专利名称：用广谱脉冲光灭活病原体的方法
背景技术：
在科学研究和在药物/治疗剂制造中生物衍生组合物的使用无所不在。常规用人血作为蛋白质制剂的来源，用于治疗各种疾病和异常；例如，级分血浆，提供凝血因子VIII、凝血因子IX、抗凝血酶、转铁蛋白、白蛋白、免疫球蛋白和血小板，以及其它治疗剂。在许多药物学/治疗剂和相关组合物，如基因工程改造的细胞系的重组DNA和/或重组蛋白质、病毒载体、氨基酸、蛋白胨、胰岛素和单克隆抗体的生产中常用组织培养方法。类似的，在研究和制造中常规使用动物衍生的试剂，如牛血清白蛋白(BSA)和羊血组分。
由于这些组合物来自活生物体，包括人类、动物和植物，它们可能被一种或多种病毒、细菌或其它病原体污染。只要人或其它动物与污染的产品接触，就可导致个体感染、疾病、甚至死亡。在个体必须用某组合物治疗一段较长时间时，例如，某些血友病人必须经常用血液衍生的组合物治疗一生的情况下，这种感染的危险是特别引人注意的。类似的，具有严重免疫系统缺陷的人，如患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病人特别容易通过接触生物衍生组合物中污染的病原体而感染。用兽医学药物治疗的动物也同样受到污染组合物的威胁。除了对接受生物衍生组合物的人造成感染危险外，由于存在病毒、细菌和其它病原体污染物，这种组合物本身的效力也可能是有缺陷的。
生物衍生组合物不仅被用于药物/治疗剂的生产，某些产品还常用作生物学研究的试剂(或用于生产制剂)。当生物衍生试剂被病毒、细菌或其它病原体污染时，使用它的研究计划就可能变得无用、不确定或甚至误导。常用于制造和研究的血液产品包括BSA和人血浆蛋白质。
重组DNA和蛋白质、单克隆抗体、病毒载体和相关组合物也是生物衍生组合物用于研究和制造过程的例子。虽然这些产品很少可能被病毒、细菌和/或其它病原体污染，但是这些污染仍然是可能的。另外，当这些组合物被用作研究工具时，如果它们被污染，会对这些研究造成显著的风险，使得必须在此关心这种污染。
因此，生物衍生的组合物，特别是人或动物来源的，包括例如细胞系、血液和/或血浆，在出售前需要严谨的病毒安全评估。目前提供这种安全性确认的方法包括在特定制造步骤用感染性试验或其它诊断试验测试原材料和产品中的病毒、细菌和/或其它病原体。
测试材料的有效性受到可得到的测试方法、试验灵敏度和检测不到的未知或突变病原体，尤其是病毒的可能性的限制。因此，在开发制造方法的过程中，包括设计用来从这些生物学衍生的组合物中去除或灭活病毒和/或其它病原体的加工步骤。测试这些方法能否去除或灭活病毒至所需的或最合适的安全水平。各方法步骤对数减少之和决定了病毒清除的总效果。例如，对于每一个加工步骤，病毒含量必须下降至少1个对数。
目前，已有许多去除生物衍生组合物中的污染和对其进行消毒的方法。总的说，这些处理方法包括物理方法、化学方法、加热方法、辐照方法和优选的，它们的一些组合。长时间加热生物衍生组合物；用一种或多种化学试剂联合加热或辐射处理这种组合物；和用溶剂-清洁剂方法灭活病毒是三种最常用的去除生物衍生组合物中污染的方法。然而，没有一种灭活生物衍生组合物中病原体特别是病毒的方法被证明对后续广谱病原性物质是成功的。另外，这些方法大部分需要进一步加工生物学组合物，来除去在灭活病毒、细菌和/或其它病原体中使用的化学药品。这些额外的加工步骤通常包括一或多次抽提步骤和/或层析步骤，它们大大提高了制造最终产品的成本，并因此提高了产品对消费者的零售价格。
已有的去除或灭活病毒和/或其它污染物的示范性物理方法包括高度专门化的过滤方法、亲和层析、离子交换层析和聚乙二醇分级。然而，这些物理方法受到许多限制，尤其是当许多组合物不能如此过滤时。因此，在使用过滤、层析和其它物理方法的程度上，它们常常是一系列消除污染方法中的一个步骤。例如，为了产生较纯的凝血因子VIII、凝血因子IX或免疫球蛋白的溶液，必须先对血浆进行溶剂-清洁剂处理方法，然后层析处理，最后进一步过滤，得到所要的最终产物。可用超滤消除血液或血液产品中的细小病毒，但该方法仅部分有效。例如，它可应用于凝血因子IX浓缩液，但不能用于凝血因子VIII。
例如，在美国专利号4,540,573(Neurath等)、美国专利号4,946,648(Dichtelmüller等)、美国专利号5,418,130(Platz等)、美国专利号5,527,704(Wolf，Jr.等)、美国专利号5,663,043(Zepp等)和美国专利5,866,316(Kempf等)中描述了其它去除或灭活病毒、细菌/或其它病原体污染的生物衍生组合物的熟知方法。这些专利描述了联合处理生物衍生组合物，特别是哺乳动物血产品，如血浆、血浆组分或血液细胞物质(红细胞、血小板或蛋白质组分)，来灭活其中的病毒和/或细菌污染物。另外，所有所述方法包括使用至少一种化学药品直接降解污染生物或使其对另一种化学药品或加热或辐照的降解作用敏感。
这些联合处理方法的使用对于某些病毒比用一种化学药剂处理更有效，而且更可靠。例如，实验已显示单用β-丙内酯冷处理仅灭活了血浆中0-3log的HIV和SV40(Scheidler等，1998)，单用紫外线辐射处理血浆仅对约40％接受者提供了防止肝炎感染的保护作用；但是使用同时用β-丙内酯和紫外线辐射处理的血浆感染率为0(Lo Grippo等，“用紫外线和丙内酯处理人血浆-6年临床评估”，JAMA1987722-726(1964))。因此可理解单用一种化学试剂灭活生物衍生组合物中的病毒污染物已是次优选的。
