专利名称：溶钙化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗与骨或矿物质体内平衡异常有关的各种疾病，包括但不限于甲状旁腺机能减退、骨肉瘤、牙周病、骨折愈合、骨关节炎、类风湿性关节炎、佩吉特氏病和骨质疏松症。本发明的方法涉及钙受体的口服活性拮抗剂与抗吸收剂的共同给药。
在哺乳动物中，细胞外Ca2+处在严密的体内平衡控制之下，调节各种过程，例如血液凝结、神经与肌肉应激性和细胞功能。细胞外Ca2+抑制甲状旁腺细胞分泌甲状旁腺激素(PTH)，抑制破骨细胞的骨吸收作用，以及刺激甲状腺C细胞分泌降钙素。钙受体蛋白能够使某些特定的细胞迅速响应于细胞外Ca2+浓度的变化。
PTH是调节血液和细胞外液中的Ca2+体内平衡的首要内分泌因子。通过作用于骨与肾细胞，PTH增加血液中的Ca2+水平。这种细胞外Ca2+的增加充当一种负反馈信号，降低PTH的分泌。细胞外Ca2+与PTH分泌的互反关系构成保持机体Ca2+体内平衡的重要机理。
细胞外Ca2+直接作用于甲状旁腺细胞，调节PTH的分泌。已经确认，甲状旁腺细胞表面蛋白的存在可检测细胞外Ca2+的变化。参见Brown等《自然》366574，1993。在甲状旁腺细胞中，这种蛋白质、即钙受体充当细胞外Ca2+的受体，检测细胞外Ca2+离子浓度的变化，引发功能性细胞应答、即PTH分泌。
细胞外Ca2+影响各种细胞功能，参见Nemeth等《细胞与钙》11319，1990。例如，细胞外Ca2+在滤泡旁细胞(C细胞)和甲状旁腺细胞中起到一定作用。参见Nemeth等《细胞与钙》11323，1990。还研究了细胞外Ca2+对破骨细胞的作用。参见Zaidi《生物科学报道》10493，1990。
已知有各种化合物模拟细胞外Ca2+对钙受体的作用。溶钙剂(calcilytics)是能够拮抗钙受体活性的化合物，由此导致一种或多种由细胞外Ca2+唤引的钙受体活性降低。溶钙剂在对Ca2+受体有活性的钙受体调制剂的探索、研制、设计、修饰和/或构建中可用作前导分子。这类溶钙剂可用于各种以一种或多种组分水平异常为特征的疾病状态的治疗，这些组分例如多肽如激素、酶或生长因子，其表达和/或分泌受一种或多种Ca2+受体活性的调节或影响。溶钙化合物的靶疾病或障碍包括一些涉及骨与矿物质代谢异常的疾病。
钙体内平衡是以一种或多种下列活性异常为特征的血清钙的异常增加或减少；钙的尿排泄的异常增加或减少；骨钙水平的异常增加或减少(例如，正如骨矿物质密度测量所评估的)；饮食钙的异常吸收；影响血清钙水平的信使、例如PTH和降钙素的产生和/或释放的异常增加或减少；和由影响血清钙水平的信使引起的应答的异常改变。
因而，钙受体拮抗剂为与骨或矿物质体内平衡异常有关的疾病的药物治疗提供了独特的方法，这些疾病例如甲状旁腺机能减退、骨肉瘤、牙周病、骨折愈合、骨关节炎、类风湿性关节炎、佩吉特氏病和骨质疏松症。
众所周知的是例如在甲状旁腺机能亢进中所见到的PTH的慢性升高引起破骨细胞介导的骨损失和骨组织学异常。Dobnig和Tumer《内分泌学》Vol.138，pp.4607-4612(1997)显示，大剂量PTH皮下输注(40和80μg/kg/天)2小时或以上，引起体重迅速下降、血钙过多和骨骼组织学异常，这与在甲状旁腺机能亢进中所见到的变化是一致的。该文献指出，尽管PTH的间歇给药在进行骨生成中是可取的，不过如果PTH升高太长时间，那么骨吸收也升高了。这种PTH升高持续时间上的局限限制了可能用于拮抗钙受体的化合物的选择。
因此，在工业中存在对能够利用钙受体拮抗剂的疗法的需要，该拮抗剂可能引起瞬间PTH升高，而不引起文献所证实的伴发吸收问题。
进一步对这样一种疗法存在需要，它导致较低程度的PTH升高，同时具有与目前可利用的治疗相同的有益效果。
发明概述本发明提供治疗与骨或矿物质体内平衡异常有关的各种疾病的新颖的方法，包括但不限于甲状旁腺机能减退、骨肉瘤、牙周病、骨折愈合、骨关节炎、类风湿性关节炎、佩吉特氏病和骨质疏松症。
本发明的方法涉及溶钙剂与抗吸收剂对需要治疗的患者的共同给药。本发明溶钙剂包括可以导致长时间PTH升高的试剂。优选地，本发明试剂导致PTH的瞬间升高。
附图的详细说明
图1描绘按照研究1用溶钙剂或PTH处理后骨质减少大鼠近节胫骨BMD。
七月龄大鼠是卵巢切除的(ovx)，使其发展成骨质减少达两个月。假手术的大鼠用载体处理(◇)，ovx大鼠用载体(○)、NPS 2143 100μmol/kg p.o.(□)或大鼠PTH l-345μg/kg s.c.(△)处理。在所示时间点测量BMD。统计学显著性表示为*P＜0.05；**P＜0.01。
图2描绘按照研究1用溶钙剂或大鼠PTH处理的骨质减少大鼠的血浆PTH水平。
用溶钙剂(实心圆)或PTH(空心圆)处理后，相对于所示试剂给药而言定时采集血浆样本。
图3描绘按照研究1将溶钙剂给药后的溶钙剂循环水平。
相对于所示化合物给药而言定时采集血浆样本。
图4描绘按照研究1用溶钙剂或PTH处理后骨质减少大鼠近节胫骨的动态组织形态测定。
图4a)描绘％标记的周长(％L.Pm)；图4b)描绘％侵蚀的表面(％Er.P)；图4c)描绘％骨样的周长(％Os.Pm)；图4d)描绘骨生成率骨区指示物(BFR/B.Ar)％/年。统计学显著性表示为*P＜0.05；**P＜0.01。
