肿瘤疫苗的制作方法

专利名称：肿瘤疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及在肿瘤的复发预防、转移抑制及治疗方面有用的肿瘤疫苗。
已开发出多种肿瘤疫苗(Pardoll，D，M.，Nature Med.，4(5Suppl)，pp.525-531，1998)。大体分类的话，肿瘤特异的肿瘤疫苗有(1)应用性状已经明确的肿瘤抗原肽作为肿瘤疫苗；(2)应用肿瘤组织的提取液作为肿瘤疫苗，其中包含未鉴定的肿瘤抗原肽；(3)这些抗原与抗原呈递细胞，特别是与抗原呈递能力强的树突细胞结合后作为疫苗使用(Nestle，F.O.，et al.，Nature Med.，4，pp.328-332，1998)；(4)让树突细胞摄取肿瘤抗原蛋白，使之负载后作为疫苗使用；(5)使树突细胞与肿瘤细胞融合后作为疫苗使用；(6)使肿瘤抗原与脂质体结合，连同脂质体摄取作后为疫苗使用(Nakanishi，T.，et al.，Biochem.Biophys.，Res.Comm.，240，pp.793-797，1997)；(7)用放射线或固定剂对肿瘤细胞进行失活处理，然后作为肿瘤疫苗施用；(8)用基因治疗法，将对抗原呈递细胞或淋巴细胞有刺激作用的细胞因子基因导入肿瘤细胞，以此作为疫苗施用，或者将肿瘤抗原基因导入适当的细胞内，以表达该基因的肿瘤细胞作为疫苗施用；(9)将肿瘤抗原基因整合到病毒或细菌中，感染患者；(10)施用活的肿瘤细胞、肿瘤抗原肽或肿瘤细胞提取液，再通过其它途径施用大量的细胞因子(Rosenberg，S.A.，et al.，Nature Med.，4，pp.321-327，1998)，或者将细胞因子缓释性制剂化后施用(Golumbek，P.T.，et al.，Cancer Res.，53，pp.5841-5844，1993)等。
但是，上述肿瘤疫苗每一个均有其优缺点。例如，方法(1)只能适用于表达与鉴定出的肿瘤抗原肽相适应的特定的主要组织相容性复合物(以下，略作MHC，I类MHG记作MHC-I，II类MHC记作MHC-II)的肿瘤。人类的MHC种类繁多，而该肿瘤抗原肽的适应病例极为有限。为了克服这种缺点，开发出了方法(2)，它使用包含未鉴定的肿瘤抗原肽的肿瘤组织提取液，但从肿瘤组织提取出的肿瘤抗原肽的量是极微量的，当作为原材料的肿瘤量少时，多不能进行浓缩。其结果，不能如鉴定出的、合成的肿瘤抗原肽大量施用，其效果也就很有限。
象方法(3)中，先让肿瘤抗原肽与抗原呈递细胞结合的话，CTL的活化效果就高。但是分离、制备抗原呈递细胞，尤其其中抗原呈递能力强的树突细胞时，为了避免外周血和骨髓产生的危险的移植片对宿主间排斥反应(以下，略作GVHD)，必须从肿瘤疫苗疗法的适用对象，肿瘤患者本人来制备，而且技术要求高，也很复杂。方法(4)和(5)存在与方法(3)同样的问题，方法(5)的融合操作极为繁杂。方法(6)虽不必考虑GVHD的危险性，但肿瘤抗原向抗原呈递细胞的导入效率未必高，另外，为制备肿瘤疫苗，需要较大量的肿瘤抗原。
方法(7)的问题是，通过大量培养来得到肿瘤细胞不仅繁杂且耗费高，并且肿瘤细胞中所包含的肿瘤抗原量甚微。另外，已知这一方法在对抗原性高的肿瘤细胞追加多聚-L-赖氨酸处理时能成功(Naito，M.and Seno，S.，Cell Biol.International Rep.，5，pp.675-681，1981)，抗原性低的肿瘤细胞则不能成功。方法(8)和(9)的基因治疗，从治疗操作到获得治疗许可，手续极为繁杂。现阶段，方法(10)有些希望，但是尤其在Rosenberg等的方法中，同时施用的大量的白介素-2的副作用很严重，肿瘤临床效果也不一定高。即使用Golumbek等的方法，将细胞因子缓释制剂化时，制备经放射线处理的活肿瘤细胞也很繁杂。
期望能极为便利地获得肿瘤疫苗。其中一点是，将活的肿瘤细胞或抗原呈递细胞作为疫苗的一部分来施用的方法，由于有必要在活的状态下进行操作，所以技术非常复杂就成为一个问题。若进行基因治疗，操作过程则更为复杂。在肿瘤抗原肽已确定时，能大量合成并施用肿瘤抗原肽，然而肿瘤抗原肽的种类非常多，又由于受患者个人MHC的限制，多数情况下都无法判定哪种肿瘤抗原肽适用于作为对象的患者个人，因此适用受限。不用肿瘤抗原肽而应用肿瘤抗原蛋白时，由于蛋白在抗原呈递细胞内被处理并可筛选出与MHG相应的肿瘤抗原肽，其蛋白不受所适用患者个人MHC的限制，但问题是肿瘤抗原蛋白本身的纯化及大量制备很难。
