专利名称：用于促进神经细胞分化的含有环状甘油磷酸酯及其类似物的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有环状甘油磷酸酯及其类似物的药物组合物以及治疗与神经有关的疾病和病症的方法。
在生物学上最为重要的6元环状磷酸酯是环AMP。环AMP的环实际上1，3 cGP骨架的衍生物。在生物学系统中检测到的其它环状磷酸酯包括葡萄糖环状磷酸二酯(Leloir，1951)、2’，3’-环状磷酸二酯(Markham和Smith，1952)、核黄素-4’，5’-环状磷酸二酯(Forrest和Todd，1950)、肌醇-1，2-环状磷酸二酯(Dawson等，1971)和环状溶血磷脂酸(Friedman等，1996)。
除了被广泛研究的环AMP和环GMP外，到目前为止还没有提出关于其它生物学环状磷酸酯的具体的生物学活性。
有许多病症和疾病是由脑区域的退化和神经元的损失所引起的。所述疾病的一个例子是神经变性疾病如帕金森氏症(PD)。该疾病通常涉及产生多巴胺的神经元的变性。目前常用的治疗方法主要是用药物连续地刺激多巴胺受体，虽然该方法在开始时可以引起症状的缓解，但会逐渐失去效力。此外，这些药物也不能阻止这些疾病所特有的多巴胺神经元的进行性变性。
有许多生长因子例如神经生长因子(NGF)、基础成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子、脑衍生的生长因子和神经胶质衍生的神经营养因子(Knusel B.等，1990；Knusel等，1991；Linn等，1993)可以在体外刺激多巴胺能神经元的存活和分化。在涉及诱导帕金森氏症的动物模型中，当用GDNF(Tomac，A.等，1995)和睫状神经营养因子(CNTF)(Hagg，T.和Varon 1993)等因子进行治疗时，诱导的动物显示出行为的改善和酪氨酸羟化酶(TH)的增加，所述TH是多巴胺生成途径免疫反应性的关键酶。化合物及其缩写的列表在本说明书中，将下列化合物(其结构式如权利要求书之前的附录A中所示)用如下缩写表示1. 1，3环甘油磷酸酯-1，3 cGP2. 1，2环甘油磷酸酯-1，2 cGP3. 3-酰基1，2环甘油磷酸酯(环状溶血磷脂酸)-c-lysoPA4. 苯基1，3 cGP-P-1，3 cGP5. 苯基1，2 cGP-P-1，2 cGP6. 1，3环状丙二醇磷酸酯-1，3 cPP7. 1，2环状丙二醇磷酸酯-1，2 cPP8. 苯基1，3cPP-P-1，3 cPP9. 苯基1，2，环状丙二醇磷酸酯-P-1，2，cPP10. 环状二羟基丙酮磷酸酯-cDHAP11. 苯基环状二羟基丙酮磷酸酯-P-cDHAP术语表以下是上文中以及随后的说明书和权利要求书中所用术语的解释CG-本发明所用的环状甘油磷酸酯及其类似物。促进神经细胞分化-该术语涉及本发明所用的CG在与细胞接触后引起所述细胞成熟成为神经细胞的能力。该活性可以通过以下实施例中所述的体外和体内试验之一进行评估。体外试验的一个例子是使能够分化成神经细胞的细胞(例如PC 12细胞)在试验化合物的存在下生长并通过显微镜下评估来测定细胞内的神经分支。体内试验可以涉及，例如，将存在受损的多巴胺能神经元的动物用试验化合物治疗并测试运动和肢体震颤参数以及就地测定与所治疗动物的多巴胺能传导有关的分子。靶细胞-能够成熟成为神经细胞的任何细胞。该细胞的非限定性实例是PC 12和初级脑细胞。类似物-涉及从本发明的环状甘油磷酸酯之一衍生的并且基本保持了衍生前的环状磷酸酯的活性的任何化合物，包括，例如环状甘油磷酸酯的脱氧类似物和苯酯类似物，优选脱氧类似物。基本保持-该术语涉及类似物将衍生前的环状甘油磷酸酯所具有的活性实现到一定程度的能力。当活性为环状甘油磷酸酯的活性水平的30％或以上，优选50％或以上，更优选70％或以上，首选90％或以上时，可以认为类似物的活性是基本保持了。有效量-当本发明的方法是用于预防不希望的病症时，术语“有效量”应理解为是指在给药时可以防止所述病症出现的活性化合物的量。预防所述病症例如神经变性病症需要在疾病的任何症状出现之前，例如在发生疾病的高危险性个体中进行，或者当组合物是用于治疗神经损伤后所期望的神经拯救时。当组合物或方法是用于治疗进行性的不希望的病症时，术语“有效量”应理解为是指可以有效改善或预防所治疗的病症和相关症状加强的活性化合物的量。神经促进活性-该术语包括当与本发明所用的CG接触时可以在靶细胞内促进的各种与神经有关的活性。所述活性包括但不仅限于促进神经生长、在生病的大脑中提供多巴胺营养支持环境、防止神经变性和神经拯救。预防或治疗-根据本发明，术语“病症和疾病的预防”应理解为是指在存在发生所述病症和疾病的高危险因素的个体中降低所述病症和疾病出现的可能性、降低在所述病症和疾病出现时与所述病症和疾病有关之症状的程度或完全预防它的出现。
