专利名称：从发酵大豆里提取genistein为抗癌和抗二恶英致癌的物质的制作方法
1，发明背景环境荷尔蒙二恶英是现代社会文明的产物。人类在改造自然社会的同时污染了环境。大量农药等有害化学物质的使用，汽车尾气的排放，工业生产造成了无法控制的环境污染。严重影响各种生态系统，也造成自然环境的日益恶化。近年除了不断有牛肉，鸡肉，0-157等污染食品的报告；在食品中有二恶英的检出。人们日常面临环境荷尔蒙两大污染食品污染和大气污染。食品污染是由于农药，杀虫剂大面积喷洒及食品添加剂等的使用。在现在的食品中、约有90％左右使用过农药，杀虫剂及食品添加剂。二恶英是毒性极强的物质，虽然这种污染极微量，但在人体中不能自然降解，游离状态的二恶英代谢时间约7-15年，在人体内蓄积一定时间后，有致癌的可能，特别是以乳癌和前列腺癌为多。二恶英不但致癌，还对免疫功能及内分泌系统产生毒害，造成了对人类生存的威胁。亚洲地区，特别是乳癌和前列腺癌，在20年前的发病比较低，近10年有增加，这与环境污染有直接关系。但至今尚未有发现较好的预防方法。
本发明是利用发酵大豆提取的genistein成分，防止环境荷尔蒙与生物体受体的结合，无副作用，故能预防环境荷尔蒙引起的癌症，也能防止二恶英所产生的毒性作用。预防环境荷尔蒙引起的癌症，并对二恶英所产生的毒害有抵抗作用。
2，目前技术1)异黄酮与genistein的提取技术Genistein来源于大豆的异黄酮。Genistein，在中国无统一命名，中文称染料木素；染料木因；染料木黄酮；金雀异黄酮 (引自中国科学出版社，日英汉生物化学词典，1987版)。异黄酮在大豆中仅有0.3％的含量。用一般方法提取异黄酮，回收量极低。异黄酮中至少有十二种的化学成分，提取异黄酮后再提取genistein，由于回收量仅有0.1％，不能在大量生产上应用。少数用合成方法制取genistein。因为异黄酮是糖原成分，普通方法制取一般回收量较低。又因异黄酮中含有多种成分，虽也含有微量的genistein，但不能在体内保持一定的血浓度。人体利用异黄酮时要求其糖元成分要在体内转化，转化程度取决于人的个体差异，因在体内的血浓度不稳定、吸收量小、食后通常有胀气、少数还有过敏的反应。不适合于慢性肾病，痛风的病人食用。本发明应用生物技术，对大豆发酵技术进行改进，改变了普通大豆分离后不易吸收，和人体有差异不一致、不能保持一定血浓度等缺点、同时大大提高了genistein的回收量、解决了原始的提取方法回收少、造价高的问题。
2)异黄酮与genistein作用的基楚研究及最近进展大豆的异黄酮有抗动脉硬化(Kirk E.A.et.al，J.Nutr.，128，954(1998)；抗更年期(Murkies A.L.et.al.Maturitas，21，189，(1995)；及抗骨质疏松症Blair H.C.et.al.，J.Celluar Biochem.，61，629(1996)等作用。近年有论文报告异黄酮有预防乳癌和预防前列腺癌的作用(Herman C.et.al.J.Nutr.，125，757S(1995)。
在异黄酮中至少有12种物质组成。其中有Genistein；daidzein(大豆甙)；和genistin(异黄甙)等三种物质具有抗癌作用有报告。Genistein抗癌，抗氧化作用，均高于daidzein和genistin(Lee HP Lance，337，1197，1991；M Nomrua，Cancer Research，53，5815-5821，1993；S barnes，Biochem.Biophys.Res.Commun.179，661-667，1997.)。但抗二恶英类物质致癌的作用尚未有报告。作为抗二恶英致癌的药品或机能性食品的作用也尚未见报告。本发明研究了长寿之国日本经常食用发酵大豆食品(大酱)，乳癌发病率也少，对大酱成分，大豆发酵方法及提取技术及有效单一成分进行了各方面的确认。
1、本发明是用发酵大豆的生物新技术提取有效成分染料木因genistein方法。
提取genistein单体的方法。大豆经过水浸，蒸煮，冷却后，加入麹菌和适量的炭酸钙和炭酸镁，在一定湿度和温度，经过数月发酵，异黄酮可有90％以上、再抽出和精制的genistein。根据纯度分别可作为药品和食品。Genistein是多糖，在体内不需要糖转化的过程，容易吸收。Genistein食后无胀气，有直接的生物活性，在体内保持一定的血浓度，在人体内48-72小时可排出体外，无副作用和无过敏的特点。提取genistein时提取粗异黄酮、再用高压液相分离方法提取精制的genistein。
图1 genistein的化学结构2、Genistein在生物体细胞内的药理作用Genistein在生物体细胞内可与环境荷尔蒙发生竞争，可把环境荷尔蒙作用细胞的受体部位占据(主要是体内的游离的环境荷尔蒙在受体部位产生竞争)使环境荷尔蒙不易进入体内细胞，可抑制环境荷尔蒙与人体的受体部位结合，而不会引起体内细胞核的变异，可预防环境荷尔蒙-二恶英所致的毒性作用。
