专利名称：包含编码血管生成因子的核酸的重组缺损腺病毒治疗肺动脉高血压症的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含编码血管生成因子的核酸的载体在预防、缓解和/或治疗肺动脉高血压症中的用途。本发明还涉及局部有效地给药这些载体的具体药物组合物。
肺动脉高血压症(HTAP)是一种常见的、严重时致命的目前除了移植手段以外不可治愈的病症。
该病症的特征在于阻碍右心室血液排出和危害心脏供血量的肺动脉阻力上升。多种HTAP肺动脉壁的功能性和结构性异常与HTAP病情发展有关，其中包括平滑肌细胞增生和近中内膜肥大，胞外基质积累，血管稀疏和外周毛细血管密度降低。
本发明首次提出治疗肺动脉高血压症的有效方法。该方法基于利用包含编码血管生成因子的核酸的载体。
尽管研究过不同的血管生成因子如成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)与肺动脉高压症发展的关联性，但是迄今为止，尚无法澄清这些因子的作用。
1989年鉴定了第一个内皮细胞选择性生长因子VEGF。此后所进行的研究证实了VEGF在正常和病理状态下血管生成过程中的重要性。这是在兔角膜和鸡绒膜尿囊这两种体内常规生血管模型中的强血管生成因子。VEGF也是已知的血管渗透性因子。这是一种34-36kDa的同型二聚体糖蛋白，它与肝素结合，其结构包括允许其被分泌的信号肽。编码VEGF的基因由8个外显子组成。通过可变剪接产生四种肽形式。它们分别包含人源121、165、189和206个氨基酸。
在成年人体内，VEGF在许多正常组织，特别是心脏和肺中得到表达。该表达并非必然地与明显的血管生成相关。VEGF的不同形式被确认为fms家族具有酪氨酸激酶活性的两个受体Flt-1受体和Flk-1受体。Flt-1受体(VEGFR)-1是高亲合力(10pM)受体。KDR受体或Flk-1受体或(VEGFR)-2是低亲合力(750pM)受体，其负责肽的促有丝分裂作用。VEGF表达的调控过程中最值得注意的一个方面是其在低血氧条件下的敏感性。业已表明，较短的低氧期通过体外培养细胞，特别是心肌细胞和平滑肌细胞刺激VEGF的表达。但是该因子在肺动脉高血压症的发展或预防中的作用还是未知的。
血管内皮生长因子家族还包括在本发明中可使用的其它分子，例如PIGF(胎盘生长因子)，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E。在血管内皮生长因子家族中VEGF和VEGF-B是本发明范围内特别优选的形式。
在成年人许多组织，特别是心脏，骨骼肌和胰脏中产生VEGF-B。通过可变剪接可以产生两种肽形式，并且分别包括167和186个氨基酸。VEGF-B刺激内皮细胞增生，但是不与VEGFR-2受体连接。
成纤维细胞生长因子(FGF)家族包括很多成员，迄今为止，至少14个成员得以鉴定(参见Birnbaum等，医药科学(Medecine et Science)13，p.392-396，1997)。虽然FGF-1和FGF-2形式在肺上皮细胞中和在肺中血管细胞中得到表达，但是，没有任何有关与肺动脉高血压症相关的这些因子的表达、这些因子诱导内皮细胞和肺平滑肌细胞增生的能力、这些因子在与不同的环境条件特别是低血氧条件相关的支气管或肺泡上皮细胞中表达的信息。
出人意料地，本申请人现在证明将编码血管生成因子的核酸转移到肺中能够以空前的效力减小肺动脉血管压力和预防与肺动脉高血压症相关的右心室肥厚。
为了研究血管生成因子在预防和治疗低血氧肺动脉高血压症中的效果，本申请人使用患有慢性低血氧症的大鼠作为模型。通过以气管内滴注施用的腺病毒类型重组载体实现编码血管生成因子的核酸的转移。得到的结果证明，这些血管生成因子，特别是VEGF-B或FGF-1，在肺中的表达使得肺动脉血管压力降低，预防右心室肥厚和改造肺动脉血管。因此，本发明首次提出一种有效治疗肺动脉高血压症的方法。
在可以用于本发明范围内的不同的血管生成因子中，尤其可以提到成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员，更特别地FGF-1，FGF-2，FGF-4和FGF-5，血管内皮生长因子，更特别地VEGF，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E和P.I.G.F(胎盘生长因子)以及血管生成素型因子(血管生成素1和血管生成素2)。