根据本发明，所述病症或疾病的治疗是指改善与病症或疾病有关的症状、降低所述症状的程度或完全消除所述症状。
因此，第一方面，本发明提供了用于促进靶细胞中的神经细胞分化的药物组合物，该组合物含有可药用载体以及作为活性成分的通式I的化合物 其中Y是-(CH2)m-、-CH(OH)-或-C(＝O)-，m是0-3；X是H、烷基、-CH2OH-、CH2O酰基或-CH2酰基；R是H、阳离子、烷基或选择性取代的芳基。
本文所用的术语“烷基”是指含有约1至约24个碳原子，例如，优选约3个碳原子至约20个碳原子，首选约5个碳原子至约15个碳原子的烷基；术语“酰基”是指脂肪族的饱和或不饱和C1-C24酰基，优选含有偶数碳原子的酰基，首选从天然脂肪酸衍生的酰基，例如选自乙酰基、丁酰基、己酰基、辛酰基、癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基和硬脂酰基的饱和脂肪族酰基，或选自棕榈油酰基、油酰基、亚油酰基和蓖麻油酰基的不饱和脂肪酸；术语“芳基”是指单或多个碳环的芳基，首选苯基，其选择性地被C1-C4烷基、卤素和/或羟基所取代。R可以是任何生理上适宜的阳离子，优选Na+。
在一个实施方案中，Y是-CH(OH)-，X是H，R是H或苯基。根据该实施方案，组合物含有1，3环甘油磷酸酯(1，3 cGP)或苯基1，3环甘油磷酸酯(P-1，3 cGP)。
在另一个实施方案中，Y是-C(＝O)-，X是H，R是H或苯基。根据该实施方案，组合物含有环状二羟基丙酮磷酸酯(cDHAP)或苯基环状二羟基丙酮磷酸酯(P-cDHAP)。
在又一个实施方案中，Y是-(CH2)m-，m是0，X是-CH2OH，R是H或苯基。根据该实施方案，组合物含有1，2环甘油磷酸酯(1，2 cGP)或苯基1，2环甘油磷酸酯(P-1，2 cGP)。
在又一个实施方案中，Y是-(CH2)m-，m是0，X是C1-C24烷基、优选-CH3，R是阳离子或苯基。根据该实施方案，组合物含有1，2环状丙二醇磷酸酯(1，2 cPP)或苯基1，2环状丙二醇磷酸酯(P-1，2cPP)。
在又一个实施方案中，Y是-(CH2)m-，m是1，X是C1-C24烷基、优选-CH3，R是阳离子或苯基。根据该实施方案，组合物含有1，3环状丙二醇磷酸酯(1，3 cPP)或苯基1，3环状丙二醇磷酸酯(P-1，3cPP)。
在又一个实施方案中，Y是-(CH2)m-，m是0，X是-CH2(C1-C24)酰基、优选油酰基，R是阳离子。根据该实施方案，组合物含有3-酰基-1，2环甘油磷酸酯(环状溶血磷脂酸-c-lyso PA)。
本发明所用的CG可以显示多种神经促进活性中的一种，包括但不仅限于促进神经元分支、促进神经生长、在大脑的生病区域提供多巴胺营养支持环境、防止神经变性和神经拯救。所有这些活性均落在神经促进活性的范围内。
因此，本发明还提供了用于促进神经活性的药物组合物，该组合物含有可药用载体和作为活性成分的上述通式I的化合物。
本发明的药物组合物促进神经细胞分化的能力以及在一种或多种上述途径中的神经元活性使得它们特别适用于治疗各种疾病。因此，本发明还提供了含有可药用载体和作为活性成分的上述通式I化合物的药物组合物，该组合物可用于预防或治疗可以通过促进神经细胞分化和/或神经活性进行预防或治疗的疾病。
所述疾病可以是精神疾病例如精神分裂症或痴呆，或是导致学习能力缺失的疾病。
此外，本发明的药物组合物还可用于治疗涉及多巴胺能神经细胞损伤的神经变性疾病。所述病症的例子是早老性痴呆(AD)或帕金森氏症(PD)。
包括在本发明范围内的其它神经变性疾病是，由于个体接触有害的环境因素例如危险的化学物质所引起的疾病、由于机械损伤(例如由于眼睛接触机械损伤性的外部因素所引起的眼神经的损伤)所引起的神经变性疾病等。
