与血液凝固相关的疾病的预防和治疗的制作方法

专利名称：与血液凝固相关的疾病的预防和治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及产生一种具有持久性凝固性过高状态的动物模型的方法，用于具有持久性凝固性过高状态的疾病的预防或治疗剂，用于感染导致的凝固性过高状态的预防或治疗剂，用于静脉或动脉血栓形成的预防或治疗剂，和由于血管中层(vascular media)肥大导致的疾病的预防或治疗物质。
背景技术：
血液凝固是一种反应，其中丝氨酸蛋白酶母体持续被激活形式的蛋白酶激活，其最终产生凝血酶，从而导致纤维蛋白形成。血栓形成作为过渡增加的血液凝固反应的结果而产生，所述过渡增加的血液凝固反应由于血浆凝固和纤维蛋白溶解系统中、血小板功能中、与各种疾病状态的发展相关的白细胞和血管内皮细胞的变化而引起。血液凝固反应的起始因素是组织因子。在急性冠状血管综合征例如急性心肌梗塞和不稳定咽峡炎中，当动脉粥样硬化发生之后形成的斑块中大量存在的组织因子暴露于血时，由于斑块破裂而触发血液凝固反应。
在与脓毒症和恶性肿瘤相关的扩散性血管内凝固综合症中，激活的单细胞和巨噬细胞表达组织因子或者肿瘤细胞表达组织因子，从而引发增加的血液凝固。一旦组织因子与血液接触，则在非常短的时间内发生血液凝固反应并且导致血液凝块的形成。因此，为了防止血栓形成，需要阻断可能在任何时间触发的或者可能持久性发生的血液凝固反应。因此，表现出持久性基础上的凝固性过高状态的实验模型对于开发有效抗凝剂来说是必需的。在任何常规已知的血栓形成模型中，都是在短时间内诱发血栓形成。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种实验模型，其中通过在持久基础上使人组织因子接触血液以使凝固性过高状态持久。
血液凝固是一种反应，其中丝氨酸蛋白酶母体持续被激活形式的蛋白酶激活，其最终产生凝血酶，从而导致纤维蛋白形成。血栓形成作为过渡增加的血液凝固反应的结果而产生，所述过渡增加的血液凝固反应由于血浆凝固和纤维蛋白溶解系统中、血小板功能中、与各种疾病状态的发展相关的白细胞和血管内皮细胞的变化而引起。血液凝固反应的起始因素是组织因子(TF)。
在急性冠状血管综合征例如急性心肌梗塞和不稳定咽峡炎中，当动脉粥样硬化发生之后形成的斑块中大量存在的组织因子暴露于血时，由于斑块破裂而触发血液凝固反应。在与脓毒症和恶性肿瘤相关的扩散性血管内凝固综合症中，激活的单细胞和巨噬细胞表达TF或者肿瘤细胞表达TF，从而引发增加的血液凝固，并且这种状态是持久的。一旦TF接触血液，则在非常短的时间内发生血液凝固反应并且导致血液凝块的形成。因此，为了防止血栓形成，需要阻断可能在任何时间触发的或者可能持久性发生的血液凝固反应。因此，需要能阻断在持久性基础上发生的凝固性过高状态的持久性的药物作为有效抗血栓形成剂。
因此，根据本发明的第二方面，提供了用于具有持久性凝固性过高状态疾病的新颖的预防或治疗物质。
严重的感染经常与异常凝固有关，异常凝固诱发疾病状态，例如多器官衰竭和扩散性血管内凝固综合症，并且代表加重患者预后的因素。因此考虑使用的指征是重要的。在严重感染中，其中全身性感染，例如脓毒症，血管内皮细胞的损伤已经暗示器官失调的启动机理。在脓毒症中，特别是在革兰氏阴性细菌引起的脓毒症中，细胞成分脂多糖(LPS)起着重要作用。
释放到血液中的LPS不仅激活单细胞并从而产生导致凝固性过高状态的组织因子(TF)，而且产生并释放细胞因子，例如TNF，IL-1β和IL-8，并从而激活嗜中性粒细胞和血管内皮细胞。被激活的嗜中性粒细胞粘附细胞内皮细胞以释放细胞毒性物质例如活性酶和弹性蛋白酶，其损伤血管内皮细胞。在由细胞因子激活的或者嗜中性粒细胞损伤的血管内皮细胞中，TF的产生增强，其进一步加重了凝固性过高状态。结果，发生全身性微血栓，这引发导致多器官衰竭的器官中的循环衰竭。
因此，非常需要开发用于感染引起的血液可凝状态的预防或治疗剂。
因此，根据本发明的第三方面，提供了用于感染引起的血液可凝状态的新颖的预防或治疗剂。
作为导致静脉血栓形成启动的机理，认为静脉郁积、对静脉壁的损伤以及凝固性过高起着重要作用。特别地，侵袭作用例如手术、婴儿出生和外伤诱发对血管壁的物理损伤以及凝固作用及纤维蛋白溶解系统异常，并且手术后的褥疮诱发静脉郁积。不只是静脉内生成的血液凝块诱导肢体的循环衰竭，而且凝块本身进入循环并且流入肺动脉导致致命的肺栓塞。因此，考虑预防静脉血栓形成本身是重要的。因此，需要开发能有效防止或治疗静脉血栓形成的制剂。
因此，根据本发明的第四方面，提供了治疗静脉血栓形成的新颖的预防或治疗剂。
在动脉血栓形成中，具有晚期硬化血管中发生血液凝块，并且在大多数情况下，重要器官例如大脑和心脏中发生疾病是致命的。特别是，相信急性冠状综合症例如不稳定咽峡炎和急性心肌梗塞是容易引起突然死亡的危险疾病状态。最近证明动脉粥样硬化斑块破裂并且接着发生血栓是疾病发生机理中的重要因素。
还已经证明血栓形成的起始因子组织因子(TF)在斑块的细胞表面上和胞外间隙过量表达，因此，相信由斑块破裂导致的组织因子(TF)暴露于血液中是血栓形成的主要因素。
因此，非常需要开发预防或治疗动脉血栓形成的新颖的药物。
因此，根据本发明的第五方面，提供了用于动脉血栓形成的新颖的预防或治疗剂。
在治疗冠状心脏病中，经皮经腔冠状血管成形术(PTCA)占据重要位置。但是手术后几个月发生的再狭窄防碍了该治疗方法的效果，因此造成问题。作为再狭窄的原因，变得越来越清楚，对内皮细胞的损伤导致的急性期和亚急性期间形成的血栓形成是重要的。损伤的内皮细胞表达的组织因子(TF)的血液与平滑肌和亚内皮组织中的成纤维细胞的接触对于血栓形成是重要的。血管壁中的细胞生长以使覆盖生成的血栓从而使血管腔区域变窄。血管组织本身的生长和血管直径的限制也是造成血管腔区域变窄的原因，并且它们是再狭窄的直接因素。因此，非常需要预防或治疗再狭窄的新颖的药物。
因此，根据本发明的第六方面，提供了用于血管中层的肥大导致的疾病的新颖的预防或治疗物质。
本发明的公开为了解决上述问题进行了集中而广泛研究之后，本发明人发现，通过向实验动物植入(implanted)通过在其中引入人组织因子(TF)基因而能持久性表达人组织因子的动物细胞从而提高动物中人组织因子的浓度，能够将所述动物的凝固性过高状态长时间保持，从而完成本发明。
因此，根据本发明的第一方面，本发明提供了植入了其中插入了编码人组织因子(TF)的基因或者其部分并且能表达所述基因的动物细胞的实验动物，所述动物具有长时间持续凝固性过高状态的非人动物。
所述人组织因子的部分是例如缺少胞内区的人组织因子。所述动物细胞优选是哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞优选是人骨髓瘤细胞。所述动物优选是小鼠。至少一种下面的现象指征所述凝固性过高状态，包括人组织因子血浆浓度的提高，血小板减少，纤维蛋白原减少，可溶性纤维蛋白单体复合物浓度提高，和凝血酶-抗凝血酶III复合物的浓度提高。
本发明还提供了产生上述动物的方法，其中向非人动物植入了编码人组织因子(TF)的基因或者其部分并且能表达所述基因的动物细胞，然后筛选具有持久凝固性过高状态的动物。
本发明还提供了筛选抗血栓形成剂的方法，该方法包括使用上述动物。
为了解决上述第二个问题进行了集中而广泛研究之后，本发明人发现，抗人组织因子的抗体(抗-人TF抗体，或者有时称之为抗-TF抗体)能防止凝固性过高状态的持久性。
因此，根据本发明的第二方面，本发明提供了用于具有持久性凝固性过高状态的疾病的预防或治疗剂，所述制剂包括抗人组织因子(人TF)的抗体。
上述抗体是例如多克隆抗体。上述抗体优选是单克隆抗体。上述抗体优选是重组抗体。上述抗体优选是改变的抗体。上述改变的抗体优选是嵌合抗体或人源化抗体。上述人源化抗体优选是b-b，i-b或i-b2型人源化抗体。上述抗体例如是抗体修饰物。上述抗体修饰物是例如抗体片段Fab，F(ab’)2或Fv，或者单链Fv(scFv)。
为了解决上述第三个问题进行了集中而广泛研究之后，本发明人发现，抗人组织因子的抗体(抗-人TF抗体，或者有时称之为抗-TF抗体)能防止或治疗感染导致的凝固性过高状态。
因此，根据本发明的第三方面，本发明提供了用于感染导致的凝固性过高状态的预防或治疗剂，所述制剂包括抗人组织因子(人TF)的抗体。
上述抗体是例如多克隆抗体。上述抗体优选是单克隆抗体。上述抗体优选是重组抗体。上述抗体优选是改变的抗体。上述改变的抗体优选是嵌合抗体或人源化抗体。上述人源化抗体优选是b-b，i-b或i-b2型人源化抗体。上述抗体例如是抗体修饰物。上述抗体修饰物是例如抗体片段Fab，F(ab’)2或Fv，或者单链Fv(scFv)。
为了解决上述第四个问题进行了集中而广泛研究之后，本发明人发现，抗人组织因子的抗体(抗-人TF抗体，或者有时称之为抗-TF抗体)能防止或治疗静脉血栓形成。
因此，根据本发明的第四方面，本发明提供了用于静脉血栓形成的预防或治疗剂，所述制剂包括抗人组织因子(人TF)的抗体。
上述抗体是例如多克隆抗体。上述抗体优选是单克隆抗体。上述抗体优选是重组抗体。上述抗体优选是改变的抗体。上述改变的抗体优选是嵌合抗体或人源化抗体。上述人源化抗体优选是b-b，i-b或i-b2型人源化抗体。上述抗体例如是抗体修饰物。上述抗体修饰物是例如抗体片段Fab，F(ab’)2或Fv，或者单链Fv(scFv)。
为了解决上述第五个问题进行了集中而广泛研究之后，本发明人发现，抗人组织因子的抗体(抗-人TF抗体，或者有时称之为抗-TF抗体)能防止或治疗动脉血栓形成。
因此，根据本发明的第五方面，本发明提供了用于动脉血栓形成的预防或治疗剂，所述制剂包括抗人组织因子(人TF)的抗体。
上述抗体是例如多克隆抗体。上述抗体优选是单克隆抗体。上述抗体优选是重组抗体。上述抗体优选是改变的抗体。上述改变的抗体优选是嵌合抗体或人源化抗体。上述人源化抗体优选是b-b，i-b或i-b2型人源化抗体。上述抗体例如是抗体修饰物。上述抗体修饰物是例如抗体片段Fab，F(ab’)2或Fv，或者单链Fv(scFv)。
为了解决上述第六个问题进行了集中而广泛研究之后，本发明人发现，抗人组织因子的抗体(抗-人TF抗体，或者有时称之为抗-TF抗体)能防止或治疗血管中层肥大引起的疾病。
因此，根据本发明的第六方面，本发明提供了用于血管中层肥大引起的疾病的预防或治疗剂，所述制剂包括抗人组织因子(人TF)的抗体。
上述抗体是例如多克隆抗体。上述抗体优选是单克隆抗体。上述抗体优选是重组抗体。上述抗体优选是改变的抗体。上述改变的抗体优选是嵌合抗体或人源化抗体。上述人源化抗体优选是b-b，i-b或i-b2型人源化抗体。上述抗体例如是抗体修饰物。上述抗体修饰物是例如抗体片段Fab，F(ab’)2或Fv，或者单链Fv(scFv)。
附图的简要说明

图1是H链嵌合/L链嵌合抗体，H链人源化b型/L链人源化b型抗体，H链人源化i型/L链人源化b型抗体，和H链人源化i型/L链人源化b2型抗体的抗原结合活性之比较图。
图2是H链嵌合/L链嵌合抗体，H链人源化b型/L链人源化b型抗体，H链人源化i型/L链人源化b型抗体，和H链人源化i型/L链人源化b2型抗体的中和人TF的活性(抑制Xa因子产生的TF活性)之比较图。
图3是显示H链嵌合/L链嵌合抗体，H链人源化b型/L链人源化b型抗体，H链人源化i型/L链人源化b型抗体，和H链人源化i型/L链人源化b2型抗体的中和人TF的活性(抑制X因子产生的TF活性)之比较图。
图4显示是H链嵌合/L链嵌合抗体，H链人源化b型/L链人源化b型抗体，H链人源化i型/L链人源化b型抗体，和H链人源化i型/L链人源化b2型抗体的中和人TF的活性(抑制血浆凝固的TF活性)之比较图。
图5是显示在植入了已经引入人组织因子基因的细胞的小鼠中植入肿瘤细胞后(虚线)和在植入了没有引入所述基因的细胞的小鼠中植入肿瘤细胞之后(实线)肿瘤体积随着时间的变化图。
图6是显示在植入了已经引入人组织因子基因的细胞的小鼠中植入肿瘤细胞后(虚线)和在植入了没有引入所述基因的细胞的小鼠中植入肿瘤细胞之后(实线)人组织因子的血浆浓度随着时间的变化图。
图7是显示在植入了已经引入人组织因子基因的细胞的小鼠中植入肿瘤细胞后(虚线)和植入了没有引入所述基因的细胞的小鼠中植入肿瘤细胞之后(实线)血小板计数随着时间的变化图。
图8是显示在植入了已经引入人组织因子基因的细胞的小鼠中植入肿瘤细胞后(虚线)和在植入了没有引入所述基因的细胞的小鼠中植入肿瘤细胞之后(实线)纤维蛋白原的血浆浓度随着时间的变化图。图中的点指示相对值，其中以没有植入肿瘤细胞的对照小鼠(正常)的纤维蛋白原的浓度作为100％。
图9是显示在植入了已经引入人组织因子基因的细胞的小鼠中植入肿瘤细胞后(虚线)和在植入了没有引入所述基因的细胞的小鼠中植入肿瘤细胞之后(实线)可溶性纤维蛋白单体复合物(sFMC)的血浆浓度随着时间的变化图。
图10是显示在植入了已经引入人组织因子基因的细胞的小鼠中植入肿瘤细胞后(虚线)和在植入了没有引入所述基因的细胞的小鼠中植入肿瘤细胞之后(实线)凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)的血浆浓度随着时间的变化图。
图11显示是小鼠体内血小板计数随时间的变化图，所述小鼠在植入已经引入了人组织因子基因的肿瘤细胞后45天开始，每周施用1毫克/千克抗-人TF抗体、共施用三周。
图12是显示最后施用抗人组织因子抗体后第6天小鼠体内可溶性纤维蛋白单体复合物(sFMC)的血浆浓度图，所述小鼠在植入已经引入了人组织因子基因的肿瘤细胞后45天开始，每周施用1毫克/千克所述抗体、共施用三周。
图13是显示最后施用抗人组织因子抗体后第6天小鼠体内凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)的血浆浓度图，所述小鼠在植入已经引入了人体组织因子基因的肿瘤细胞后45天开始，每周施用1毫克/千克所述抗体、共施用三周。
图14是显示使用渗透泵，在植入了其中已经引入了人TF基因的肿瘤细胞49天后一次施用1毫克/千克抗-人TF抗体或者以601.5IU/千克、1900.3IU/千克或6487.3IU/千克持续24-小时施用低分子量肝素的小鼠体内的血小板计数随着时间的变化图。
实施本发明的最佳方式已经克隆了编码用于本发明的第一方面的人组织因子(TF)的基因，其碱基序列和由其编码的氨基酸序列也是已知的(H.Morrissey等，细胞(Cell)，Vol.50，p.129-135(1987))。SEQ ID NO103-104中给出了编码全长人组织因子和相应的氨基酸序列的碱基序列。根据本发明，可以使用其中去除了胞内区的编码TF的基因或者编码保留引发血液凝固系统活性的部分的基因。
作为将该基因引入动物细胞并且表达其的载体，可以使用任何在动物细胞中有功能的表达载体，包括，例如，pCOS1，pSV2-neo，pMAM-neo，和pSG5。根据本发明，通常使用有用的启动子，人组织因子基因和位于其3’-末端下游polyA信号可以功能性地连接并且能够被表达。作为启动子/增强子，可以提到人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子，病毒启动子例如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴肾病毒40(SV40)的启动子，从哺乳动物细胞例如人延伸因子1α(HEF1α)衍生的启动子/增强子。对于表达载体，作为复制因子，可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒等的那些。此外，对于表达载体可以含有作为可选择性标记物的磷酸转移酶APH(3’)II或I(neo)基因，胸苷激酶(TK)基因，二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
作为将基因引入细胞的方法，可以使用电穿孔方法，磷酸钙方法，脂转染方法等。作为其中引入表达载体的细胞，可以使用任何细胞，只要其能植入给动物细胞。为了该目的，可以使用各种培养细胞，包括例如哺乳动物细胞例如来自人、小鼠、大鼠、仓鼠和猴的培养细胞，肿瘤细胞是最优选的。作为细胞的具体例子，可以使用人骨髓瘤细胞系例如KPMM2和ARH-77，小鼠白血病细胞系例如P815，P388，和L1210。
本发明中使用的实验动物是除人之外的哺乳动物，优选小的实验动物，例如小鼠，大鼠和仓鼠，小鼠是最优选的。
根据本发明的第二方面，凝固性过高状态指人TF诱导的身体状况，并给出血小板计数减少和纤维蛋白原浓度降低，可溶性纤维蛋白单体复合物(sFMC)浓度提高以及凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)提高的病征。
尽管本发明中使用的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，倘若其对于由于TF的凝固性过高状态的持久性具有预防或治疗作用，单克隆抗体是优选的。另外也可以使用嵌合抗体，人源化抗体或以单克隆抗体为基础的单链Fv等。人源化抗体是特别优选的。
尽管在本发明第三方面中使用的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，倘若其对于由于TF的凝固性过高状态的持久性具有预防或治疗作用，单克隆抗体是优选的。另外也可以使用嵌合抗体，人源化抗体，以单克隆抗体为基础的单链Fv等。人源化抗体是特别优选的。
尽管本发明第四方面中使用的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，倘若其对于由于TF的凝固性过高状态的持久性具有预防或治疗作用，单克隆抗体是优选的。另外也可以使用嵌合抗体，人源化抗体，以单克隆抗体为基础的单链Fv等。人源化抗体是特别优选的。
尽管本发明第五方面中使用的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，倘若其对于由于TF的凝固性过高状态的持久性具有预防或治疗作用，单克隆抗体是优选的。另外也可以使用嵌合抗体，人源化抗体，以单克隆抗体为基础的单链Fv等。人源化抗体是特别优选的。
尽管本发明第六方面中使用的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，倘若其对于由于TF的凝固性过高状态的持久性具有预防或治疗作用，单克隆抗体是优选的。另外也可以使用嵌合抗体，人源化抗体，以单克隆抗体为基础的单链Fv等。人源化抗体是特别优选的。
1.抗-人TF抗体本发明中使用的抗-人TF抗体可以是任何来源，任何类型(单克隆，多克隆)和任何形状，倘若它们具有预防或治疗病毒性出血热的作用。
使用公知方法能够获得作为多克隆抗体或单克隆抗体的本发明中使用的抗-人TF抗体。哺乳动物源的单克隆抗体特别优选作为本发明中使用的抗-人TF抗体。哺乳动物源的单克隆抗体包括杂交瘤产生的那些和通过基因工程技术在用包含抗体基因的表达载体转化的宿主中产生的那些。这些抗体通过与人TF结合借助人TF来抑制血栓的形成。
2.产生抗体的杂交瘤使用公知方法基础性产生生产单克隆抗体的杂交瘤。也就是使用人TF或者其部分(片段)作为敏化抗原，并且用常规免疫方法对其进行免疫。用常规细胞融合方法使这样获得的免疫细胞与已知的亲本细胞融合，然后通过常规筛选方法筛选生产单克隆抗体的那些细胞而制备单克隆抗体。
具体地说，可以用下面的方法获得单克隆抗体。