图5描绘按照研究2用雌激素+/-溶钙剂处理后骨质减少ovx大鼠胫骨用冯科萨氏染剂染色的区域。
代表性区域来自处理后5周的动物，其中图5a)代表载体；图5b)代表17β-雌二醇(s.c.小丸0.01mg/90天)；
图5c)代表NPS 2143(100μmol/kg每天p.o.)。
图6描绘按照研究2用溶钙剂加/减17β-雌二醇处理后骨质减少大鼠近节胫骨的组织形态测定。
图6a)描绘％小梁骨面积(％Tb.Ar)；图6b)描绘成骨速率组织面积参数(BFR/T.Ar)％/年。统计学显著性表示为*P＜0.05；**P＜0.01。
发明的详细说明本发明的溶钙化合物包括所有溶钙化合物。“溶钙化合物”表示该化合物能够抑制钙受体活性，由此导致一种或多种由细胞外Ca2+引起的钙受体活性降低。这样的化合物包括但不限于选自下组的化合物N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺盐酸盐；N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(4-甲氧基苯基)乙胺盐酸盐；N-[(2R-羟基-3-[(2，3-二氯)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(4-甲氧基苯基)乙胺盐酸盐；N-[(R)-2-羟基-3-[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-羧基苯基)磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(6-(1，2，3，4-四氢萘基)乙胺；N-[(R)-2-羟基-3-[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-羧基苯基)磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(苯并噻吩-3-基)乙胺；N-[(R)-2-羟基-3-[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-羧基苯基)磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(苯并噻吩-2-基)乙胺；N-[(R)-2-羟基-3-[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-羧基苯基)磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(十氢萘-2-基)乙胺；N-[(R)-2-羟基-3-[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-羧基苯基)磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-4-苯基丁基胺；N-[(R)-2-羟基-3-[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-羧基苯基)磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-4-(2-甲氧基苯基)丁基胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[N-甲基-N-[4-乙基羧基苯基]磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-甲基羧基甲氧基苯基]磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(1，2，3，4-四萘-6-基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(苯并噻吩-3-基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(苯并噻吩-2-基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(十氢萘-2-基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-4-(2-甲氧基苯基)丁基胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-4-苯基丁基胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[N-苄基-N-[4-甲基苯基]磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(4-甲氧基苯基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[N-[4-苄基]磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-5-[[4-羧基]苯基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基-N-[3-羧基]苯基]磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基-N-[3-甲基羧基]苯基]磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-(2-苯基-2-R，S-羧基)苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-(3-羧基丙基)苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-萘基乙胺；