3、Genistein的中药植物并用的效果Genistein与中药、叶绿素及植物纤维并用，有促进肠内废物排出作用，可使游离的环境荷尔蒙——二恶英排出体外，使体内的二恶英的毒害减少。
4、Genistein与中药生素E等并用能防止大气污染，放射线等有害物质对精子细胞的氧化作用；提高精子细胞质量。
5、免疫机能的调整作用。Genistein与人参等合用，可使抗毒作用增加。使NK细胞的作用增加。抑制二恶英诱发癌细胞增殖。增加体内免疫机能，并有抗毒性和预防免疫系统疾病等功能。
6、Genistein来源于发酵大豆，兼有日本的纳豆和大酱健康食品的效果并优于其效果。Genistein是粉状物质，可以作为医药和食品形式应用。在医药品应用的场合，可作为药品口服剂，可以是散剂，颗粒，锭剂，糖衣锭和口服液等剂型。在药品应用的场合，一般一日约50-200μg/kg体重范围内，通常1日1-3次服用。具体正确用量，应视使用者的年龄，体重，症状，投与方法考虑。应注意genistein适用于中高年人群，不适用于儿童。Genistein可作为食品和食品添加剂，调味料及机能性健康食品。在食品应用的场合，可制成果物，饮料等。实用例本发明是利用发酵大豆提取染料木因genistein方法和提取过程说明。大豆经过水浸，蒸煮，冷却后，加入麹菌和适量炭酸钙和炭酸镁1)图2是大豆发酵及genistein的提取方法大豆→水浸→蒸煮→冷却→加麹菌→发酵→调整→异黄酮抽出→30％genistein抽出可作为健康食品或药品→再抽出→精制→干燥→提取60％以上genistein可作为药品。
2)急性毒性试验，予小白鼠每日genistein用2000mg/kg/日(相当使用范围的10000万倍)经两周口服， 急性毒性试验，无1例死亡。动物试验结果(1)予6周龄Sprague-Dawley雌性大白鼠投与混有胡麻油7，12-dimethylbenz[a]anthtacene(DMBA)1mg/日/1回，同时给含有0.1％genistein的饲料。对照组仅投与胡麻油含DMBA 1mg/日/1回和普通饲料。5周以后对照组诱发的乳癌可触及、60周以后解剖。实验结果如下(表1)实验群 实验数 Dioxin发癌数发癌匹数 发癌率 肿疡个数/匹对照组普通饲料 20匹DMBA1mg/日/P.O18/20 90％ 3.5试验组0.1％genistin 20匹DMBA1mg/日/P.O9/20 45％ 1.4解剖发现对照组的比试验组的大白鼠子宫增大，乳腺发达。本发明实验用二恶英致癌的物制可诱发大白鼠发生乳癌。在加用genistein后可减少45％的乳癌发病。Genistein有抑制二恶英毒性作用和抗二恶英的致癌作用。
(2)予6周龄Sprague-Dawley雄性大白鼠皮下注射二恶英(DMAB)，注射量50mg/kg/5回/周共8周投与。予含有0.1％genistein的饵料和对照组普通饵料进行观察。结果如表2所示表2实验组 实验数 二恶英类5回/周 发癌个数 发癌率对照组普通饲料n＝15 DMBA/50mg/kg(皮下) 9/1560.0％试验组1 0.1％daidzin组 n＝15 DMBA/50mg/kg(皮下) 6/1540.0％试验组2 0.1％genistein组 n＝15 DMBA/50mg/kg(皮下) 5/1533.3％本发明实验用二恶英致癌物制可诱发大白鼠发生前列腺癌。40周以后比较，在加用genistein后可减少26.7％的前列腺癌的发病率。加用0.1％daidzin组在加用genistein后可减少的20％前列腺癌的发病。以上实验证明genistein能抗二恶英引起的大白鼠乳癌和前列腺癌的发生。
5)人体癌细胞试验结果用发酵大豆提取的genistein及与非发酵大豆单体对人的癌细胞成长阻害试验结果。Genistein的用量，用1ml培养液中阻害移植癌细胞的增殖率人的癌细胞抑制试验用IC50(ug/ml)、如表3所示。Cell line 发酵 大豆μg/ml非发酵 大豆μg/mlgenistein daidzeingenistein daidzeinHSC-45M2(胃癌)7.1- 18.0-HCC-44B2(肺癌)11.5 - 33.0-MDA-468 (乳癌)6.5 34.0＞100 ＞100MCF-7 (乳癌)12.0 28.0＞100 ＞100Genistein抑制人的乳癌细胞MCF-7，和人的乳癌MDA-468细胞的成长，对大肠癌细胞和胃癌细胞也有抑制作用。非发酵genistin抑制癌细胞增殖但用量要增加到3-20倍。