另一方面，已知CTL的诱导方法有，将病理切片脱蜡处理后，从所得固定肿瘤组织上的外周血单核细胞级分诱导CTL的方法(Liu，S.Q.et al.，Nature Med.，2，pp.1283-1283，1996)。通常，溶解状态的抗原蛋白给予抗原呈递细胞时，MHC-II与抗原蛋白来源的抗原肽结合，并且对与产生抗体相关联的体液免疫的刺激效果高；MHC-I与抗原蛋白来源的抗原肽结合，但对激活杀伤性细胞的细胞免疫应答的刺激效果低。而Falo等应用抗原性强的异种蛋白-卵白蛋白与铁粉结合，不加佐剂，注射给小鼠，诱导出对卵白蛋白来源的抗原肽产生反应的CTL(Falo，Jr.，L.D.，et al.，Nat.Med.，1，pp.649-653，1995)。
本发明者们发现，将可溶性肿瘤抗原蛋白固定到微小的聚苯乙烯珠上，在体外细胞培养系统中，以微小固形物的形式被人外周血单核细胞级分中的抗原呈递细胞吞食时，可从同一人的外周血淋巴细胞中有效诱导出CTL(Kim，C.，et al.，Cancer Immunol.Immunother.，47，pp.90-96，1998)。另外，已知死细胞来源的抗原，在死细胞状态被未成熟的树突细胞吞食时，激发免疫应答的效率与不被吞食时相比可达数千倍(稻叶1998年12月2日，日本免疫学会，演讲题目SI-3-3)。
本发明者们为了解决上述课题进行了深入研究，他们应用肿瘤组织、肿瘤细胞或对这些成分进行固定操作而得到的固化材料，将这些材料微粒化，使其大小适于被抗原呈递细胞所吞食，或通过溶解操作使之溶解，再与至少一种细胞因子组合，应用这样的肿瘤疫苗，实现高效预防肿瘤的复发、转移抑制及治疗。
也就是说，本发明提供肿瘤疫苗，它包含由肿瘤组织、肿瘤细胞及选自由这些成分构成的组的固化肿瘤材料制备的微粒和至少一种细胞因子和/或细胞因子诱导剂；并且本发明提供肿瘤疫苗，它包含由肿瘤组织、肿瘤细胞及选自由这些成分构成的组的固化肿瘤材料制备的溶解物和至少一种细胞因子和/或细胞因子诱导剂。
本发明的优选方案是提供进一步包含能引起非特异性免疫应答的佐剂的上述肿瘤疫苗；在体内同一局部施用的上述肿瘤疫苗；包含作为细胞因子的缓释性细胞因子制剂的上述肿瘤疫苗；含有作为细胞因子的粒细胞·巨噬细胞集落刺激因子和/或白介素-2的上述肿瘤疫苗。从其它观点来看，就是提供至少与一种细胞因子组合应用的肿瘤疫苗，并且包含由肿瘤组织、肿瘤细胞及选自由这些成分构成的组的固化肿瘤材料制备的微粒或从该肿瘤材料制备的溶解物作有效成分的疫苗。
再从其它观点来看，就是提供肿瘤的治疗方法、复发预防方法及转移抑制的方法，并且将有效量的由肿瘤组织、肿瘤细胞及选自由这些成分构成的组的固化肿瘤材料制备的微粒和至少一种细胞因子和/或细胞因子诱导剂施于患者的方法；将有效量的由肿瘤组织、肿瘤细胞及选自由这些成分构成的组的固化肿瘤材料制备的溶解物和至少一种细胞因子和/或细胞因子诱导剂施于患者的方法；在同一局部重复施用的上述方法；以及由制备上述肿瘤疫苗的上述固化肿瘤材料制备的微粒或溶解物的使用。
本发明的完成受到美国政府的资助，因此美国政府享有与本发明相关的权利。
图2表示例4中用溶解固定肿瘤细胞制备的肿瘤疫苗体内致敏的实验结果。图中，○表示PBS对照组，□表示1次肿瘤疫苗施用组，■表示3次肿瘤疫苗施用组。
图3表示例5中改变培养的淋巴细胞与靶肿瘤细胞的比率(E/T比)时，检测细胞杀伤活性的结果。图中，●表示PBS对照组，■表示肿瘤疫苗施用组，□表示其它种的对照组(预先用X射线50Gy照射过的活B16-F10细胞+GM-CSF微球施用组)。
图4表示例6中应用的各种肿瘤疫苗的细胞杀伤活性。图中，●表示PBS对照组，○表示HA-A20细胞施用组，□表示没混合GM-CSF微球的肿瘤疫苗施用组，▲表示预先用X射线50Gy照射过的活GM-CSF-HA-A20细胞施用组，△表示混合了GM-CSF微球的肿瘤疫苗施用组。
图5表示本发明的肿瘤疫苗的细胞杀伤活性被抗小鼠CD8的单克隆抗体抑制的结果。
本发明的最佳实施方案本发明肿瘤疫苗的特征是，含有由肿瘤组织、肿瘤细胞及选自由这些成分构成的组的固化肿瘤材料制备的微粒或溶解物作为肿瘤抗原，还包含至少一种细胞因子和/或细胞因子诱导剂。