首先，通过表达J.H.Morrissey等，细胞(Cell)，Vol.50，p.129-135(1987)中公开的TF基因/氨基酸序列能够获得用作抗体的敏化抗原的人TF。即将编码人TF的基因序列插入已知的表达载体以转化合适的宿主细胞，之后，用已经方知纯化存在于宿主细胞或者其培养上清液中的靶人TF蛋白质。本说明书参考实施例1中描述了该方法。此外，可以根据参考实施例2描述的方法，从含有TF的生物样品例如人胎盘通过提取和纯化使用作为抗原的人TF。
然后，将纯化的人TF蛋白质用作敏化抗原。或者通过例如基因重组可以产生其中人TF的C-末端的膜渗透区已经被去除的可溶性TF，并且其可以用作敏化抗原。
尽管对于要用敏化抗原免疫的哺乳动物没有特别限定，但是优选考虑它们与细胞融合中使用的亲本细胞相容性来选择。它们典型的实例包括啮齿类动物例如小鼠、大鼠和仓鼠或者兔、猴等。
使用公知方法进行用敏化抗原对动物的免疫。例如，作为典型的免疫方法，通过将敏化抗原注射到哺乳动物腹腔或皮下来进行免疫。
具体地说，用磷酸缓冲盐水(PBS)或生理盐水将敏化抗原稀释到合适的体积，根据需要将生成的悬浮液与合适量的一般佐剂例如弗氏完全佐剂混合。乳化之后，以多剂量对哺乳动物每4-21天施用。此外在用敏化抗原免疫时可以使用合适的载体。
在用这种方式免疫动物并且证实血清中期望的抗体水平提高之后，从该哺乳动物取免疫细胞并且进行细胞融合。然而脾细胞是特别优选的免疫细胞实例。
哺乳动物骨髓瘤细胞可用作与上述免疫细胞进行细胞融合的其它亲本细胞。各种已知的细胞系可用作这些骨髓瘤细胞，优选包括P3(P3×63Ag8.653)(Kearney，J.F.et al.，J. Immunol. (1979)123，1548-1550)，P3×63Ag8U.1(Yelton，D.E.et al.，Current Topicsin Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)，NS-1(Kohler，G.and Milstein，C.，Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)，MPC-11(Margulies，D.H.et al.，Cell(1976)8，405-415)，SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)，F0(de St.Groth，S.F.and Scheidegger，D.J.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)，S194(Trowbridge，I.S.，J.Exp.Med.(1978)148，313-323)andR210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133).
基本上根据已知方法例如Milstein等(Kohler，G.和Milstein，C.，酶学方法(Method Enzymol)(1981)733-46)描述的方法，可以进行上述免疫细胞和骨髓瘤细胞之间的细胞融合。
更具体地说，在例如细胞融合促进剂存在下，在常规营养肉汤中进行上述细胞融合。所使用的细胞融合促进剂的实例包括聚乙二醇(PEG)，仙台病毒(HVJ)等，另外，根据需要，可以加入佐剂例如二甲亚砜等以进一步增强融合效果。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定，例如优选的比例是免疫细胞的数目是骨髓瘤细胞数目的1-10倍。用于上述细胞融合要使用的培养基的例子包括RPMI1640培养基、MEM培养基和其它常用于该细胞培养类型的适合上述骨髓瘤细胞系生长的常规培养基。而且可以与上述介质联合使用血清补充物例如胎牛血清(FCS)。
如下进行细胞融合将在上述培养介质中的预定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞充分混合，通常以30-60％(w/v)的浓度向其中加入预先加热至大约37℃的PEG(例如具有大约1000-6000的分子量)溶液，并且混合，形成靶融合细胞(杂交瘤)。然后通过连续加入合适量的培养介质，并且通过离心反复去除上清液从而去除杂交瘤生长不期望的细胞融合试剂等。
通过在常规选择的培养基例如HAT培养基(培养基含有次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷)中培养来筛选如此获得的杂交瘤。一般将在所述HAT培养基中的培养持续足以有效杀死除靶杂交瘤之外的细胞(非融合细胞)的一段时间，一般是几天至几周。然后进行常规临界稀释，筛选其中生产靶抗体的杂交瘤并且进行单克隆。
另外，除了通过用抗原免疫除人之外的动物获得上述杂交瘤之外，也可通过体外敏化人淋巴细胞至人TF，并且将得到的敏化的淋巴细胞与人骨髓瘤细胞例如具有永久有丝分裂能力的骨髓瘤细胞系U266融合，来获得具有人TF结合活性的期望的人抗体(参见日本审查后专利公布No.1(1989)-59878)。此外，将用作抗原的人TF给予具有人抗体基因所有组成成分的全部或部分的转基因动物，获得抗-人TF的抗体产生细胞，并衰减那些细胞从衰减的细胞可以获得对于抗-人TF的人抗体(参见国际未审专利申请WO94/25585，WO93/12227，WO92/03918，WO94/02602，WO96/34096和WO96/33735)。
可以在常规的培养基中传代培养以这种方式得到的产生单克隆抗体的杂交瘤，并且可以在液氮中储存延长的时间。
为了从所述杂交瘤获得单克隆抗体，用常规方法培养所述杂交瘤，获得培养上清液，或给相容的哺乳动物施用杂交瘤使之在该哺乳动物中增殖，以腹水形式获得抗体。前一方法适合获得高纯度抗体，而后一方法适合大量生产抗体。
参考实施例2中具体描述了单克隆抗体制备的例子。在该实施例中获得了六种单克隆抗体(称为ATR-2，3，4，5，7和8)。尽管这些都可以在本发明中使用，但是ATR-5是最优选的。
3.重组抗体本发明中可以使用重组抗体作为单克隆抗体，所述重组抗体是通过重组基因技术制备的，其中从杂交瘤克隆抗体基因并且掺入到合适的载体中，然后将其引入宿主(参见，例如，Vandamme，A.M.等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)(1990)192，767-775)。
更具体地，从生产抗-人TF抗体的杂交瘤中分离编码抗-人TF抗体的可变区(V)的mRNA。利用例如公知方法例如胍超离心方法(Chirgwin，J.M.等，生物化学(Biochemistry)(1979)18，5294-5299)或AGPC方法(Chomczynski，P.和Sacchi，N.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)分离mRNA来制备总RNA，然后利用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)制备靶mRNA。另外，也可使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)直接制备mRNA。
使用逆转录酶可以从生成的mRNA合成抗体的V区的cDNA。使用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(Seikagaku Kogyo制造)可以合成cDNA。另外，可以使用PCR，利用5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech制造)和5’-RACE方法，进行cDNA的合成和扩增(Frohman，M.A.等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等，核酸研究(Nucleic Acides Res.)(1989)17，2919-2932)。
从生成的PCR产物纯化靶DNA片段并且可以与载体DNA连接。此外，从中构建重组载体然后引入大肠埃希氏杆菌等，从中筛选菌落来制备期望的重组载体。通过已知方法例如二脱氧基核苷酸链中止方法可以证实靶DNA的碱基序列。
获得编码期望的抗-人TF抗体的V区的DNA之后，将其渗入包含编码期望的抗体的恒定区(C区)的DNA的表达载体中。
为了制备本发明使用的抗-人TF抗体，在表达调控区例如增强子和/或启动子的控制下，将该抗体基因掺入到表达载体中。接着，通过将此表达载体转化宿主细胞表达抗体。
为了表达抗体基因，可以分别将编码抗体的重链(H链)或轻链(L链)的DNA掺入到表达载体中，并且同时转化宿主细胞，或者可以将编码H链和L链的DNA掺入到单一表达载体中并且转化宿主(参见国际专利申请公布WO94-11523)。
此外，除了上述宿主细胞之外，可以使用转基因动物来产生重组抗体。例如，将抗体基因插入编码一种蛋白质的基因的中间可以融合基因的形式制备重组抗体，所述蛋白质特征性地产生于乳房奶中。向山羊胚胎注射包含已经向其中插入了抗体基因的融合基团的DNA片段，并且将该胚胎引入雌性山羊体内。从接受所述胚胎的山羊或者其后代生出的转基因山羊生产的母奶中获得期望的抗体。另外，为了提高转基因山羊生产的含有期望的抗体的乳房奶的量，可以给予该转基因山羊合适的激素(Ebert，K.M.等，生物/技术(Bio/Technology)(1994)12，699-702)。
参考实施例3具体描述了制备重组抗体的方法的实施例。
4.改变的抗体在本发明中，除了上述提到的抗体之外，还可以使用以用于降低抗人的异源抗原性为目的的人工改变的重组抗体，例如嵌合抗体和人源化抗体。可以使用已知的方法制备改变的抗体。
通过将按上述方式的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接能够获得嵌合抗体，然后将其掺入到表达载体中并且引入宿主产生抗体。使用该已知方法，能够获得用于本发明的嵌合抗体。
人源化抗体也称之为重构人抗体，这是通过将除人以外的哺乳动物的抗体例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR)植入到人抗体的互补性决定区的结果。用于此目的的典型重组DNA技术是已知的(参见欧洲未审专利申请公布EP125023和WO96-02576)。
更具体地，通过PCR方法，使用多种寡核苷酸作为引物合成设计用来连接的小鼠抗体CDR和人抗体的构架区(FR)的DNA序列，所述的寡核苷酸是这样制备的，以使在CDR和FR的末端区具有相互重叠的部分(参见国际专利公布WO98/13388中描述的方法)。
对于通过CDR连接的人抗体的构架区，选择其中的互补决定区形成满意的抗原结合位点的区。当期望时，可以取代抗体可变区的构架区中的氨基酸，以使重构的人抗体的互补性决定区可以形成合适的抗原结合位点(Sato，K.等，癌症研究(Cancer Res.)(1993)53，851-856)。
人抗体的C区可以用于嵌合抗体或人源化抗体的C区。例如，在H链中可以使用Cγ1，Cγ2，Cγ3和Cγ4，在L链中可以使用Cκ和Cλ。另外，可以修饰人抗体的C区以改善抗体的稳定性或者它的生产。
由来自人以外的哺乳动物的抗体的可变区和来自人抗体的恒定区组成嵌合抗体。另一方面，由来自人以外的哺乳动物的抗体的互补性决定区和来自人抗体的构架区和C区组成人源化抗体。由于人源化抗体降低了在人体中的抗原性，使得它们作为本发明中使用的治疗剂的活性成分是有用的。
参考实施例4中具体描述了构建嵌合抗体的方法。
参考实施例5中具体描述了构建人源化抗体的方法。在该参考实施例中，使用具有表1和表2中给出的氨基酸序列的a，b，c，d，e，f，g，h，i，j，b1，d1，b3和d3型作为人源化重链(H链)可变区(V区)。
表1H链V区的氨基酸序列FR1 CDR1 FR2CDR21 2 3 4 5 6123456789012345678901234567890 12345 67890123456789 012A3456789012345L39130(a) QVQLLESGAVLARPGTSVKISCKASGFNIK DYYMH WVKQRPGQGLEWIG GNDPANGHSMYDPKFQGZ34963(b) ------------------------------ ----- -------------- -----------------M30885(c) ------------------------------ ----- -------------- -----------------M62723(d) ------------------------------ ----- -------------- -----------------Z80844(e) ------------------------------ ----- -------------- -----------------L04345(f) ------------------------------ ----- -------------- -----------------S78322(g) ------------------------------ ----- -------------- -----------------Z26827(h) ------------------------------ ----- -------------- -----------------U95239(i) ------------------------------ ----- -------------- -----------------L03147(j) ------------------------------ ----- -------------- -----------------P01742(b1) ------------------------------ ----- --R-A-------M- -----------------P01742(d1) ------------------------------ ----- --R-A-------M- -----------------Z80844(b3) ------------------------------ ----- --R-A--------- -----------------Z80844(d3) ------------------------------ ----- --R-A--------- -----------------表2H链V区的氨基酸序列(续表1)FR3 CDR3 FR47 89 10 1167890123456789012ABC345678901234 56789012 34567890123L39130(a) RAKLTAATSASIAYLEFSSLTNEDSAVYYCAR DSGYAMDY WGQGTLVTVSS234963(b) -VTI--D--TNT--M-L---RS--T-I----- -------- -----------M30885(c) -VTMLVD--KNQRS-RL--V-AA-T------- -------- -----------M62723(d) -VTI--DE-T-T--M-L---RS------F--- -------- -----------Z80844(e) -VSI--DE-TK---M-LN--RS--T---F--- -------- -----------L04345(f) -VTI--DT-T-T--M-LR--RSD-T------- -------- -----------S78322(g) K-T---DE-S-T--MQL---RS------S--- -------- -----------Z26827(h) -VTMS-DK-S-A---QWT--KAS-T-I-F--- -------- -----------U95239(i) -VTI--D--T-TVFM-L---RS--T------- -------- -----------L03147(j) -VTF--D---NT--M-LR--RSA-T------- -------- -----------P01742(b1) -VTI--D--TNT--M-L---RS--T-I----- -------- -----------P01742(d1) -VTI--DE-T-T--M-L---RS------F--- -------- -----------Z80844(b3) -VTI--D--TNT--M-L---RS--T-I----- -------- -----------Z80844(d3) -VTI--DE-T-T--M-L---RS------F--- -------- -----------
还有，使用具有表3中给出的氨基酸序列的a，b，c，b1和b2型作为人源化轻链(L链)V区。
表3L链V区的氨基酸序列FRI CDRI FR2 CDR21 2 3 4 512345678901234567890123 45678901234 567890123456789 0123456Z37332(a) DIQMTQSPSSLSASYGDRVTITC KASQDIKSFLS WYQQKPGKAPKLLIY YATSLADS68699(b) ----------------------- ----------- --------------- -------P01607(c) ----------------------- ----------- --------------- -------S65921(b1) ----------------------- ----------- -F------S--T--- -------X93625(b2) ----------------------- ----------- ------E----S--- -------FR3 CDR3FR46 7 8 9 1078901234567890123456789012345678 901234567 8901234567Z37332(a) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC LQHGESPYT FGGGTKVEIKS68699(b) --------------Y----------------- --------- ----------P01607(c) --------------Y-----------I----- --------- ----------S65921(b1) --------------Y----------------- --------- ----------X93625(b2) --------------Y----------------- --------- ----------如参考实施例6和参考实施例7所示，作为结合了上述H链V区的不同型和L链V区的不同型的抗原结合能力和TF-中和活性的评价结果，当指示为“H链V区型”-“ L链V区型”时，“b-b”、i-b”和“i-b2”结合表现出特别高的活性。图1给出了这些人源化抗体的抗原结合能力，图2给出了人TF的中和活性(TF因子Xa产生抑制活性)，图3给出了人TF的中和活性(因子X结合抑制活性)，图4给出了人TF的中和活性(TF血浆凝固抑制活性)。
