专利名称：：虫草素提取工艺及制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及药用真菌领域，特别是涉及从虫草中提取虫草素的工业化工艺，本方面还涉及利用虫草素制备的医药制剂。据报导，虫草属菌中的冬虫夏草、蛹虫草、人工培养蛹虫草菌丝等多种虫草中的化学成分基本一致。除含有甾醇类、糖醇类、有机酸及氨基酸等化合物外还含有虫草素(Cordycepin)即3＇-脱氧腺苷(3＇-Doxyadenosine)3＇-氨基3＇-脱氧腺苷及其他核苷类等生理活性成分。Cunnigham等早期用Dowex-1-ce树脂从蛹虫草〔Cordycepsmilitaris(L)link〕中提取得虫草素。经研究证明虫草素有抗病毒、抗肿瘤、抑制癌细胞分裂等作用。腺苷具有舒张血管、降低血压、减慢心率、抑制血小板凝集等多种生理活性。目前国内外一些学者采用高效液相色谱法、薄层层析法等测定多种虫草菌中虫草素及腺苷的含量，并也有从冬虫夏草发酵菌丝及人工培养蛹虫草米饭培养基固体残渣中提出虫草素的报导。但目前为止以工业化为目标提取虫草素结晶体的工艺流程技术，并将其制成虫草素系列制剂的深层次分离开发新药制品，尚未有报道。本发明目的之一提供从虫草菌中提取虫草素(3＇-氨基-3＇-脱氧腺苷)结晶体的工业化生产工艺流程。本发明的目的之二是将虫草素制成针剂、乳剂、脂质体等制剂，使中药产品达国际先进水平，开辟药学方面新用途。本发明是如下所述完成1、虫草素提取工艺将虫草置于60℃-80℃的干燥箱中进行干燥，然后粉碎，过40-60目筛备用，取粉碎后的原料加5倍30％乙醇(温度70℃)浸泡24-48小时，将浸泡后的混悬液上回流装置，加热回流2小时，回收乙醇，加水沉淀，调pH3．5，24小时后过滤，将回收后的药液加水溶解进行冷藏沉淀，温度4℃，时间24小时。将冷置后的药液用微孔滤膜进行过滤(0．85μm)滤液用0．1mol／L调4．0备用，上离子换柱，收集洗脱液，将洗脱液进行减压浓缩至粘稠状，将粘稠的液体于4℃，冷置24小时使之结晶析出，过滤，上述滤液加适量正丁醇，置4℃，冷置24小时使之结晶析出，过滤，滤液如此反复处理2-3次，将过滤所得结晶至冷冻干燥机中进行干燥，即得。高效液相法检查虫草素含量(1)标准曲线制备分别吸取0．46mg／ml的标准溶液0．25、0．5、0．75、1．00、1．25、1．5ml配成2．5ml的系列标准液，分别进样20ml进行高效液相法含量测定。条件固定相250×4．6mmODS柱。流动相水∶甲醇∶四氢呋喃(70∶20∶10)的碳酸铵缓冲液pH=6，柱前压40kg／cm2，流速1ml／min温度16℃。以积分值对测试液浓度作回归处理，在0．92-5．5mg范围内呈良好的线性关系，回归方程y=3．1×10-6x-0．0456γ=0．9966(2)样品制备取蛹虫草1g于是塞管内，先乙醚脱脂(10ml×3次)凉干后取10ml乙醇浸72小时，取浸液5ml，通过装2g的硅胶小柱，用甲醇洗至50ml做样品测试液，进样20ml，结果与标准品基本一致，加样回收率97．3±4．8％，n=4。2．虫草素制剂生产工艺流程(1)虫草素冻干粉针将虫草素溶解于注射用水，加入配料甘露醇，EDTA-2Na，用针用活性炭0．2％，吸附30分钟，用滤纸过滤掉活性炭，用0．12μm滤膜，过滤，用0．15μm滤膜，除菌过滤，分装为每瓶0．1克虫草素，上塞，轧盖，包装。(2)虫草素注射液将虫草素溶解于注射用水，然后加入EDTA-2Na，搅拌溶解，加水至1000ml，加针用活性炭0．2％，搅拌吸附30分钟，用滤纸过滤掉活性炭，用0．22μm滤膜，精滤、分装于2ml安瓶中(每只相当于虫草素0．1g)溶封于100℃流通蒸汽灭菌30分钟，灯检包装。(3)虫草素糖衣片取虫草素淀粉加10％淀粉糊制成软材，用16#筛进行制粒，14#筛整粒，加入适量滑石粉搅均，用直径=8mm浅弧冲打片、包衣、干燥、分装、包装即得。(4)虫草素滴丸称取处方量的聚乙二醇6000，聚乙二醇10000于80℃进行熔融，然后加入虫草素继续加热，搅拌均匀，然后上滴丸机，采用下列方法进行滴制，每丸重25mg，取丸、甩干，吸去多余冷却液、干燥、分装即得。本工艺技术特征1、凡虫草属菌，不论是天然虫草或人工培养虫草、菌米饭培养基培养的固体菌米的虫草等含有虫草素成份的虫草属真菌各部位，均能用于提取。