作为肿瘤细胞或肿瘤组织，例如可应用哺乳类动物来源的，优选来源于人的，但只要是包含作为治疗和预防对象的肿瘤的肿瘤抗原的细胞或组织，任一生物种来源的细胞或组织均可使用。肿瘤组织只要是包含肿瘤细胞的组织，对其种类无特殊限制。另外，应用肿瘤组织或肿瘤细胞的成分时，只要是包含能成为肿瘤抗原的物质，其种类无限制。固形癌组织、骨髓、白细胞等从活体分离或提取的含有癌细胞的活体样品可作为肿瘤材料应用。作为肿瘤组织或肿瘤细胞的成分，例如可应用抗原肽和抗原蛋白。
用于制备固化肿瘤材料的固定方法无特殊限制，可采用业内人士可以应用的任何手段。例如，应用组织固定剂时，可以用中性福尔马林、戊二醛、甲醇、乙醇等醇类。除此之外，只要是可使活体组织或细胞、或其成分固化的方法，任何方法均可应用。也可通过石蜡包埋和冷冻等方法将肿瘤材料固化。骨组织等本来就是固态的组织作为固化肿瘤组织应用时，希望采用适宜的固定方法。
微粒的制备方法无特殊限制，例如，将固化的肿瘤组织破碎成微细片段而制备微粒的方法，除此之外，溶解肿瘤组织的破碎片段和肿瘤细胞并固定到固体微粒的方法，或将抗原肽和抗原蛋白等可溶性肿瘤抗原固定到固体微粒的方法等。作为固体微粒，可应用直径0.05μm-1000μm程度的铁粉、炭粉、聚苯乙烯珠子等。另外，可应用将组织的破碎片段、肿瘤细胞或可溶性肿瘤抗原与脂质体等脂质颗粒结合，形成能被抗原呈递细胞作为微粒识别吞食的粒子，或可应用可溶性肿瘤抗原本身通过结合剂或交联剂相互结合形成微粒化的粒子。
微粒的大小无特殊限定，希望其大小为体内具有吞食能力的细胞可吞食的程度。对本来微小的单个细胞状态的固定肿瘤细胞没必要进行特殊破碎，但在细胞固定化操作中发生集结时，要进行破碎或分散处理。破碎或分散处理可应用匀浆处理、超声波处理、消化酶部分消化法等。另外，可通过空隙大小在1000μm以下的筛网，优选通过380μm以下的筛网来制备微粒。这些微粒的制备方法为该领域的人员所熟知，业内人士可单独应用适宜的方法，或组合应用数种方法来制备微粒。
由固化的肿瘤组织制备溶解物的方法，例如可采用应用蛋白酶的方法。蛋白酶如蛋白酶K等。另外，也可应用蛋白酶以外的酶、酸或碱等适当组合的方法。只要能溶解固化肿瘤材料，可采用任意方法，业内人士可选择适当的方法。也可将溶解物固定到上述固体微粒。
本说明书中所使用的“溶解物”这一术语是指固化的肿瘤材料在水、生理盐水、缓冲液等水性介质中分散成肉眼看不到固形物的程度的状态，其分散物只要达到能被抗原呈递细胞吞食的程度即可，并没有其他特殊的限定。另外，固定化肿瘤材料的制备方法、微粒的制备方法及溶解物的制备方法的详细内容在本说明书的实施例中有具体指示，所以业内人士可参照上述一般说明及实施例的具体说明，必要时对之进行适当的修饰乃至改变，即可制备出所期望的微粒或溶解物。
本发明的肿瘤疫苗中所包含的细胞因子的种类无特殊限制，可应用一种或两种以上的细胞因子。例如，优选应用粒细胞·巨噬细胞集落刺激因子(以下，略作GM-CSF)或白介素-2(以下，略作IL-2)，也优选GM-GSF与IL-2组合应用。另外，也可应用刺激体内局部免疫细胞的，实现结果与施用GM-CSF和/或IL-2时同样状况的其它细胞因子和细胞因子诱导剂。这两种细胞因子以外的其它细胞因子或细胞因子诱导剂例如白介素12、白介素18、干扰素类等，但不限定于此。
这些细胞因子和诱导剂，优选制备成缓释性制剂，这样可使其在施用局部的浓度尽可能地长期保持在高状态。这种缓释手段如Golumbek等的报告(Golumbek，P.T.，et al.，Cancer Res.，53，pp.5841-5844，1993)，业界已知的各种缓释方法，可采用任何一种方法。
本发明的肿瘤疫苗可含有引起非特异性免疫应答的佐剂。可应用一种佐剂或组合应用两种以上的佐剂。作为佐剂，如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、卡介苗(BCG)等细菌制剂、结核菌素等细菌成分制剂、匙孔血蓝蛋白和酵母甘露聚糖等天然高分子物质、明矶、TiterMax Gold等合成佐剂制剂等，但不限定于这些具体例，只要是有佐剂效果的物质均可应用。是否应用佐剂，要以施用局部炎症性反应的强度、施用结果引起的抗肿瘤效果的强度为指标进行判断。例如，可在同一局部交替施用含佐剂的肿瘤疫苗和不含佐剂的肿瘤疫苗。