5.修饰的抗体物质本发明中使用的抗体可以其抗体片段或修饰抗体物质存在，倘若它们结合人TF并且抑制人TF的活性。例如，抗体片段的实例包括单链Fv(scFv)，其中Fab，F(ab’)2Fv，或者H链或L链的Fv与合适的连接体连接。
更具体地，用酶例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体，产生抗体片段，或者构建编码这些抗体片段的基因，然后插入表达载体，其在合适的宿主细胞中表达(参见，例如，Co，M.S.等，免疫学杂志(J.Immunol.)(1994)152，2968-2976；Better，M.和Horwitz，A.H.，酶学方法(Methods in Enzymology)(1989)178，476-496；Plucktrun，A.和Skerra，A.，酶学方法(Methods inEnzymology)(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，酶学方法(Methods inEnzymology)(1986)121，652-663；Rousseaux，J.等，酶学方法(Methods in Enzymology)(1986)121，663-669；Bird，R.E.等，TIBTECH(1991)9，132-137)。
通过将抗体的H链的V区和L链的V区连接能够获得scFv。在此此scFv中，H链的V区和L链的V区通过连接体、优选肽连接体连接(Huston，J.S.等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1988)85，5879-5883)。scFv中的H链的V区和L链的V区可以从本发明说明书中作为抗体所述的任何来源产生。可以使用包括例如12-19个氨基酸残基的任意单链肽作为连接V区的肽连接体。
使用编码上述抗体的H链或H链V区的DNA和编码上述抗体的L链或L链V区的DNA的部分(所述部分是编码那些序列的全部或所需要的氨基酸序列的)作为模板，通过PCR技术，使用确定其两端的引物对进行扩增，并且合并和扩增编码肽连接体部分和确定以使其两端要分别与H链和L链连接的引物对的DNA，能够获得编码scFv的DNA。
另外，一旦构建了编码scFv的DNA，就能够通过常规方法获得包含它们的表达载体和用所述表达载体进行转化的宿主，并且通过常规方法使用得到的宿主能够获得scFv。
通过用上述相同的方法获得其基因并且使其在宿主中表达能够制备这些抗体片段。这里使用的“抗体”包括这些抗体片段。
可以使用与各种分子例如聚乙二醇(PEG)偶联的抗-人TF抗体作为抗体修饰物。这里使用的“抗体”包括这些抗体修饰物。通过将这样获得的抗体进行化学修饰能够获得这些抗体修饰物。本领域已经建立了这些方法。
6.重组抗体或改变的抗体的表达和制备利用公知方法能够表达和获得如上所述构建的抗体基因。在哺乳动物细胞的情况下，通过功能性偶联通常使用的有用的启动子、要表达的抗体基因以及其3’-末端下游的聚A信号，可以表达抗体基团。作为启动子/增强子的例子是人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子。
另外，可以用于本发明中使用的抗体的表达的其它启动子/增强子包括病毒启动子/增强子，例如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴肾病毒40(SV40)以及来源于哺乳动物细胞例如人延伸因子1α(HEF1α)的启动子/增强子。
使用SV40启动子/增强子时，通过Mulligan等的方法(自然(Nature)(1979)277，108-114)的方法可以容易地完成基因表达，在使用HEF1α启动子/增强子时，通过Mizushima等的方法(核酸研究(Nucleic Acids Res.)(1990)18，5322)的方法可以容易地完成基因表达。
在大肠埃希氏杆菌情况下，通过功能性地偶联通常使用的有用启动子、抗体分泌的信号序列以及要表达的抗体基因，可以表达所述基因。启动子的实例包括lacz启动子和araB启动子。当使用lacz启动子时，可以使用Ward等的方法(自然(Nature)(1098)341，544-546；Ward，E.S.等，FASEB J.(1992)6，2422-2427)，或当使用arab启动子时，可以使用Better等的方法(科学(Science)(1988)240，1041-1043)进行基因表达。
当在大肠埃希氏杆菌周质中生产时，应该使用pelB信号序列作为抗体分泌的信号序列(Lei，S.P.等，细菌学杂志(J.Bacteriol)(1987)169，4379-4383)。分离周质中产生的抗体之后，在使用之前适当地重折叠抗体的结构。
可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒或牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点作为复制起点。此外，为了扩增宿主细胞系统中基因拷贝数，表达载体可以包括作为可筛选标记的氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因，胸苷激酶(TK)基因，大肠埃希氏杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因，二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
可以使用任意表达系统，例如真核细胞和原核细胞系统来制备本发明中使用的抗体。真核细胞包括，例如，哺乳动物细胞系统，昆虫细胞系统，真菌细胞系统，例如丝状真菌细胞和酵母细胞，原核细胞的实例可以包括，例如，细菌细胞，例如大肠埃希氏杆菌细胞。
优选地，用于本发明的抗体可以在哺乳动物细胞例如CHO细胞，COS细胞，骨髓瘤细胞，BHK，Vero和Hela细胞中表达。
下一步，通过体内或体外培养转化的宿主细胞，能够获得靶抗体。通过公知方法培养宿主细胞。例如，可以使用DMEM，MEM，RPMI1640和IMDM作为培养基，上述介质还可以结合使用血清补充物例如胎牛血清(FCS)。
7.抗体的分离和纯化可以从细胞或宿主分离如上所述产生并且表达的抗体，并纯化至同质性。可以通过亲和柱完成本发明使用的抗体的分离和纯化。作为使用蛋白质A柱的柱子，包括Hyper D，POROS，SepharoseF.F.(Pharmacia制造)等。另外，应该使用用于蛋白质的常规分离和纯化的方法。并且对这些方法没有限制。例如，通过合适地选择和组合除了上述亲和色谱外的色谱、过滤、超滤、盐析或透析等，可以分离和纯化抗体(抗体实验手册(AntibodiesA Laboratory Manual)，Harlow和David Lane编著，冷泉港实验室，1988)。
8-1.防止凝固性过高状态持久性的活性的测定为了研究本发明预防和治疗具有持久性凝固性过高状态疾病的效力，需要一种新的动物模型，本申请的相同申请人的标题是“持久性凝固性过高状态的动物模型及其产生方法”的专利申请说明书中描述了该评价方法细节。在本说明书实施例1中描述了该评价方法的具体实施例。
实施例2和图11-13给出了使用上述人源化抗-人TF抗体“i-b2”型的实验结果。根据该实验，在实施例1中给出的动物模型系统中，在植入有包含人TF基因的肿瘤细胞的小鼠的血小板数降低到大约没有植入所述肿瘤细胞的小鼠的血小板计数的一半后(植入后5-6周)，反复静脉内给予1毫克/千克/周人源化抗-人TF抗体“i-b2”型，结果使血小板计数保持在与没有植入所述肿瘤细胞的小鼠相等的水平上，直到实验结束，即开始施药之后三星期。
施用本发明的人源化抗-人TF抗体抑制可溶性纤维蛋白单体复合物(sFMC)和凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)浓度的提高。结果证明施用本发明的抗-人TF抗体可以防止凝固性过高状态的持久性并且保持正常状态。
8-2.对感染产生的凝固性过高状态的治疗效果的证实凝血酶原时间的延长、纤维蛋白原血浆浓度的降低、纤维蛋白降解产物的血清浓度的提高等可以归因于凝固性过高状态。给予本发明抗人-TF抗体可以抑制连续输注LPS诱导的凝血酶原时间的延长、纤维蛋白原血浆浓度的降低、纤维蛋白降解产物的血清浓度的提高，结果证明本发明的抗-人TF抗体对于感染产生的凝固性过高状态的预防和/或治疗是有效的。
实施例3中具体描述了该效果。
8-3.静脉血栓形成的预防和/或治疗效果的证实实施例4具体描述了本发明的抗-人TF抗体对静脉血栓形成具有预防和/或治疗效果。
8-4.动脉血栓形成的预防和/或治疗效果的证实实施例5具体描述了本发明的抗-人TF抗体对动脉血栓形成具有预防和/或治疗效果。
8-5.对因血管中层增厚产生的疾病的预防和/或治疗效果的证实实施例6具体描述了本发明的抗-人TF抗体对因血管中层增厚产生的疾病具有预防和/或治疗效果。
9.给药和配制药物的方法本发明的治疗剂用于预防、治疗或改善具有持久性凝固性过高状态，感染、静脉血栓形成、动脉血栓形成导致的凝固性过高状态的疾病和因血管中层肥大产生的疾病的目的。
每次给药的有效剂量选自0.001毫克至1000毫克/千克体重的范围。或者，可以选择0.01-100毫克/千克，优选0.1-10毫克/千克的剂量。但是，含有本发明的抗-人TF抗体的治疗剂不局限于这些剂量。
优选的给药方法是但不局限于静脉内注射、静脉内滴注等。
可以使用标准方法(Remington制药科学(Remington’sPharmaceutical Science)，最新版本，Mark PublishingCompany，Easton.USA)配制含有抗-人TF抗体作为活性成分的本发明的治疗剂，并且其中可以含有药学可接受载体和/或添加剂。
这样的载体或添加剂的例子包括水，药学可接受有机溶剂，胶原，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羧乙烯基聚合物，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸钠，藻酸钠，水溶性葡聚糖，羧甲基淀粉钠，果胶，甲基纤维素，乙基纤维素，黄原酸胶，阿拉伯胶，酪蛋白，琼脂，聚乙二醇，双甘油，甘油，丙二醇，凡士林，石蜡，十八烷基醇，硬脂酸，人血清白蛋白(HSA)，甘露糖醇，山梨糖醇，乳糖，药学可接受表面活性剂等。
使用的添加剂选自但是不局限于上述物质及其组合，如果需要，取决于本发明的剂型。例如，当用作注射液时，可以将纯化的抗-人TF抗体溶解于一种溶剂例如生理盐水、缓冲液和葡萄糖溶液中，其中可以加入抗-吸附剂，例如Tween80、Tween20、明胶和人血清白蛋白。或者，可以将它们冻干并在使用之前溶解并且重新配制成剂型。作为用于冻干的赋形剂，可以使用糖醇和糖例如甘露糖醇和葡萄糖。
实施例将参照实施例更具体地解释本发明。
实施例1.实验小鼠的产生将其中编码人组织因子基因(SEQ ID NO103)已经插入到动物表达载体pCOS1中的载体(hTF-pCOS1)用限制酶PruI消化并且线性化，其然后通过电穿孔引入人骨髓瘤细胞系KPMM2(FERM BP-7419)。
通过用EcoRI和SamI消化从HEF-PMh-gγ1(WO92/19759)去除抗体基因，然后通过连接EcoRI-NotI-BamHI接合体(Takara Shuzo)构建pCOS1。在含有1毫克/毫升G418的RPMI1640培养基(含有20％FCShIL-64ng/ml)中培养之。通过流式细胞仪证实生长的细胞是使用抗-人组织因子抗体(American Diganostica)人组织因子的表达。这给出其中已经引入人组织因子基因的细胞系KPMM2/TF226。
在含有4ng/ml人IL-6和20％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养引入上述人组织因子基因之前的亲本细胞株(KPMM2/亲本)和基因引入株KPMM2/TF226。以1×107细胞分别将这样培养的KPMM2/TF226细胞和亲本KPMM2/亲本细胞皮下植入到SCID小鼠(从日本CLEA获得，雄性，7周龄，平均体重大约22克)的胁腹中，并且研究肿瘤体积、血液中血小板数以及人组织因子、纤维蛋白原、可溶性纤维蛋白单体复合物(sFMC)和凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)的血浆浓度随着时间的变化。
结果如图5所示，所有小鼠的肿瘤体积随着时间而增大。但是如图6所示，其中植入了其中引入了人组织因子基因的细胞的小鼠人组织因子的血浆浓度随着时间增加，但是植入了其中没有引入人组织因子基因的动物细胞的小鼠一点没有增加。如图7和图8所示，在植入了其中引入了人组织因子基因的动物细胞的小鼠中，血小板和纤维蛋白原各自随着时间减少，其表明这些血液中的凝固成分被消耗。相反，植入了其中没有引入人组织因子基因的动物细胞的小鼠中，没有发现血液中这些凝固成分的减少。
如图9和图10所示，在植入了其中引入了人组织因子基因的动物细胞的小鼠中，可溶性纤维蛋白单体复合物(sFMC)和凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)各自的血浆浓度随着时间而增大，其表明凝固性过高状态是持久性的。相反，植入了其中没有引入人组织因子基因的动物细胞的小鼠中，没有发现血液中上述凝固成分的减少。
由上述结果证明，在植入了其中引入了人组织因子基因的动物细胞的小鼠中，凝固性过高状态是持久性的，证明本发明的动物作为持久性凝固性过高状态的模型是有用的。
实施例2在实施例1描述的模型中研究了人源化抗-人TF抗体“i-b2”型的作用。对SCID小鼠(日本CLEA，雄性，7周龄，平均体重大约22克)植入KPMM2/TF226之后5-6周，当血小板数减少到没有植入肿瘤组的一半时，证明凝固性过高状态的持久性，因此，自植入之后第45天开始，每周一次静脉内施用1毫克/千克人源化抗-人TF抗体“i-b2”型。结果，在施用人源化抗-人TF抗体“i-b2”型之后第三天，血小板数恢复至高于没有植入肿瘤组的水平，从实验开始到实验结束的第三周，血小板计数保持在和没有植入肿瘤组相等的水平上。
在第三次施用人源化抗-人TF抗体“i-b2”型之后第六天，测定可溶性纤维蛋白单体复合物(sFMC)的和凝血酶-抗凝血酶III复合物(TAT)的血浆浓度，发现施用该抗体抑制它们的增加(图12和图13)。这些结果表明人源化抗-人TF抗体“i-b2”型通过一周一次施用于其中长时间保持凝固性过高状态的模型而具有稳定保持正常水平凝固的作用。
实施例3在异氟烷麻醉下，以1mg/kg/hr(2ml/kg/hr)剂量以连续方式对食蟹猴(从中国南宁Chuang灵长类实验动物研究中心进口，雄性和雌性数目相等，估计年龄5-7岁，体重2.99-5.81千克)静脉内注射溶解于生理盐水中的LPS6小时。在开始连续注射LPS之前10分钟，分别对施用人源化抗-人TF抗体组的猴子静脉内施用0.3毫克/千克(1毫升/千克)的人源化抗-人TF抗体“i-b2型”，对对照组的猴子静脉内施用溶剂(20mM乙酸钠/150mM氯化钠，pH6.0)。
在连续注射LPS结束时，通过插入股动脉的导管抽取柠檬酸化血液和正常血液，测定凝血酶原时间、纤维蛋白原的血浆浓度和纤维蛋白降解产物的血清浓度。结果如表4所示，LPS注射导致凝血酶原时间延长，纤维蛋白原的血浆浓度的降低和纤维蛋白降解产物的血清浓度的提高，即凝固性过高状态，但是在接受人源化抗-人TF抗体“i-b2型”的猴子中，这些变化被强有力地抑制。这些结果表明人源化抗-人TF抗体“i-b2型”能够抑制感染导致的凝固性过高状态。
表4通过LPS注射人源化抗-人TF抗体对凝固性过高的作用
*平均值±标准偏差实施例4在通过静脉郁滞和对静脉壁的损伤诱导的静脉血栓形成模型中，评价人源化抗-人TF抗体对静脉血栓形成的作用。通过结扎血管产生静脉郁滞。使用“聚多卡醇(Polidocanol)(一种用于食管静脉曲张的治疗药，Kreussler)”诱导对静脉壁的损伤。
在静脉血栓模型中使用估计年龄3-4岁，体重2.97-3.99千克的食蟹猴(从中国Chuang灵长类实验动物研究中心获得)。用异氟烷和一氧化二氮的混合物麻醉猴于以暴露两侧颈静脉。通过缝合围绕接近心脏的部位，完全结扎暴露的颈静脉的节段，并通过缝合围绕接近头部的部位，可逆地结扎，以便以后松开。将导管以指向头部的方向从靠近心脏的部位插入暴露的颈静脉两端结扎之间的节段中。通过导管除去暴露的颈静脉两端结扎之间的节段中的血液，内部用生理盐水洗涤。通过导管向暴露的血管结扎之间的节段中注射0.5％的聚多卡醇，移去导管，同时在紧靠导管插入点的上端处可逆性地结扎血管节段。
五分钟之后，松开心脏侧可逆性结扎点排出聚多卡醇。松开头侧的可逆性结扎点排出少量血，然后暴露的血管的节段完全位于紧靠导管插入点的上端。向节段中填充血液后，在接近头部的部分完全结扎暴露的颈静脉。调节两端完全接扎之间的节段为1.5cm长。30分钟之后，测定形成的凝块的湿重。为了评价，使用两侧颈静脉中凝块湿重的加和。在静脉血栓形成开始之前2小时，以0.3毫克/千克和1.5毫克/千克的剂量静脉内施用人源化抗-人TF抗体“i-b2型”。
表5给出了结果。施用人源化抗-人TF抗体导致形成的血块的重量的减小。因此证明人源化抗-人TF抗体在此模型中具有预防静脉内凝块形成的作用。
表5食蟹猴静脉血栓形成中人源化抗-人TF抗体的作用
实施例5在使用通过血管狭窄和对动脉壁的损伤诱导的动脉血栓形成模型中，评价人源化抗-人TF抗体对动脉血栓形成的作用。通过用圆形针尖拧紧的20G针头紧紧结扎血管然后移去针产生血管狭窄和对动脉壁的损伤。这是模拟由于动脉粥样硬化的血管狭窄和由于斑块破裂的对动脉壁损伤的模型。
使用估计年龄3-5岁，体重3.55-3.99千克的食蟹猴(从中国Chuang灵长类实验动物研究中心获得)。用氯胺酮(肌内施用)和butofanol(肌内施用)麻醉猴子暴露右侧主颈动脉。暴露的血管周围插入多普勒流量计的探头，并且监测血流量大约5分钟。证实血流流量恒定之后，在探头头侧的邻近部位周围诱导血管狭窄和对动脉壁的损伤。
接下来的15分钟观测血流量，并且测定由于血栓形成的血管梗阻时间。松开右主颈动脉处的结扎之后，对施用抗体组的猴子施用人源化抗-人TF抗体。在左主颈动脉处也测定由于血栓形成的血管梗阻时间。在左主颈动脉血栓形成开始之前1小时以0.3毫克/千克和1.5毫克/千克的剂量静脉内施用人源化抗-人TF抗体“i-b2型”。
表6给出了结果。施用人源化抗-人TF抗体导致血管梗阻时间的缩短。因此证明人源化抗-人TF抗体在此模型中具有预防动脉内血栓形成的作用。
表6食蟹猴动脉血栓形成中人源化抗-人TF抗体的作用
*都是各组的平均值实施例6肌内用5-10毫克/千克Ketalar，和静脉内用15-20毫克/千克戊巴比妥麻醉食蟹猴(从KEARI Inc.购得，Vietnam产猴，估计年龄4-5岁)，并且切割颈部暴露颈动脉。通过外颈动脉，插入Fogarty导管(3-5F)，并且将囊充气刮掉血管内膜5分钟。刮掉后抽出导管并且缝合伤口。一个月之后，杀死动物，并且取出颈动脉。此时，以相同方式取出没有充气损伤的另一侧的颈动脉。
在血管损伤之前10分钟，以0.3毫克/千克的剂量静脉内施用人源化抗-人TF抗体“i-b2型”1分钟。将取出的动脉固定在福尔马林中，制备组织切片，用HE染料和Elastica van Gieson染料染色，接着成像分析来测定内膜区。结果如图7所示，人源化抗-人TF抗体“i-b2型”强烈抑制内膜的肥大。这表明人源化抗-人TF抗体“i-b2型”通过抑制血管组织本身的生长在短时间内抑制腔区的变窄，其提示这能够有效地防止再狭窄。