2、工艺简便易行，可以达到工业化生产虫草素。一般中药提取设备即可满足本工艺需要，无需特殊加工。便于本技术的推广。3、工艺成熟，效果可靠。该工艺经过多次试验，虫草素收率达到90％以上。4、所用试剂、辅料易于采购且价格底廉，工艺成本低。5、产品制剂填补国内空白，具有抗肿瘤、抗白血病等作用，可用于胃癌、鼻咽癌等的治疗。成本相对比较低，解决了广大癌症患者的经济负担。优点和积极效果1、方法简单易行，普通中药提取条件即可，可达工业化大量提取。2、降低成本，有综合利用价值。3、回收率高，虫草素腺苷回收率达90％以上。4、虫草素冷干粉针等制剂优于猪苓多糖，干扰素-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子白介素-Ⅱ的作用，同时对白血病细胞表面标志物表达有诱导作用。实施例1虫草素的提取1．干燥粉碎取原料虫草置于60℃-80℃的干燥箱中进行干燥，然后用粉碎机进行粉碎，过40-60目筛备用。2．浸泡取粉碎后的原料加5倍呈的30％乙醇(温度70℃)浸泡24-48小时，备用。3．回流提取将浸泡后的混悬液按回流装置，加热回流2小时(温度不易太高，回流液成滴即可)。4．回收乙醇回醇提取后的混悬液按乙醇回收装置回收乙醇至无醇味为止。5．加水沉淀将回收后的药液加水溶解进行冷藏沉淀，温度4℃，时间24小时。6．过滤将冷置后的药液用微孔滤膜进行过滤(0．85μm)滤液用0．1mol／L调4．0备用。7．上离子换柱(1)上柱树脂型号732号、724号、717号树脂树脂处理方法将树脂加2倍量的蒸馏水或去离子水浸泡之后，15分钟倒掉水，再加2倍量的水浸泡，如此反复5次，再用去离子水浸泡30分钟7次，之后用2mol／L盐酸浸泡8小时以上，再用去离子水冲洗至pH为8，再用2mol／L盐酸处理，用蒸馏水洗至中性(或用蒸馏水或去离子水浸泡15分钟，水洗3次，再用乙醇浸泡过液，倒掉乙醇，用蒸馏水将树脂装入玻璃柱内，再用蒸馏水滴洗至树脂为无乙醇味为止，用2mol／L盐酸冲洗约5-8倍量，用2mol／L盐酸冲洗药2倍量<与树脂量比>、用蒸馏水洗至中性)。用2mol／L氯化铵(是树脂量的4倍)去中洗，将中性柱转换成NH+4型柱，NH+4柱流液的pH≈5。将pH=4的滤液通过上述制备好的NH+4型离子交换柱，柱流量为1．2ml／分。(2)洗脱液用蒸馏水或去离子水洗脱柱内树脂，并将回收洗脱液，洗至洗脱液不呈现棕色为好，再用0．152氨水洗脱，每接收一定量时做一次纸层析检查，直至洗脱液干净为止。(3)收集洗脱液洗脱下来的液体进行集中收集。8．浓缩将洗脱液进行减压浓缩至粘稠状。9．冷藏、结晶将粘稠的液体于4℃，冷置24小时使之结晶析出，过滤。10．正丁醇结晶上述滤液加适量正丁醇，置4℃，冷置24小时使之结晶析出，过滤，滤液如此反复处理2-3次。11．虫草结晶将过滤所得结晶至冷冻干燥机中进行干燥，即得(虫草素含量≥98％)。实施例2虫草素制剂的制备(1)虫草素冻干粉针剂产品处方虫草素100gEDTA-2Na0．05g甘露醇500g制成1000支操作过程取处方量的虫草素加适量热注射用水溶解，再加入EDTA-2Na，然后再加入甘露醇加0．2％的针用活性碳吸符30分钟，脱炭，在无菌条件下进行粗滤、精滤、除菌过滤、分装，每瓶装虫草素0．1g，然后置冻干机中进行冷冻干燥、上塞、轧盖、包装。(2)虫草素注射液产品处方虫草素100gEDTA-2Na0．05g注射用水加至1000ml制成1000支操作过程取处方中的虫草素，加适量注射用水溶解，然后加入EDTA-2Na，搅拌溶解，加水至1000ml，加针用活性炭0．2％，搅拌吸附30分钟，脱炭、精滤、分装于2ml安瓶中(每只相当于虫草素0．1g)溶封于100℃流通蒸汽灭菌30分钟，灯检包装。(3)虫草素糖衣片产品处方虫草素100g淀粉150g滑石粉适量制成1000片操作过程取虫草素淀粉加10％淀粉糊制成软材，用16#筛进行制粒，14#筛整粒，加入适量滑石粉搅均，用直径=8mm浅弧冲打片、包衣、干燥、分装、包装即得。(4)虫草素滴丸产品处方虫草素100g聚乙二醇600050g聚乙二醇10000100g制成10000粒操作方法称取处方量的聚乙二醇6000，聚乙二醇10000于80℃进行熔蛹，然后加入虫草素继续加热，搅拌均匀，然后上滴丸机采用下列方法进行滴制，每丸重25mg，取丸、甩干，吸去多余冷却液、干燥、分装即得。