本发明肿瘤疫苗的制剂形式无特殊限制，但希望是适于局部施用的制剂形式。对制剂化方法也无特殊限制，可通过该领域内可利用的方法的单独应用，或适当的组合应用来制备成所期望形式的制剂。制剂化过程中除可应用注射用蒸馏水和生理盐水等水性介质外，可应用1种或2种以上该领域内可利用的制剂用添加物。例如，应用缓冲剂、pH调节剂、助溶剂、稳定剂、镇静剂及防腐剂等，它们的具体成分业内人士已众所周知。另外，可将肿瘤疫苗制成冷冻干燥剂等固体制剂，用时加入注射用蒸馏水等溶解剂制备成注射剂。
应用本发明的肿瘤疫苗进行疫苗疗法时，可只一次施用肿瘤疫苗，但是为了使肿瘤抗原与细胞因子或细胞因子诱导剂尽可能长时间共存，优选在体内的同一局部反复施用。例如，为了在施用局部激起炎症性反应，达到免疫细胞集中存在于此的持续状态，两成分最好共存3小时以上。施用不含佐剂的肿瘤疫苗时，可在同一局部施用佐剂。一般而言，可将肿瘤疫苗施用给肿瘤材料来源的患者，但也可施用给这样的肿瘤患者，其包含的肿瘤抗原在病理诊断上与肿瘤材料包含的肿瘤抗原同种或近缘。
施用局部无特殊限制，如皮内、皮下、肌内、淋巴结内、脾脏等主要脏器内，优选细胞因子不易简单扩散消失的部位。不过，通过选用肿瘤疫苗的有效成分不易扩散的剂型，可进行任意部位的局部施用，也可通过应用药物输送系统进行全身施用。本发明的肿瘤疫苗的施用剂量与施用期限无特殊限制，希望根据疫苗疗法的效果来决定适宜的施用剂量与施用期限。施用例如可通过注射等途径进行。
将微粒沉淀悬浮到2ml双蒸水中，添加20mg/ml浓度的用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(以后，略作EDC)溶液，使其终浓度达0.8mg/ml。25℃保存15分钟，再添加无菌的2ml 0.1M的甘氨酸溶液。25℃保存30分钟后，生成稳定的微球，将该悬浮液在半径12cm的水平转头上2000rpm离心10分钟，沉淀微球并回收。向其中加入适量的双蒸水悬浮，反复离心，共洗涤6次。其后，悬浮到含有1μg的GM-CSF(相当于106国际单位)的，或含有103国际单位IL-2的20μl生理盐水中。3.致敏和肿瘤排斥反应的测定混合上述1中制备的固定Hepa1-6细胞、上述2中制备的GM-CSF微球和IL-2微球、市售的佐剂TiterMax Gold(CytRX，Atlanta，Norcross，GA)，作为肿瘤疫苗。它们在每0.05ml肿瘤疫苗中的量依次是1.25×106个，106单位，103国际单位，20μl。改变这些组成制剂的组合，也制作成肿瘤疫苗。其组合分别如表1、表2和表3所示。
将肿瘤疫苗，皮内注射到与Hepa1-6细胞具有同源(syngeneic)关系的6-8周龄C57BL/6雄性小鼠尾根部，每只注射0.05ml。1组5只。对照组的5只C57BL/6雄性小鼠注射0.05mlPBS。7天后，再在同一部位施用一次，再7天后，直接肝内注射悬浮到0.05mlPBS中的培养的Hepa1-6活细胞107个(最大肝叶的被膜下)。21天后，测量形成的肝癌组织的大小，计算出其体积。(结果)如表1所示，对照组中所有的小鼠形成肝癌，癌组织的平均体积为270mm3。与此相对，用包含固定Hepa1-6细胞、佐剂TiterMaxGold、IL-2微球、GM-CSF微球的肿瘤疫苗进行处置的组中，5只中4只完全没看到肿瘤(表中，用无肿瘤小鼠的比率表示)，观察到肝癌的1只小鼠，其肿瘤仅为18mm3的小肿瘤。这表明肿瘤的疫苗疗法有效。表1致敏 无肿瘤小鼠 肿瘤体积(mm3)的比例 (平均±SD) 范围对照组(A)PBS0/5 270±146 140-480处置组(B)固定Hepa 1-6细胞 4/5 3.6±80-18+Titer Max Gold+IL-2/GM-CSF微球接着，为了判定肿瘤疫苗构成成分的组合的重要性，改变了处置组中肿瘤疫苗成分。结果如表2所示。对照组(A)与处置组(E)得到与表1同样的结果，并显示出重现性。表2致敏 无肿瘤小鼠肿瘤体积(mm3)的比例(平均±SD) 范围对照组(A)PBS0/5 420±326 144-910处置组(B)PBS0/5 152±106 75-294+固定Hepa 1-6细胞+Titer Max Gold(C)PBS0/567±97 18-240+固定Hepa 1-6细胞+Titer Max Gold+IL-2微球(D)PBS2/532±430-105+固定Hepa 1-6细胞+Titer Max Gold+GM-CSF微球(E)固定Hepa 1-6细胞 4/53.6±8 0-18+Titer Max Gold+IL-2/GM-CSF微球该表中，处置组(B)中，用只包含固定Hepa1-6细胞和佐剂TiterMax Gold的肿瘤疫苗致敏小鼠，无肿瘤小鼠1只也没看到。