(N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-5-(3-羧基丙基)苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-萘基乙胺；和(N-[2R-羟基-3-[2-[2-[6-氨基甲基]吡啶基]乙氧基]-1，1-二甲基-2-萘基乙胺。
骨由蛋白基质组成，其中结合有纺锤形或平板形羟磷灰石晶体。I型胶原代表骨的主要结构蛋白，包含大约90％结构蛋白。其余10％基质由大量非胶原性蛋白组成，包括骨钙蛋白、蛋白聚糖、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、血小板反应蛋白、纤连蛋白和骨涎蛋白。骨骼在整个生命过程中经历离散焦点的改型。这些焦点或改型单元经历由骨吸收相和继之以骨置换相组成的周期。
骨吸收作用是由破骨细胞进行的，它们是造血系的多核细胞。破骨细胞粘附于骨表面，形成密封的地带，然后在它们的顶端(也就是吸收)表面形成广泛的变皱膜波动。这在骨表面上产生封闭的细胞外腔，它被变皱膜中的质子泵酸化，破骨细胞向其中分泌蛋白酶。腔的低pH溶解骨表面上的羟磷灰石，而蛋白酶消化蛋白基质。按照这种方式，形成吸收腔隙或凹。在该相循环结束时，成骨细胞置于新的蛋白基质上，随后被矿化。在若干疾病状态中，例如骨质疏松症和佩吉特氏病，骨吸收与生成之间的正常平衡被破坏了，每个周期都存在骨的净损失。最终，引起骨的弱化，可以增加因微小创伤而骨折的危险。
本文所用的“抗吸收”表示能够预防、延缓或阻止骨吸收的试剂。可用于本发明的抗吸收剂包括但不限于雌激素、1，25(OH)2维生素D3、降钙素、双膦酸酯和组织蛋白酶K抑制剂。
本发明化合物还可以配制成其药学上可接受的盐和配合物。药学上可接受的盐是在所给药的剂量和浓度下无毒的盐。
药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如硫酸盐、盐酸盐、富马酸盐、马来酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、环已基氨基磺酸盐和奎尼酸盐。药学上可接受的盐可以从诸如下列的酸获得盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、环己基氨基磺酸、富马酸和奎尼酸。
若存在酸性官能团，例如羧酸或酚，则药学上可接受的盐还包括那些碱加成盐，例如含有苯乍生、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺、普鲁卡因、铝、钙、锂、镁、钾、钠、铵、烷基胺和锌。
为了使用本发明的化合物或其药学上可接受的盐来治疗人和其他哺乳动物，在正常情况下按照标准的药学实践配制成药物组合物。
溶钙化合物可以通过不同途径给药，包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、口服、局部(透皮)或透黏膜给药。关于全身给药，口服给药是优选的。关于口服给药，例如，可以将化合物配制成常规的口服剂型，例如胶囊剂、片剂和液体制剂，例如糖浆剂、酏剂和浓缩滴剂。
或者，可以采用注射(肠胃外给药)，例如肌内、静脉内、腹膜内和皮下。关于注射，将本发明化合物配制成液体溶液，优选为生理上可相容的缓冲液或溶液，例如盐水溶液、汉克氏溶液或林格氏溶液。另外，可以将化合物配制成固体剂型，临使用前溶解或悬浮之。还可以制成冻干剂型。
全身给药还可以通过透黏膜或透皮方式。关于透黏膜或透皮给药，在制剂中使用适合于所要渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域所公知的，关于透黏膜给药例如包括胆汁盐和夫西地酸衍生物。另外，洗涤剂可以用于促进渗透。透黏膜给药例如可以是鼻喷雾剂、直肠栓剂或阴道栓剂。
关于局部给药，可以将本发明化合物配制成软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂，这是本领域所公知的。
各种溶钙化合物的给药量可以通过标准操作加以确定，并考虑诸如化合物的IC50、EC50、化合物的生物半衰期、患者的年龄、大小与体重、与患者有关的疾病或障碍等因素。这些因素和其他所要考虑的因素的重要性是本领域普通技术人员已知的。
给药量还取决于给药途径和口服生物利用度的程度。例如，关于口服生物利用度低的化合物，将不得不给以相对高的剂量。
优选地，组合物是单位剂型。关于口服用药，例如可以给以片剂或胶囊剂，关于鼻部用药，可以用计量的气雾剂，关于透皮用药，可以用局部制剂或贴剂，关于透黏膜释放，可以用颊部贴剂。在每种情况下，患者都可以接受单一剂量。