美国专利号4,726,949、4,866,282和4952,812，Miripol等(本文下文收集的，Miripol专利)描述了用波长主要为280纳米-320纳米的紫外光辐射一薄层白血细胞约0.25-15分钟，以导致白血细胞基本上丧失其在同种异体免疫病人中引发免疫反应的能力。Miripol专利说明，应在实施所述方法中避免使用发射254纳米波长处的有效能量的紫外线灯泡，因为该波长的光导致血细胞损伤。类似的，鉴定出UV-A范围(约365纳米)也是不理想的，因为它不能很好的降低淋巴细胞同种异体免疫的作用。虽然Miripol专利描述了一种用紫外光辐照血液产品(即白血细胞)的方法，并不表明这些方法对于灭活病毒、细菌和/或其它病原体消除生物衍生组合物中的污染是有用的，也不表明广谱脉冲光(必须包括253和365纳米范围的光)与单用紫外光相比较可提供改进的消除污染作用。
虽然已知道并使用了各种消除生物衍生组合物污染的方法，但未开发出能稳定有效消除大部分病原性微生物，而且能安全的用于生物衍生组合物，包括治疗性蛋白质和/或其它生物分子的方法。热处理一般需要大量时间，并对于蛋白质或其它需要回收的物质有损害；例如，血浆蛋白组分和人白蛋白需要在60℃加热10-11小时来灭活病毒。已发现细小病毒、肝炎A和其它非脂包膜病毒对于溶剂/清洁剂具有抗性，还显示细小病毒对加热灭活具有抗性。
鉴于在生物衍生组合物中加入化学物质来消除污染的方法很流行，已开发了许多方法用于在消除污染处理后，去除或灭活这些化学物质。例如，美国专利号4,540,573(Neurath等)、4,789,545(Woods等)和5,817,765(Isaksson等)描述了不同方法，用于将生物衍生终产物与其中存在的化学污染物分开，作为灭活病原性污染物处理的结果。显然需要进行额外加工步骤，以从生物衍生组合物中除去先前加入的化学物质，这是不理想的。
虽然细菌和其它病原性污染物在制造和使用生物衍生组合物中受到关注，但病毒常常是最受关注的。病毒根据其基因组常分为DNA或RNA病毒，和/或根据有衣壳或无衣壳的生理特征分组。另外，各个病毒常常分类编入一病毒家族，一个家族中共有某些进化特征。例如疱疹病毒家族(疱疹病毒科)中的病毒是衣壳DNA病毒而腺病毒家族的病毒是无衣壳DNA病毒。有衣壳和无衣壳RNA病毒的例子分别是黄病毒科(包括黄热病病毒、丙型肝炎病毒和牛腹泻病毒)，和微小核糖核酸病毒科(包括脊髓灰质炎病毒、鼻病毒和甲肝病毒)。当然，在生物衍生组合物中对于人类毒性最强，和/或最普遍的病毒在开发和实施消除污染的方法中受到了最大的关注。这些病毒包括例如细小病毒、猿猴乳多空病毒(SV40)、人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。
细小病毒是一种无衣壳DNA病毒。人-B19细小病毒的感染可导致流产或导致感染HIV的人持续贫血。细小病毒可通过血液或血产品传播，对于热处理和溶剂/清洁剂处理具有抗性。它甚至还能通过已用两种灭活方法联用处理的组合物传播。犬细小病毒(CPV)普遍存在于环境中，并且是一种严重的兽医学病原体，需要针对它的疫苗。显然，已证明能灭活HIV的光灭活方法对于CPV是无效的(Hirayama等，1997)。
猿猴乳多空病毒(SV40)是一种无衣壳DNA病毒。当使用在含有SV40的恒河猴细胞中制备的脊髓灰质炎和腺病毒疫苗时，在二十世纪50年代晚期和60年代早期发生了疏忽的人对SV40的接触，Shah，K.等，Am.J.Epidemiology，1031-12(1976)。虽然皮肤调查已发现接触SV40与肿瘤发生之间没有可辨别的相关性(具体说，在与SV40污染的脊髓灰质炎疫苗接触与脑和卵巢中发现肿瘤的发生之间无关)，但近来已在各种人组织中检测到了与SV40有关的DNA序列。例如，已在脉络丛肿瘤、室管膜瘤、间皮瘤和骨肉瘤中发现SV40-相关的DNA。见例如，Bersagel等，NEJ Med.，326988-93(1992)；Carbone等，Oncogene 91781-90(1994)；Cristando等，J.Environ.Pathol Toxicol Oncol.1429-34(1995)；和Martini等，Cancer Res.564820-25(1996)。已从脉络丛肿瘤分离到了感染性SV40，Lednecky等，Virology，212710-717(1995)。不清楚生物衍生组合物中的SV40污染物可能在何种情况下，和以何种程度感染该产品的接受者。因此，有益的是尝试除去和/或灭活存在于生物衍生组合物中的SV40，然后施用该产品。不幸的是，已发现SV40对热的抗性较强，并不总能被β-丙内酯处理灭活。见Lelie等，J.Med.Virol.，23(3)297301(Nov.1987)和Sheilder等Biologicals，26(2)135-144(June 1998)。
人免疫缺陷病毒(HIV)是一种熟知的无衣壳RNA病毒，在人中导致疾病和死亡。在合适的条件下，HIV可被γ辐射灭活(Salai等，Ann.Transplant，2(1)55-56，1997)和一些化学物质所灭活(Dewilde等，Biol.Chem.379(1)1377-79，1998，Arthur等，AIDS Res.Human Retroviruses 14(Suppl.13)5311-19(Oct.1998))。然而，显示用β-丙内酯仅有限灭活HIV-2(Scheidler等，Biologicals，26(2)135-44(June 1998))。类似的，已显示HIV的热处理仅在某些组合物中是有效的(Azari等，Artif.Cells Blood Substit.immobil Biotech 26(5-6)577-82(1998年11月))；而HIV-1和-2都能被合适的溶剂/清洁剂在几分钟内灭活(Biesert等，Vox Sang 74(Suppl 1)207-212(1998))。还已报道HIV可被可见光和染料亚甲基蓝的联合处理所灭活(Muller-Breitkreutz和Mohr，1998)。