由此说明并用细胞因子的重要性。处置组(C)中，用除固定Hepa1-6细胞和佐剂TiterMax Gold之外只包含IL-2微球的肿瘤疫苗，同样无肿瘤小鼠1只也没看到。但所生肿瘤的大小均明显缩小，平均肿瘤体积为67mm3，只为对照组(A)的1/6以下。由此说明IL-2微球的重要性。另外，处置组(D)中，用除固定Hepa1-6细胞和佐剂TiterMax Gold之外只包含GM-CSF微球的肿瘤疫苗，无肿瘤小鼠只有2只。由此说明GM-CSF微球的重要性。但是，无肿瘤小鼠仅为处置组(E)的无肿瘤小鼠的半数，未取得处置组(E)那样的成绩。由该结果可以判断细胞因子IL-2和GM-CSF组合应用至关重要。
为了进-步研究作为肿瘤抗原的固定肿瘤细胞的必要性，也为了测定佐剂的效果，制备不含固定肿瘤细胞的肿瘤疫苗，或不含佐剂的肿瘤疫苗，比较其结果。结果如表3所示。表3致敏 无肿瘤小鼠肿瘤体积(mm3)的比例(平均±SD) 范围对照组(A)PBS0/5 231±146 120-480处置组(B)PBS0/5 174±149 60-432+Titer Max Gold(C)PBS0/5 300±258 60-648+Titer Max Gold+IL-2/GM-CSF微球(D)PBS0/5 210±170 60-480+IL-2/GM-CSF微球(E)PBS1/5 85±780-210+固定Hepa 1-6细胞(F)PBS1/5 78±580-150+固定Hepa 1-6细胞+Titer Max Gold(G)固定Hepa 1-6细胞 5/5 00+Titer Max Gold+IL-2/GM-CSF微球(H)PBS4/5 7±16 0-36+固定Hepa 1-6细胞+IL-2/GM-CSF微球与表1相同，对照组(A)与处置组(G)得到与表1同样的结果，但是处置组(G)中，5只全部是无肿瘤小鼠。除不合固定Hepa1-6细胞之外，处置组(C)中应用包含与处置组(G)相同的IL-2微球和GM-CSF微球，以及佐剂TiterMax Gold的肿瘤疫苗进行处理，可以看到所有的小鼠均有大的肝癌生成(平均300mm3)。由该结果可以判定固体微粒状的肿瘤抗原是极为重要的。实际上，如处置组(E)中看到的那样，即便PBS中只加了固定Hepa1-6细胞的肿瘤疫苗，也有1只无肿瘤小鼠。与此相对，在含有固定Nepa1-6细胞、IL-2微球和GM-CSF微球，不含佐剂TiterMax Gold的处置组(H)中，可看到4/5为无肿瘤小鼠，而有一只生成了小而清晰的36mm3的肝癌。由此可以判定激起非特异性免疫应答的佐剂的效果也值得充分考虑。
由这些结果可以得到这样的结论作为由Hepa1-6细胞造成的抑制小鼠肝癌癌组织形成的肿瘤疫苗，组合应用固定Hepa1-6细胞、IL-2微球、GM-CSF微球、佐剂TiterMax Gold，对于抗肿瘤效果的发挥是最为有效的。例2由固定肿瘤组织制备微粒化肿瘤抗原的方法破碎包含固定肿瘤细胞的固定肿瘤组织，制备微细的固化肿瘤抗原。(方法)将与例1中给对照组(A)的小鼠使用的等量的Hepa1-6细胞移植到小鼠的大腿皮下，3周后摘出所生成的肝癌组织，在市售的中性福尔马林液中，室温浸泡3天并固定。取出该组织，用眼科剪刀剪成直径1mm左右的细块，加入原初肝癌湿重10倍量的PBS，再在冰冷的匀浆器(Heidorf公司制，DIAX-600，6G电动轴)中匀浆30秒钟。为了让匀浆液冰冷，每次间隔3分钟以上，重复5次。将该匀浆液1.2ml移到1.5ml Eppendorf离心管中，在Eppendorf微量高速离心机上，15000rpm离心3分钟，测量压紧体积(packed volume)。测量是与加入了50μl以上水的1.5ml Eppendorf离心管进行比较。将剩余的匀浆液在半径12cm的水平转头上，2000rpm离心10分钟，得到沉淀。