本发明的第一个目的涉及含有编码血管生成因子的核酸的载体在制备用于预防、缓解和/或治疗肺动脉高血压症的药物组合物方面的用途。
优选地，所述血管生成因子是选自FGF或VEGF或血管生成素家族的内皮细胞生长因子，或者是选自这些家族中至少一个家族的至少两个因子的组合。作为血管生成因子的有利组合的例子，特别可以提到至少FGF-1和VEGF的组合，至少FGF-1和VEGF-B的组合，至少FGF-1和血管生成素1的组合，至少VEGF和血管生成素1的组合，和至少VEGF-B和血管生成素1的组合。
根据特殊方式，所述内皮细胞生长因子选自FGF-1，FGF-2，FGF-4，FGF-5或者它们的变体。
根据另一种方式，所述内皮细胞生长因子选自VEGF，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E或者它们的变体。优选地，所述内皮细胞生长因子选自VEGF或VEGF-B。
本发明范围内，术语多肽或蛋白质的“变体”意指从多肽或蛋白质衍生的并且具有上述多肽或上述蛋白质的至少一种生物功能的任何类似物，片段，衍生物或突变体。可能存在自然状态的多肽或蛋白质的不同变体。这些变体可以是通过编码蛋白质的结构基因在核苷酸序列中的差异表征的等位基因变体，或者可以来自差别剪接或翻译后修饰。通过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加和/或修饰能够获得这些变体。通过本领域技术人员公知的任何技术能够实现这些修饰。
这些变体特别是对于它们的固定位点具有更大亲合力的分子、能够在体内表达改进的序列、对蛋白酶具有更大抗性的分子、具有更大治疗效果或更小副作用，或者任选地具有新生物性能的分子。
在FGF-1的优选变体中，可以更特别地提到FGF-1天然变体，例如专利US4868113中描述的并且具有154个氨基酸、140个氨基酸或134个氨基酸的形式。在VEGF优选变体中，可以提到VEGF121，VEGF165，VEGF189和VEGF206形式。VEGF-B优选变体中，可以提到VEGF186和VEGF167形式。作为更特别优选的变体实例，可以提到FGF-1(21-154)和VEGF165形式和VEGF186和VEGF167形式。
本发明范围中可使用的其它变体特别是其中一个或多个残基被取代的分子，通过缺失几乎不或完全不参与与被考虑的结合位点相互作用的或者表现出不期望的活性的区域而获得的衍生物，和与天然序列相比具有补充的残基例如像分泌信号和/或连接肽的衍生物。
在FGF-1情况下，有利地，编码血管生成因子的核苷酸序列还包含使指导感染细胞的分泌途径中合成的FGF-1的分泌信号，以便在胞外区室中更有效地释放合成的FGF-1并且能激活其受体。使用的分泌信号可以是异源甚至合成的分泌信号。作为例子，可以提到允许大量分泌FGF-1的人类β干扰素的分泌信号。
在本发明范围内使用的编码血管生成因子的DNA序列可以是cDNA、基因组DNA(gDNA)，或一种例如由其中插入一个或多个内含子的cDNA组成的杂合构建体。还可能涉及合成序列或半合成序列。特别有利地，使用cDNA或gDNA。特别地，使用gDNA在人的细胞中能更好地表达。
有利地，编码血管生成因子的序列处在能够使其在肺上皮细胞中表达的信号控制下。优选地，涉及异源表达信号，即与自然存在的负责血管生成因子表达的信号不同的信号。特别地，可以涉及负责其它蛋白质表达的序列，或者合成序列。特别地，可以涉及真核生物或病毒基因的启动子序列。例如，可以涉及来自人们希望感染的细胞基因组的启动子序列。同样地，可以涉及来自病毒基因组的启动子序列，其中包括使用的腺病毒。在这方面，例如可以列举ElA、MLP、CMV、LTR-RSV等启动子。另外，这些表达序列可以通过添加激活序列、调节序列或能够使组织特异性表达的序列进行修饰。事实上，特别有意义地，使用定向地或主要地在肺上皮细胞中呈现活性的表达信号，以便使DNA序列只是在载体有效地感染这些细胞时才表达，并且产生其效果；在这方面，可以例举细胞角蛋白18的基因的启动子。
