有治疗作用,来氟米特在制备治疗银屑病药物中应用。
文档编号A61K31/42GK1286085SQ0012510
公开日2001年3月7日 申请日期2000年9月8日 优先权日2000年9月8日
发明者肖飞 申请人:欣凯医药化工中间体(上海)有限公司