将该沉淀5ml悬浮到70％乙醇中，并洗净，2000rpm离心10分钟，弃上清，然后再度悬浮到原来体积的PBS中。将之通过40目的不锈钢网(Sigma公司制，S0770，孔径380μm)。取1.2ml通过的悬浮液到1.5ml Eppendorf离心管中，在微量高速离心机上，15000rpm离心3分钟，测量压紧体积(packed volume)。测量是与加入了一定量水的1.5ml Eppendorf离心管进行比较。(结果)从固定肝癌组织得到的匀浆中的组织断片非常细，通过上述筛网后，微细到很容易通过普通22G规格以下的细注射器。回收的细胞数虽无法确定，但目测回收的压紧体积(packed volume)可清楚地显示回收细胞数超过相当于Hepa1-6活细胞107个的水平，用通过上述筛网前后的压紧体积(packed volume)计算的回收率为78％。该匀浆包含固化的肿瘤细胞断片，且可充分满足作为肿瘤疫苗的需要量，所以可作为微粒化的肿瘤抗原使用。例3体外诱导CTL的抗肿瘤效果以固定肿瘤细胞作为靶细胞，检测诱导CTL时的肿瘤细胞杀伤活性与特异性。(方法)1.固定肿瘤细胞将源于C57BL/6小鼠的黑素瘤细胞B16的亚株B16-F10(购自American Type Culture Collection(Bethesda，MA，USA))108-109个浸到10％福尔马林液中，4℃固定2-4周。将之悬浮在30ml 70％乙醇中，离心洗涤，然后再悬浮到PBS中，离心洗涤3次。将之悬浮到适量的含10％胎牛血清的细胞培养用MEM培养基中，37℃加温2-3天，或60℃加温4小时。再离心回收(以下，将进行这种处理的细胞叫做固定B16-F10细胞)，悬浮成5×108个/ml。2.通过体外致敏和肿瘤细胞杀伤活性来测定抗肿瘤效果从没经过任何致敏的C57BL/6小鼠脾脏，用业内人士熟知的方法轻轻碾碎组织，得到脾脏细胞。其大部分为淋巴细胞。取该细胞4×107个，与2×106个固定B16-F10细胞一起，在添加了人IL-1β(167单位/ml)、人IL-2(67国际单位/ml)、人IL-6(134单位/ml)(均为Immunex公司制)，含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养10日，使之增殖。培养开始后第3天及第5天，全部更换培养液，以后每2天更换一半。如此增殖的淋巴细胞为CTL。
抗肿瘤效果的测定是在体外测定CTL的肿瘤细胞杀伤活性。细胞杀伤活性是以未经放射线照射的活B16-F10作靶细胞，用广为人知的标准测定方法4小时Cr-51释放法进行测定。另外，用例1中叙述的Hepa1-6细胞和购自American Type Culture Collection(Bethesda，MA，USA)的Lewis肺癌细胞替代B16-F10作为靶细胞进行比较。(结果)

图1表示了通过体外致敏诱导的CTL的活性。纵座标的％Lysis表示CTL对靶细胞的杀伤活性。横座标的E/T比表示用4小时Cr-51释放法测定杀伤活性时CTL数与靶细数的比值。B16-F10作为靶细胞时(□)，E/T比为10时，约杀伤20％。其活性比来自相同C57BL/6小鼠的其它2种肿瘤细胞作靶细胞时明显要高。该结果说明针对固定B16-F10细胞诱导的CTL，对于虽来自相同的C57BL/6小鼠，但与其它2种肿瘤细胞相比，它能特异性识别B16-F10活细胞并具有杀伤力。例4从溶解固定肿瘤细胞制备微粒化肿瘤抗原的方法及其体内的抗肿瘤效果用病理切片做材料时，用例2所示的方法进行微粒化的话，其产量很糟，并且肿瘤疫苗的制备很困难。此时，可如下用消化酶溶解固定肿瘤细胞，将之作成微球制剂，并与细胞因子的微球制剂组合制备肿瘤疫苗。(方法)1.溶解固定肿瘤微球的制备方法及肿瘤疫苗制剂的制备方法将固定B16-F10细胞悬浮到PBS中，并使其终浓度为5×108个/ml，向其中添加终浓度达1mg/ml的链霉蛋白酶K(pronase k)(Sigma公司)，56℃加温一晚。3000rpm离心10分钟，除去沉淀，上清作为溶解B16-F10抗原。向该上清中加入例1中应用的人血清白蛋白注射液，使其终浓度达2.5％。其以后的操作与例1中GM-CSF微球的制备顺序相同，制备出溶解固定肿瘤微球。最终稀释成悬浮到80μl生理盐水中的微球中所含肿瘤抗原的量相当于107个肿瘤细胞数。将之与由例1中相同方法制备的GM-CSF微球20μl混合，作为肿瘤疫苗制剂。2.通过体内致敏和肿瘤细胞攻击来测定抗肿瘤效果用乙醚麻醉与B16-F10细胞具有同源(syngeneic)关系的6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠(1组10只)，使用26G注射器，将肿瘤疫苗制剂注射到小鼠的大腿皮内，每只注射100μl。