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是一种衣壳RNA病毒，属于黄病毒科，在牛中导致严重疾病。由于该病毒能穿过胎盘感染牛胚胎，估计胎牛血清10％-75％之间的商品污染了BVDV。虽然尚不清楚BVDV在什么情况下感染人类，感染到什么程度，它的存在已与小儿胃肠炎和人小头畸形联系起来(Harasawa，1997)。另一引人关注的是非细胞病变性BVDV株能在宿主细胞RNA中掺入其基因组，从而在被该病毒污染的连续传代细胞系中提出了致癌问题。用化学物质如β-丙内酯已实现了有限的BVDV灭活(Scheidler等，Biologicals，26(2)135-144(1998年6月))。另外，74℃热处理90分钟已显示减少了7log的BVDV(Azari等，Actif.Cells BloodSubstit.Immobil.Biotech.26(5-6)577-82(Nov.1998))。然而显然这种剧烈而长时间的热处理对许多污染的组合物是不适合的。
广谱脉冲光(BPL)提供了一种用广谱的非相干多色光的高强度短历时脉冲灭活微生物的方法。BPL与连续非脉冲紫外光有许多方面的不同。BPL的光谱含有紫外光，还包括更宽的光谱，特别是在约180-2600纳米之间的广谱。BPL的光谱和海平面的阳光光谱相似，虽然比其强90,000倍，并包括在正常情况下被地球大气层滤去的200-300纳米之间波长的紫外光。与非脉冲紫外光的更长曝光时间和较低能量相比，BPL以相对高能的短历时脉冲应用。见例如美国专利号5,034,235(Dunn等)、5,489,442(Dunn等)、5,768,853(Bushnell等)和5,786,598(Clark等)。
已用BPL去除各种目标，如食品、包装、水和其它液体、半流体和固体的污染和/或对其消毒。本来，这些是通过将目标物放入或使目标物通过BPL消毒室，使目标物暴露在合适数量的合适能量水平的BPL光束下。见例如上述四个专利和5,900,211(Dunn等)。然而重要的是，使用BPL去除生物性衍生组合物的污染在这之前还未被描述或考虑过。虽然BPL已被证明能用于对固体表面和/或某些相对透明的液体内的各种微生物进行灭活，还没有提出BPL可用于去除含有蛋白质和/或其它感兴趣的生物分子的生物衍生组合物中的污染。由于生物衍生的治疗和药物组合物常常在静脉内施用，而且是任一情况下以浓缩形式施用，所以完全去除污染微生物对于确保安全是关键的。类似的，选择的净化加工必须能有效而可靠的消除生物衍生组合物的污染，而对最终产品的效力没有不良影响。
BPL提供了与非脉冲紫外光不同的生物学作用。例如已知产生色素的细菌，如黑曲霉(Aspergillus niger)对紫外光辐射比芽孢杆菌孢子更有抗性。然而在用BPL的研究中，黑曲霉在干燥表面上比以下三种不同的芽孢杆菌孢子更敏感嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。另外，常规UV处理会损伤DNA，其损伤机制在某些实验条件下可逆转，这些机制分类为“暗酶修复”或“光酶修复”(Block，S.Disinfectin，Sterilization and Preservation，第四版，Williamsand Wilkins，U.S.A.(1991))。在用BPL处理相同的微生物(如枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、黑曲霉、生孢梭菌(Clostridium sporogenens)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、霍乱沙门菌和绿脓杆菌)时，该暗酶或光酶的光反应不发生(Furukawa等“全新的脉冲光消毒技术可同时对注射用溶液及其2毫升聚乙烯容器消毒”，在PDA国际会议上发表，Japan(1999年2月))。存在可见光范围内的波长，以及产生这两种不同光的方法进一步将BPL与紫外光区分开来。常采用汞灯产生紫外光，它造成了一些安全威胁；而BPL是使用惰性气体，如氙气的灯产生的。
因此，需要的是一种新方法，来灭活生物衍生组合物中所含的病毒、细菌和/或其它病原体，这对于各种病原体，尤其是对于各种病毒是有效的，而且能用于各种组合物，而不会无谓损伤最终产品的效果。
发明概述本发明提供了用广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲消除生物衍生组合物的方法和装置，而满足上述需要和其它需要。具体说，本文描述了至少减少1个log的存在于生物衍生组合物中的活病原体，如病毒、细菌、毒素、致热原、真菌和/或朊病毒的含量的方法，该方法包括提供一种含有至少一种病原体的生物衍生组合物，并用至少一种广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲照射该生物衍生组合物，从而使活病原体的含量减少至少10倍(即，1个log)。本文描述的方法可以有益的用于生物衍生组合物，如单克隆抗体、基因工程改造的哺乳动物细胞系产生的蛋白质、基因治疗产品(如病毒载体)、人和/或动物血液制品产物、生物药物(如肝素和/或胶原)、牛血清、羊血、蛋白胨/氨基酸和/或牛胰岛素/转铁蛋白，而不会破坏该组合物的治疗性质、药物性质、抗原性、营养或其他所需性能。特别是，在暴露于这种广谱脉冲光下时，存在于该生物衍生组合物中的蛋白质、多糖、核酸、脂类、抗体和其它感兴趣的生物分子不会丧失对其用途必须的性能，即感兴趣的生物分子不会被不可逆改变(例如使它们不再显示其理想的生物活性)。因此，有益的是在经过这种广谱脉冲光处理后，生物衍生组合物几乎(如果存在)不需要其它加工步骤。
因此在一个方面，本文提供了一种迅速、有效和可靠的方法，即通过将产品暴露于至少一种高强度短历时BPL(即广谱的非相干多色光)脉冲光来灭活存在于生物衍生产品，如血浆中的病毒，如HIV-1或-2、甲、乙或丙型肝炎病毒、HTLV-I或II，或巨细胞病毒。在另一个方面，本文提供了类似的快速、有效和可靠的方法，即通过将组合物暴露于BPL，来灭活存在于动物血液衍生组合物中的病毒，如SV40和/或有关的血液携带病毒。