此外，已知在原发的神经变性后，存在于变性神经附近的其它神经会发生继发性变性。对患有原发性神经变性疾病的个体进行治疗可以预防或减少存在于变性神经附近的其它神经的继发性变性的出现。该治疗称为“神经拯救”，也包括在本发明的范围内。
又一方面，本发明提供了诱导促进靶细胞的神经细胞分化的方法，该方法包括，将所述靶细胞与有效量的上述通式I化合物接触适当的时间。
适当的时间是指能够使本发明的组合物产生其活性的时间。本领域技术人员很容易利用本文所述的方法确定对于各种组合物和靶细胞的适当的时间。通常，与某些已知的可以影响神经细胞的因子例如NGF相比，本发明所用的CG与靶细胞接触以产生其作用所需的时间非常短(几分钟)。
根据本发明的又一方面，提供了在个体中促进神经活性的方法，该方法包括，向有需要的个体施用有效量的上述通式I的化合物。
本发明还提供了预防或治疗可以通过促进神经细胞分化和/或神经活性进行预防或治疗的疾病的方法，该方法包括，向有需要的人施用治疗有效量的上述通式I的化合物。
本发明的方法可用于治疗其中上述作用是有益的各种病症和疾病，即，其中CG的作用是改善或减少所治疗病症或疾病的不希望的症状。这些病症和疾病可以是，例如(但不仅限于)精神疾病例如精神分裂症或痴呆、导致学习能力缺乏的疾病、神经变性疾病例如早老性痴呆或帕金森氏症，以及预防或治疗神经损伤后的神经拯救。
图2显示了在培养基中生长的(对照)(图2A)、用直链的α和β甘油磷酸酯(分别为图2B和2C)或环状甘油磷酸酯和类似物1，3cGP、苯基-1，3 cGP、1，2 cGP、1，3 cPP和苯基-1，3 cPP(分别为图2D-图2H)或用NGF(图2I)脉冲3小时的PC12细胞的照片。保温后，将细胞洗涤然后在生长培养基中生长，照片显示了在用各种因子处理7天后的细胞。仅在用上述环状甘油磷酸酯和类似物处理的PC12细胞中观察到了神经分支(图D-H)。
图3显示了用对照培养基(图3A)、αGP(图3B)、βGP(图3C)、浓度为0.5μM的各种CG1，3 cGP、苯基-1，3 cGP、1，2 cGP、1，3cPP和苯基-1，3 cPP(分别为图2D-图2H)和用NGF(图3I)处理7天后PC 12细胞的照片。在与α或βGP(分别为图3B和C)保温后均没有观察到神经分支，而在与各种CG一起保温的细胞中观察到了不同程度的神经分支(图3D-H)。在这些条件下，在与NGF一起保温的细胞中观察到了广泛的神经分支(图3I)。
图4显示了用对照培养基(4A)、50ng/ml NGF(4B)处理14天、用50ng/ml NGF处理7天然后洗涤并用不含NGF的生长培养基(4C)或2μM、4μM或6μM的1，3 cPP(分别为4D、4E和4F)处理7天的PC 12细胞的照片。
发明详述环状甘油磷酸酯可以通过酶降解磷脂来形成，该降解在大部分情况下会生成5或6元环的环状甘油磷酸酯。含有通过酶降解磷脂和通过合成形成的环状甘油磷酸酯的组合物均包括在本发明的范围内。具有不到5个或6个以上碳原子的环的CG也包括在该范围内。
本发明所用的环状甘油磷酸酯及其类似物通常可以通过本领域已知的用于合成磷酸酯的任何一种方法来合成。以下具体描述了用于制备本发明环状磷酸酯的具体方法(参见实施例)。
本发明的这些环状甘油磷酸酯的类似物也包括在本发明的范围内，这些类似物通常是1，3环状磷酸酯的脱氧类似物以及苯酯。这些类似物也可以通过酶方法或本领域已知的合成方法来制备。
除活性成分外，药物组合物还可含有本领域已知的各种载体。载体的性质取决于准备采用的给药形式以及组合物所应用的适应症。组合物还可含有多种添加的成分，例如稀释剂、润滑剂、粘合剂、防腐剂等。
本发明的组合物可以通过任何适宜的方式给药。优选的给药方式是静脉内、局部或口服，但有时也可以采用其它给药方式。
通常，本发明的药物组合物含有约1mg至约10mg活性成分/每公斤所治疗个体的体重。
虽然本发明的组合物通常只含有单一的CG，但有时也可以在组合物中含有或者共同给药两种或多种CG，这些CG于是可以以协同或加合的方式发挥作用来预防或治疗神经变性疾病。
本发明所用的CG可以以其异构体的形式使用(参见，例如构成附录A中所述的合成1，3 cGP的四种立体异构体)。对于不同的目的，其中的一种异构体可能比其它异构体更为优选。