6)Genistin防放射线幅射的试验结果Genistein与椎茸，红参，五味子、维生素E等并用实验以调整体质、先后服用进行放射线照射实验。予BALB/c 6周龄雄性小白鼠进行放射线照射、分别用复合制剂剂量为10.5-21.0(g/kg)/日，共2周进行测定、结果是对精子400个计数/匹及精子的质量进行检定实验。如(表4所示)全体项目 服用剂量(g/kg) 动物数/匹 照射剂量(Gy)精子总畸形率(％)未服用照射组 - 20 36.8±1.7服用前照射 10.5 20 34.8±0.9服用后照射 21.0 20 34.5±1.2环境荷尔蒙易对生殖系统细胞产生氧化作用，故现在人类精子数比50年前减少了一半。利用genistein与椎茸，红参，五味子、维生素C，E等混合制剂有对放射线的幅射的精子有增加的作用。Genistein有抗大气污染，废气，烟草环境荷尔蒙，和放射线，紫外线有害射线等有害作用，防止精子细胞氧化；推论是结合体内游离的环境荷尔蒙，增加体质、促使体内的有害物质排出体外的作用。
7)Genistein与椎茸，红参，五味子，维生素C，E等混合使用使免疫力增强。予6周龄雄性BALB/c小白鼠服用复合制剂服用剂21.0(g/kg)/日，共4周照射损伤后测定外周血相的影响，尾静脉采血，EDTA处理。自动血球极数装置(东亚医用电子(株)制Sysmer F-800)血相测定(结果如表5所示)实验项目 服用剂量(g/kg) 白细胞数 红细胞数 血小板数 血红蛋白数未服用照射 -140(102/ul) 560(104/ul) 24(104/ul) 12.1(g/dl)服用后照射21.0 480(102/ul) 710(104/ul) 35(104/ul) 13.4(g/dl)8)予(TCDD)二恶英投与8周龄小白鼠的动物实验。BALB/c小白鼠A群1回700ng/kggenistein投与，B群90ng/kg用量genistein，C群700ng/kg的genistein加入参数种中药如；椎茸，芦荟，红参，五味子、绿茶等提取物饲养4月后解剖。AB群小白鼠胸腺萎缩，淋巴球减少，抗体产生及免疫机能抑制。C群4月后显示细胞凋亡，淋巴球正常。Genistein与中药等并用有增加二恶英排出的作用、NK细胞增加、能使免疫细胞机能增强。
9)Genistein适用乳癌(MCF-7病理型)患者，前列腺癌患者，及以下工作者特别是血中二恶英浓度增高人群和正常人(1)适用于农药用的杀虫剂， 除草剂，防腐剂，杀菌剂，漂白剂接触频繁产业工作人员。
(2)适用于工业化学与食品或医药品(有机物，含磷合成洗剂，睡眠药避妊药)产业工作人员。
(3)适用于环境污染，废物物质处理产业工作人员。
(4)Genistein适用于中，老年人更年期等健康人群，但其安全用量、长期服用无毒副作用要经过临床研究。
(5)Genistein对未发育的青少年不适于使用。注*二恶英Dioxin是环境荷尔蒙最引人注目的物质。二恶英不单指一种化学物质，包括7种同系的物质(CH3数字不同甾化合物群构成的有机化学物质，75种的化学物质品种。
权利要求
1 本发明是利用发酵大豆进行提取的粗制或精制的genistein(染料木素)，可作健康食品与抗癌的药品。
2 要求1的分离物质在体内有直接的生物活性，能在体内保持一定的时间和稳定的浓度，食后无胀气，不受个体差异影响，无过敏反应，极少有副作用。
3 要求1的物质genistein具有植物性激素样的作用，作用原理是将环境荷尔蒙作用的细胞的受体部位占据，与体内的游离的环境荷尔蒙产生竞争，故能防止环境荷尔蒙与人体受体的异常结合，也不会进入细胞核造成突变而引起发癌。
4 要求1的genistein与叶绿素及植物纤维等并用，可抑制环境荷尔蒙二恶英与体内的受体细胞结合，並可促使二恶英排出体外，使体内的二恶英的毒害减少。
5 Genistein与维生素E等结合能防止环境荷尔蒙二恶英，放射线等有害毒性作用，能防止精子细胞的氧化作用。
6 Genistein与人参合用，可使抗毒作用增强，使体内杀伤细胞(NK细胞)作用增强，并有抗毒性和预防免疫系统疾病等功能。
7 Genistein可作为食品或医药品，也可作为机能性的健康食品或食品添加剂，调味料等。
全文摘要
用发酵大豆提取的genistein在生物体中有直接的生物活性,食后无胀气,能保持一定的体内浓度,不受个体差异的影响等优点。Genistein有植物激素样的作用,与体内的游离的环境荷尔蒙产生竞争,将细胞的受体部位占据。加用genistein的动物可减少二恶英引起的发癌;与人参、叶绿素、植物纤维、中药等并用、可增强二恶英的排出和机体的免疫系统功能。
文档编号A61K31/352GK1352896SQ0013307
公开日2002年6月12日 申请日期2000年11月8日 优先权日2000年11月8日
发明者程锦雁 申请人:程锦雁, 陈清轩, 牛屹东