表7动物序号未损伤的血疗损伤的血疗中层面积(mm2) 中层面积(mm2)对照组 1 1.062.15(203％)2 0.741.45(196％)3 0.821.78(217％)抗-人TF抗体4 0.751.15(153％)5 0.780.96(123％)6 0.860.98(114％)(相对于非损伤侧的百分比)实施例7在实施例1描述的模型中研究人源化抗-人TF抗体“i-b2型”和低分子量肝素的作用。对SCID小鼠(CLEA日本，雄性，7周龄，平均体重大约24克)植入KPMM2/TF226之后6-7周，血小板计数减少至没有植入肿瘤组的大约一半，证实凝固性过高状态的持久性。因此，在植入之后49天开始静脉内施用1毫克/千克人源化抗-人TF抗体“i-b2型”或者通过皮下包埋允许24小时持续释放的渗透泵以601.5IU/千克，1900.3IU/千克，和6487.3IU/千克连续施用低分子量肝素。结果，施用人源化抗-人TF抗体“i-b2”型之后第一天，血小板计数恢复，第三天血小板计数超过没有植入肿瘤组，并且即使7天之后还保持第三天的效果。相反，在施用6487.3IU/千克低分子量肝素组，在连续给药之后第一天和第二天观察到血小板计数稍微恢复，但是在第三天该效果消失，尽管血小板数还稍微有所恢复(图14)。
参照实施例1.制备可溶性人TF的方法用下面的方法制备可溶性人TF(shTF)。
向哺乳动物细胞表达载体(包含新霉素抗性基因和DHFR基因)插入编码随后被FLAG肽M2置换的人TF穿入区(220位氨基酸)的基因，并且引入CHO细胞。关于人TF的cDNA序列参见James H.Morrissey等的文章(细胞(Cell)(1987)50129-135)。SEQ ID NO101和102给出了该可溶性人TF的基因序列和氨基酸序列。用G418筛选药物之后，筛选表达细胞，然后用氨甲喋呤使其进行表达扩增，并且构建表达shTF的细胞。
在没有血清的培养基CHO-S-SFMII(GIBCO)中培养细胞以获得含有shTF的培养上清液。用等体积的40mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)将其稀释2倍，加到用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)平衡过的Q-Sepharose高流速柱(100毫升，Pharmacia Biotech)。用含有0.1M氯化钠的相同缓冲液洗涤之后，氯化钠的浓度变为0.3M，从柱中洗脱出shTF。为了获得shTF级分，加入硫酸铵至2.5M终浓度，离心(10000rpm，20分钟)沉淀出污染蛋白质。将上清液加给Butyl TOYOPEARL(30毫升，TOSOH)，然后用含有2.5M硫酸铵的50mM Tris-HCl缓冲液(pH6.8)洗涤。
在50mM Tris-HCl缓冲液(pH6.8)中，硫酸铵的浓度从2.5M至0M线性地降低使得洗脱shTF。通过Centri-Prep10(Amicon)浓缩含有shTF的峰级分。对用含有150mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)平衡过的TSK凝胶G3000SWG柱(21.5×600mm，TOSOH)加入浓缩物，收集shTF的峰级分。用0.22μm膜过滤器无菌过滤并且证明产物是可溶性人TF(shTF)。假定样品的摩尔消光系数ε＝40130并且分子量＝43210，计算样品浓度。
参考实施例2抗-TF单克隆抗体的制备1.人TF的纯化根据Ito的方法(Ito，T.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)114691-696，1993)对来自人胎盘的TF进行纯化。因此，在含有1.0mM苄脒盐酸盐，1mM苯基甲基磺酰氟，1mM二异丙基氟磷酸酯和0.02％叠氮化钠的Tris缓冲盐水(TBS，pH7.5)中将人胎盘匀浆，然后用冷丙酮将沉淀脱脂。将获得的脱脂粉末悬浮于含有2％TritonX-100的上述缓冲液中溶解TF。
使用伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B柱(Pharmacia)和抗-TF抗体-结合琼脂糖4B柱(Pharmacia)将上清液进行亲和色谱以获得纯化的TF。用超滤膜(PM-10，Amicon)浓缩并且作为纯化样品在4℃下储存。
通过结合了市售抗-TF单克隆抗体(American Diagnostica)和多克隆抗体(American Diagnostica)的夹心ELISA，用重组TF为标准物对纯化的样品中的TF含量进行定量。
通过使样品进行SDS-PAGE，使用4-20％密度梯度聚丙烯酰胺凝胶，并且将产物银染色，证实纯化样品的纯度。
2.免疫和杂交瘤制备将纯化的人TF(大约70微克/毫升)与等体积的弗氏完全佐剂(Difco)混合之后，以10微克TF/小鼠皮下接种到5周龄Balb/c雄性小鼠(Nippon Charles River)的腹部。第12，18，和25天，用与弗氏不完全佐剂混合的TF以5微克/小鼠TF皮下加强免疫，在第32天以5微克/小鼠腹膜内给予用PBS稀释的TF溶液作为最后免疫。
最后免疫之后三天，从四只小鼠制备脾细胞，并且通过聚乙二醇方法以大约其1/5细胞数与小鼠骨髓瘤细胞系P3U1融合。将融合细胞悬浮于含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(下文称之为RPMI-培养基)(Lifetech Oriental)，每只小鼠接种到96孔板的400个孔中(大约400细胞/孔)。融合之后第1，2，3和5天，用含有HAT(DainipponSeiyaku)和调制的H1(Boehringer Mannheim GmbH)的RPMI-培养基(下文称之为HAT-培养基)置换一半体积的原培养基来进行杂交瘤的HAT筛选。
通过进行有限稀释两倍克隆通过下述筛选方法筛选的杂交瘤。
对于有限稀释，在两个96-孔板中每孔接种平均0.8个细胞。通过显微镜检查证实单一菌落的孔，通过下面对TF-结合活性和TF-中和活性的测定来筛选克隆。得到的克隆的条件从HAT-培养基变为RPMI-培养基。证实由于适应导致的抗体产生能力降低不存在之后，再次进行有限稀释进行完全克隆。通过上述方法，获得产生六种强烈抑制TF/因子VIIa复合体和X因子结合的抗体(ATR-2，3，4，5，7和8)的杂交瘤。
3.腹水形成和抗体的纯化根据标准方法进行创建的杂交瘤的腹水形成。因此，将体外传代培养的106杂交瘤腹膜内植入给事先已经接受两次静脉内施用的矿物油的BALB/c雄性小鼠。从植入之后1-2周出现腹部膨胀的小鼠收集腹水。
使用装有蛋白质A柱(Nippon Gaishi)的ConSepLC100系统(Millipore)从腹水纯化抗体。
4.细胞-ELISA从ATCC获得已知高水平表达TF的人膀胱癌细胞J82(Fair D.S.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26211692-11698，1987)，并且在37℃，5％CO2和100％湿度条件下在RPMI-培养基中传代和保持。
通过以105细胞/孔用J82细胞接种96-孔板，在上述条件下培养一天，去除培养基后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，加入4％低聚甲醛溶液(PFA)，并且使之在冰上静置10分钟以固定来制备细胞-ELISA板。去除PFA之后，用PBS洗涤平板，向其中加入含有1％BSA和0.02％叠氮化钠的Tris缓冲液(封闭溶液)，使用之前在4℃下储存平板。
用下面的方法进行细胞-ELISA。因此，从如上制备的平板去除封闭缓冲液，向其中加入抗-TF抗体溶液或杂交瘤培养上清液并且在室温下反应1.5小时。用含有0.05％Tween20的PBS洗涤之后，碱性磷酸酶偶联的山羊抗-小鼠IgG(H+L)(Zymed)反应1小时。洗涤之后，加入1毫克/毫升对硝基苯磷酸二钠(Sigma)，1小时之后测定405nm处的吸光度来确定与J82细胞结合的抗-TF抗体的量。
5.以Xa因子活性为指数的针对TF的中和活性的测试系统向含有5mM氯化钙和0.1％牛血清白蛋白的50微升Tris缓冲盐水(TBSpH7.6)中加入10微升从人胎盘得到的凝血因子III(thromboplastin)溶液(5毫克/毫升)(Thromborel S)(Boehring)和10微升VIIa因子溶液(82.5ng/ml)(American Diagnostics)，室温下反应1小时，使生成TF/VIIa因子复合物。加入10微升预定浓度的稀释的抗-TF抗体溶液或杂交瘤培养上清液以及10微升X因子溶液(3.245微克/毫升)(Celsus Laboratories)，并且反应45分钟之后，加入10微升0.5M EDTA中止反应。向其中加入50微升2mM S-2222溶液(Daiichi Kagaku Yakuhin)，测定在30分钟内的405/655nm处吸光度的变化并且设定为TF的X-因子-产生活性。在该方法中，能够测定抑制TF/VIIa因子复合物和X因子结合的抗体的活性。
6.针对血浆凝固抑制活性的测试系统50微升适当稀释的抗-TF抗体溶液与100微升购得的正常人血浆(Kojin Bio)混合并且在37℃下反应3分钟。然后向其中加入50微升从人胎盘得到的凝血因子III溶液(1.25毫克/毫升)，利用血浆凝固测定仪(CR-AAmelung)测定血浆凝固时间。
7.抗体同型的测定对于杂交瘤的培养上清液和纯化的抗体，使用小鼠单克隆抗体同型测定试剂盒(Amersham制造)来证实抗体的同型。结果如下。
表5抗-TF单克隆抗体的免疫球蛋白同型ATR-2 IgG1，κATR-3 IgG1，κATR-4 IgG1，κ
ATR-5 IgG1， κATR-7 IgG2a，κATR-8 IgG2a，κ参照实施例3.编码抗人TF的小鼠单克隆抗体的V区的DNA的克隆(1)mRNA的制备使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech)从参照实施例2获得的杂交瘤ATR-5(IgG1κ)制备mRNA。根据试剂盒所附的说明书，在提取缓冲液中将各杂交瘤细胞完全匀浆，然后，通过寡(dT)-纤维素离心柱之后，通过乙醇沉淀来纯化mRNA。将mRNA沉淀溶解于洗脱缓冲液。
(2)编码小鼠抗体V区的基因的cDNA的制备和扩增(i)H链V区cDNA的克隆使用5’-RACE方法(Frohman，M.A.等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)858998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)172919-2932.1989)进行抗人TF的小鼠单克隆抗体的H链V区的编码基因的克隆。关于5’-RACE方法，使用Marathon cDNA扩增试剂盒(CLONTECH)并且根据试剂盒所附的说明书进行操作。
使用大约1微克如上制备的mRNA为模板，加入试剂盒所附的cDNA合成引物，其在42℃下与逆转录酶反应60分钟进行对cDNA的逆转录。其与DNA聚合酶I，DNA连接酶和RNase H在16℃下反应1.5小时，并且和T4 DNA聚合酶在16℃下反应45分钟，从而合成双链cDNA。用苯酚和氯仿提取该双链cDNA，通过乙醇沉淀回收。
通过在16℃下与T4 DNA连接酶反应过夜，cDNA连接物连接该双链cDNA的两个末端。用含有0.1mM EDTA的10mM Tricine-KOH(pH8.5)和将反应混合物稀释50倍。使用该产物为模板，通过PCR扩增编码H链V区的基因。对于5’-端引物使用试剂盒所附的连接物引物1，对于3’-端引物使用MHC-G1引物(SEQ ID NO1)(S.T.Jones，等，生物技术(Biotechnology)，988-89，1991)。
100微升用于ATR-5抗体H链V区的PCR溶液中含有120mMTris-HCl(pH8.0)，10mM KCl，6mM(HN4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.001％BSA，0.2mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1mM MgCl2，2.5单位的KODDNA聚合酶(Toyo Boseki)，30-50pmole连接物引物1，以及MHC-Gl引物，和1-5微升其上已经连接了cDNA连接物的cDNA的反应混合物。
使用DNA热循环仪480(Perkin-Elmer)进行所有的PCR，并且以94℃30秒，55℃30秒和74℃1分钟的温度循环将PCR进行30次循环。
(ii)L链V区cDNA的克隆使用5’-RACE方法(Frohman，M.A.等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)858998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)172919-2932.1989)进行抗人TF的小鼠单克隆抗体的L链V区的编码基因的克隆。关于5’-RACE方法，使用Marathon cDNA扩增试剂盒(CLONTECH)，并且根据试剂盒所附的说明书进行操作。使用大约1微克如上制备的mRNA为模板，加入cDNA合成引物，其在42℃下与逆转录酶反应60分钟进行对cDNA的逆转录。
其与DNA聚合酶I，DNA连接酶和RNase H在16℃下反应1.5小时，并且和T4 DNA聚合酶在16℃下反应45分钟，从而合成双链cDNA。用苯酚和氯仿提取该双链cDNA，通过乙醇沉淀回收。通过在16℃下与T4DNA连接酶反应过夜，cDNA连接物连接该双链cDNA的两个末端。用含有0.1mM EDTA的10mM Tricine-KOH(pH8.5)将反应混合物稀释50倍。使用该产物为模板，通过PCR扩增编码L链V区的基因。对于5’-端引物使用连接物引物1，对于3’-端引物使用MKC引物(SEQ IDNO2)(S.T.Jones，等，生物技术(Biotechnology)，988-89，1991)。
100微升PCR溶液中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM KCl，6mM(HN4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.001％BSA，0.2mMdNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1mM MgCl2，2.5单位的KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)，30-50pmole连接物引物1，以及MKC引物，和1微升其上已经连接了cDNA连接物的cDNA的反应混合物。
使用DNA热循环仪480(Perkin-Elmer)进行所有的PCR，开且以94℃30秒，55℃30秒和74℃1分钟的温度循环将PCR进行30次循环。
(3)PCR产物的纯化和片段化用苯酚和氯仿提取上述PCR反应混合物，并且通过乙醇沉淀回收扩增的DNA片段。37℃下用限制酶XmaI(New English Biolabs)消化DNA片段1小时。通过使用2％-3％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离XmaI消化混合物，切下含有大约500bp长DNA片段作为H链V区和大约500bp长DNA片段作为L链V区的琼脂糖条。用苯酚和氯仿提取琼脂糖条，并且用乙醇沉淀DNA片段，然后将其溶解于10微升含有lmM EDTA的10mM Tris-HCl(pH8.0)和(下文称之为TE)。
使用DNA连接酶试剂盒2型(Takara Shuzo)，根据试剂盒所附说明书，在16℃下反应1小时，使如上制备的含有编码小鼠H链V区和L链V区的基因的XmaI消化的DNA片段和用XmaI消化制备的pUC19质粒载体连接。
将连接混合物加入100微升大肠埃希氏杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)并且在冰上温育30分钟并且在42℃下温育1分钟。
然后，向其中加入300微升Hi-感受态肉汤(Nippongene)并且在37℃下温育1小时。然后将大肠埃希氏杆菌平铺在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂培养基(分子克隆实验指南(Molecular ClongALaboratory Manual)，Sambrook等，冷泉港实验出版社，1989)(下文中称为LBA琼脂培养基)上，并且在37℃下温育过夜获得大肠埃希氏杆菌转化体。
该转化体在37℃下在3毫升或4毫升含有50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基(下文称之为LBA培养基)培养过夜，使用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞级分制备质粒DNA，然后测定核苷酸序列。
(2)编码小鼠抗体V区的基因的核苷酸序列的测定使用染料中止子循环测序FS即用反应试剂盒(Perkin-Elmer)，通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测定质粒中cDNA编码区的核苷酸序列。作为测序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)(SEQ ID NO3)和M13引物RV(Takara Shuzo)(SEQ ID NO4)，通过在两个方向证实核苷酸序列来确定序列。
这样获得的包含来自杂交瘤ATR-5的编码小鼠H链V区的基因的质粒记为ATR-5Hv/pUC19，包含来自杂交瘤ATR-5编码小鼠L链V区的基因的质粒记为ATR-5Lv/pUC19。SEQ ID NO5和99分别给出了质粒ATR-5Hv/pUC19中包含的各小鼠抗体的H链V区的编码基因的核苷酸序列(包括相应的氨基酸序列)，SEQ ID NO6和100分别给出了质粒ATR-5Lv/pUC19中包含的各小鼠抗体的L链V区的编码基因的核苷酸序列(包括相应的氨基酸序列)。
参者实施例4.嵌合抗体的构建制备嵌合ATR-5抗体，其中小鼠ATR-5抗体V区连接人抗体C区。通过将编码ATR-5抗体V区的基因与编码人抗体C区的表达载体连接构建嵌合抗体表达载体。
(1)嵌合抗体H链V区的构建为了使其与编码人抗体H链C区的表达载体连接，通过PCR方法修饰ATR-5抗体H链V区。设计5’-端引物ch5HS(SEQ ID NO7)使其与编码V区的DNA的5’-端杂交并且具有Kozak共有序列(Kozak，M.等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196947-950，1987)和限制酶SalI的识别序列。设计3’-端引物ch5HA(SEQ ID NO8)使其与编码J区的DNA的3’-端杂交并且具有限制酶NheI的识别序列。