另一个方面，本文提供了减少存在于生物衍生组合物中的病原体含量的方法，这些方法包括首先稀释生物衍生组合物，然后用至少一种广谱非相干多色光的高强度、短历时脉冲照射该稀释的生物衍生组合物，最后将生物衍生组合物浓缩到所需浓度。在这方面，本发明对于消除广谱光不大能射穿，因此如果不先稀释就不能被充分消毒的生物衍生组合物的污染是有用的。另外，当该生物衍生组合物的蛋白质含量特别高，如高于10％，理想的是用BPL照射之前先稀释该组合物，以便更好的控制BPL对蛋白质的效果并更好的控制组合物中存在的病原体的灭活。
本文还提供了灭活存在于生物学衍生物中多种污染微生物的方法，其中污染微生物包括至少两种选自病毒、细菌、真菌和朊病毒的微生物，该组合物中的蛋白质、肽、和/或其它感兴趣的生物分子不会被不可逆改变，从而使其保留了预期目的的效果，该方法包括使生物衍生组合物暴露于与至少一种广谱光的脉冲。
在另一个方面，本文提供了通过使组合物接触广谱(即170-2600纳米；l.8×1015-1.2×1014Hz)非相干多色光的高强度(如0.01焦耳/平方厘米-50焦耳/平方厘米，如0.05焦耳/平方厘米-1.0焦耳/平方厘米，其中能量密度是在靶目标表面测得的)、短历时(即10纳秒-100毫秒，如0.3毫秒)脉冲灭活存在于生物衍生组合物中的至少一种微生物的方法。通常用1-5次脉冲。
在一个具体方面，本发明提供了一种减少生物衍生组合物中存在的活病原体含量的方法，该方法包括步骤提供一种生物衍生组合物，该组合物含有至少一种病原体，用广谱非相干多色光的至少一次高强度短历时脉冲照射该生物衍生组合物，从而使活病原体的含量减少至少10倍。
在另一个具体方面，本发明提供了一种灭活存在于含有感兴趣的生物分子的生物衍生组合物中的病毒的方法，该方法包含步骤提供一种含有感兴趣的生物分子和病毒的生物衍生组合物，用广谱脉冲光的至少一次脉冲照射该生物衍生组合物，从而灭活病毒。
在另一个具体方面，本发明提供了一种含有感兴趣生物分子的生物衍生组合物，其中通过用广谱脉冲光的至少一次脉冲照射该生物衍生组合物，使组合物中的活病毒含量比其原来含量至少降低了10倍，而灭活病毒，同时保留所述生物分子的生物活性。
在另一个方面，本发明提供了一种减少生物衍生组合物中存在的活病原体含量的方法，该方法包括步骤提供含有至少一种病原体和至少一种感兴趣的生物分子的生物衍生组合物，用广谱非相干多色光的至少一次高强度短历时脉冲照射该生物衍生组合物，降低了活病原体的含量，而不破坏感兴趣的生物分子。
附图简述
图1是示范性脉冲光处理装置的处理区示意图，可用于消除本发明生物衍生组合物中的污染，该装置使用排列紧密的薄板，处理其中放置的组合物；图2是另一种本文所用的示范性脉冲光处理装置的示意图，该装置使生物衍生组合物沿纵向流过环绕一伸长的非相干脉冲光源的套筒，该光源提供广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲；图3是另一种示范性脉冲光处理装置的示意图，其中生物衍生组合物在椭圆反光镜内平行于一个或多个伸长的非相干光源流动，并用广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲处理；和图4是一张流程图，说明在制备用脉冲光消除生物衍生组合物污染，使组合物暴露于脉冲光，然后处理已净化的组合物中所采用的各个步骤中的一些步骤。
优选例的详细描述本发明提供了一种迅速、可靠和有效灭活存在于生物衍生组合物中的病原体的方法。已发现可用广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲灭活存在于生物衍生组合物，如血液衍生组合物、基因工程改造的细胞系衍生的组合物、组织培养过程衍生的组合物和相关产品中的病毒、细菌和其它病原体(应理解这种应用的目的包括致热原、毒素、真菌和朊病毒)，一般不破坏感兴趣生物分子，如组合物中的蛋白质、多糖、抗体、核酸脂类、氨基酸和/或蛋白胨的所需生物学性质。
具体说，将生物衍生组合物置于和/或流过广谱脉冲光处理装置，在该装置的处理区域中用广谱(如170-2600纳米；即1.8×1015-1.2×1014Hz)的高强度(如0.01焦耳/平方厘米，例如0.05-1.0焦耳/平方厘米，在组合物表面测得)非相干多色光至少一次，优选两次，最优选三次短历时(如少于100毫秒，优选约0.3毫秒)的脉冲照射组合物。总的说，预计这种商业方法可使用1-5次短脉冲。如此照射的结果，生物衍生组合物内的活病原体含量减少了至少1个log(即10倍)，优选减少2个log以上(即100倍)。最有益的是，可在生物衍生组合物处理过程中的不同时间点简单和快速的使用该处理方法，从而进一步确保完全或近乎完全灭活组合物中的病原体。
可用各种装置实施这些减少病原体的方法。已有人描述了设计用于提供广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲的装置，例如在｀235专利、｀236专利、｀853专利、｀442专利、｀853专利、｀598专利和专利号5,900,211中。与用于提供广谱脉冲光处理的装置相同的是，处理室是不透光的；闪光灯置于该装置内，使其射出的光最佳射在目标物体上；优选使用能进一步使脉冲光最大程度指向目标物体的反射材料；当在闪光灯和目标物体之间需要材料(如处理室内的目标物体的支持结构)还使用了可透射材料(如石英、蓝宝石或类似材料)，从而使对BPL的干扰最小化。
在设计或选择BPL处理装置中，最重要的是配置仪器的处理区，即仪器内用脉冲光照射目标物体的区域。由于脉冲光必须照到目标物体的所有表面，一般将处理区设计成能将最大程度照向目标物体。例如，当同时使用一盏以上的闪光灯来消除目标物体污染时，优选将处理区设计成目标物体与每盏闪光灯都是等距离的，优选闪光灯环绕目标物体。为了确保脉冲光照射到整个目标物体，在处理区中用来支持目标物体的结构优选由至少约1％，优选至少约10％，更优选至少约50％，和最优选至少约85％的BPL可透过的材料组成。下列描述是根据本发明能用于生物衍生组合物消毒或净化的示范性装置。