将编码一个或多个血管生成因子的核酸导入载体。本发明范围内，术语“载体”意指能够将核酸转移到细胞宿主细胞，优选肺细胞，更优选肺上皮细胞中的任何工具。术语载体包括用于将核酸体内或离体转移到细胞中的病毒和非病毒载体。用于实施本发明的一类载体例如可以是质粒，粘粒，或者任何没有被病毒、噬菌体、人工染色体、重组病毒等壳体化的任何DNA。优选涉及质粒或重组病毒。
在质粒型载体中，可以提到任何克隆质粒和/或本领域技术人员已知的一般包括复制起点的表达质粒。也可以提到载有例如专利申请WO96/26270和WO97/10343中描述的改进的复制起点和/或选择性标记的质粒。
在重组病毒型载体中，优选可以提到腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、重组腺伴随病毒或SV40病毒。文献中大量描述了用于复制的这类缺损重组病毒型的构建体，和这些载体的感染性质(特别参见S.Baeck和K.L.March(1998)，Circul.Research，第82卷，第295-305页)，T.Shenk，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley等(1996)，腺病毒病毒及其复制(病毒学)，第211-2148页，EDS-Ravenspublishers/Philadelphia，P.Yeh和M.Perricaudet(1997)，FASEB第11卷，第615-623页。
用于实施本发明的特别优选的重组病毒是缺损型重组腺病毒。
所述腺病毒是尾部约36(千碱基)kb的双直链DNA病毒。存在不同的血清型，其结构和性质多少有点变化，但它们具有类似的遗传组构。更特别地，重组腺病毒可以是人源或动物源的。关于人源的腺病毒，优选地可以列举C组的腺病毒，特别是2(Ad2)、5(Ad5)、7(Ad7)或12(Ad12)类腺病毒。在动物源的不同腺病毒中，优选地可以列举犬源腺病毒，特别是所有CAV2腺病毒菌株[例如曼哈顿株或A26/61(ATCC VR-800)]。在这里引作参考文献的专利申请WO 94/26914中特别列举了其他动物源腺病毒。
腺病毒基因组特别地含有在每个端部的反向重复序列(ITR)、壳体化的序列(Psi)、早期基因和晚期基因。主要的早期基因包含在E1、E2、E3和E4区中。其中，E1区中所包含的基因对于病毒繁殖尤其是必不可少的。主要的晚期基因包含在L1至L5区中。Ad5腺病毒基因组被完全测序，并且可以由数据库得到(具体参见Genbank M73260)。同样地，部分，甚至全部其他腺病毒基因组(Ad2、Ad7、Ad12等)也都被测序。
为了利用它们作为重组载体，曾制备出由腺病毒衍生的带有不同治疗基因的不同构建体。在这些构建体的每一种中，该腺病毒被修饰，以便使其在感染细胞中不能复制。于是，在现有技术中描述的构建体是病毒复制必不可少的E1区的缺失腺病毒，异源DNA序列已插入该区中[Levrero等人，《基因》(Gene)101(1991)195；Gosh-Choudhury等人，《基因》50(1986)161]。另外，为了改善载体的性质，曾提出在腺病毒基因组中产生其他缺失或修饰。于是，曾在ts 125突变体中导入热敏点突变，这样能够使DNA链的72kDa蛋白失活(DBP)(Van derVliet等人，《病毒学杂志》(J.Virol.)，1975，15(2)348-354)。其他载体含有对复制和/或病毒繁殖必不可少的其他区，即E4区的缺失。事实上在调节晚期基因表达、在晚期核RNA的稳定性、在消退宿主细胞蛋白表达和在病毒DNA复制的效率方面都涉及E4区。其中E1和E4区缺失的腺病毒载体因此具有转录基底噪音，并且还具有非常低的病毒基因表达。这样一些载体例如在专利申请WO 94/28152、WO 95/02697、WO 96/22378中曾有描述。另外，还描述过在IVa2基因中带有修饰的载体(WO 96/10088)。
在一个本发明的优选实施方式中，重组腺病毒是C组的人腺病毒。更优选地，涉及Ad2或Ad5腺病毒。