实施例3虫草素的提取材料蛹虫草菌，蚕蛹虫草工艺流程如上实施例1所述。实验结果见表1、表2表1以蛹虫草菌米为原料提取虫草素结果<tablesid="table1"num="001"><table>批次菌米投入量(公斤)提取虫草素(克)150525053505</table></tables>表2蚕蛹虫草为原料提取结果<tablesid="table2"num="002"><table>批次蚕蛹虫草投入量(公斤)提取虫草素(克)150102501035010</table></tables>实施例4虫草素制剂的制备工艺同实施例2，结果见下表<tablesid="table3"num="003"><table>序号制剂名称虫草投入量成品名含量测定(相当标示量)1虫草素冻干粉剂100克814支98．52虫草素水针剂100克826支97．23虫草素糖衣片100克1800片99．84虫草素滴丸100克9200粒100．2</table></tables>注上述结果为三次投料的平均值。实施例5虫草素冻干粉针药效试验将提取出的虫草素制成冻干粉针，送吉林市中医中药研究院做药效试验，初步试验结果，具有抑制服癌细胞分裂，对离体、整体肝细胞有促进ATP生成和抗氧化的作用。权利要求1．从虫草中提取虫草素的方法，包括干燥粉碎，浸泡，回流提取，回收乙醇，加水沉淀，过滤，上离子换柱，收集洗脱液，浓缩，冷藏、结晶，过滤，正丁醇结晶，虫草结晶。2．根据权利要求1所述的方法，其中干燥粉碎是取原料虫草置于60℃-80℃的干燥箱中进行干燥，然后用粉碎机进行粉碎，过40-60目筛备用。3．根据权利要求1所述的方法，其中浸泡是指取粉碎后的原料加5倍30％乙醇(温度70℃)浸泡24-48小时。4．根据权利要求1所述的方法，其中回流提取是指将浸泡后的混悬液按回流装置，加热回流2小时。5．根据权利要求1所述的方法，其中回收乙醇是指回流提取后的混悬液按乙醇回收装置回收乙醇至无醇味为止。6．根据权利要求1所述的方法，其中将回收后的药液加水溶解进行冷藏沉淀，温度4℃，时间24小时。7．根据权利要求1所述的方法，将冷置后的药液用微孔滤膜进行过滤(0．85μm)滤液用0．1mol／L调pH4．0。8．根据权利要求1所述的方法，其中上离子换柱为将滤液上NH+4型离子交换柱，柱流量为1．2ml／分，用蒸馏水或去离子水洗脱柱内树脂，并将回收洗脱液，洗至洗脱液不呈现棕色为好，再用0．152氨水洗脱，每接收一定量时做一次纸层析检查，直至洗脱液干净为止。9．根据权利要求1所述的方法，其中将洗脱液进行减压浓缩至粘稠状。10．根据权利要求1所述的方法，其中将粘稠的液体于4℃，冷置24小时使之结晶析出，过滤。11．根据权利要求1所述的方法，其中正丁醇结晶为将滤液加正丁醇，置4℃，冷置24小时使之结晶析出，过滤，滤液如此反复处理2-3次。12．根据权利要求1所述的方法，其中将过滤所得结晶至冷冻干燥机中进行干燥，得虫草素结晶。13．虫草素制剂，含有权利要求1所述的方法获得的虫草素。14．根据和权利要求13所述的方法，该制剂为冻干粉针剂，其配方如下虫草素，100g，EDTA-2Na，0．05g，甘露醇，500g，制成1000支。15．根据权利要求13所述的方法，该制剂为虫草素注射液，产品处方虫草素，100g，EDTA-2Na，0．05g，注射用水加至1000ml，制成1000支。16．根据权利要求13所述的方法，该制剂是虫草素糖衣片，产品配方为虫草素100g，淀粉150g，滑石粉适量，制成1000片。17．根据权利要求13所述的方法，该制剂为虫草素滴丸，其配方为虫草素100g，聚乙二醇600050g，聚乙二醇10000100g，制成10000粒。全文摘要本发明公开了从虫草中提取虫草素的方法,包括干燥粉碎,浸泡,回流提取,回收乙醇,加水沉淀,过滤,上离子换柱,收集洗脱液,浓缩,冷藏、结晶,过滤,正丁醇结晶,虫草结晶。该发明还公开了含有虫草素的药用制剂,如冻干粉剂,针剂,糖衣片和滴丸。文档编号A61P31/12GK1294133SQ0013037公开日2001年5月9日申请日期2000年11月6日优先权日2000年11月6日发明者徐哲,苑桂华,王波申请人:吉林东北虎药业股份有限公司