图1显示了用BPL处理生物衍生组合物的优选示范性装置的处理区示意图。在该优选装置中，两片薄(如不到5毫米，例如约2厘米)的可透射板110、112彼此平行放置，并相互非常靠近(即分开不到5毫米，如约1毫米)，提供了通道或管道100，使待处理的组合物能通过其中。在板110、112的各一侧装置了闪光灯系统102、104，各包括部分包围闪光灯108的反射片106，这些闪光灯系统是可商品购得的，例如PurePulse Technologies of San Diego的PUREBRIGHT型PBS-1号。
优选伸长闪光灯108，优选生物衍生组合物(由图1中的箭头114表示)的流动伸长的闪光灯平行。优选板110、112彼此沿两条平行于闪光灯的对边固定，从而使在它们之间通过的组合物被包含在其中。可使用合适的透光胶体，如琼脂糖。可用正方形的透射管道(如石英或蓝宝石)将组合物转运过照射的处理区。虽然仅用两个闪光灯系统102、104照射，但可使用其它系统；例如管道100可被脉冲光源环绕。在这两种情况下，当生物衍生组合物通过(或停留在)管道100时，从闪光灯系统116发出的光照向它，从而灭活其中含有的病毒和/或其它微生物。将管道100的板110、112靠近放置在一起有好处，可使待处理的组合物通过时分散成一薄层，即使组合物比较不透明和/或未稀释时，也有利于组合物整体暴露在脉冲光下。
图2显示了另一种示范性装置50的示意图，该装置可用于灭活组合物中的病毒和/或其它污染的微生物。装置50包括一个反射性柱状外壳，形成了处理室202，组合物流经其中，周围环绕脉冲光源204。脉冲光源是高能氙闪光灯，按照常规的闪光灯操作实践装有合适的电源(未显示)。
液体循环泵208根据脉冲光源204的脉冲重复速率控制着组合物通过处理室202的流速，从而在组合物位于处理室202中时，使通过其中的全部产品暴露在预定数量的广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲。一般待处理的组合物以约1-4升/分钟的流速被泵送通过该处理室。流出处理室202的组合物就被消除污染，一般没有感染性。
可以安排产品处理室202与脉冲光源204分开，以避免其中的组合物与光源204接触。要办到这一点可以使用石英外壳(或石英柱)环绕光源204，而待处理的组合物在石英柱外通过。冷却水可以在光源204和石英外壳之间循环。
处理室的直径可根据许多因素而不同，包括但不限于待处理的组合物的具体吸收特性，光源204即闪光灯的物理和操作特性，和光脉冲即闪光之间产品混合的程度。处理室202可以包括一作为其外壁的集成反射片或外部反射片，以反射照射光穿过组合物回到组合物流动通道。当使用外部反射片时，该集成反射片可包括一石英(或其它透射材料)柱体(或管道)，组合物在其中通过，外面装有外部反射片。
注意到一些天然或稀释后的生物衍生液体对包括相当部分的UV光谱的光相对透明。因此，光在这些组合物中的吸收较少减弱，光通量密度主要仅随离光源的距离而下降。然而，对于其它具有显著吸收的组合物，光通量密度将同时随离闪光灯的距离和组合物的吸收而下降。在任一情况下，在整个处理区中应维持理想的最小光通量密度，如0.4或0.5焦耳/平方厘米(或甚至低至0.1-0.2焦耳/平方厘米，这取决于待灭活的具体微生物)。可另选的或另外的，应进行混合，以确保所有要处理的液体都受到适当的光通量密度和脉冲数处理以达到所需程度或水平的灭活，即杀死或灭菌。虽然闪光灯204在图2的装置50中位于处理室202内部，图3显示了可另选的(或另外的)将一盏或多盏闪光灯256置于处理室252的外部。显示了一种优选设计，其中将待处理的组合物通过采用透射处理管道(如石英管)的处理室252。处理室252沿椭圆反射片254的一个焦点放置。沿椭圆反射片254的另一个焦点放置了一闪光灯256。闪光灯256最好套在石英管中，用水冷却。由于椭圆反射片254将光脉冲聚焦在处理室252的中央，对于待处理的组合物的光吸收提供了补偿，从而所有组合物都受到均一的光处理。在所示实施例的一个变化(未显示)中，如需要可采用多个椭圆反射片，每个在一个焦点有一个闪光灯，在另一个焦点具有处理室252。
虽然已描述在实施本发明的方法中可使用各种装置，但本领域技术人员将会理解为了这些目的可选择使用各种其它装置，包括上述装置的组合，因此它们在本文中是平等考虑的。例如，可使用小型脉冲光灭菌器来处理含有生物衍生组合物的静脉内用溶液，该灭菌器的一个入口接受静脉插管，使该溶液通过脉冲光室，并从出口输出，然后通过剩下的静脉插管进入病人体内。
在这样的处理装置中，使用BPL来照射和处理生物衍生组合物，以减少病原体如病毒和/或细菌的含量至少10倍。优选处理方法包括用强度至少约0.01焦耳/平方厘米，优选约0.02-50焦耳/平方厘米、和最优选约0.05-1.0焦耳/平方厘米的脉冲光照射生物衍生组合物，其中能量强度是在照射的组合物表面测得的。光脉冲优选历时非常短。优选脉冲历时不到100毫秒；最优选约10纳秒到100毫秒之间，如大约0.3毫秒。除了高强度和短历时脉冲光外，它应是广谱非相干多色光。优选包括170-2600纳米(即频率为1.8×1015Hz-1.2×1014Hz)的光。因为脉冲之间的时间非常短，如不到100毫秒，对于每次处理，可在不到1分钟内完成一次多脉冲灭活处理。如果处理是被泵送或循环(与批处理相反)流动的产品，理想的是提供多个闪光灯，沿流动路线安置，使流速更快。这类处理与先前已知的减少生物衍生组合物中的病原体含量的方法完全相反，后者需要几小时才能完成。
为了根据本发明的方法最有效和最可靠的处理生物衍生组合物，该组合物应尽可能的用广谱脉冲光充分照射。因此，重要的是至少在处理过程中将待处理的组合物包含在这种广谱脉冲光能充分透射，例如至少1％穿透的材料中以实现可靠灭活。合适的材料的例子包括例如聚烯烃，如聚乙烯和聚丙烯，尼龙，石英和蓝宝石；598专利讨论了各种适用于脉冲光处理装置的聚合物。