有利地，在本发明范围内使用的重组腺病毒在其基因组的E1区中包含一处缺失。更优选地，它包含E1a和E1b区的一处缺失。作为实例，可以列举对核苷酸454-3328、386-3446或357-4020(参照Ad5基因组)产生不利影响的缺失。
根据另一个变通方式，在本发明范围内使用的重组腺病毒还包括其基因组E4区中的一处缺失。更特别地，在E4区中的缺失对整个开放可读框(phasesouvertes)产生不利影响。作为具体实例，可以列举缺失33466-35535或33093-35535。这里引作参考的专利申请WO 95/02697和WO 96/22378中描述了E4区中其它类型缺失。
包含编码血管生成因子的核酸的表达盒可以插入重组基因组的不同位点。该盒可以插入E1、E3或E4区，取代缺失的序列或添加。该盒还可以插入在产生病毒顺位必不可少的序列(ITR序列和壳体化序列)之外任何其他的位点。
在本发明的意义上，术语“表达盒”应当理解为是其可以插入载体中特定限制性位点的核酸，DNA片段；DNA片段除了含有编码RNA或有意义多肽的核苷酸序列外，还含有表达所述有意义序列必需的序列(增强子、启动子，聚腺苷酸化序列)。可以设想DNA片段和限制性位点用来保证在适用于转录和/或翻译的可读框内插入所述片段。
在壳体化细胞系中，即能够在重组腺病毒基因组中反式互补一个或多个缺损功能的细胞系，产生这些重组腺病毒。在本领域技术人员已知的壳体化的细胞系中，例如可以列举293细胞系，其中一部分腺病毒基因组被整合。更确切地，293细胞系是含有血清型5腺病毒基因组(Ad5)左端(约11-12％)的肾的人胚细胞系，包含左ITR、壳体化区、其中包括E1a和E1b的E1区、pIX蛋白编码区和一部分pIVa2蛋白编码区。这种细胞系能够与E1区缺损的，即没有全部或部分的E1区的重组腺病毒反式互补，还能够产生具有高效价的病毒原种。这种细胞系在允许的温度下(32℃)也能够产生还含有热敏突变E2的病毒原种。特别地基于A549人的肺癌细胞(WO94/28152)或基于人的成视网膜细胞(《人基因治疗》(Hum.Gen.Ther).(1996)215)，描述了能够与E1区互补的其他细胞系。另外，也描述了能够反式互补多个腺病毒功能的细胞系。特别地，可以列举互补E1和E4区的细胞系(Yeh等人，《病毒学杂志》(J.Virol.)，第70卷(1996)，第559-565页；《癌症基因治疗》(Cancer Gen.Ther.)2(1995)322；Krougliak等人，《人基因治疗》6(1995)1575)和E1和E2区互补的细胞系(WO94/28152、WO95/02697、WO95/27071)。
这些重组腺病毒通常是通过将病毒DNA导入壳体化的细胞系中，接着在约2或3天后溶解细胞得到的(腺病毒循环动力学是24-36小时)。为了实施该方法，导入的病毒DNA可以是完全的重组病毒基因组，该基因组任选地在细菌中(WO96/25506)或在酵母中(WO 95/03400)构建，在细胞中转染。还可能涉及感染壳体化细胞系所使用的重组病毒。病毒DNA还能够以每个都带有一部分重组病毒基因组和一个同源区的片段形式导入，在导入壳体化细胞中之后，它们能够通过在不同片段之间的同源重组重新构建重组病毒基因组在溶解细胞之后，重组病毒颗粒可以通过氯化铯梯度离心法分离。在被引入本发明作为参考文献的专利申请WO 98/00528中描述了另一种方法。
作为适用于实施本发明的载体的例子可以提到包含本发明中描述的编码人FGF-1或人VEGF-B的基因的重组腺病毒，或者包含MulhauserJ等人描述的编码人VEGF的165异构体的基因的重组腺病毒(复制缺损型重组腺病毒载体表达的VEGFl65体内诱导血管生成，Circ Rec.195；77-1077-1086)，提到的这两篇文献在本申请中引作参考文献。
本发明还涉及一种药物组合物，该组合物含有上述载体和生理学上可接受的赋形剂。可以配制本发明的药物组合物，使得通过口服、肠胃外、鼻内、动脉内、静脉内等途径给药。
优选地，所述药物组合物含有用于通过气管内、特别是通过滴注或者通过静脉内给药的制剂的药学可接受赋形剂。特别涉及无菌或等渗盐溶液(磷酸一钠，磷酸二钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙或氯化镁等，或者这些盐的混合物)、或干燥的组合物、特别是冻干物，根据情况通过加入无菌水或生理血清，使得能够构成用于气管内滴注的溶液。