100微升PCR溶液中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM KCl，6mM(HN4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.001％BSA，0.2mMdNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1mM MgCl2，2.5单位的KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)，50pmole ch5HS引物和ch5HA引物，以及1微升质粒ATR5Hv/pUC19作为模板DNA。对于PCR，使用DNA热循环仪480(Perkin-Elmer)，并且以94℃30秒，55℃30秒和74℃1分钟的温度循环将PCR进行30次循环。
用苯酚和氯仿提取上述PCR反应混合物，并且通过乙醇沉淀回收扩增的DNA片段。在37℃下用限制酶NheI(Takara Shuzo)消化DNA片段1小时，然后37℃下用限制酶SalI(Takara Shuzo)消化1小时。通过使用3％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离消化混合物，切下含有大约450bp长DNA片段的琼脂糖条。用苯酚和氯仿提取琼脂糖条，并且用乙醇沉淀DNA片段，然后将其溶解于20微升TE中。
作为克隆载体，使用其中引入限制酶NheI，SalI，和SplI，BglII的识别序列的改变的启动子载体(下文称之为CVIDEC)。使用DNA连接试剂盒2型(Takara Shuzo)根据试剂盒所附说明书在16℃下反应1小时，使如上制备的编码小鼠H链V区的基因片断和用NheI和SalI消化制备的CVIDEC载体连接。
将连接混合物加入100微升大肠埃希氏杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)，并且在冰上温育30分钟并且在42℃下温育1分钟。然后，向其中加入300微升Hi-感受态肉汤(Nippongene)并且在37℃下温育1小时，然后将大肠埃希氏杆菌平铺在LBA琼脂培养基上，并且在37℃下温育过夜获得大肠埃希氏杆菌转化体。该转化体在37℃下在3毫升LBA培养基中培养过夜，使用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞级分制备质粒DNA。
使用染料中止子循环测序FS即用反应试剂盒(Perkin-Elmer)通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测定质粒中cDNA编码区的核苷酸序列。作为测序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)(SEQ ID NO3)和M13引物RV(Takara Shuzo)(SEQ ID NO4)，通过在两个方向证实核苷酸序列来测定序列。包含5’-端编码ATR-5抗体H链V区的基因，SalI识别序列和Kozak共有序列，和3’-端NheI识别序列的质粒记为chATR5Hv/CVIDEC。
(2)嵌合抗体L链V区的构建为了使其与编码人抗体L链C区的表达载体连接，通过PCR方法修饰ATR-5抗体L链V区。设计5’-端引物ch5LS(SEQ ID NO9)使其与编码V区的DNA的5’-端杂交并且具有Kozak共有序列(Kozak，M.等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196947-950，1987)和限制酶BglII的识别序列。设计3’-端引物ch5LA(SEQ ID NO10)使其与编码J区的DNA的3’-端杂交并且具有限制酶SplI的识别序列。
100微升PCR溶液中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM KCl，6mM(HN4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.001％BSA，0.2mMdNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1mM MgCl2，2.5单位的KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)，50pmole ch5LS引物和ch5LA引物，以及1微升质粒ATR5Lv/pUC19作为模板DNA。对于PCR，使用DNA热循环仪480(Perkin-Elmer)，并且以94℃30秒，55℃30秒和74℃1分钟的温度循环将PCR进行30次循环。
用苯酚和氯仿提取上述PCR反应混合物，并且通过乙醇沉淀回收扩增的DNA片段。在37℃下用限制酶SplI(Takara Shuzo)消化DNA片段1小时，然后37℃下用限制酶BglII(Takara Shuzo)消化1小时。通过使用3％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离消化混合物，切下含有大约400bp长DNA片段的琼脂糖条。用苯酚和氯仿提取琼脂糖条，并且用乙醇沉淀DNA片段，然后将其溶解于20微升TE中。
使用DNA连接酶试剂盒2型(Takara Shuzo)根据试剂盒所附说明书在16℃下反应1小时，使如上制备的编码小鼠L链V区的基因和用SplI和BglII消化制备的CVIDEC载体连接。
将连接混合物加入100微升大肠埃希氏杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)并且在冰上温育30分钟并且在42℃下温育1分钟。然后，向其中加入300微升Hi-感受态肉汤(Nippongene)并且在37℃下温育1小时，然后将大肠埃希氏杆菌平铺在LBA琼脂培养基上，并且在37℃下温育过夜获得大肠埃希氏杆菌转化体。该转化体在37℃下在3毫升LBA培养基中培养过夜，使用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞级分制备质粒DNA。
使用染料中止子循环测序FS即用反应试剂盒(Perkin-Elmer)通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测定质粒中cDNA编码区的核苷酸序列。作为测序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)和M13引物RV(Takara Shuzo)，通过在两个方向证实核苷酸序列来测定序列。包含5’-端编码ATR-5抗体L链V区的基因和具有BglII识别序列和Kozak共有序列以及3’-端具有SplI识别序列的质粒记为chATR5Lv/CVIDEC。
(3)嵌合抗体表达载体的构建使用从IDEC引入的抗体表达载体构建嵌合抗体表达载体。作为载体，使用IgG1-型抗体表达载体H5KG1(V)和IgG4-型抗体表达载体N5KG4P。通过使ATR-5的H链C区的编码基因与紧位于表达载体H5KG1(V)或N5KG4P的人抗体H链C区之前的SalI-NheI位点连接并使ATR-5的L链C区的编码基因与紧位于表达载体H5KG1(V)或N5KG4P的人抗体L链C区之前的BglII-SplI位点连接，产生嵌合ATR-5抗体表达载体。
(i)H链V区的引入在37℃下用限制酶NheI(Takara Shuzo)消化质粒chATR5Hv/CVIDEC3小时，37℃下用限制酶SalI(Takara Shuzo)消化3小时。通过使用1.5％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离消化混合物，切下含有大约450bp长DNA片段的琼脂糖条。用苯酚和氯仿提取琼脂糖条，并且用乙醇沉淀DNA片段，然后将其溶解于20微升TE中。
在37℃下用限制酶NheI(Takara Shuzo)消化表达载体N5KG1(V)和N5KG4P3小时，37℃下用限制酶SalI(Takara Shuzo)消化3小时。通过使用1.5％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离消化混合物，切下含有大约9000bp长DNA片段的琼脂糖条。用苯酚和氯仿提取琼脂糖条，并且用乙醇沉淀DNA片段，然后将其溶解于20微升TE中。
使用DNA连接试剂盒2型(Takara Shuzo)根据试剂盒所附说明书在16℃下反应1小时，使如上制备的包含编码H链V区的基因和用SalI和NheI消化的N5KG1(V)和N5KG4P连接。
将连接混合物加入100微升大肠埃希氏杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)并且在冰上温育30分钟并且在42℃下温育1分钟。然后，向其中加入300微升Hi-感受态肉汤(Nippongene)并且在37℃下温育1小时，然后将大肠埃希氏杆菌平铺在100微克/毫升LBA琼脂培养基上，并且在37℃下温育过夜获得大肠埃希氏杆菌转化体。该转化体在37℃下在3毫升LBA培养基中培养过夜，使用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞级分制备质粒DNA。包含编码嵌合ATR-5抗体H链基因的这些质粒分别定为chATR5Hv/N5KG1(V)和chATR5Hv/N5KG4P。
(ii)L链V区的引入在37℃下用限制酶BglII(Takara Shuzo)和SplI(Takara Shuzo)消化质粒chATR5Lv/CVIDEC1.5小时。通过使用1.5％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离消化混合物，切下含有大约400bp长DNA片段的琼脂糖条。用苯酚和氯仿提取琼脂糖条，并且用乙醇沉淀DNA片段，然后将其溶解于20微升TE中。
在37℃下用限制酶BglII(Takara Shuzo)和SplI(Takara Shuzo)消化质粒chATR5Hv/N5KG1(V)和chATR5Hv/N5KG4P1.5小时。通过使用1.5％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离消化混合物，切下含有大约9400bp长DNA片段的琼脂糖条。用苯酚和氯仿提取琼脂糖条，并且用乙醇沉淀DNA片段，然后将其溶解于20微升TE中。
使用DNA连接试剂盒2型(Takara Shuzo)根据试剂盒所附说明书在16℃下反应1小时，使如上制备的包含编码L链V区的基因和用SplI和BglII消化的chATR5Hv/N5KG1(V)或chATR5Hv/N5KG4P连接。
将连接混合物加入100微升大肠埃希氏杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)并且在冰上温育30分钟并且在42℃下温育1分钟。然后，向其中加入300微升Hi-感受态肉汤(Nippongene)并且在37℃下温育1小时，然后将大肠埃希氏杆菌平铺在100微克/毫升LBA琼脂培养基上，并且在37℃下温育过夜获得大肠埃希氏杆菌转化体。该转化体在37℃下在1升含有50微克/毫升氨苄青霉素的2xYT培养基中培养过夜，使用质粒Maxi试剂盒(QIAGEN)从细胞级分制备质粒DNA。包含编码嵌合ATR-5抗体基因的这些质粒分别定为chATR5/N5KG1(V)和chATR5/N5KG4P。
(4)转染到COS-7细胞中为了评价嵌合抗体的抗原结合活性和中和活性，将上述表达质粒转染到COS-7细胞中并且瞬时表达抗体。
通过使用基因脉冲发生仪(Bio Rad)进行电穿孔将质粒chATR5/N5KG1(V)或chATR5/N5KG4P转导到COS-7细胞中。以1×107细胞/毫升的细胞浓度向悬浮于Dulbecco PBS(-)(下文称之为PBS)的0.78毫升的COS-7细胞中加入50微克所述质粒，使接受1500V和25μF电容的脉冲。
经室温下10分钟回收期之后，将经电穿孔的细胞悬浮于含有5％Ultra低IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培养基中，并且在5％CO2培养箱中用10厘米培养皿培养。培养24小时之后，吸出培养上清液，然后加入无血清HBCHO(Irvine Scientific)。进一步培养72小时之后，收集培养上清液并且离心去除细胞碎片。
(5)抗体的纯化如下使用rProtein A Sepharose Fast Flow(Pharmacia Biotech)，从COS-7细胞的培养上清液纯化嵌合抗体。
将1毫升rProtein A Sepharose Fast Flow装入柱子，并且通过10倍体积的TBS将柱子平衡。将COS-7细胞的培养上清液加到平衡过的柱子上，然后用10体积的TBS冲洗。
然后通过用13.5毫升的2.5mM HCl(pH3.0)洗脱吸附的抗体级分，并且通过加入1.5毫升的1M Tris-HCl(pH8.0)立即中和洗脱物。
通过使用Centriprep100(Amicon)对纯化的抗体级分进行两次超滤，将溶剂换为含有150mM NaCl的50mM Tris-HCl(pH7.6)(下文称之为TBS)，并且最后浓缩至大约1.5毫升。
(6)稳定生产的CHO细胞系的建立为了建立稳定产生嵌合抗体的细胞系，将上述表达质粒引入适应CHO-S-SFMII无血清培养基(GIBCO)的CHO细胞(DG44)中。
用限制酶SspI(Takara Shuzo)酶切质粒chATR5/N5KG1(V)或chATR5/N5KG4P，使DNA线性化，并且在用苯酚和氯仿提取之后，通过乙醇沉淀作用回收DNA。通过使用基因脉冲发生仪(Bio Rad)进行电穿孔将线性化质粒转导到DG44细胞中中。以1×107细胞/毫升的细胞浓度向悬浮于PBS的0.78毫升的DG44细胞加入10微克所述质粒，使接受1500V和25μF电容的脉冲。
室温下10分钟回收期之后，将电穿孔过的细胞悬浮于含有次黄嘌呤/胸苷(GIBCO)的CHO-S-SFMII培养基(GIBCO)中，并且在CO2培养箱中用两个96-孔板(Falcon)培养。开始培养之后第一天，将培养基换为含有次黄嘌呤/胸苷(GIBCO)和500微克/毫升GENETICIN(G418Sulfate，GIBCO)的CHO-S-SFMII培养基(GIBCO)的筛选培养基来筛选其中引入了抗体基因的细胞。更换筛选培养基之后，大约2周之后用显微镜检查细胞。观察到有益细胞生长之后，通过下面对于测定抗体浓度描述的ELISA测定产生的抗体的量，并且筛选具有高抗体产率的细胞。
参照实施例5.人源化抗体的构建(1)人源化抗体H链的构建(i)人源化H链“a”型的构建通过PCR方法利用CDR-嫁接产生人源化ATR-5抗体H链。为了产生具有来自人抗体L39130的RF(DDBJ，Gao L.等，未公开，1995)的人源化H链“a”型，使用七种PCR引物。CDR-嫁接引物hR5Hv1S(SEQ IDNO11)，hR5Hv2S(SEQ ID NO12)，和hR5Hv4S(SEQ ID NO13)具有有义DNA序列，CDR-嫁接引物hR5Hv3A(SEQ ID NO14)和hR5Hv5A(SEQ IDNO15)具有反义DNA序列，各引物在其两个末端具有18-35bp互补序列。
对hR5Hv1S设计使其具有Kozak共有序列(Kozak，M.等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196947-950，1987)和SalI识别位点，设计hR5Hv5A使其具有NheI识别位点。外源引物hR5HvPrS(SEQ ID NO16)与CDR-嫁接引物hR5Hv1S具有同源性，hR5HvPrA(SEQ ID NO17)与CDR-嫁接引物hR5Hv5A具有同源性。
通过Pharmacia Biotech合成和纯化CDR-嫁接引物hR5Hv1S，hR5Hv2S，hR5Hv3A，hR5Hv4S和hR5Hv5A，和外源引物hR5HvPrS和hR5HvPrA。
使用KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)并且使用附属缓冲液，在98微升中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM KCl，6mM(HN4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.001％BSA，0.2mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1mM MgCl2，2.5单位的KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)，和50pmole的各种CDR-嫁接引物hR5Hv1S，hR5Hv2S，hR5Hv3A，hR5Hv4S和hR5Hv5A的条件下，以94℃30秒，50℃1分钟和72℃1分钟的温度循环将PCR进行5次循环。进一步加入100pmole的外源引物hR5HvPrS和hR5HvPrA之后，以相同的温度循环在100微升系统中将PCR进行25次循环。通过使用2％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离通过PCR方法扩增的DNA片段。
切下含有大约430bp长DNA片段的琼脂糖条。向其中加入3倍体积(ml/g)的TE，然后用苯酚，苯酚/氯仿，和氯仿提取来纯化DNA片段。用乙醇沉淀纯化的DNA，并且将其三分之一体积溶解于17微升水。用NheI和SalI消化得到的PCR反应混合物，并且使用DNA连接试剂盒2型(Takara Shuzo)根据试剂盒所附说明书，使之和用NheI和SalI消化制备的质粒载体CVIDEC连接。
将连接混合物加入100微升大肠埃希氏杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)并且在冰上温育30分钟并且在42℃下温育1分钟。然后，向其中加入300微升Hi-感受态肉汤(Nippongene)并且在37℃下温育1小时，然后将大肠埃希氏杆菌平铺在100微克/毫升LBA琼脂培养基上，并且在37℃下温育过夜获得大肠埃希氏杆菌转化体。该转化体在37℃下在3毫升LBA培养基中培养过夜，使用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞级分制备质粒DNA。
使用染料中止子循环测序FS即用反应试剂盒(Perkin-Elmer)通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测定质粒中cDNA编码区的碱基序列。作为测序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)和M13引物RV(TakaraShuzo)，通过在两个方向证实核苷酸序列来测定序列。
因为在EcoT221识别位点之前或之后发现突变和/或缺失，因此连接具有正确序列的各片段，然后再次亚克隆到CVIDEC来确定核苷酸序列。具有正确序列的质粒记为hATR5Hva/CVIDEC。质粒hATR5Hva/CVIDEC中包含的人源化H链“a”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列在SEQ ID NO18中给出。SEQ ID NO19中也给出了“a”型的氨基酸序列。