根据本发明，可将CG以单剂量给药，或者在一段时间内反复给药。
还可以将本发明的组合物与其它治疗药物联合向所治疗的个体给药，例如，当所治疗的病症是神经变性疾病时，可将组合物与目前治疗神经变性疾病所用的药物例如多巴胺受体兴奋剂、L-多巴一起或与生长因子例如NGF一起给药。在所述联合治疗中，可将CG与其它治疗药物同时或以不同的时间给药，以产生最大的预防或治疗作用。
当原料化合物中含有一个或多个羟基时，即Y是-CH(OH)-和/或X是-CH2OH-时，必需对这些羟基进行保护，例如通过苄基化进行保护，然后在环化之后通过常规的催化氢化在适宜催化剂例如Pt或Pd的存在下将苄基除去。
反应在无水溶剂例如二氧六环或二氯甲烷中、在等量亲核试剂例如吡啶或三乙胺的存在下进行。当R不是芳基时，终产物通常以盐的形式得到。
以下将说明一系列已知的和新的5和6元环的环状磷酸酯的合成。实施例11，3环甘油磷酸酯(1，3 cGP)的合成基本按照Buchnea(Buchnea，1973)所述的方法进行。简单地讲，将2-苄氧基-1，3-丙二醇(Aldrich)与等摩尔量的三氯氧磷(Aldrich)在二氯甲烷中反应。将形成的2-苄基-1，3 cGP在钯黑的催化下用氢气在甲醇中处理除去苄基残基。以钡盐的形式分离得到1，3 cGP，其在纸色谱上是纯净的(正丙醇∶氨∶水6∶3∶1，Rf＝0.52)。
1，3 cGP还可以通过将磷脂酰甘油(PG)用磷脂酶C按照文献中的描述(Shinitzky等，1993)裂解来制备。纸色谱表明该产物含有约10-20％的α-GP。实施例21，2环甘油磷酸酯(1，2 cGP)的合成该化合物按照文献中的描述(Kugel，L.和Halmann，M.，J.Am.Chem. Soc.，894125-4128(1967)制备。将β-甘油磷酸酯的二钠盐(Sigma)先转化成酸的形式，然后用二环己基碳二亚胺(A1drich)环化。以钡盐的形式分离得到产物，其在纸色谱上是纯净的。实施例3苯基1，3环状甘油磷酸酯(P-1，3 cGP)的合成按照实施例1所述的制备1，3 cGP的方法，将2-苄氧基-1，3-丙二醇与苯基二氯代磷酸酯(Aldrich)反应。苄基化的中间体产物在薄层色谱(乙酸乙酯∶己烷3∶2 Rf＝0.58)上是纯净的，熔点136℃。将其按照实施例1所述进行氢化选择性地除去苄基残基。所得到的P-1，3 cGP(化合物III)在薄层色谱(同上)上是纯净的，Rf＝0.15，熔点为116℃。实施例41，3环状丙二醇磷酸酯(1，3 cPP)的合成1，3 cPP通过将1，3-丙二醇(Aldrich)与等摩尔量的三氯氧磷反应然后按照Buwalda等，1997的描述进行纯化制得。以游离酸的形式分离得到产物(熔点99-100℃)。
32P标记的1，3 cPP(1，3 cP32P)用32POCl3制得。后者通过将少量H332PO4(Amersham)引入到过量的冷的POCl3中制得(Neuhaus和Korkes，1958)。然后将反应在微量水平上进行，并通过与未标记的1，3 cPP一起共结晶分离出1，3 cP32P。实施例51，2环状丙二醇磷酸酯(1，2 cPP)的合成1，2 cPP通过与实施例4相同的方法制备，但使用的是1，2-丙二醇(Aldrich)。该化合物以钡盐的形式分离得到，其在纸色谱上(正丙醇∶氨∶水6∶3∶1，Rf＝0.55)是纯净的。实施例6苯基1，3环状丙二醇磷酸酯(P-1，3 cPP)的合成P-1，3 cPP按照与实施例4类似的方法，通过将1，3-丙二醇与等摩尔量的苯基二氯代磷酸酯在无水吡啶中反应进行制备。将产物用乙酸乙酯-己烷结晶两次，熔点为72℃。实施例7苯基1，2环状甘油磷酸酯(P-1，2 cGP)的合成该新化合物按照实施例3的方法通过将1-苄氧基-2，3-丙二醇与苯基-PO2Cl2反应然后通过选择性地氢化除去苄基残基制得。用乙醇-丙酮进行结晶，产物的熔点为95℃。实施例8苯基1，2环状丙二醇磷酸酯(P-1，2 cPP)的合成该新化合物按照实施例6的方法通过将1，2-丙二醇与等摩尔量的苯基-PO2Cl2在干燥吡啶反应制得。用乙酸乙酯-己烷进行结晶，产物的熔点为69℃。实施例9环状二羟基丙酮磷酸酯(cDHAP)的合成该新化合物通过将POCl3与二羟基丙酮反应制得。