为了形成包含材料可优选不同材料，这取决于使用的脉冲光处理装置的具体配置。例如，当处理装置使用靠近安置的薄板中流过生物衍生组合物时，这些板优选用较硬的透光性材料制成，如石英或蓝宝石。相反，当处理区是静脉管时，优选柔韧的聚合物材料。
除了考虑用何种脉冲光处理装置，和待要处理的生物衍生组合物包含在哪种材料中以外，还应考虑组合物本身的某些性质。例如，生物衍生组合物的透光性对于确保广谱脉冲光的完全照射是重要的。生物衍生组合物的不同组分可能引起广谱脉冲光对组合物的透射性减少。例如，全细胞、高浓度的蛋白质和/或大量脂类或其它大分子的存在都可能干扰广谱脉冲光透过和/或对生物衍生组合物的穿透性。
幸运的是，通常可用简单的稀释调节生物衍生组合物的透射性，而不对组合物造成永久损伤，这种方法常用于这些组合物的加工过程，因此这些方法的合适技术是众所周知的。例如，如果需要改进血浆对BPL的透射性，以按照本发明对其进行最佳处理，可首先用合适的盐水溶液稀释血浆，然后用BPL处理，处理后重新浓缩或进一步加工，来提供所需的最终产品。由于用本发明的脉冲光处理可能破坏存在于生物衍生组合物中的全细胞而不可修复，所以这些方法最适合处理既不包括全细胞，又不需要在用BPL处理后回收完整全细胞的生物衍生组合物。
如前所述，可有益的用这些方法灭活存在于生物衍生组合物中的病原体，一般不破坏组合物内感兴趣的生物分子的治疗性、药理性、营养性和/或其他所需性质。虽然一些感兴趣的生物分子的效力可能因为用广谱脉冲光处理而轻微下降，但是在许多这样的情况下剩余的活性仍可接受。另外，在某些情况下，一些感兴趣的生物分子的效力可因BPL处理而增强，可能导致增强的或甚至新的疗效。
图4是一张流程图，其中说明了本发明方法的各种实施例中的一些。可将待处理的生物衍生组合物的未稀释样品300稀释成稀释组合物302或不经稀释处理。提出了三种将生物衍生组合物引入脉冲光处理装置处理区的三种优选示范方法管式流动方法304、批处理方法306和板式流动处理308。图2和3描述了管式流动304法的具体实施例。根据这第一个备选方案，将组合物经管子或类似的伸长装置引入处理室的处理区。这包括例如在椭圆形处理装置中处理，通过一静脉内管道处理和相关方法。优选至少在组合物所在点受到脉冲光照射的管道直径足够小，使组合物整体被照射到。
将生物衍生组合物引入处理室的处理区的第二种替代方法是以批量形式306处理组合物。在这个替换方法中，可将组合物分成相对少量，置于一个或多个合适的透光容器中并用脉冲光照射。批量处理法特别适用于培养基组分，如胎牛血清的脉冲光处理，可以用该批量法非常迅速而有效的处理小量物质。图4中提出的第三种替代方法是板式流动308装置。如上文详述的，板式流动308装置含有两张靠近放置的薄板，待处理的组合物从其中流过。有利的是，这种具体替换方法可将组合物分散成薄而宽的层，允许一次处理相当体积的组合物，其它将生物衍生组合物引入脉冲光处理室的处理区的方法对于本领域技术人员来说将是明白易懂的。
下面是一些用本文描述的方法灭活具体病原体的例子。特别是，说明了存在于生物衍生组合物中的HIV-1和BVDV的灭活。这些实验的结果显示，测试的四种病毒各自的含量在用广谱非相干多色光的三次高强度短历时脉冲处理后显著下降了。在用广谱非相干多色光的仅一次高强度短历时脉冲照射后，显示HIV-1和CPV病毒含量下降大于3个log。随后的第五个实施例说明了胎牛血清中一种细菌大肠杆菌的灭活。
实施例1SV40的灭活用猿病毒40(SV40，ATCC VR-305)接种非洲绿猴肾(AGMK)细胞。当75％-100％的细胞展示细胞病变作用(CPE)时，收集病毒。冰冻病毒原种，并-60℃储藏在含有10％-15％胎牛血清(FBS)的培养液中。用AGMK细胞滴定含有SV40的样品。用于生长和维持AGMK细胞的培养液是Eagles极限必需培养基(E-MEM)，含5％-10％加热灭活的FBS、10毫克/毫升庆大霉素、100单位/毫升的青霉素、和2.5毫克/毫升两性霉素B。
在湿润的5-7％C02的大气中36-38℃培育细胞培养物。
在无菌聚乙烯样品容器中加入0.2毫升体积的以含有10％热-灭活FBS的E-MEM配的SV40。制备了12份样品。9份样品用BPL处理。其中三份样品用一次光脉冲处理，三份样品用两次脉冲处理，三份样品用三次脉冲处理。三份未处理的样品用作对照。
暴露脉冲光后，在接种有AGMK的96-孔微量培养板中制作各病毒样品的10倍稀释液，进行滴定。使SV40吸附1-2小时，然后从孔中除去，替换以新鲜培养液。用RPMI(无酚红)滴定作为对照。所有滴定在板中作一式四份，监测CPE和/或细胞毒性的存在达10日。表1列出了结果。
表1用BPL处理SV40
将曝光后滴度与曝光前滴度比较，以测定是否曝光后BPL后病毒感染力下降。实施例1显示SV40下降了2-3个log。该实施例中使用了可得到的最高滴度。当使用的起始滴度越高，用的脉冲次数越多，或培养液稀释到较低的蛋白浓度时，预期病毒减少也越大。
实施例2HIV-I的灭活用HIV-I型毒株HTLVIIIB(Vanderbilt University，Nashville，TN)接种CCRF-CEM细胞。当用免疫荧光试验法(IFA)测定感染性达到最小值80％时，收集HIV-1。冰冻病毒储液，-60℃储藏在含有10％-15％FBS的培养液中。
用MT-2细胞(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program.目录号237)滴定含有HIV-1的样品。用于MT-2细胞生长和维持的培养液是补充有2mM L-谷氨酰胺、25mM Hepes、2克/升NaHCO3、15％热灭活FBS和50毫克/毫升庆大霉素的RPMI1640(含有酚红)。在36-38℃在湿润的5-7％CO2大气中培育细胞培养物。