对照组注射等量的PBS。反复施用肿瘤疫苗时，隔周重复等量施用。初次肿瘤疫苗施用2周后，在腹部皮下注射悬浮的培养B16-F10活细胞105个。抗肿瘤效果用残存无肿瘤小鼠的％计算。(结果)图2表示体内致敏实验的结果。与对照组相比，肿瘤疫苗制剂施用组的残存无肿瘤小鼠的％明显要高。尤其是在施用该肿瘤疫苗制剂3次的组中，观察时间超过90天，仍有半数的小鼠保持无肿瘤的状态。该结果提示体内施用肿瘤疫苗制剂也能诱导针对B16-F10细胞的CTL，所以它能杀伤其后注射的活B16-F10细胞，使半数的小鼠无法生存。另外，该结果还提示肿瘤摘除手术后，用其肿瘤细胞制备肿瘤疫苗制剂的话，防止肿瘤复发的肿瘤疫苗疗法可成立。例5从溶解固定肿瘤细胞制备的肿瘤疫苗制剂的CTL诱导效果例4中施用了肿瘤疫苗的动物，体外验证其实际体内诱导的CTL。(方法)用与例4相同的方法，将肿瘤疫苗制剂施用给C57BL/6雄性小鼠，而作为对照组的小鼠及其他种的对照组，使用将107个经X-射线50Gy照射过的活B16-F10细胞与GM-CSF微球20μl混合并作为对照肿瘤疫苗制剂施用给小鼠的组，代替例4中施用1次肿瘤疫苗制剂的组。从这些组中取出脾脏及鼠腹股沟淋巴结，轻轻碾碎组织，得到淋巴细胞。将这些淋巴细胞在添加了人IL-1β(167单位/ml)、人IL-2(67国际单位/ml)、人IL-6(134单位/ml)(均为Immunex公司制)，含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养7日，使之增殖。该实验体系，从在培养期间完全不用固定B16-F10细胞进行刺激这一点来讲，与例3的体系不同。这样在培养期间无诱导出CTL的可能性，可使与体内诱导的CTL数成比例数的CTL在体外增殖。培养淋巴细胞的细胞杀伤活性是用未经放射线照射的活B16-F10细胞作靶细胞，用众所周知的标准测定方法4小时Cr-51释放方法进行测定。(结果)改变培养淋巴细胞与目的肿瘤细胞的比例(E/T比)，检测细胞的杀伤活性。结果如图3所示。用与例4相同的方法，将肿瘤疫苗制剂体内施用给小鼠，用来源于这些小鼠的淋巴细胞处理的组，其杀伤靶细胞B16-F10的比率明显要高。该淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤活性，与根据已知能诱导CTL的既存的方法制备的其他种对照组(施用对照肿瘤疫苗制剂的小鼠)来源的淋巴细胞的细胞杀伤活性几乎相同。该结果提示在小鼠体内能诱导针对B16-F10细胞的CTL。另外，由此结果可以断定，由于CTL的肿瘤细胞杀伤能力高，所以一旦诱导出CTL，那么在体内也能杀伤已经存在的肿瘤细胞，进而可以期待抑制肿瘤的转移和治愈肿瘤。例6从溶解固定肿瘤细胞制备的肿瘤疫苗的CTL诱导效果-用HA-20细胞时确认了根据本发明诱导出的CTL，并不限定于作为抗原的肿瘤B16-F10细胞一种。(方法)HA-A20细胞是来源于Balb/c小鼠的B淋巴瘤细胞株。通过基因操作使该细胞改变的GM-CSF-HA-A20细胞是导入了流感血凝素(influenza-hemagglutinin)和小鼠GM-CSF两种基因的表达载体的稳定细胞株，已成为经典的GM-CSF生成性活细胞型肿瘤疫苗的研究材料(Levitsky，H.I.，et al.，J.Immunol.，156，pp.3858-3865，1996)。用野生型HA-A20细胞替代B16-F10细胞，用与例4相同的方法，制备混合了20μl GM-CSF微球的肿瘤疫苗制剂，用于致敏Balb/c小鼠。此时，将PBS施用组、107个预先经X-射线50Gy照射过的活HA-A20细胞施用组、未混合GM-CSF微球的肿瘤疫苗制剂施用组及107个预先经X-射线50Gy照射过的活GM-CSF-HA-A20细胞施用组作为对照组。