将1.8g(0.01M二聚体或0.02M单体)二羟基丙酮二聚体MW-180溶于20mL新蒸馏的二氯甲烷。
于室温下向溶液中缓慢加入3.07g＝1.87mL(0.02M)磷酰氯(MW-153.5，d-1.645)的4mL MeCl2溶液。将溶液回流15小时(溶液为黑色)。蒸除二氯甲烷然后向溶液中加入100mL 90％丙酮/水。将反应混合物回流18小时。将黑色的溶液用活性碳在室温下处理然后过滤。从得到的浅黄色溶液中蒸除丙酮和水，将非常细的结晶残余物溶于10mL丙酮。向溶液中加入0.01M BaJ2的80mL丙酮溶液，开始析出环状二羟基丙酮磷酸酯钡盐的细的结晶。将沉淀用少量丙酮洗涤3次然后干燥。将产物溶于少量水中然后用丙酮沉淀进行纯化。得到的产物为白色结晶状粉末，在纸色谱中(溶剂混合物∶正丙醇∶NH4H2O 6∶3∶1)Rf-0.50。实施例10苯基环状二羟基丙酮磷酸酯(P-cDHAP)的合成该新化合物通过将苯基-PO2Cl2与二羟基丙酮在干燥吡啶中反应制得。真空蒸除溶剂后，将残余物用乙酸乙酯萃取两次。蒸除乙酸乙酯后得到油状残余物。实施例11环状油酰基溶血磷脂酸(c-lysoPA)的合成该新化合物通过将油酰基溶血磷脂酸(Avanti Polar Lipids)与过量的二环己基碳二亚胺(DCC)在二甲亚砜中反应制得。产物呈油状。生物学部分材料和方法无限增殖PC 12细胞系是在神经元分化中研究得最多的一种细胞系。在神经生长因子的存在下，这些细胞可以分化成神经元细胞。使来源于大鼠嗜铬细胞瘤的PC 12细胞以单层的形式在补充有10％胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和5mM谷酰胺的Eagle’s培养基(EM)中在用5％CO2缓冲的潮湿恒温箱中于37℃下生长。每隔4天更换一次培养基，细胞每隔8天传代一次并形成融合的单层(在10cm的平皿中1.5×106个细胞，或在24孔板中每孔105个细胞)。PC 12细胞最初是圆形的细胞，在神经生长因子(NGF)的存在下经数天成为神经。在撤走NGF后，神经开始回缩并开始在细胞中发生细胞凋亡。在大鼠中诱导PD将Sprague-Dawley(SD)大鼠(重量230-250g)用氯胺酮加赛拉嗪腹膜内给药进行麻醉，然后将它们的头固定在立体定位架上。然后向中前脑束内注射6OH-DA(8mg/4mL)以单侧地破坏多巴胺能末梢(Fitoussi，N.等神经科学(Neuroscience)，85(2)405-413)(1998))。疾病的症状在2-3周内出现。
用旋转计量试验在行为上评估多巴胺能的切除，这是基于在受损伤一侧多巴胺受体的向上调节。全身性给药DA激动剂(阿朴吗啡，0.25mg/kg，皮下)可以引起单侧多巴胺能切除的大鼠的旋转，旋转方向朝向受损伤一侧的对侧。向大脑内给药环状甘油磷酸酯及其类似物用ALZET渗透泵(ALZET Corporation，Palo Alto，CA)将环状磷酸酯给药到大脑内。在评估了黑质纹状体损伤(旋转行为)后，用立体定位装置将一个插管(30号)插入到大鼠SN内侧0.5mm处。以1μl/小时的速率微量输注环状磷酸酯3或14天。大脑解剖和提取将大鼠斩首并迅速取出它们的大脑。然后将大脑置于放置在冰上的大鼠大脑模子中，切下0.5mm的连续部分然后置于冰冷的显微镜载物片上。迅速用内径为1.1mm的不锈钢套管按照如下坐标进行组织钻孔纹状体，A1.5-2.0mm；SN，P5.5-5.0mm，包括大部分所需的区域。将组织样品立即在液氮中冷冻并在-70℃下保存直到提取。提取通过将钻出的组织融化然后将其在置于冰上的含有EDTA/乙醇(0.021％)的0.5mL高氯酸盐溶液(0.1M)中进行探针超声(80瓦，5秒，带有Sonifier B-12；Branson，Danbury，CN)来完成。取样(100μl)进行蛋白质分析，剩余物进行离心(2000xg，10分钟，4℃)，将得到的上清液(组织提取液)过滤(0.45μm Acrodisk，Gelman；Ann.Arbor. Ml)然后于-70℃下存放直至进行ELISA分析来测定ILS或GDNF或进行HPLC分析来测定5-HT和5-HIAA含量。GDNF的评估按照如下描述测定环状甘油磷酸酯对于SVG细胞和脑组织提取液生成和释放GDNF的影响。