(ii)人源化H链“b”和“c”型的构建通过利用FR-改组方法用来自另一种人抗体的FR3置换“a”型的FR3产生“b”和“c”型。为了用来自人抗体Z34963(DDBJ，BorretzenM.等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9112917-12921，1994)的FR3置换“b”型中的FR3，产生了4种编码FR3的DNA引物。FR-改组引物F3RFFS(SEQID NO20)和F3RFBS(SEQ ID NO21)具有有义DNA序列，F3RFFA(SEQID NO22)和F3RFBA(SEQ ID NO23)具有反义DNA序列。
F3RFFS和F3RFFA彼此具有序列互补性，并且在两个末端上具有BalI和XhoI识别序列。为了用来自人抗体P01825(SWISS-PROT，PoljakRJ.等，生物化学(Biochemistry)，163412-3420，1977)置换“c”型中的FR3，产生了4种编码FR3的DNA引物。FR-改组引物F3NMFS(SEQ IDNO24)和F3NMBS(SEQ ID NO25)具有有义DNA序列，F3NMFA(SEQ IDNO26)和F3NMBA(SEQ ID NO27)具有反义DNA序列。F3NMBS和F3NMBA彼此具有序列互补性，并且在两个末端上具有XhoI和NcoI识别序列。
通过Pharmacia Biotech合成F3RFFS，F3RFBS，F3RFFA，F3RFBA，F3NMFS，F3NMBS，F3NMFA和F3NMBA。将F3RFFS和F3RFFA，和F3RFBS和F3RFBA退火，并且分别用BalI和XhoI，以及NcoI和XhoI消化。将它们引入通过用BalI和NcoI消化制备的质粒hATR5Hva/CVIDEC(BalI/NcoI)，并且测定核苷酸序列。具有正确序列的质粒记为hATR5Hvb/CVIDEC。质粒hATR5Hvb/CVIDEC中包含的人源化H链“b”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列在SEQ ID NO28中给出。SEQ ID NO29中也给出了“b”型的氨基酸序列。
将F3NMFS和F3NMFA，和F3NMBS和F3NMBA退火，并且分别用BalI和XhoI，以及NcoI和XhoI消化。将它们引入通过用BalI和NcoI消化制备的质粒hATR5Hva/CVIDEC(BalI/NcoI)，并且测定核苷酸序列。具有正确序列的质粒记为hATR5Hvc/CVIDEC。质粒hATR5Hvc/CVIDEC中包含的人源化H链“c”型核苷酸序列及其相应的氨基酸序列在SEQID NO30中给出。SEQ ID NO31中也给出了“c”型的氨基酸序列。
(iii)人源化H链“d”和“e”型的构建通过利用FR-改组方法，用来自另一种人抗体的FR3置换“a”型的FR3产生“d”和“e”型。为了用来自人抗体M62723(DDBJ，PascualV.等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)861320-1328，1990)的FR3置换“d”型中的FR3，产生4种编码FR3的DNA引物。FR-改组引物F3EPS(SEQ ID NO32)具有有义DNA序列，F3EPA(SEQ ID NO33)具有反义DNA序列，引物的3’-端具有18bp互补序列。
外源引物F3PrS(SEQ ID NO34)和F3PrA(SEQ ID NO35)与FR-改组引物F3EPS和F3EPA具有同源性，并且也可以用于其它FR3的FR改组。为了用来自人抗体Z80844(DDBJ，Thomsett AR.等，未公开)的FR3置换“e”型中的FR3，产生2种编码FR3的DNA引物。FR-改组引物F3VHS(SEQ ID NO36)具有有义DNA序列，F3VHA(SEQ ID NO37)具有反义DNA序列，引物的3’-端具有18bp互补序列。通过Pharmacia Biotech合成F3EPS，F3EPA，F3PrS，F3PrA，F3VHS和F3VHA。
使用KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)并且使用附属缓冲液，在100微升反应混合物中含有1μM FR-改组引物F3EPS和F3EPA，或者F3VHS和F3VHA，0.2mM dNTPs，1.0mM MgCl2各5微升和2.5单位的KOD DNA聚合酶的条件下，以94℃30秒，50℃1分钟和74℃1分钟的温度循环将PCR进行5次循环。进一步加入100pmol的外源引物F3PrS和F3PrA之后，以相同的温度循环将PCR进行25次循环。
通过使用2％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离通过PCR方法扩增的DNA片段。切下含有大约424bp长DNA片段的琼脂糖条，向其中加入3倍体积(ml/g)的TE，然后用苯酚，苯酚/氯仿，和氯仿提取来纯化DNA片段。用乙醇沉淀纯化的DNA之后，将其三分之一体积溶解于14微升水。用BalI和NcoI消化得到的PCR反应混合物，并且引入用BalI和NcoI消化制备的质粒hATR5Hva/CVIDEC(BalI/NcoI)，并且测定核苷酸序列。
具有正确序列的质粒记为hATR5Hvd/CVIDEC。质粒hATR5Hvd/CVIDEC中包含的人源化H链“d”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列在SEQ ID NO38中给出。SEQ ID NO39中也给出了“d”型的氨基酸序列。质粒hATR5Hve/CVIDEC中包含的人源化H链“e”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列在SEQ ID NO40中给出。SEQ IDNO41中也给出了“e”型的氨基酸序列。
(iv)人源化H链“f”和“g”型的构建通过利用FR-改组方法，用来自另一种人抗体的FR3置换“a”型的FR3产生“f”和“g”型。为了用来自人抗体L04345(DDBJ，HillsonJL等，实验药物杂志(J.Exp.Med.)178331-336，1993)的FR3置换“f”型中的FR3，以及为了用来自人抗体S78322(DDBJ，Bejcek BE等，癌症研究(Cancer RES.)552346-2351，1995)的FR3置换“g”型中的FR3，合成2种分别编码FR3的DNA引物。“f”型的FR-改组引物F3SSS(SEQID NO42)具有有义DNA序列，F3SSA(SEQ ID NO43)具有反义DNA序列，引物的3’-端具有18bp互补序列。
“g”型的F3CDS(SEQ ID NO44)具有有义DNA序列，F3CDA(SEQID NO45)具有反义DNA序列，引物的3’-端具有18bp互补序列。通过Pharmacia Biotech合成和纯化F3SSS，F3SSA，F3CDS和F3CDA。使用KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)并且使用附属缓冲液，在100微升反应混合物中含有1μM FR-改组引物F3SSS和F3SSA，或者F3CDS和F3CDA，0.2mM dNTPs，1.0mM MgCl2各5微升和2.5单位的KOD DNA聚合酶的条件下，以94℃30秒，50℃1分钟和74℃1分钟的温度循环将PCR进行5次循环。进一步加入100pmole的外源引物F3PrS和F3PrA之后，以相同的温度循环将PCR进行25次循环。
通过使用2％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离通过PCR方法扩增的DNA片段。切下含有大约424bp长DNA片段的琼脂糖条，向其中加入3倍体积(ml/g)的TE，然后用苯酚，苯酚/氯仿，和氯仿提取来纯化DNA片段。用乙醇沉淀纯化的DNA之后，将其三分之一体积溶解于14微升水。用BalI和NcoI消化得到的PCR反应混合物，并且引入用BalI和NcoI消化制备的质粒hATR5Hva/CVIDEC(BalI/NcoI)，并且测定核苷酸序列。
具有正确序列的质粒记为hATR5Hvf/CVIDEC和hATR5Hvg/CVIDEC。该质粒hATR5Hvf/CVIDEC中包含的人源化H链“f”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列，以及“f”型的氨基酸序列在SEQ ID NO46和SEQ ID NO47中给出。该质粒hATR5Hvg/CVIDEC中包含的人源化H链“g”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列，以及“g”型的氨基酸序列在SEQ ID NO48和SEQ ID NO49中给出。
(v)人源化H链“h”型的构建通过利用FR-改组方法，用来自另一种人抗体的FR3置换“a”型的FR3产生“h”型。为了用来自人抗体Z26827(DDBJ，van Der Stoep等，实验药物杂志(J.Exp.Med.)17799-107，1993)的FR3置换“h”型中的FR3，合成2种分别编码FR3的引物。“h”型的FR-改组引物F3ADS(SEQ ID NO50)具有有义DNA序列，F3ADA(SEQ ID NO51)具有反义DNA序列，引物的3’-端具有18bp互补序列。
通过Pharmacia Biotech合成和纯化F3ADS，F3ADA。使用KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)并且使用附属缓冲液，在100微升反应混合物中含有1μM FR-改组引物F3ADS和F3ADA，0.2mM dNTPs，1.0mM MgCl2各5微升和2.5单位的KOD DNA聚合酶的条件下，以94℃30秒，50℃1分钟和74℃1分钟的温度循环将PCR进行5次循环。进一步加入100pmole的外源引物F3PrS和F3PrA之后，以相同的温度循环将PCR进行25次循环。通过使用2％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离通过PCR方法扩增的DNA片段。
切下含有大约424bp长DNA片段的琼脂糖条，向其中加入3倍体积(ml/g)的TE，然后用苯酚，苯酚/氯仿，和氯仿提取来纯化DNA片段。用乙醇沉淀纯化的DNA之后，将其三分之一体积溶解于14微升水中。用BalI和NcoI消化得到的PCR反应混合物，并且引入用BalI和NcoI消化制备的质粒hATR5Hva/CVIDEC(BalI/NcoI)，并且测定核苷酸序列。具有正确序列的质粒记为hATR5Hvh/CVIDEC。质粒hATR5Hvh/CVIDEC中包含的人源化H链“h”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列以及“h”型氨基酸序列在SEQ ID NO52中给出。SEQ IDNO53中给出了“h”型的氨基酸序列。
(vi)人源化H链“i”和“j”型的构建通过利用FR-改组方法，用来自另一种人抗体的FR3置换“a”型的FR3产生“i”和“j”型。为了用来自人抗体U95239(DDBJ，Manheimer-Lory AJ.等，未公开)的FR3置换“i”型中的FR3，以及为了用来自人抗体L03147(DDBJ，Collect TA.等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910026-10030，1992)的FR3置换“j”型中的FR3，合成2种分别编码FR3的引物。“i”型的FR-改组引物F3MMS(SEQ ID NO54)具有有义DNA序列，F3MMA(SEQ ID NO55)具有反义DNA序列，引物的3’-端具有18bp互补序列。
“j”型的F3BMS(SEQ ID NO56)具有有义DNA序列，F3BMA(SEQID NO57)具有反义DNA序列，引物的3’-端具有18bp互补序列。通过Pharmacia Biotech合成和纯化F3MMS，F3MMA，F3BMS和F3BMA。使用Ampli Taq Gold(Perkin-Elmer)并且使用附属缓冲液，在100微升反应混合物中含有1μM FR-改组引物F3MMS和F3MMA，或者F3BMS和F3BMA，0.2mM dNTPs，1.0mM MgCl2各5微升和2.5单位的Ampli TaqGold的条件下，以94℃30秒，50℃1分钟和74℃1分钟的温度循环将PCR进行5次循环。进一步加入100pmole的外源引物F3PrS和F3PrA之后，以相同的温度循环将PCR进行25次循环。
通过使用2％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离通过PCR方法扩增的DNA片段。切下含有大约424bp长DNA片段的琼脂糖条，向其中加入3倍体积(ml/g)的TE，然后用苯酚，苯酚/氯仿，和氯仿提取来纯化DNA片段。用乙醇沉淀纯化的DNA之后，将其三分之一体积溶解于14微升水。用BalI和NcoI消化得到的PCR反应混合物，并且引入用BalI和NcoI消化制备的质粒hATR5Hva/CVIDEC(BalI/NcoI)，并且测定核苷酸序列。
具有正确序列的质粒记为hATR5Hvi/CVIDEC和hATR5Hvj/CVIDEC。质粒hATR5Hvi/CVIDEC中包含的人源化H链“i”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列，和“i”型的氨基酸序列在SEQ ID NO58和SEQ IDNO59中给出。质粒hATR5Hvj/CVIDEC中包含的人源化H链“j”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列，和“j”型的氨基酸序列在SEQ IDNO60和SEQ ID NO61中给出。
(vii)人源化H链“b1”和“d1”型的构建通过利用FR-改组方法，用来自另一种人抗体的FR2置换“b”和“d”型的FR2，产生“b1”和“d1”型。为了用来自人抗体P01742(SWISS-PROT，Cunningham BA.等，生物化学(Biochemistry)93161-3170，1970)的FR2置换FR2，合成2种分别编码FR2的DNA引物。FR-改组载体F2MPS(SEQ ID NO62)具有有义DNA序列，F2MPA(SEQ ID NO63)具有反义DNA序列。它们具有彼此互补的序列，并且在其两端具有EcoT22I和BalI的识别序列。
通过Pharmacia Biotech合成和纯化F2MPS和F2MPA。将F2MPS和F2MPA退火，并且用EcoT22I和BalI消化。将它们引入用EcoT22I和BalI消化制备的质粒hATR5Hvb/CVIDEC(EcoT22I/BalI)和hATR5Hvd/CVIDEC(EcoT22I/BalI)，并且测定核苷酸序列。具有正确序列的质粒记为hATR5Hvb1/CVIDEC和hATR5Hvd1/CVIDEC。质粒hATR5Hvb1/CVIDEC中包含的人源化H链“b1”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列，和“b1”型的氨基酸序列在SEQ ID NO64和SEQ IDNO65中给出。质粒hATR5Hvd1/CVIDEC中包含的人源化H链“d1”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列，和“d1”型的氨基酸序列在SEQID NO66和SEQ ID NO67中给出。
(Viii)人源化H链“b3”和“d3”型的构建通过利用FR-改组方法，用来自另一种人抗体的FR2置换“b”和“d”型的FR2，产生“b3”和“d3”型。为了用来自人抗体Z80844(DDDJ，Thomsett AR.等，未公开)的FR2置换FR2，合成2种分别编码FR2的DNA引物。FR-改组载体F2VHS(SEQ ID NO68)具有有义DNA序列，F2VHA(SEQ ID NO69)具有反义DNA序列。它们具有彼此互补的序列，并且在其两端具有EcoT22I和BalI的识别序列。通过Pharmacia Biotech合成和纯化F2VHS和F2VHA。
将F2VHS和F2VHA退火，并且用EcoT22I和BalI消化。将它们引入用EcoT22I和BalI消化制备的质粒hATR5Hvb/CVIDEC(EcoT22I/BalI)和hATR5Hvd/CVIDEC(EcoT22I/BalI)，并且测定核苷酸序列。具有正确序列的质粒记为hATR5Hvb3/CVIDEC和hATR5Hvd3/CVIDEC。质粒hATR5HVb3/CVIDEC中包含的人源化H链“b3”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列，和“b3”型的氨基酸序列在SEQ ID NO70和SEQ IDNO71中给出。质粒hATR5Hvd3/CVIDEC中包含的人源化H链“d3”型的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列，和“d3”型的氨基酸序列在SEQID NO72和SEQ ID NO73中给出。
(2)人源化抗体L链V区的构建(i)“a”型通过使用PCR方法进行CDR-嫁接产生人源化ATR-5抗体L-链V区。对于产生具有从人抗体Z37332(DDBJ，Welschof M.等，免疫学方法(J.Immunol.Methods)179203-214，1995)衍生的构架区的人源化抗体L链(“a”型)，使用七种PCR引物。
CDR-嫁接引物h5Lv1S(SEQ ID NO74)和h5Lv4S(SEQ ID NO75)具有有义DNA序列，CDR-嫁接引物h5Lv2A(SEQ ID NO76)，h5Lv3A(SEQID NO77)，和h5Lv5A(SEQ ID NO78)具有反义DNA序列，各引物在其两个末端具有20bp互补序列。外源引物h5LvS(SEQ ID NO79)与h5LvA(SEQ ID NO80)与CDR-嫁接引物h5Lv1S和h5Lv5A具有同源性。通过Pharmacia Biotech合成和纯化CDR-嫁接引物h5Lv1S，h5Lv4S，h5Lv2A，h5Lv3A，，h5Lv5A，h5LvS和h5LvA。
100微升PCR溶液中含有120mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM KCl，6mM(HN4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.001％BSA，0.2mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1mM MgCl2，2.5单位的KOD DNA聚合酶(Toyo Boseki)，50pmoleCDR-嫁接引物h5Lv1S，h5Lv2A，h5Lv3A，h5Lv4S，h5Lv5A。