与例4相同，施用1次来致敏Balb/c小鼠。随后，用野生型HA-A20细胞替代B16-F10细胞，用与例5相同的方法，测定CTL对HA-A20细胞的活性。另外，同时并行这样的实验，用众所周知的4小时Cr-51释放方法这一标准测定方法进行测定时，同时向96孔板的各孔中添加针对已知为典型的CTL细胞表面抗原的小鼠CD8的单克隆抗体(Sigma公司制，产品号F7525，5μg)。(结果)如图4所示，对照组中，PBS施用组、(预先经X-射线50Gy照射过的活的)HA-A20细胞施用组、未混合GM-CSF微球的肿瘤疫苗制剂施用组中几乎看不到细胞杀伤活性。而在混合了20μl GM-CSF微球的肿瘤疫苗制剂施用组中，存在明显的靶细胞野生型HA-A20细胞的细胞杀伤活性，其强度与已知的经典的GM-CSF生成性活细胞型肿瘤疫苗(预先经X-射线50Gy照射过的活的)的GM-CSF-HA-A20细胞施用组几乎相同。但是，如图5所示，当E/T比为64时，添加抗小鼠CD8的单克隆抗体，明显抑制细胞杀伤活性。这提示细胞杀伤活性大部分是由CD8阳性淋巴细胞，即包含典型CTL的淋巴细胞组产生的。例7例2中制备的由固定肿瘤组织而来的微粒化肿瘤抗原在体内的抗肿瘤效果(方法)将例2中制备的微粒化肿瘤抗原10μl压紧体积(packedvolume)一份，代替例1中应用的1.25×106个固定肿瘤细胞，进行与例1的表1的实验同样的实验，测定体内的抗肿瘤效果。但用培养Hepa1-6活细胞攻击时，例1中是直接肝内注射107个细胞，而本实施例中是注射2×107个细胞于左后肢皮下，体外测定肿瘤组织的生长速度。肿瘤大小的表示方法，按照该研究领域的习惯，不用体积而用皮下肿瘤的面积表示。同时，作为相同实验中的一组，制备不使用佐剂Titer Max Gold 20μl，而用市售的结核菌素20μl(日本BCG制造株式会社)代替的组。(结果)如表4所示，对照组在3周时间内，用Hepa1-6活细胞攻击的6只小鼠均有肿瘤形成。但是，在处置组中，与例1的表1中(B)组相对应的，用微粒化肿瘤抗原替代固定肿瘤细胞的组中，6只小鼠中只有3只形成肿瘤，3只中观察到抗肿瘤效果(50％)。另外，该微粒化肿瘤抗原组的，用结核菌素作为佐剂的组中，6只小鼠中只有1只形成肿瘤，抗肿瘤效果高达83％。
由这些结果可以得出这样的结论作为抑制癌组织形成的肿瘤疫苗，从固定肿瘤组织制备的微粒化肿瘤抗原、IL-2微球、GM-CSF微球、佐剂Titer Max Gold或结核菌素的组合，用于发挥抗肿瘤效果是十分有效的。
表4致敏 无肿瘤小鼠 肿瘤面积(mm2)的比例 (平均±SD) 范围对照组(A)PBS 0/6 164±76 81-256处置组(B)固定肿瘤组织来源的微粒化肿瘤抗原 3/6 70±80 0-180+IL-2/GM-CSF微球+Titer Max Gold(C)固定肿瘤组织来源的微粒化肿瘤抗原 5/6 8.2±20 0-49+IL-2/GM-CSF微球+结核菌素产业上的实用性本发明肿瘤疫苗的特征是，它制备简便，同时具有不论哪种肿瘤的复发预防、转移抑制及治疗均可适用的通用性，且抗肿瘤效果极佳。
权利要求
1.一种肿瘤疫苗，其特征在于含有由肿瘤组织、肿瘤细胞及选自由这些成分构成的组的固化肿瘤材料制备的微粒，和至少一种细胞因子和/或细胞因子诱导剂。
2.一种肿瘤疫苗，其特征在于含有由肿瘤组织、肿瘤细胞及选自由这些成分构成的组的固化肿瘤材料制备的溶解物，和至少一种细胞因子和/或细胞因子诱导剂。
3.根据权利要求第1项或第2项记载的肿瘤疫苗，其中进一步含有佐剂。
4.根据权利要求第1项到第3项中任一项记载的肿瘤疫苗，其中含有缓释性细胞因子制剂作为细胞因子。
5.根据权利要求第1项到第4项中任一项记载的肿瘤疫苗，其中含有粒细胞·巨噬细胞集落刺激因子和/或白介素-2作为细胞因子。
6.一种肿瘤疫苗，它是与至少一种细胞因子组合应用的肿瘤疫苗，并且含有由肿瘤组织、肿瘤细胞及选自由这些成分构成的组的固化肿瘤材料制备的微粒或由该肿瘤材料制备的溶解物作为有效成分。
全文摘要
肿瘤疫苗,它包含由肿瘤组织、肿瘤细胞及选自由这些成分构成的组的固化肿瘤材料制备的微粒或溶解物,至少一种细胞因子和/或细胞因子诱导剂(例如粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子和/或白介素－2等),及根据需要可含有佐剂。其特征是它制备简便,同时具有不论哪种肿瘤的复发预防、转移抑制及治疗均可适用的通用性,且抗肿瘤效果极佳。
文档编号A61P35/00GK1355709SQ00805910
公开日2002年6月26日 申请日期2000年2月9日 优先权日1999年2月9日
发明者大野忠夫, 彭宝岗, K·利昂, 刘书钦 申请人:理化学研究所, 约翰斯霍普金斯大学, 大野忠夫, 彭宝岗