关于口服给药的每单位剂量适合含有0.01至500mg/kg、优选为0.1至50mg/kg的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，以游离碱计。关于肠胃外、鼻、口吸入、透黏膜或透皮途径，适合的每日剂量含有0.01mg/kg至100mg/kg的式(I)化合物。局部制剂适合含有0.01至5.0％的式(I)化合物。活性成分每天可以给药1至6次，优选为一次，即足以表现所需的活性，这对本领域技术人员来说是显而易见的。
本文所用的疾病的“治疗”包括但不限于疾病的防止、抑制和预防。
基于受影响的细胞而言，可能被治疗或预防的疾病和障碍包括与骨和矿物质有关的疾病或障碍；甲状旁腺机能减退；中枢神经系统的疾病或障碍，例如癫痫发作、中风、头创伤、脊髓损伤、氧不足诱发的神经细胞损伤(例如发生在心动停止或新生儿呼吸窘迫)、癫痫、神经变性疾病(例如阿耳茨海默氏病、亨廷顿氏病和帕金森氏病)、痴呆、肌肉紧张、抑郁、焦虑、惊恐症、强迫观念与行为障碍、创伤后精神紧张性障碍、精神分裂症、抗精神病药恶性综合征和图雷特氏综合征；涉及肾再吸收水过量的疾病，例如抗利尿激素分泌失调综合征(SIADH)、肝硬化、充血性心力衰竭和肾变病；高血压；预防和/或减少阳离子抗生素(例如氨基苷类抗生素)的肾毒性；肠运动性障碍，例如腹泻和痉挛性结肠；GI溃疡病；伴有过度钙吸收的GI疾病，例如肉样瘤病；自体免疫疾病与器官移植排斥；鳞状上皮细胞癌；和胰腺炎。
在本发明的优选实施方式中，本发明化合物用于以非脉冲方式增加血清甲状旁腺激素(PTH)水平。增加血清PTH水平可以有助于治疗诸如甲状旁腺机能减退、骨肉瘤、牙周病、骨折、骨关节炎、类风湿性关节炎、佩吉特氏病和骨质疏松症等疾病。
未受损的人PTH的正常范围是约10至约65pg/ml。增加血清PTH还可以用于预防性抑制或预防疾病的发作。例如可以对血清PTH低的人、或者血清PTH不低但是增加PTH具有有益的补偿作用的人进行预防性治疗。优选的是患者具有异常低的血清PTH。本文所用的“异常低的血清PTH”表示血清PTH水平低于一般水平，优选的量与疾病或疾病发作有关。
增加血清PTH水平可以用于治疗各种疾病，包括与骨和矿物质有关的疾病。
PTH水平增加的持续时间优选为12小时或以上，更优选为18小时或以上，最优选为24小时或以上。
PTH比未受损的人PTH的正常范围优选的增加3倍或以下。更优选PTH水平比正常范围增加2倍或以下。
本发明还提供包含本发明化合物及其药学上可接受的盐的组合物，能配制成糖浆剂、片剂、胶囊剂和锭剂，口服给药后具有活性。糖浆剂一般将由化合物或盐与矫味剂或着色剂在液体载体中的悬液或溶液组成，该液体载体例如乙醇、花生油、橄榄油、甘油或水。若组合物是片剂，则可以使用常用于制备固体制剂的药物载体。这类载体的实例包括硬脂酸镁、白土、滑石、明胶、阿拉伯胶、硬脂酸、淀粉、乳糖和蔗糖。若组合物是胶囊剂，则任意常规的包封方法都是适合的，例如在硬明胶胶囊外壳中使用上述载体。若组合物是软明胶外壳胶囊剂，则可以考虑任意常用于制备分散或悬浮的药物载体，例如水性树胶、纤维素、硅酸盐或油，将它们加在软明胶胶囊外壳中。
典型的肠胃外组合物由化合物或盐在无菌的水性或非水性载体中的溶液或悬液组成，可不含或含有肠胃外可接受的油，例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油。
典型的吸入组合物是溶液、悬液或乳液的形式，它们可以配制成干粉，或者使用常规的推进剂配制成气雾剂，例如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷。
典型的栓剂包含以这种方式给药后是活性的本发明化合物或其药学上可接受的盐与粘合剂和/或润滑剂，例如聚乙二醇、明胶、可可脂或其他低熔点的蜡类或脂肪、或它们的合成类似物。
典型的皮肤与透皮制剂包含常规的水性或非水性赋形剂，例如霜剂、软膏剂、洗剂或糊剂，或者是药物硬膏剂、贴剂或膜剂。
该组合物优选的是以单位剂型形式，例如片剂、胶囊剂或计量的气雾剂，以便患者可以使用单一剂量。
按照本发明要求在服用本发明的化合物后没有不可接受的毒理作用。
生物鉴定进行下列鉴定。
切除卵巢的大鼠研究研究1对七月龄Sprague Dawley雌性处鼠进行双侧卵巢切除术或假手术，然后饲养动物三个月，使其发展为骨质减少。此时，分成一组假手术组(n＝10)和三组切除卵巢(ovx)动物(n＝10-14)。选择ovx组的组间在腰椎、近节胫骨或远节股骨的骨矿物质密度(“BMD”)没有显著差异。各组分别是假手术组、用载体(20％含水包衣(encapsin))处理的ovx对照组和用N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺盐酸盐(“用溶钙剂给药”)(100μmol/kg体重每天p.o.)或大鼠的PTH 1-34(5μg/kg体重每天s.c.)处理的ovx组。
在研究期间抽取血样，用于测定循环的PTH和骨钙素。在处理前和第4、第8周用DXA(QDR-4500 Hologic，Waltham，Mass)测定BMD。到期摘除胫骨，用于组织学分析。所有动物在给药开始前10天和3天接受四环素，在处死前10天和3天接受钙黄绿素(10mg/kg)。