使用DNA热循环仪480(Perkin-Elmer)以94℃30秒，50℃1分钟和72℃1分钟的温度循环将PCR进行5次循环，来组装5个CDR-嫁接引物。向反应混合物进一步加入100pmole的外源引物h5LvS和h5LvA之后，以94℃30秒，52℃1分钟和72℃1分钟的温度循环将PCR进行30次循环扩增装配的DNA片段。
通过使用3％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离PCR反应混合物。切下含有大约400bp长DNA片段的琼脂糖条。用苯酚和氯仿提取该琼脂糖条，通过乙醇沉淀回收DNA片段。用限制酶SplI(Takara Shuzo)和BglII(Takara Shuzo)在37℃下消化回收的DNA片段4小时。用苯酚和氯仿提取消化混合物，并且乙醇沉淀该DNA片段之后，将其溶解于10微升TE中。使用DNA连接试剂盒2型(Takara Shuzo)根据试剂盒所附说明书在16℃下反应1小时，连接如上制备的编码人源化L链V区的SplI-BglII DNA片段和用SplI和BglII消化制备的CVIDEC载体。
将连接混合物加入100微升大肠埃希氏杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)，并且在冰上温育30分钟并且在42℃下温育1分钟。然后，向其中加入300微升Hi-感受态肉汤(Nippongene)并且在37℃下温育1小时，然后将大肠埃希氏杆菌平铺在LBA琼脂培养基上，并且在37℃下温育过夜获得大肠埃希氏杆菌转化体。该转化体在37℃下在3毫升LBA培养基中培养过夜，使用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞级分制备质粒DNA。
使用染料中止子循环测序FS即用反应试剂盒(Perkin-Elmer)，通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测定质粒中cDNA编码区的核苷酸序列。作为测序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)和M13引物RV(Takara Shuzo)，通过在两个方向证实核苷酸序列来测定序列。
包含编码人源化抗体L链V区的基因并且在5’-端具有BglII识别序列和Kozak序列并且在3’-端具有SplI识别序列的质粒指定为hATR5Lva/CVIDEC。SEQ ID NO81中给出该人源化L链“a”型的核苷酸序列(包括其相应的氨基酸序列)。SEQ ID NO82中也给出了“a”型的氨基酸序列。
(ii)“b”和“c”型通过置换“a”型的FR3(FR-改组)产生“b”和“c”型。对于“b”型，使用来自人抗体S68699(DDBJ，Hougs L等，临床免疫原实验(Exp.Clin.Immunogen et.)10141-151，1993)的FR3，以及对于“c”型，使用来自人抗体P01607(SWISS-PROT，Epp O等，生物化学(Biochemistry)144943-4952，1975)的FR3。
编码“b”型的FR3的引物F3SS(SEQ ID NO83)和F3SA(SEQ IDNO84)，或者编码“c”型的FR3的引物F3RS(SEQ ID NO85)和F3RA(SEQID NO86)彼此具有序列互补性，并且在其两个末端具有限制酶KpnI和PstI识别序列。通过Pharmacia Biotech合成和纯化F3SS，F3SA，F3RS和F3RA。通过在96℃下处理2分钟并且在50℃下处理2分钟将F3SS，F3SA，F3RS和F3RA各100pmole退火，并且产生双链DNA片段。
37℃下用限制酶KpnI(Takara Shuzo)将这些双链DNA片段消化1小时，然后37℃下用限制酶PstI(Takara Shuzo)消化1小时。用苯酚和氯仿提取消化混合物，用乙醇将其沉淀之后，将其溶解于TE中。
37℃下用限制酶KpnI(Takara Shuzo)将质粒hATR5Lva/CVIDEC消化1小时，然后37℃下用限制酶PstI(Takara Shuzo)消化1小时。通过使用1.5％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离消化混合物，切下含有大约3000bp长DNA片段的琼脂糖条。用苯酚和氯仿提取该琼脂糖条，通过乙醇沉淀DNA片段之后，将其溶解于TE中。
使用DNA连接试剂盒2型(Takara Shuzo)根据试剂盒所附说明书在16℃下反应1小时，连接如上制备的编码“b”或“c”型的FR3的KpnI-PstI DNA片段和用KpnI和PstI消化去除FR3的hATR5Lva/CVIDEC载体。
将连接混合物加入100微升大肠埃希氏杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)并且在冰上温育30分钟并且在42℃下温育1分钟。然后，向其中加入300微升Hi-感受态肉汤(Nippongene)并且在37℃下温育1小时，然后将大肠埃希氏杆菌平铺在LBA琼脂培养基上，并且在37℃下温育过夜，获得大肠埃希氏杆菌转化体。该转化体在37℃下在3毫升LBA培养基中培养过夜，使用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞级分制备质粒DNA。
使用染料中止子循环测序FS即用反应试剂盒(Perkin-Elmer)，通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测定质粒中cDNA编码区的核苷酸序列。作为测序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)和M13引物RV(Takara Shuzo)，通过在两个方向证实核苷酸序列来测定序列。
其中人源化抗体L链“a”型的FR3被置换的包含编码“b”或“c”型的基因的质粒分别指定为hATR5Lvb/CVIDEC或hATR5Lvc/CVIDEC。SEQ ID NO87和88中给出质粒hATR5Lvb/CVIDEC中包含的人源化L链“b”型的核苷酸序列和相应的氨基酸序列以及“b”型的氨基酸序列。SEQ ID NO89和90中给出质粒hATR5Lvc/CVIDEC中包含的人源化L链“c”型的核苷酸序列和相应的氨基酸序列以及“c”型的氨基酸序列。
(iii)“b1”和“b2”型通过置换“b”型的FR2产生“b1”和“b2”型。对于“b1”型，使用来自人抗体S65921(DDBJ，Tonge DW等，免疫年(YearImmunol.)756-62，1993)的FR2，对于“b2”型，使用来自人抗体X93625(DDBJ，Cox JP等，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24827-836，1994)的FR2。
编码“b1”型的FR2的引物F2SS(SEQ ID NO91)和F2SA(SEQ IDNO92)，或者编码“b2”型的FR2的引物F2XS(SEQ ID NO93)和F2XA(SEQ ID NO94)彼此具有序列互补性，并且在其两个末端具有限制酶AflII和SpeI识别序列。通过Pharmacia Biotech合成F2SS，F2SA，F2XS和F2XA。通过在96℃下处理2分钟并且在50℃下处理2分钟将F2SS和F2SA，或者F2XS和F2XA各100pmole退火，并且产生双链DNA片段。
37℃下用限制酶AflII(Takara Shuzo)和SpeI(Takara Shuzo)将这些双链DNA片段消化1小时。用苯酚和氯仿提取消化混合物，在用乙醇将其沉淀之后，将其溶解于TE中。
37℃下用限制酶AflII(Takara Shuzo)和SpeI(Takara Shuzo)将质粒hATR5Lvb/CVIDEC消化1小时。通过使用1.5％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离消化混合物，切下含有大约3000bp长DNA片段的琼脂糖条。用苯酚和氯仿提取该琼脂糖条，用乙醇沉淀DNA片段之后，将其溶解于TE中。
使用DNA连接试剂盒2型(Takara Shuzo)根据试剂盒所附说明书在16℃下反应1小时，连接如上制备的编码“b1”或“b2”型的FR2的AflII-SpeI DNA片段和其中用AflII和SpeI消化去除FR2的hATR5Lvb/CVIDEC。
将连接混合物加入100微升大肠埃希氏杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)并且在冰上温育30分钟并且在42℃下温育1分钟。然后，向其中加入300微升Hi-感受态肉汤(Nippongene)，并且在37℃下温育1小时，然后将大肠埃希氏杆菌平铺在LBA琼脂培养基上，并且在37℃下温育过夜获得大肠埃希氏杆菌转化体。该转化体在37℃下在4毫升LBA培养基中培养过夜，使用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞级分制备质粒DNA。
使用染料中止子循环测序FS即用反应试剂盒(Perkin-Elmer)，通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测定质粒中cDNA编码区的核苷酸序列。作为测序引物，使用M13引物M4(Takara Shuzo)和M13引物RV(Takara Shuzo)，通过在两个方向证实核苷酸序列来测定序列。
其中人源化抗体L链“b”型的FR2被置换的包含编码“b1”或“b2”型的基因的质粒分别指定为hATR5Lvb1/CVIDEC或hATR5Lvb2/CVIDEC。SEQ ID NO95和96中给出质粒hATR5Lvb1/CVIDEC中包含的人源化L链“b1”型的核苷酸序列和相应的氨基酸序列以及“b1”型的氨基酸序列。SEQ ID NO97和98中给出质粒hATR5Lvb2/CVIDEC中包含的人源化L链“b2”型的核苷酸序列和相应的氨基酸序列以及“b2”型的氨基酸序列。
(3)人源化抗体的表达载体的构建(i)人源化H链和嵌合L链的结合用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hva/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段并且引入通过用NheI和SalI消化chATR5/N5KG4P、chATR-5抗体表达质粒载体制备的chATR5/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHva-chLv/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvb/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段并且引入通过用NheI和SalI消化chATR5/N5KG4P、一种chATR-5抗体表达质粒载体制备的chATR5/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHvb-chLv/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvc/CVIDEC，hATR5Hvd/CVIDEC，和hATR5Hve/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段并且引入通过用NheI和SalI消化chATR5/N5KG4P、一种chATR-5抗体表达质粒载体制备的chATR5/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHVc-chLv/N5KG4P，hHvd-chLv/N5KG4P和hHve-chLv/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvf/CVIDEC和hATR5Hvh/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段并且引入通过用NheI和SalI消化chATR5/N5KG4P、一种chATR-5抗体表达质粒载体制备的chATR5/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHvf-chLv/N5KG4P和hHvh-chLv/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvi/CVIDEC和hATR5Hvj/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段并且引入通过用NheI和SalI消化chATR5/N5KG4P、一种chATR-5抗体表达质粒载体制备的chATR5/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHvi-chLv/N5KG4P和hHvj-chLv/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvb1/CVIDEC，hATR5Hvd1/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段并且引入通过用NheI和SalI消化chATR5/N5KG4P、一种chATR-5抗体表达质粒载体制备的chATR5/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHvb1-chLv/N5KG4P和hHvd1-chLv/N5KG4P。
(ii)人源化L链和嵌合H链的结合使用抗体表达载体N5KG4P，将其与嵌合H链结合并且表达，并且评价人源化L链。
37℃下用限制酶BglII(Takara Shuzo)和SplI(Takara Shuzo)将质粒hATR5Lva/CVIDEC，hATR5Lvb/CVIDEC，hATR5Lvc/CVIDEC，hATR5Lvb1/CVIDEC，和hATR5Lvb2/CVIDEC消化2-3小时。通过使用1.5％或2％NuSieve GTG琼脂糖(FMC BioProducts)进行琼脂糖凝胶电泳来分离消化混合物，切下含有大约400bp长DNA片段的琼脂糖条。用苯酚和氯仿提取该琼脂糖条，用乙醇沉淀DNA片段之后，将其溶解于TE中。
使用DNA连接试剂盒2型(Takara Shuzo)根据试剂盒所附说明书在16℃下反应1小时，连接包含分别编码这些型的人源化L链V区的SplI-BglII DNA片段和用SplI和BglII消化的/hATR5Hv/N5KG4P。
将连接混合物加入100微升大肠埃希氏杆菌JM109感受态细胞(Nippongene)，并且在冰上温育30分钟并且在42℃下温育1分钟。然后，向其中加入300微升Hi-感受态肉汤(Nippongene)并且在37℃下温育1小时，然后将大肠埃希氏杆菌平铺在LBA琼脂培养基上，并且在37℃下温育过夜获得大肠埃希氏杆菌转化体。
该转化体在37℃下在250毫升或500毫升LBA培养基中培养过夜，使用质粒Maxi试剂盒(QIAGEN)从细胞级分制备质粒DNA。其中引入编码嵌合H链和人源化L链的基因的质粒分别指定为chHv-hLva/N5KG4P，chHv-hLvb/N5KG4P，chHv-hLvc/N5KG4P，chHv-hLvb1/N5KG4P和chHv-hLvb2/N5KG4P。
(iii)人源化H链和人源化L链的结合用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hva/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，并且引入通过用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗体L链“a”型的cDNA序列的质粒chHv-hLva/N5KG4P制备的hLva/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHva-hLva/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvb/CVIDEC和hATR5Hvc/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，并且引入通过用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗体L链“a”型的cDNA序列的质粒chHv-hLva/N5KG4P制备的hLva/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHvb-hLva/N5KG4P和hHvc-hLva/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvb/CVIDEC，hATR5Hvd/CVIDEC和hATR5Hve/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，并且引入通过用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗体L链“b”型的cDNA序列的质粒chHv-hLvb/N5KG4P制备的hLvb/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHvb-hLvb/N5KG4P，hHvd-hLvb/N5KG4P如hHve-hLvb/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvf/CVIDEC，hATR5Hvg/CVIDEC和hATR5Hvh/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，并且引入通过用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗体L链“b”型的cDNA序列的质粒chHv-hLvb/N5KG4P制备的hLvb/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHvf-hLvb/N5KG4P，hHvg-hLvb/N5KG4P和hHvh-hLvb/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvi/CVIDEC和hATR5Hvj/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，并且引入通过用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗体L链“b”型的cDNA序列的质粒chHv-hLvb/N5KG4P制备的hLvb/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHvi-hLvb/N5KG4P和hHvj-hLvb/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvb1/CVIDEC和hATR5Hvd1/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，并且引入通过用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗体L链“b”型的cDNA序列的质粒chHv-hLvb/N5KG4P制备的hLvb/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHvb1-hLvb/N5KG4P和hHvd1-hLvb/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvb3/CVIDEC和hATR5Hvd3/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，并且引入通过用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗体L链“b”型的cDNA序列的质粒chHv-hLvb/N5KG4P制备的hLvb/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHvb3-hLvb/N5KG4P和hHvd3-hLvb/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvb/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段，并且引入通过用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗体L链“b1”和“b2”型的cDNA序列的质粒chHv-hLvb1/N5KG4P和chHv-hLvb2/N5KG4P制备的hLvb1/N5KG4P(SalI/NheI)和hLvb2/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHvb-hLvb1/N5KG4P和hHvb-hLvb2/N5KG4P。