将细胞在含或不含环状磷酸酯的条件下保温12、24和48小时。离心后取出上清液并用ELISA试剂盒(ENDOGEN，MA，USA和PROMEGA，Madison，USA)分析GDNF。RNA的分离用Tri ReagentTM(Boehringer Mannheim，德国)从培养的细胞或组织提取液中分离总RNA。将细胞在试剂中溶解(106细胞/1mL试剂)。用玻璃聚四氟乙烯棒将冷冻的组织钻取物用试剂匀化(50mg组织/1mL)。然后加入氯仿并通过离心将组织匀浆分成三相。小心地取出水相，防止破坏中间相或有机相，以避免基因组DNA污染。通过加入异丙醇使RNA从水相中析出沉淀，用乙醇洗涤然后溶于用DEPC处理的水中。将RNA在260nm和280nm下进行分光光度检测，在使用前于-80℃下存放。
在含有3μg总RNA、10mM引物dT(Boehringer Mannheim，德国)和1mM dNTP mix(Boehringer Mannheim，德国)的体积为20μl的反应中完成cDNA第一链的合成。于65℃加热2分钟并冷却至4℃后，加入50单位M-MuLV逆转录酶和20单位RNAse抑制剂(Boehringer Mannheim，德国)引发反应。然后将混合物升温至37℃60分钟。在50μl的反应体积中完成cDNA的PCR。将cDNA第一链(2μl)加入到含有如下组分的PCR混合物中0.2mM dNTP mix(Boehringer Mannheim，德国)，1mM的各种寡核苷酸引物(引物按照公开的GDNF cDNA序列设计。5’-TCACCAGATAAACAAATGGC-3’{5’}和5’-TACATCCACACCTTTTAGCG-3’{3’}分别对应于碱基81-101和460-480)(Biosource，CA，USA)和2.5U Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)。将反应液用矿物油覆盖，然后于94℃变性2分钟。用设定了40次循环的MJ Research热循环控制装置进行PCR，所述循环包括于94℃变性1分钟，然后于55℃进行引物退火1分钟和于72℃进行引物延伸1分钟。在40次循环结束时，将反应混合物于72℃保持10分钟。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶(含有溴化乙锭)上进行电泳分析。大脑中存活的细胞的免疫化学评估在实验结束时，将动物用氯胺酮和赛拉嗪进行腹膜内麻醉，然后通过心脏穿刺用依次用PBS和4％低聚甲醛进行灌注。然后取出大脑并在4％低聚甲醛中后固定24小时，然后转移到20％蔗糖中48小时。
用低温恒温器制得35μm的组织切片然后置于PBS中的24孔板中。将切片与抗酪氨酸羟化酶(TH)的初级兔多克隆抗体(Chemicon，CA，USA)或抗神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的初级小鼠单克隆抗体(Chemicon，CA，USA)一起于4℃下保温过夜。然后将切片用PBS洗涤，与HRP结合的次级抗体(绵羊抗兔或抗小鼠)(Chemicon，CA，USA)一起保温然后用PBS洗涤。然后将切片与产色的二氨基联苯胺(DAB)一起保温，用苏木精进行复染色，然后通过光学显微镜进行拍摄。对TH的阳性染色显示了纹状体和黑质中多巴胺能细胞的量，即多巴胺能细胞的存活率。对注射道内GFAP的阳性染色显示了神经胶质瘤进程。微透析微透析技术需要在活大鼠的脑内植入小(500μm直径)的探针。按照如下描述对大鼠进行植入。将大鼠用戊巴比妥麻醉，置于立体定位装置中，按照立体定位的坐标用钻孔器在其头盖骨上钻孔，然后将市售的微透析探针(CMA/10探针，3mm长，20kD截止值；CarnegieMedicine，West lafayette，IN)插入到纹状体内。通过探针缓慢地(1μl/分钟)灌注人工脑脊液(CSF；145mM NaCl，1.2mM CaCl2，2.7mM KCl，1.0mM MgCl2，pH7.4)。小分子将在人工CSF和脑组织的细胞外液之间扩散。使大鼠恢复20-24小时，然后从微透析探针的流出物中收集透析液。