研究2如上所述准备动物并监测。各组分别是假手术组、用口服载体(20％含水包衣)处理的ovx对照组和另外4组接受N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺盐酸盐(100μmol/kd/d，p.o.)、17β-雌二醇(s.c.小丸剂0.01mg/90天)或N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺盐酸盐+雌二醇(各自如上)的ovx组。给药持续5周，然后处死动物，收集胫骨，用于组织学分析。
循环化合物和PTH水平的测量定时采集涉及化合物或PTH给药的血浆样本。用RIA(NicholsInstitute Diagnostics，San Juan Capistrano，CA)测量 PTH 1-34。用LC/MS/MS(检测限＝10ng/ml)定量血浆中的化合物浓度。
组织形态测定评价通过增加乙醇的浓度使骨样本脱水，在丙酮中脱脂，包埋在异丁烯酸甲酯(Polysciences，Inc.，Warrington，PA)中。在Leica切片机(SM2500S)上切取近节胫骨的纵向未脱钙的切片(5μm)；组织块预先已经用Villanueva染剂染色。在不知道组分配的情况下，利用Osteomeasure系统(OsteoMetrics Incorpotated)进行组织形态测定分析。胫骨干骺端内的测量限于从生长板下1mm开始的大约8mm2的平均组织面积。主要的测量包括骨与骨髓的面积(mm2)、骨面积(mm2)、骨周长(mm)、单标记与双标记的周长(sL.Pm，dL.Pm，mm)、骨样的周长(O.Pm，mm)和侵蚀的周长(Er.P，mm)。派生的指标包括小梁状骨体积(％Tb.Ar)、小梁数(Tb.N，mm-1)、小梁厚度(Tb.Th，μm)、小梁间距(Tb.Sp，μm)、成骨速率、表面参数(BFR/Tb.Pm，μm3/μm2/年)、BFR/Tb.Ar(骨面积参数，％/年)、BFR/B.Ar(组织参数，％/年)、矿物质外加率(MAR，μm/天)和标记周长百分比(％Lp)。用双侧t检验评估统计学分析。
人破骨细胞介导的骨吸收作用测定按照James《骨矿物质研究杂志》Vol.11，pp.1453-1460，从新鲜的破骨细胞瘤组织中分离解聚的人破骨细胞和进行体外人破骨细胞吸收作用测定。简而言之，在37℃下，将人破骨细胞接种在含有化合物或载体的牛骨密质粒子上达24小时。然后除去培养基，利用竞争性结合酶联免疫吸附测定(ELISA)(19)(Osteometer A/S，Rodovre，Denmark)定量人I型胶原α1链羧基末端肽水平，作为吸收作用的生物化学读数。与在不含抑制剂的载体中培养破骨细胞所得上清液相比，结果以吸收作用的抑制百分比表示。从所得剂量反应曲线测定IC50值。
胎鼠长骨吸收作用测定该测定基本上同Votta《骨》Vol.15，pp.533-538，(1994)。在妊娠第18天向定时妊娠的Sprague-Dawley大鼠(Taconic Farms，Germantown，NY)皮下注射200微居里45CaCl2，笼养过夜，然后用Innovar-Vet (Pittman-Moore，Mundelein，IL)麻醉，通过颈脱位处死。无菌摘除胎儿，除去周围软组织和软骨样末端，解剖桡骨和尺骨。随后将骨遗迹(n＝4)在含有1mg/ml BSA的BGJb培养基(Sigma，St.Louis，MO)中培养18-24小时，然后转移至新鲜的培养基中，在有或没有PTH(人甲状旁腺激素[1-34]，Bachem，Torrence，CA)和所需抑制剂的存在下另外培养48小时。(在室温下，在5％TCA中增溶1小时后)用液体闪烁光谱测定定量释放到培养基中的45Ca和残留在骨中的45Ca。与相应的对照骨相比，数据以从所处理的骨中释放的45Ca百分比表示。用单向方差分析(ANOVA)评估统计学差异。IC50是基于两次独立实验所得数据的。
成骨细胞cAMP产生和碱性磷酸酶活性测量人TF274成骨细胞(通过人骨髓基质细胞的无限增殖化而得)中的cAMP蓄积，参见James，出处同上；还测量来自小梁骨外植体的原代人成骨细胞中的cAMP蓄积，如Beresford《生物化学与生物物理学学报》Vol.801，pp.58-65(1984)所述。利用非放射性方案(Amersham试剂盒)测量细胞样本中的cAMP水平。利用标准比色法测定碱性磷酸酶活性，如前面Gowen《关节炎与风湿病》Vol.31，pp.1500-1507(1988)所述。在0.1、1和10μM下试验N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺盐酸盐。使用PTH 40ng/ml作为阳性对照。
从研究1所述测定所得结果说明，PTH水平的微小而持续升高导致骨变质增加，没有净骨增益或损失。