可以根据不同的参数，特别是根据所用给药方式、待表达的基因、或寻求的表达时间选择滴注或注射所用的剂量。一般地，本发明重组病毒以104-1014pfu的剂量形式配制和给药，优选地是106-1010pfu。术语pfu(噬斑形成单位)相应于病毒溶液的感染能力，并可通过感染适当细胞培养物进行测量，是对感染细胞的斑点数的量度。病毒溶液中pfu值的测定技术已收集在文献中。
另外，本发明的组合物还可以含有化学或生物化学转移剂。术语“化学或生物化学转移剂”应当理解是促进核酸渗透到细胞中的任何(即除了重组病毒以外的)化合物。可以涉及阳离子非病毒剂，如阳离子脂类，肽，聚合物(聚乙烯亚胺，聚赖氨酸)，纳米粒子；或非阳离子非病毒剂，如非阳离子的脂质体，非阳离子的聚合物或纳米粒子。
根据优选方式，本发明的组合物含有缺损重组载体，该载体含有编码内皮细胞生长因子的基因，并且该组合物可配制成供气管内给药的形式。有利地，本发明的组合物含有104-1014pfu，优选地是106-1010pfu。
本发明还涉及适用于预防、缓解和/或治疗肺动脉高血压症的药物的制备方法，其特征在于将含有编码生长因子的核酸的重组载体与一种或多种相容并且药学上可接受的助剂混合。
本发明还涉及一种哺乳动物，特别是人的肺动脉高血压症的治疗方法，该方法包括施用有效量重组载体，该重组载体含有编码内皮细胞生长因子的核酸。
参照下面仅供说明而非限制性的实施例更详细地描述本发明。
图1根据Crouzet等人(PNAS，第94卷，第1414页，1997年)描述的方法，由pXL3208和pXL3215质粒开始获得经双重组生成的pXL3264质粒。pXL3264质粒含有E1和E3区缺失5型腺病毒基因组并且含有CMV-spFGF1-SV40表达盒。
图2代表pXL3179载体。pXL3179质粒是从pXL2774质粒(WO97/10343)衍生的载体，其中在来自人巨细胞病毒(hCMV IE)的早期区的启动子和SV40病毒(GenBank SVCG)的晚期区的聚腺苷酸化信号的控制下导入人成纤维细胞干扰素的信号肽和FGF-1(成纤维细胞生长因子)的cDNA的融合物的编码基因(sp-FGF-1，Jouanneau等，1991 PNAS882893-2897)。
图3代表pXL3636和pXL3637载体。这些载体的结构类似于pXL3208质粒，并且它们分别在sp-FGF-1的位置(pXL3208，图1)包含编码VEGF-B167(pXL3636)和VEGF-B186(pXL3637)的序列。
材料与方法分子生物学的一般技术分子生物学中使用的常规方法，例如质粒DNA的制备提取，根据氯化铯梯度的质粒DNA离心分离，用琼脂糖或丙烯酰胺凝胶进行的电泳法，通过电洗脱完成的DNA片段纯化，用酚或酚-氯仿提取蛋白，用乙醇或异丙醇在盐介质中沉淀DNA，在大肠杆菌中转化等，都是本领域技术人员熟知的，并且在文献具有充分描述[Maniatis T等人，“分子克隆，实验室手册”，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1982；Ausubel F.M.等人(编著)，“分子生物学的通用规程”，John Wiley &Sons，纽约，1987]。
关于连接，根据DNA片段的大小，在琼脂糖或丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离这些DNA片段，用苯酚或苯酚/氯仿混合物提取，在乙醇中沉淀，然后在根据供应商推荐的噬菌体T4(Biolabs)的DNA连接酶存在下培养。
根据供应商的说明书，用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段对凸出的5’端进行填平。在根据生产者建议使用的噬菌体T4(Biolabs)的DNA聚合酶存在下，破坏凸出的3’端。通过借助核酸酶S1进行的处理研究破坏凸出的5’端。
根据Taylor等人[《核酸研究》(Nucleic acid Res.)，13(1985)8749-8764]的研制的方法，使用Amersham提供的试剂盒，用合成的寡脱氧核苷酸在体外进行诱变。