在基线和通过探针给药DA拮抗剂的过程中，将透析液(在30分钟的间隔内收集30μl)收集在含有15μl EDTA-乙醇(0.02/1％)作为防腐剂的聚乙烯试管内。将收集的透析液于-70℃下存放直至进行HPLC分析。组织提取液和微透析液中单胺和代谢物的分析将冷冻的组织提取液和微透析液融化，然后直接注射到与氧化电位为0.70至0.78V的电化学检测器(460型；Waters；Milford，MA)相连的HPLC仪(Altex Ion Pair Ultrasphere C18，4.6mm内径250mm柱号235335)中。流动相由2升水、0.55g 1-庚烷磺酸、0.2g EDTA、16mL三乙胺、12mL 85％磷酸和80mL乙腈组成，流速为0.8ml/分钟。将各样品进行HPLC，通过该方法测定DA及其代谢物二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香兰酸(HVA)的水平。结果
B组-浓度为50ng/ml的神经生长因子(NGF)。
C组-浓度为1μM的1，3 cGP。
监测上述培养基中神经元的生长速率并通过显微照片进行记录。如
图1所示，虽然在α甘油磷酸酯存在下的细胞生长不能促进细胞内的神经分支(图1A)，但在NGF(图1B)或1，3 cGP(图1C)存在下生长的细胞中清楚地看到了神经分支。
如图2所示，在上述条件下，仅在与上述CG一起保温的细胞中观察到了神经分支(图2D-2H)。在与直链甘油磷酸酯一起保温细胞中没有发现神经分支(图2B和C)，在上述条件下，NGF也不能促进任何神经再生(图2I)。
如图3所示，在与各种上述CG一起保温的细胞(图3B-3H)以及在NGF的存在下生长的细胞(图3I)中观察到了神经分支，但在与直链甘油磷酸酯一起生长的对照细胞中没有观察到神经分支(图3A)。
然后通过局部、口服或按照以上描述用渗透泵直接注射到脑内进行给药将大鼠用α和β直链GP或用CG进行治疗。
通过用微透析技术和上述方法评估L-DOPA、多巴胺(DA)、多巴胺代谢物DOPAC和HVA以及生长因子GDNF的原位生成来评估直链GP和CG的作用。还在用上述各因子治疗的大鼠中定量评估了运动和肢体震颤参数。
如图4A所示，当PC 12细胞在不含添加剂的生长培养基中生长时，不能观察到神经元的伸展(对照)。细胞在NGF(50ng/mL)的存在下生长整整14天可以观察完整的神经元分化(参见图4B)。如图4C所示，当细胞先在NGF(50ng/mL)的存在下生长7天然后再在不含NGF的条件下生长7天时，观察到了彻底的神经回缩，细胞的分化水平也回到了对照的水平。当PC 12细胞先在NGF(50ng/mL)的存在下生长7天然后再与2μM、4μM或6μM的1，3 cPP一起生长7天时(图4D、4E和4F)，可以观察到对回缩的神经元网络(该神经元网络是在与NGF一起保温的最初7天内形成的)的部分至完全的拯救。附录A
权利要求
1.用于在靶细胞中促进神经细胞分化的药物组合物，该组合物含有可药用载体和作为活性成分的通式I的化合物 其中Y是-(CH2)m-、-CH(OH)-或-C(＝O)-，m是0-3；X是H、烷基、-CH2OH-、CH2O酰基或-CH2酰基；R是H、阳离子、烷基或选择性取代的芳基。
2.用于促进神经活性的药物组合物，该组合物含有可药用载体和作为活性成分的权利要求1的通式I化合物。
3.权利要求2的药物组合物，其中所述的神经活性选自促进神经元分枝、促进神经生长、在大脑的发病部位提供多巴胺营养支持环境、防止神经变性和神经拯救。
4.用于预防或治疗可以通过促进神经细胞分化和/或神经活性进行预防或治疗的病症和疾病的药物组合物，该组合物含有可药用载体以及作为活性成分的权利要求1的通式I化合物。
5.权利要求4的药物组合物，其中所述的病症和疾病是精神病。
6.权利要求5的药物组合物，其中所述的精神病是精神分裂症或痴呆。
7.权利要求5的药物组合物，其中所述的精神病是学习能力缺陷。
8.权利要求4的药物组合物，用于治疗涉及多巴胺能神经细胞损伤的神经变性疾病。
9.权利要求8的药物组合物，其中所述的神经变性疾病是早老性痴呆。
10.权利要求8的药物组合物，其中所述的神经变性疾病是帕金森氏病。
11.权利要求4的药物组合物，其中所述的病症和疾病是由于接触有害的环境因素或由于机械损伤所引起的。