在处理之前立即地和在给药八周之后，体内测量腰椎、远节股骨和近节胫骨中的骨矿物质密度(BMD)。预先已经切除卵巢三个月的动物在全部三个骨骼部位显著丧失骨质量腰椎和近节胫骨为15％，远节股骨为24％。在处理过程期间，用N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺处理的骨质量不受影响，但是每日用5μg/kg PTH处理的近节胫骨在八周后恢复至ovx前的水平(图1)。该实验结束时的血浆PTH水平测量显示，接受N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺的动物已经升高了PTH水平(＞100pg/ml)，药物给药后四小时仍保持较高PTH水平(图2)。这种升高作用持续多长时间是未知的，不过PTH水平在24小时后(恰在下一次给药之前)回落至基线水平。给以5μg/kgPTH的动物的PTH水平在与接受N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺相同的范围内，但是在给药后2-4小时恢复至基线水平(图2)。PTH反应持续时间上的差异可以由持续接触N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺来解释，发现后者升高长达八小时(图3)。
在这两种给药条件下所得PTH图上的差异已经使我们可直接测定接触PTH的时间对骨变质的影响。近节胫骨的动态组织形态测定显示，骨生成(％L.Pm，％Os.Pm)升高至PTH和N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺ovx对照水平之上(图4a，b)。所有处理的矿物质外加率都没有变化。不过，以％侵蚀的周长表示的骨吸收作用在N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺组中显著高于PTH或ovx对照组(图4c)。与其他两组相比，N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺处理组中由BFR/B.Ar所证明的骨变质戏剧性增加进一步例证了这一点(图4d)。因而，由溶钙剂给药所实现的适当延长的PTH升高导致骨生成和吸收的戏剧性增加，且没有净骨增益或丧失。外源性给药的PTH也增加吸收和生成，但是生成超过吸收，导致骨质增加。
研究2所得结果说明，在抗吸收剂的存在下，PTH水平的微小而持续的升高导致骨变质增加，且有净骨增益。
进行第二项研究，在有或没有雌激素的存在下，每日用N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺盐酸盐对已被ovx三个月的七月龄大鼠给药达4周。图5显示用冯科萨氏染剂染色的代表性动物胫骨切片，动物分别在ovx后没有被处理(5a)、用单独的雌激素处理(5b)或者用雌激素加N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺处理(5c)。显然，N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺与雌激素共同给药(5c)导致骨质增加超过单独的雌激素。近节胫骨的静态组织形态测定(表1)显示，ovx动物的％小梁面积(％Tb.Ar)比假手术动物低72％(P＜0.0001)。这种骨损失没有被雌二醇显著恢复。单独的N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺对ovx诱导的骨质减少没有作用。不过，N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺加雌激素导致％Tb.Ar比ovx组增加两倍(图6a)。这似乎是由N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺加雌激素所诱导的小梁厚度增加而引起的(表1)。N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺加雌激素组的成骨速率/组织面积显著升高(图6b)。成骨速率/组织面积的升高显示，所测量区域中的骨质量在增加，反映在未被改型(建模)的骨表面有新骨生成，这是PTH作用的经典特征。这似乎是吸收作用相对于NPS处理的动物而言降低的结果(大概由于同时用雌激素处理)，即使骨生成保持升高也是如此。
N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺对体外成骨细胞和破骨细胞的直接作用由于我们已经研究证明了Ca2+敏感受体对成骨细胞与破骨细胞的作用，因此就研究了N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺体外对成骨细胞与破骨细胞的直接作用。
成骨细胞活性尽管PTH导致所用两种细胞类型的cAMP水平都增加两倍，但N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺对基础或PTH诱导的cAMP水平没有作用。用N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺处理TF274细胞没有导致碱性磷酸酶活性有任何变化，PTH诱导的碱性磷酸酶也不受N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺的影响。N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺在10μM浓度下证明具有一定的体外毒性。