根据生产者的说明书，使用“DNA热循环器”(Perkin Elmer Cetus)，采用所述的PCR技术进行DNA片段的酶促扩增[聚合酶催化的链反应，Saiki R.K.等人《科学》，230(1985)1350-1354；Mullis K.B.和Faloona F.A.，酶方法(《Meth.Enzym.》)，155(1987)335-350]。
采用Sanger等人研制的方法[美国国家科学院(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，74(1977)5463-5467]，使用Amersham提供的试剂盒，确认核苷酸序列。
实施例1表达FGF-1蛋白的重组腺病毒的构建该实施例描述包含编码FGF-1蛋白的基因的腺病毒载体的构建，该基因以操作方式与CMV启动子连接。
编码人FGF-1的人cDNA包含490碱基对，并且编码也被称为ECGFβ(β-内皮细胞生长因子)154个氨基酸的多肽。通过翻译后成熟机理存在两种从ECGFβ衍生的天然多肽，涉及酸性FGF(酸性FGF15-154aa)和ECGFα(α-内皮细胞生长因子；21-154aa)或FGF-1。
在后面描述的腺病毒中存在的FGF-1形式(sp-FGF-1)事实上是Jouanneau等(P.N.A.S.(1991)882893-2897)描述的FGF-1(21-154aa)和人β干扰素的信号肽的融合蛋白。
sp-FGF-1的表达处于巨细胞病毒的增强子/启动子(CMV，-522至+72核苷酸)的控制下(Boshart等人，1985《细胞》，41521-530)。SV40病毒的聚腺苷酸化位点(根据SV40基因组的2538-2759核苷酸，Genbank locus SV4CG)在晚期方向上被插入sp-FGF-1的cDNA的3’位。通过①巨细胞病毒的增强子/启动子，②sp-FGF-1的cDNA，③SV40病毒的聚腺苷酸化位点生成的整体在下面被称作FGF-1表达盒。
根据Crouzet等人(PNAS，第94卷，第1414页，1997年)描述的方法，通过在pXL3208质粒与pXL3215质粒之间同源重组构建腺病毒。pXL3215质粒含有腺病毒基因组，而它含有在E1区插入的RSV-LacZ盒。在图1中描述了这种构建的原理。由这种双重组产生的pXL3264质粒含有缺失E1和E3区的5型腺病毒基因组，并且含有CMV-spFGF1-SV40表达盒。通过FGF-1表达盒的测序证实了这种构建。
用293细胞系(ATCC CRL-1573)中的PacI消化的pXL3264的DNA经转染产生了AV1.0CMV-FGF1腺病毒。得到的病毒颗粒然后在此相同的细胞系由通过CsCl双梯度得到的病毒原种扩增。
这些病毒颗粒然后用于研究人spFGF1基因在C2C12细胞，小鼠成肌细胞(ATCC CRL-1772)或W162细胞中的表达(Weinberg D.H.和KetnerG.A.1983，PNAS805383-5386)。
感染至MOI增加为100-3000病毒颗粒(pv)/细胞或者在脂质转染胺试剂(Gibco-BRL)存在下用含有相同的FGF-1表达盒作为对照物的pXL3179质粒转染细胞之后对W162细胞进行RNA印迹。图2代表pXL3179质粒。
感染至MOI为100-3000之后对C2C12细胞进行蛋白质印迹，并且在48小时之后收集上清液。通过纯化的兔的抗-FGF1多克隆抗体随后通过与过氧化物酶缀合的山羊的抗兔抗体随后通过与过氧化物缀合的山羊的抗兔抗体揭示FGF1。然后通过化学发光物(ECL，Amersham)揭示过氧化物酶活性并且在Lumi-Imager(Roche diagnostics)上检测。
使用C2C12细胞培养上清液证实FGF表达形式是否是生物活性的。然后向NIH3T3细胞培养物加入该上清液的系列稀释液(1/200和1/50)。通过掺入放射性标记胸苷观察这些培养物的营养效果。
得到的全部结果证明AV1.0 CMV-FGF1腺病毒表达FGF-1的生物活性形式。
实施例2表达VEGF-B蛋白的重组腺病毒的构建该实施例描述包含编码VEGF-B蛋白的基因的腺病毒载体的构建，该基因以操作方式与CMV启动子连接。