在无菌聚乙烯样品容器中加入0.2毫升以含有15％热灭活的FBS的RPMI配的HIV。制备了12份样品。9份样品用BPL处理。其中，三份用一次光脉冲处理，三份用两次脉冲处理，三份用三次脉冲处理。三份未处理的样品作为对照。
曝光后，在接种了MT-2的96-孔微量培养板中制作各病毒样品的10倍稀释液，进行滴定。HIV-1稀释液在整个滴定时间内留在孔中。用RPMI(无酚红)滴定作为对照。所有滴定在板中作一式四份，监测CPE和/或细胞毒性的存在达10日。表2列出了结果。
表2用BPL处理HIV-1
将曝光后滴度与曝光前滴度作比较，以测定是否曝光于BPL后病毒感染力下降。实施例2显示用BPL后发生HIV-1减少了5-6个log。
该实施例中使用了可得到的最高滴度。当使用的起始滴度越高，用的脉冲次数越多，或培养液稀释到较低的蛋白浓度时，预期病毒减少也越大。
实施例3CPV的灭活用CPV(ATCCVR-2017)接种A-72细胞(ATCC CRL 1542)。当75％-100％的细胞显示细胞病变作用(CPE)时，收集病毒。冰冻病毒储液，-60℃储藏在含有10％-15％FBS的培养液中。
用A-72细胞滴定含有CPV的样品。用于A-72细胞生长和维持的培养液是补充有5％-10％热灭活FBS、10毫克/毫升庆大霉素、100单位/毫升青霉素和2.5毫克/毫升两性霉素B的E-MEM。在36-38℃湿润的5-7％CO2大气中培育细胞培养物。
在无菌聚乙烯样品容器中加入0.2毫升以含有5％热灭活FBS的E-MEM配的CPV。制备了12份样品。9份样品用BPL处理。其中，三份用一次光脉冲处理，三份用两次脉冲处理，三份用三次脉冲处理。三份未处理的样品作为对照。
曝光后，在以A-72接种的96-孔微量培养板中制作各病毒样品的10倍稀释液，进行滴定。使CPV吸附1-2小时，然后从孔中除去，替换新鲜培养液。将上清液样品从CPV滴定板转移到新的滴定板中，测试血细胞凝集(HA)。用RPMI(无酚红)滴定作为对照。所有滴定在板中作一式四份，监测CPE和/或细胞毒性的存在达10日。表3列出了结果。
表3用BPL处理CPV
*该实验的检测极限是≤3.16×101。
将曝光后滴度与曝光前滴度比较，以测定是否接触BPL后病毒感染力下降。实施例3显示用BPL后发生CPV减少了3-4个log。
该实施例中使用了可得到的最高滴度。当使用的起始滴度越高，用的脉冲次数越多，或培养液稀释到较低的蛋白浓度时，预期病毒减少也越大。
实施例4BVDV的灭活用BVDV(ATCC VR-534)接种Bovine Turbinate(BT)细胞(ATCC CRL 1390)。当75％-100％的细胞显示细胞病变作用(CPE)时，收集病毒。冰冻病毒储液，-60℃含有储藏在10％-15％FBS的培养液中。
用BT细胞滴定含有BVDV的样品。用于A-72细胞生长和维持的培养液是补充有15％马血清的E-MEM。
在36-38℃湿润的5-7％CO2大气中培育细胞培养物。
在无菌聚乙烯样品容器中加入0.2毫升以含有5％热灭活FBS的E-MEM配的BVDV。制备了12份样品。9份样品用BPL处理。其中，三份用一次光脉冲处理，三份用两次脉冲处理，三份用三次脉冲处理。三份未处理的样品作为对照。
曝光后，在接种有A-72的96-孔微量培养板中制作各病毒样品的10倍稀释液，进行滴定。使BVDV吸附1-2小时，然后从孔中除去，替换新鲜培养液。用RPMI(无酚红)滴定作为对照。所有滴定在板中作一式四份，监测CPE和/或细胞毒性的存在达10日。表4列出了结果。
表4用BPL处理BVDV
将曝光后滴度与曝光前滴度比较，以测定是否接触BPL后病毒感染力下降。实施例4显示用BPL后发生BVDV减少了4个log。
该实施例中使用了可得到的最高滴度。当使用的起始滴度越高，用的脉冲次数越多，或培养液稀释到较低的蛋白浓度时，预期病毒减少也越大。
实施例5大肠杆菌的灭活用大肠杆菌(ATCC26)接种15％FBS样品并在32℃培养过夜，直到最终浓度为8.8×104CFU/ml(4.9log CFU/ml)。然后根据本文所述的方法，用3次广谱光的短历时脉冲(1.0焦耳/平方厘米/闪光)照射200微升污染的血清(含有17,600CFU，即4.25log CFU)。制备该样品的系列稀释液(10x)(用0.05M磷酸缓冲液)并接种于标准琼脂平板上。32℃培育该平板，在24和48小时计数。
培育48小时后，在任何平板上都观察不到存活的大肠杆菌。如果灵敏度水平是20CFU(即1.3log CFU)，该试验证明仅用三次广谱光脉冲处理接种有大肠杆菌的FBS，导致细菌含量减少了3个log。(4.25logCFU-1.3log CFU＝2.95log CFU)。
虽然已用具体实施例及其应用描述了本文公开的发明，但是本领域技术人员可作出许多修改和变化，而不违背权利要求限定的本发明的范围。所有的参考文献和美国专利的公开内容引入本文以供参考。
权利要求
1.一种减少生物衍生组合物中存在的病原体含量的方法，其特征在于，该方法包括步骤提供含有至少一种病原体的生物衍生组合物；和用广谱非相干多色光的至少一次高强度短历时脉冲照射生物衍生组合物，从而使活病原体含量至少减少10倍。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提供步骤提供了含有选自病毒、细菌、致热原、毒素、真菌和朊病毒的至少一种病原体的生物衍生组合物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提供步骤提供了一种生物衍生组合物，它含有至少一种病毒，选自人免疫缺陷病毒-1、人免疫缺陷病毒-2、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HTLV-I、HTLV-II、巨细胞病毒、猿猴乳多空病毒40、牛病毒性腹泻病毒和犬细小病毒。