破骨细胞活性N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺在高达3μM浓度下对人破骨细胞介导的骨吸收没有作用，而组织蛋白酶K抑制剂3，11-双(2-甲基丙基)-4，7，10-三氧代-2，5，6，8，9，12-六氮杂十三烷二酸酯的IC50为0.9μM。该测定受到它对DMSO的敏感性的限制，因此无法试验浓度超过3μM的N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺。在胎鼠长骨测定中，N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺抑制吸收作用的IC50为11.3+/-3μM。这种抑制作用的机理尚不得而知，不过由于它发生在大约300倍高于Ca2+受体介导的Ca2+活动化IC50的浓度下，因此可能与任何对Ca2+受体的作用都是无关的。不能排除与毒性有关的可能性。
上述实验证明，能够设计少量口服的活性化合物，诱导足以刺激骨变质的内源性PTH分泌。这种分子的药动学特征可获得PTH的长期升高(＞4小时)。这已经使我们可检查PTH升高的持续时间在低水平循环PTH下有什么作用。若PTH升高超过四小时，则骨变质进一步增加，但保持平衡，没有净损失或增益。用雌激素和拮抗剂进行共同治疗实验，导致如组织形态测定法所测量的骨生成增加。
众所周知，例如在甲状旁腺机能亢进中所见到的慢性PTH升高引起骨损失和骨组织学异常。Dobnig等出处同上显示，大剂量PTH(40与80μg/kg/天)皮下输注2小时或更长时间引起体重迅速下降、血钙过多和骨骼组织学异常，这与在甲状旁腺机能亢进中所见到的变化是一致的。在我们的研究中，PTH的增加尽管是持续的，但要小得多，没有引起这些不利作用。然而，PTH的合成代谢作用仍然因持续的暴露而丧失。这提示了温和的甲状旁腺机能亢进无论是自然发生的还是药理诱导的，都可能是无症状的。
这些数据还证明，关于响应于N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺而分泌的PTH的量，PTH水平持续时间短和增加倍数少对骨的变质极具有影响。大多数对大鼠PTH作用所进行的公开研究使用80μg/kg的剂量。该剂量引起循环水平达到大约5,000-14,000pg/ml，而我们的研究为150-200pg/ml。这一点证明，极低剂量的PTH有效调制骨的变质。这在最近进行的临床研究中也作了阐述，这些研究使用更加低得多的剂量，其中大约0.4-0.8μg/kg体重的剂量引起骨质量增加(8，24)。0.4μg/kg给药后30分钟引起PTH 1-34的循环水平达到大约90pmol/l(25)。循环PTH水平增加大约三倍。因而，如果响应于Ca2+受体拮抗剂而释放，那么贮存在甲状旁腺中的PTH似乎足以导致合成代谢作用。
上述数据第一次证明，使用甲状旁腺细胞Ca2+受体拮抗剂刺激内源性甲状旁腺激素分泌，导致骨生成和吸收增加。在抗吸收剂N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙基胺的存在下，导致骨质增加。这为用于骨质疏松症治疗的新一类合成代谢剂的开发提供了基础。
本说明书所引证的全部出版物、包括但不限于专利和专利申请均引用在此作为参考文献，每一份出版物都分别具体地全文引用在此作为参考文献。
权利要求
1.一种治疗以骨或矿物质体内平衡异常为特征的疾病或障碍的方法，该方法包括将有效量的溶钙化合物与有效量的抗吸收剂给需要治疗的受治疗者联合用药。
2.根据权利要求1的方法，其中该溶钙化合物选自下组N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺盐酸盐；N-[(2R-羟基-3-[(3-氯-2-氰基)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(4-甲氧基苯基)乙胺盐酸盐；N-[(2R-羟基-3-[(2，3-二氯)苯氧基-丙基]-1，1-二甲基-2-(4-甲氧基苯基)乙胺盐酸盐；N-[(R)-2-羟基-3-[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-羧基苯基)磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(6-(1，2，3，4-四氢萘基)乙胺；N-[(R)-2-羟基-3-[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-羧基苯基)磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(苯并噻吩-3-基)乙胺；N-[(R)-2-羟基-3-[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-羧基苯基)磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(苯并噻吩-2-基)乙胺；N-[(R)-2-羟基-3-[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-羧基苯基)磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(十氢萘-2-基)乙胺；N-[(R)-2-羟基-3-[