存在两种人VEGF-B形式VEGF-B167和VEGF-B186，它们的相应核苷酸序列可以GenBank中编号HSU48801(VEGF-B167)和HSU43368(VEGF-B186)获得。
与用AV1.0-CMV-spFGF-1载体类似的方法，从载体pXL3636和pXL3637开始构建AV1.0-CMV-VEGF-B167和AV1.0-CMV-VEGF-B186(图3)。VEGF-B167或VEGF-B186的表达处于巨细胞病毒的增强子/启动子(CMV，-522至+72核苷酸)的控制下(Boshart等人，1985《细胞》Cell，41521-530)。SV40病毒的聚腺苷酸化位点(根据SV40基因组的2538-2759核苷酸，Genbank locus SV4CG)在晚期方向上被插入VEGF-B167或VEGF-B186的cDNA的3’位。
根据Crouzet等人(PNAS，第94卷，第1414页，1997年)描述的方法，通过在pXL3636质粒(VEGF-B167)和pXL3215质粒或pXL3637质粒(VEFG-B186)与pXL3215质粒之间同源重组构建了腺病毒。pXL3215质粒含有腺病毒基因组，而它含有在E1区中插入的RSV-LacZ盒。在图1中描述了这种构建的原理。
由这种双重组产生的质粒含有缺失E1和E3区的5型腺病毒基因组，并且或者含有CMV-VEGF-B167-SV40表达盒或者含有CMV-VEGF-B186-SV40表达盒。
通过采用在293细胞系(ATCC CRL-1573)中被PacI消化的双重组产生的质粒的转染产生了AV1.0-CMV-VEGF-B167和AV1.0-CMV-VEGF-B186腺病毒。得到的病毒颗粒然后在此相同细胞系中由通过CsCl双梯度得到的病毒原种扩增。
实施例3大鼠身上AV1.0CMV-FGF1的肺内转移该实施例描述了用上述AV1.0CMV-FGF1载体将编码人FGF-1的基因转移到大鼠体内。相同但不包含FGF-1表达盒的重组腺病毒(AV1.0CMV.Null)用作对照动物。
将一月龄(200-250克)的雄性Wistars大鼠随机分为两组。通过腹膜内注射氯胺酮(100毫克/千克)和甲苯噻嗪(2毫克/千克)的混合物将其麻醉之后，以108pfu的剂量(用PBS稀释，最终体积是150微升)气管内滴注AV1.0CMV-FGF1载体或者AV1.0CMV.Null对照载体。研究剂量-反应关系之后选择该剂量，包括支气管肺泡洗涤液中和动物血清中蛋白质FGF-1的ELISA剂量。给予病毒之后48小时，在正常气压条件下(F1ufrance橱，Cachan，法国)将大鼠暴露于低氧气体混合物(Fio2 10％)中15天。
实施例4大鼠体内AV1.0-CMV-VEGF-B167和AV1.0-CMV-VEGF-B186的肺内转移在和实施例3描述相同的条件下进行大鼠体内AV1.0-CMV-VEGF-B167和AV1.0-CMV-VEGF-B186的肺内转移。不包含VEGF-B表达盒的重组腺病毒(AV1.0CMV.Null)被用于对照动物体内。
实施例5大鼠体内编码人VEGF-B的基因的肺内转移效率的评价根据上述标准在低氧暴露15天之后进行评价。
a-采用支气管肺泡洗涤液中FGF-1蛋白的剂量(ELISA)评价翻译效率。
b-通过麻醉下心导管插入术血液动力学研究评价HTAP，并且测量肺动脉血压，全身动脉血压和心率。
c-通过计算Fulton指数评价右心室肥厚右心室重量/左心室重量+中隔。
d-研究肺组织学和组织形态学，并且评价肺动脉和肺泡和肺泡管肌化程度(直径＜200微米)。
2a-转导效率在低氧下暴露15天之后在动物支气管肺泡液(LBA)血清中进行人VEGF-B蛋白质ELISA测量。无论在何种应用条件下(存在或不存在低氧)对照动物的血清中均不存在VEGF-B因子。同样地，在由编码VEGF-B(167型或186型)的缺损重组腺病毒载体治疗的动物的LBA中VEGF-B的浓度为零。
2b-HTAP的评价通过麻醉下心导管插入术对血液动力学研究来评价HTAP，并且测量肺动脉血压，全身动脉血压和心率。
从暴露于低氧开始15天之后两组大鼠体重相同。用AV1.0-CMV-VEGF-B167或AV1.0-CMV-VEGF-B186治疗的大鼠具有与接受AdCMV.Null的大鼠相比明显地较低的肺动脉血压，而两组(处理组和对照组)之间全身动脉血压和心率没有明显不同。