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提供步骤提供的一种生物衍生组合物，选自血浆组合物、凝血因子VIII组合物、凝血因子IX组合物、抗凝血酶组合物、转铁蛋白组合物、白蛋白组合物、免疫球蛋白组合物、单克隆抗体组合物、病毒载体组合物、肝素组合物、胶原组合物、胰岛素组合物和血清白蛋白组合物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述照射步骤包括用广谱非相干多色光的至少一次高强度短历时脉冲照射生物衍生组合物，光强度至少0.01焦耳/平方厘米，脉冲历时不到100毫秒，光波长在170-2600纳米之间。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述照射步骤包括用广谱非相干多色光的至少二次高强度短历时脉冲照射该生物衍生组合物。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提供步骤提供一种生物衍生组合物，它含有至少一种病原体并含有一种感兴趣的生物分子；所述照射步骤包括用广谱非相干多色光的至少一次高强度短历时脉冲照射该生物衍生组合物，而不破坏感兴趣的生物分子。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括在所述照射步骤之前稀释该生物衍生组合物；和在所述照射步骤后浓缩该生物衍生组合物。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括提供一种广谱脉冲光装置，所述装置包括一处理区，所述处理区由至少一盏闪光灯和两块相对的透光板组成；使生物衍生组合物在两块相对的透光板之间流动；其中在所述生物衍生组合物位于相对的两块透光板之间时对其进行所述照射。
10.一种灭活存在于含有感兴趣生物分子的生物衍生组合物中的病毒的方法，其特征在于，该方法包括步骤提供一种含有感兴趣生物分子和一种病毒的生物衍生组合物；和用广谱非相干多色光的至少一次高强度短历时脉冲照射所述生物衍生组合物，从而灭活病毒。
11.一种含有感兴趣生物分子的生物衍生组合物，其特征在于，经过如权利要求10所述的处理方法处理后，该组合物中的活病毒含量比原来的含量减少了至少10倍，而所述生物分子保留其生物活性。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述提供步骤提供的一种生物衍生组合物，选自牛血清、羊血、牛胰岛素、牛转铁蛋白、牛肝素、胶原、氨基酸、蛋白胨、肽、单克隆抗体和基因改造过的哺乳动物细胞系产生的蛋白质。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述照射步骤包括用广谱非相干多色光的至少一次高强度短历时脉冲照射生物衍生组合物，从而灭活病毒导致活病毒含量减少至少1个log。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述照射步骤包括用广谱非相干多色光的至少一次高强度短历时脉冲照射生物衍生组合物，从而灭活病毒导致活病毒含量减少至少2个log。
15.一种减少生物衍生组合物中存在的病原体含量的方法，其特征在于该方法包括步骤提供一种生物衍生组合物，它含有至少一种病原体和至少一种感兴趣的生物分子；和用广谱非相干多色光的至少一次高强度短历时脉冲照射该生物衍生组合物，从而减少活病原体的含量，而感兴趣的生物分子不受破坏。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述照射步骤包括照射生物衍生组合物，从而使其中的活病原体含量减少至少1个log。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述提供步骤提供的一种生物衍生组合物含有至少一种选自病毒、细菌、致热原、毒素、真菌和朊病毒的病原体。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述提供步骤提供的一种生物衍生组合物含有至少一种病毒，选自人免疫缺陷病毒-1、人免疫缺陷病毒-2、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HTLV-I、HTLV-II、巨细胞病毒、猿猴乳多空病毒40、牛病毒性腹泻病毒和犬细小病毒。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述提供步骤提供的一种生物衍生组合物，选自牛血清、羊血、牛胰岛素、牛转铁蛋白、牛肝素、胶原、氨基酸、蛋白胨、肽、单克隆抗体和基因改造过的哺乳动物细胞系产生的蛋白质。
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述照射步骤包括用广谱非相干多色光的至少两次高强度短历时脉冲照射生物衍生组合物。
全文摘要
通过用广谱非相干多色光的至少一次高强度短历时脉冲照射,减少生物衍生组合物中的病原体含量的方法。在得到的经处理的组合物中感兴趣的生物分子保留了生物活性。生物衍生组合物,如血清、血浆或其它血液制品,包括胰岛素、转铁蛋白、肝素、胶原、凝血因子VIII和/或凝血因子IX中,或含有单克隆抗体、或基因工程改造的细胞系等产生的蛋白质组合物中存在的病原体,如病毒、细菌、热原、真菌和/或朊病毒的含量通过用广谱脉冲光照射而降低。用广谱光的单脉冲显著降低了生物衍生组合物中的HIV－1、SV40、犬细小病毒或牛病毒性腹泻病毒的含量。
文档编号A61K38/43GK1344170SQ00805398
公开日2002年4月10日 申请日期2000年2月11日 优先权日1999年2月13日
发明者H·W·科弗, J·M·伯格尔, C·J·麦克唐纳德, S·马洛伊, A·H·布什内尔, J·R·库珀 申请人:坡里坡勒斯技术股份有限公司