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-羧基苯基)磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-4-苯基丁基胺；N-[(R)-2-羟基-3-[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-羧基苯基)磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-4-(2-甲氧基苯基)丁基胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[N-甲基-N-[4-乙基羧基苯基]磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[N-甲基-N-[3-甲基羧基甲氧基苯基]磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(1，2，3，4-四萘-6-基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(苯并噻吩-3-基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(苯并噻吩-2-基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(十氢萘-2-基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-4-(2-甲氧基苯基)丁基胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基磺酰]-N-[[[1-[2-[6-甲基]氨基]吡啶基]乙基]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-4-苯基丁基胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[N-苄基-N-[4-甲基苯基]磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(4-甲氧基苯基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[N-[4-苄基]磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-[2-萘基]乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-5-[[4-羧基]苯基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基-N-[3-羧基]苯基]磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-[[N-甲基-N-[3-甲基羧基]苯基]磺酰]氨基]苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-(2-苯基-2-R，S-羧基)苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-(2-萘基)乙胺；N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-4-(3-羧基丙基)苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-萘基乙胺；(N-[2R-羟基-3-[[2-氰基-5-(3-羧基丙基)苯氧基]丙基]-1，1-二甲基-2-萘基乙胺；和(N-[2R-羟基-3-[2-[2-[6-氨基甲基]吡啶基]乙氧基]-1，1-二甲基-2-萘基乙胺。
3.根据权利要求2的方法，其中该抗吸收剂选自下组雌激素、1，25(OH)2维生素D3、降钙素、选择性雌激素受体调制剂、玻连蛋白受体拮抗剂、V-H+-ATP酶抑制剂、src SH2拮抗剂、双膦酸酯和组织蛋白酶K抑制剂。
4.根据权利要求1的方法，其中该骨或矿物质疾病或障碍选自下组牙周病、骨折愈合、骨关节炎、类风湿性关节炎、佩吉特氏病、恶性体液性高钙血症、转移性骨疾病、关节置换和骨质疏松症。
5.根据权利要求3的方法，其中该骨或矿物质疾病或障碍是骨质疏松症。
6.根据权利要求1的方法，其中该溶钙剂导致血清PTH水平增加3倍或更高。
7.根据权利要求1的方法，其中该溶钙剂导致血清PTH水平增加2倍或更高。
8.一种治疗以骨或矿物质体内平衡异常为特征的疾病或障碍的方法，该方法包括将有效量的合成代谢化合物与有效量的抗吸收剂给需要治疗的受治疗者联合用药。
全文摘要
本发明提供了新颖的治疗骨疾病或障碍的方法。
文档编号A61K31/44GK1367687SQ00811177
公开日2002年9月4日 申请日期2000年7月31日 优先权日1999年7月31日
发明者马克辛·高恩, 拉里·J·苏瓦, 约翰·福克斯, 乔治·B·斯特鲁普, 爱德华·F·内梅思 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司, Nps医药公司