这些结果证明，转移编码VEGF-B的基因非常有效地预防与低氧下相关联的动脉血压升高。
2c-右心室肥厚的评价通过右心室重量与左心室重量+中隔之比来评价右心室肥厚。
得到的结果证明，在接受AV1.0CMV.Null的大鼠体内，右心室肥厚与采用AV1.0-CMV-VEGF-B167或AV1.0-CMV-VEGF-B186治疗的大鼠相比明显地更为严重。
2d-肺的组织学研究肺的组织学研究证明，108pfu剂量下炎症病变非常有限不存在水肿和出血，不存在支气管或肺泡上皮损伤。经常可以观察到，无论以何种方式给药治疗都不存在巨噬细胞显性间质性肉芽肿。
根据下述两个标准对肺的组织形态学进行研究，(i)动脉长度规格化的动脉壁厚度的研究(动脉管直径＜200微米)，(ii)肺泡和肺泡管未被肌化、部分肌化或完全肌化的动脉的百分比的研究。
测定动脉壁厚度，得到的结果证明，在接受AV1.0CMV.VEGF-B载体的大鼠体内动脉长度规格化的动脉壁厚度与通过AV1.0CMV.Null治疗的大鼠相比明显地更薄。
测定肺泡和肺泡管未被肌化、部分肌化或完全肌化的动脉的百分比，并且得到的结果证明，在采用编码VEGF-B的缺损型重组腺病毒载体治疗的大鼠体内，肺泡和肺泡管中未被肌化的动脉的百分比均明显地更高。
这些结果清楚地证明，内皮细胞生长因子例如VEGF-B在肺中超表达具有预防低血氧HTAP发展的作用。
实施例6大鼠体内人FGF-1基因的肺内转移效率的评价根据上述标准在低氧暴露15天之后进行评价。
a-通过测定支气管肺泡洗涤液中FGF-1蛋白的剂量(ELISA)，评价转导效率。
b-通过麻醉下心导管插入术进行血液动力学研究评价HTAP，并且测量肺动脉血压，全身动脉血压和心率。
c-通过计算Fulton指数评价右心室肥厚右心室重量/左心室重量+中隔。
d-研究肺组织学和组织形态学，并且评价肺动脉中肺泡和肺泡管的肌化程度(直径＜200微米)。
所得结果证明，内皮细胞生长因子例如FGF-1在肺中超表达具有有效预防低血氧HTAP发展的作用。
权利要求
1.包含编码血管生成因子的核酸的载体在制备用于预防、缓解和/或治疗肺动脉高血压症的药物组合物中的用途。
2.权利要求1的用途，其特征在于所述血管生成因子是选自FGF或VEGF家族的内皮细胞生长因子。
3.权利要求2的用途，其特征在于所述内皮细胞生长因子选自FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-5或它们的变体。
4.权利要求2的用途，其特征在于所述内皮细胞生长因子选自VEGF、VEGF-B或VEGF-C或它们的变体。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其特征在于所述载体是质粒、粘粒或没有经病毒壳体化的任何DNA。
6.权利要求1-4中任一项的用途，其特征在于所述载体是重组病毒，优选从腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或腺伴随的病毒得到。
7.权利要求6的用途，其特征在于所述重组病毒是缺损型重组腺病毒。
8.权利要求6的用途，其特征在于包括制备用于通过气管内途径给药的含有104-1014pfu，优选106-1010pfu的药物组合物。
9.用于预防、缓解和/或治疗肺动脉高血压症的药物的制备方法，其特征在于将包含编码血管生成因子的核酸的重组载体与一种或多种相容的并且药学可接受的助剂混合。
10.含有包含编码血管生成因子的核酸的缺损型重组载体的药物组合物，其特征在于其是气管内给药的剂型。
11.权利要求10的药物组合物，其特征在于含有104-1014pfu，优选106-1010pfu。
全文摘要
本发明涉及包含编码血管生成因子的核酸的载体在预防、缓解和/或治疗肺动脉高血压症方面的用途。
文档编号A61K35/76GK1376197SQ0080652
公开日2002年10月23日 申请日期2000年4月21日 优先权日1999年4月26日
发明者S·阿诺特, D·布拉奈勒克 申请人:阿文蒂斯药物股份有限公司, 国家健康医学研究所