12.权利要求4的药物组合物，用于治疗神经损伤后的神经拯救。
13.权利要求1-12中任意一项所述的药物组合物，其中的活性成分是选自下列的式I化合物i.1，3环甘油磷酸酯-1，3cGP；ii.1，2环甘油磷酸酯-1，2cGP；iii.3-酰基1，2环甘油磷酸酯(环状溶血磷脂酸)-c-lysoPA；iv.苯基1，3cGP-P-1，3cGP；v.苯基1，2cGP-P-1，2cGP；vi.1，3环状丙二醇磷酸酯-1，3cPP；vii.1，2环状丙二醇磷酸酯-1，2cPP；viii.苯基1，3cPP-P-1，3cPP；ix.苯基1，2，环状丙二醇磷酸酯-P-1，2，cPP；x.环状二羟基丙酮磷酸酯-cDHAP；和xi.苯基环状二羟基丙酮磷酸酯-P-cDHAP。
14.诱导促进靶细胞的神经细胞分化的方法，该方法包括，将所述靶细胞与有效量的权利要求1的通式I化合物接触适当的时间。
15.在个体中促进神经活性的方法，该方法包括，向有需要的个体施用有效量的权利要求1的通式I化合物。
16.权利要求15的方法，其中所述的神经活性选自促进神经元分支、促进神经生长、在大脑的生病区域提供多巴胺营养支持环境、防止神经变性和神经拯救。
17.预防或治疗可以通过促进神经细胞分化和/或神经活性进行预防或治疗的病症和疾病的方法，该方法包括，向有需要的人施用治疗有效量的权利要求1的通式I化合物。
18.权利要求17的方法，其中所述的病症和疾病是精神上的障碍或疾病。
19.权利要求18的方法，其中所述的精神上的障碍或疾病是精神分裂症或痴呆。
20.权利要求18的方法，其中所述的精神障碍是学习能力缺失。
21.权利要求17的方法，其中所述的病症和疾病是神经变性病症或疾病。
22.权利要求21的方法，其中所述的神经变性病症或疾病是早老性痴呆或帕金森氏症。
23.权利要求17的方法，其中所述的病症或疾病是由于个体接触有害的环境因素或由于机械损伤所引起的。
24.权利要求15的方法，用于治疗神经损伤后的神经拯救。
25.通式I化合物在制备用于促进神经细胞分化的药物组合物中的用途 其中Y是-(CH2)m-、-CH(OH)-或-C(＝O)-，m是0-3；X是H、烷基、-CH2OH-、CH2O酰基或-CH2酰基；R是H、阳离子、烷基或选择性取代的芳基。
26.通式I化合物在制备用于促进神经活性的药物组合物中的用途 其中Y是-(CH2)m-、-CH(OH)-或-C(＝O)-，m是0-3；X是H、烷基、-CH2OH-、CH2O酰基或-CH2酰基；R是H、阳离子、烷基或选择性取代的芳基。
27.权利要求26的用途，其中所述的神经活性选自促进神经元分支、促进神经生长、在大脑的生病区域提供多巴胺营养支持环境、防止神经变性和神经拯救。
28.权利要求25的用途，用于预防或治疗可以通过促进神经细胞分化和/或神经活性进行预防或治疗的病症和疾病。
29.权利要求28的用途，其中所述的病症和疾病是精神上的障碍或疾病。
30.权利要求29的用途，其中所述的精神上的障碍或疾病是精神分裂症或痴呆。
31.权利要求29的用途，其中所述的精神障碍是学习能力缺失。
32.权利要求28的用途，其中所述的病症和疾病是神经变性病症或疾病。
33.权利要求32的用途，其中所述的神经变性病症或疾病是早老性痴呆或帕金森氏症。
34.权利要求28的用途，其中所述的病症或疾病是由于个体接触有害的环境因素或由于机械损伤所引起的。
35.权利要求27的用途，用于神经损伤后的神经拯救。
全文摘要
证实了环状甘油磷酸酯及其类似物(CG)可以在靶细胞中显示神经促进活性。所述活性包括促进神经元分支、促进神经生长、在大脑的生病区域提供多巴胺营养支持环境、防止神经变性和神经拯救。CG的这些活性使得它们可用于治疗各种病症,包括但不仅限于精神障碍,例如精神分裂症、痴呆或导致学习能力缺失的障碍。此外,这些CG还可用于治疗神经变性疾病,例如早老性痴呆、帕金森氏症、由于接触有害的环境因素或由于机械损伤所引起的病症。CG还可用于对患有原发性神经变性疾病的个体进行治疗以预防或减少其它神经的继发性变性的出现(“神经拯救”)。
文档编号A61P25/28GK1348375SQ00806738
公开日2002年5月8日 申请日期2000年3月24日 优先权日1999年3月25日
发明者M·辛尼茨基 申请人:耶达研究与开发有限公司