用NheI和SalI消化包含H链V区的质粒hATR5Hvi/CVIDEC，回收人源化H链V区的cDNA片段并且引入通过用NheI和SalI消化包含人源化ATR-5抗体L链“b1”和“b2”型的cDNA序列的质粒chHv-hLvb1/N5KG4P和chHv-hLvb2/N5KG4P制备的hLvb1/N5KG4P(SalI/NheI)和hLvb2/N5KG4P(SalI/NheI)。将这样产生的质粒指定为hHvi-hLvb1/N5KG4P和hHvi-hLvb2/N5KG4P。
(4)转染到COS-7细胞中为了评价人源化抗体的抗原结合活性和中和活性，在COS-7细胞中瞬时表达上述抗体。
通过使用基因脉冲发生仪(Bio Rad)进行电穿孔将构建的表达质粒载体转导到COS-7细胞中。以1×107细胞/毫升的细胞浓度向悬浮于PBS的0.78毫升的COS-7细胞中加入50微克或20微克所述质粒，使其接受1500V和25μF电容的脉冲。
经室温下10分钟恢复期之后，将经电穿孔的细胞悬浮于含有5％Ultra低IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培养基中，并且在5％CO2培养箱中用10厘米或15厘米培养皿培养。培养24小时之后，吸出培养上清液，然后加入无血清培养基HBCHO(Irvine Scientific)。进一步培养72小时或96小时之后，收集培养上清液并且离心去除细胞碎片。
(5)抗体的纯化使用AffiGel Protein A MAPSII试剂盒(Bio Rad)或者rProteinA Sepharose Fast Flow(Pharmacia Biotech)，从COS-7细胞的培养上清液纯化嵌合抗体。按照试验盒所附的说明进行采用AffiGelProtein A MAPSII试剂盒的纯化。如下进行使用rProtein A SepharoseFast Flow的纯化将1毫升rProtein A Sepharose Fast Flow装入柱子，并且通过10倍体积的TBS将柱子平衡。将COS-7细胞的培养上清液加到平衡过的柱子上，然后用10倍体积的TBS冲洗。通过用13.5毫升的2.5mMHCl(pH3.0)洗脱吸附的抗体级分，并且通过加入1.5毫升的1MTris-HCl(pH8.0)中和洗脱物。
通过使用Centriprep30或100(Amicon)对纯化的抗体级分进行两次或三次超滤，将溶剂换为TBS，并且最后浓缩至大约1.5毫升。
参者实施例6.抗体定量测定和活性评价(1)通过用于测定抗体的ELISA平板通过ELISA测定抗体浓度如下制备测定抗体浓度的ELISA平板用100微升山羊抗-人IgGγ抗体(BIO SOURCE)固定96-孔ELISA平板(Maxisorp，NUNC)的每个孔，山羊抗-人IgGγ抗体制备成在固定缓冲液(0.1M碳酸氢钠，0.02％NaN3，pH9.6)(下文称之为CB)中、浓度为1微克/毫升。用200微升稀释缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1M NaCl，0.05％Tween 20，0.02％NaN3，1％牛血清白蛋白(BSA)，pH8.1)(下文称之为DB)封闭之后，用DB系列稀释其中表达抗体的COS-7细胞的培养上清液或者纯化的抗体，然后加入到各孔中。
室温下温育1小时之后，用含有0.05％Tween20的Dulbecco PBS(下文称之为RB)洗涤，加入用DB稀释1000倍的100微升碱性磷酸酶-偶联的山羊抗-人IgGγ抗体(Biosource)。室温下温育1小时之后，用RB洗涤，加入在底物缓冲液(50mM碳酸氢钠，10mM氯化镁，pH9.8)中溶解至1毫克/毫升的Sigma104(对硝基苯基磷酸酯，SIGMA)，然后使用Microplate Reader(Bio Rad)测定405/655nm处的吸光度。作为测定浓度的标准，使用IgG4κ(结合位点)。
(2)结合抗原活性的测定如下制备测定抗原结合的细胞ELISA平板。使用的细胞是人膀胱癌细胞J82(ATCC HTB-1)。对96-孔细胞培养板中的60个孔接种1×105J82细胞。在CO2培养箱中培养(含有10％胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640培养基)一天使得细胞生长汇合。弃除培养物液体之后，用300微升PBS将每个孔洗涤两次。向每个孔加入100微升含有4％低聚甲醛的PBS(下文称之为PFA/PBS)，并且置于冰上10分钟固定细胞。
弃除PFA/PBS，用300微升PBS将每个孔洗涤两次，然后用250微升DB封闭。用DB系列稀释培养上清液或纯化的抗体，将其100微升加给每个孔。室温下温育2小时之后用RB洗涤，加入用DB稀释1000倍的100微升碱性磷酸酶-偶联的山羊抗-人IgGγ抗体(BioSource)。室温下温育1小时之后用RB洗涤，加入底物溶液，然后使用MicroplateReader(Bio Rad)测定405/655nm处的吸光度。
(3)中和活性的测定通过人胎盘产生的凝血因子III，Thromborel S(Boehringer AG)用针对因子Xa-产生活性的抑制活性作为指数，测定小鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体的中和活性。因此，向10微升1.25毫克/毫升Thromborel S和10微升适当稀释的抗体中加入60微升缓冲液(含有5mM氯化钙和0.1％BSA的BSA)，然后将其在室温下在96-孔板中温育1小时。向其中分别加入10微升的3.245微克/毫升人因子X(CelsusLaboratories)和82.5ng/ml人因子VIIa(Enzyme Research)，然后在室温下温育1小时。
加入10微升0.5M EDTA中止反应，向其中加入50微升显色底物溶液，并且使用Microplate Reader(Bio Rad)测定405/655nm处的吸光度。室温下反应1小时之后，再次测定405/655nm处的吸光度。以没有抗体加入时每小时吸光度的变化为100％活性，通过从吸光度的每一次变化计算残留活性(％)可以测定中和活性。通过根据所附说明书的说明，溶解Testzyme显色底物S-2222(Chromogenix)，用纯化水稀释2倍，并且以1∶1的比例与1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物溶液(0.6毫克/毫升六二亚甲基溴化物，SIGMA)混合。
(4)活性的评价(i)人源化H链“a”型和嵌合L链的结合产生人源化H链“a”型和嵌合L链结合的抗体(a-ch)，并且通过细胞ELISA测定对抗原的结合活性。发现在高浓度下与抗原结合的量降低。与阳性对照嵌合抗体(ch-ch)的相比，FXa产生-抑制作用针对抗原的中和活性弱。因此，决定通过FR-改组进行人源化H链的翻译程序(version-up)。其中使用的嵌合抗体是在COS-7细胞中表达的抗体，纯化，并且评价。
(ii)人源化L链“a”型和嵌合H链的结合产生人源化L链“a”型和嵌合H链结合的抗体(ch-a)，并且通过细胞ELISA测定对抗原的结合活性。发现具有等于或高于嵌合抗体的结合活性。另一方面，与阳性对照嵌合抗体相比，针对抗原的中和活性弱。因此，决定通过FR-改组进行人源化L链的翻译程序。其中使用的嵌合抗体是在COS-7细胞中表达、纯化、并且评价的抗体。
(iii)人源化H链“a”型和人源化L链“a”型的结合产生人源化H链“a”型和人源化L链“a”型结合的抗体(a-a)，并且通过细胞ELISA测定对抗原的结合活性。发现在高浓度区结合抗原的量减少。与阳性对照嵌合抗体相比，Fxa产生-抑制作用针对抗原的中和活性弱。因此，决定通过FR-改组进行人源化H链和L链的翻译程序。其中使用的嵌合抗体是在COS-7细胞中表达的抗体，纯化，并且评价。
(iv)人源化H链“b”型，“c”型和“d”型和嵌合L链的结合产生抗体(分别是“b-ch”，“c-ch”，和“d-ch”)，它们是通过FR-改组进行翻译程序并结合嵌合L链的人源化H链，通过细胞ELISA测定对抗原的结合活性。“d-ch”表现出与嵌合抗体的结合活性相等的结合活性，“b-ch”和“c-ch”表现出稍微较低的结合活性。另一方面，发现与阳性对照嵌合抗体相比，针对抗原的中和活性在“b-ch”中几乎相等，在“d-ch”中稍弱。在“c-ch”型中显著比嵌合抗体的弱。因此，认为人源化H链“b”型和“d”型是表现出高活性的人源化H链。
(v)人源化H链“b”型和人源化L链“a”型的结合产生抗体(b-a)，它是通过FR-改组进行翻译程序并结合人源化L链“a”型的人源化H链“b”型，通过细胞ELISA测定对抗原的结合活性。发现在高浓度下结合抗原的量减少。另一方面，与阳性对照嵌合抗体相比，针对抗原的中和活性显著弱。因此，“b-a”和“a-a”是表现出高活性的。其中使用的嵌合抗体是在COS-7细胞中表达、纯化、并且评价的抗体。
(vi)人源化L链“b”型和“c”型与嵌合H链的结合产生抗体(分别是“ch-b”和“ch-c”)，它们是与嵌合H链结合的人源化L链“b”型和“c”型，发现它们两个都具有与该嵌合抗体相等的与抗原的结合活性和针对抗原的中和活性。因此，选择“b”型和“c”型作为人源化抗体L链的候选者。就抗原性来说，认为氨基酸残基数较少的小鼠抗体-衍生的“b”型比“c”型好。这里使用的嵌合抗体是在CHO细胞DG44中表达、纯化、并且评价的抗体。在下面的评述中，该抗体用作阳性对照。
(vii)人源化H链“b”型和人源化L链“b”型和“c”型的结合产生抗体(分别是“b-b”和“b-c”)，它们是与人源化L链“b”型和“c”型结合的人源化H链“b”型，并且测定与抗原的结合活性和针对抗原的中和活性。在结合活性和中和活性方面，它们两个具有比嵌合抗体稍弱的活性。
(viii)人源化H链“b”型和“d”型与嵌合L链“b”型的结合产生抗体(分别是“b-b”和“d-b”)，它们是通过FR-改组进行翻译程序并结合人源化L链“b”型的人源化H链，通过细胞ELISA测定对抗原的结合活性。“d-b”表现出与嵌合抗体相等的结合活性，而“b-b”在高浓度时表现出稍低的结合活性。另一方面，与阳性对照嵌合抗体相比，针对抗原的中和活性在“b-b”稍低，在“d-b”显著弱。因此证明“b-b”是高中和活性型，而“d-b”是高结合活性型。
(ix)人源化H链“e”型和嵌合L链和人源化L链“b”型的结合产生抗体(分别是“e-ch”和“e-b”)，它们是与嵌合L链和人源化“b”型结合的人源化L链“e”型。“e-ch”表现出与嵌合抗体相等的结合活性，但是在“e-b”中表达抗体的量非常少并且损失了大部分的结合活性。与嵌合抗体相比，“e-ch”针对抗原的中和活性显著弱。因此证明与L链“b”型结合的H链“e”型不能好地工作。
(x)人源化H链“f”型，“g”型和“h”型和人源化L链“b”型的结合产生抗体(分别是“f-b”，“g-b”和“h-b”)，它们是与人源化L链“b”型结合的人源化H链“f”型，“g”型和“h”型。在“f-b”和“h-b”抗体中，表达的抗体的量非常少。对于“f”和“h”型，产生与嵌合L链结合的抗体，但是不表达。低浓度下“g-b”达到饱和，并且与嵌合抗体相比表现出更弱的结合活性。与嵌合抗体相比，“g-b”的针对抗原的中和活性显著弱。
(xi)人源化H链“b1”型和“d1”型和人源化L链“b”型的结合产生抗体(分别是“b1-b”和“d1-b”)，它们是与人源化L链“b”型结合的人源化H链“b1”型和“d1”型。在它们的任何一个中几乎不表达抗体。对于它们，产生与嵌合L链结合的抗体，但是不表达。
(xii)人源化H链“b3”型和“d3”型和人源化L链“b”型的结合产生抗体(分别是“b3-b”和“d3-b”)，它们是与人源化L链“b”型结合的人源化H链“b3”型和“d3”型。与嵌合抗体相比，“d3-b”对抗原的结合活性稍低，而“b3-b”则低得多。“b3-b”针对抗原的中和活性比“b-b”高，但是低于嵌合抗体，并且“d3-b”和“b-b”保持活性相等。
(xiii)人源化H链“i”型和“j”型和嵌合L链和人源化L链“b”型的结合产生抗体(分别是“i-ch”和“j-ch”)，它们是与嵌合L链结合的人源化H链“i”型和“j”型，并产生与人源化L链“b”型结合的抗体(分别是“i-b”和“j-b”)，测定对抗原的结合活性和针对抗原的中和活性。任何抗体的结合活性与嵌合抗体的几乎相等，“i-ch”表现出比嵌合抗体高的中和活性，而“j-ch”显著低于嵌合抗体的中和活性。“i-b”表现出与嵌合抗体相等的中和活性，而“j-b”显著低于嵌合抗体的中和活性。
(xiv)人源化L链“b1”型和“b2”型产生抗体(分别是“ch-b1”和“ch-b2”)，它们是与嵌合H链结合的人源化L链“b1”型和“b2”型，它们两个都表现出与该嵌合抗体相等的与抗原的结合活性。关于针对抗原的中和活性，“ch-b1”表现出与嵌合抗体相等的结合活性，而“ch-b2”表现出在高浓度下比嵌合抗体稍高的活性。“b1”型和“b2”型能是人源化抗体L链的候选者，而“b2”的优越性在于其具有更强的活性。
(xv)人源化H链“b”型和人源化L链“b2”型的结合产生抗体(“b-b2”)，它是与人源化L链“b2”型结合的人源化H链“b”型，测定对抗原的结合活性和针对抗原的中和活性。结合活性稍低于嵌合抗体的。中和活性尽管稍高于“b-b”，但是低于“i-b”。
(xvi)人源化H链“i”型和人源化L链“b1”型或“b2”型的结合产生抗体(分别是“i-b1”和“i-b2”)，它们是与人源化L链“b1”型或“b2”型结合的人源化H链“i”型，测定对抗原的结合活性和针对抗原的中和活性。“i-b2”的结合活性几乎与嵌合抗体的相等，而“i-b1”的稍弱于嵌合抗体的。“i-b1”和“i-b2”的中和活性高于嵌合抗体和“i-b”的，其渐低顺序是“i-b2”＞“i-b1”。
参照实施例7.产生人源化抗体的CHO细胞的制备及其活性评价(1)建立稳定产生CHO的细胞系为了建立稳定产生人源化抗体(b-b，i-b和i-b2)的细胞系，将抗体表达基因载体引入CHO细胞(DG44)顺应无血清培养基。
用限制酶SspI(Takara Shuzo)消化质粒DNA，hHvb-hLvb/N5KG4P，hHvi-hLvb/N5KG4P，和hHvi-hLvb2/N5KG4P并且线性化，用苯酚和氯仿提取，并且通过乙醇沉淀进行纯化。使用电穿孔仪器(Gene Pulser；BioRad)将线性化表达基因载体引入DG44细胞。以1×107细胞/毫升将DG44细胞悬浮于PBS，并且向大约0.8毫升该悬浮液加入10或50微克该DNA，使其接受1500V和25μF电容脉冲。
室温下10分钟恢复期之后，将处理过的细胞悬浮于含有次黄嘌呤/胸苷(GIBCO)(下文称之为HT)的CHO-S-SFMII培养基(GIBCO)中，以100微升/孔接种两个96-孔板(Falcon)，并且在CO2培养箱中培养。开始培养之后8-9小时，加入100微升/孔含有HT和1毫克/毫升GENETICIN的CHO-S-SFMII培养基(GIBCO)替换500微克/毫升GENETICIN筛选培养基，并且筛选其中引入了抗体基因的细胞。每3-4天一次用新鲜培养基更换1/2体积的培养基。更换筛选培养基之后大约2周时，从其中4-5天之后观察到良好细胞生长的孔回收一等份培养上清液。通过上面对于测定抗体浓度描述的ELISA测定培养上清液中表达的抗体浓度，并且筛选具有抗体高产率的细胞。
(2)大规模纯化人源化抗体如上筛选产生人源化抗体(“b-b”，“i-b”和“i-b2”)的DG44细胞系之后，使用2升滚瓶(CORNING)在500毫升/瓶CHO-S-SFMII培养基中培养几天，收获培养基并且加入新鲜CHO-S-SFMII培养基再培养。将培养基离心去除细胞碎屑，用0.22μm或0.4μm过滤器过滤。通过重复该操作，获得总共大约2升的培养上清液。从获得的培养上清液，通过与蛋白质A亲和柱(Poros)连接的ConSep LC100系统(Millipore)纯化抗体。
(3)通过ELISA测定抗体浓度如下制备用于测定抗体浓度的ELISA平板用100微升山羊抗-人IgGγ抗体(BIO SOURCE)固定96-孔ELISA平板(Maxisorp，NUNC)的每个孔，所用的山羊抗-人IgGγ抗体是用CB制备成浓度为1微克/毫升的。用200微升DB封闭之后，用DB系列稀释其中表达抗体的CHO细胞的培养上清液或者纯化的抗体，然后加入到各孔中。
室温下温育1小时之后用RB洗涤，加入用DB稀释1000倍的100微升碱性磷酸酶-偶联的山羊抗-人IgGγ抗体(BioSource)。室温下温育1小时之后用RB洗涤，加入100微升底物溶液，然后使用MicroplateReader(Bio Rad)测定405/655nm处的吸光度。作为测定浓度的标准，使用人IgG4κ(结合位点)。
(4)与抗原的结合活性的测定如下制备用于测定抗原结合的细胞ELISA平板。使用的细胞是人膀胱癌细胞J82(ATCC HTB-1)。以1×105细胞的细胞量将其接种到96-孔细胞培养板。在CO2培养箱中(含有10％胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640培养基)培养一天使得细胞生长汇合。弃除培养物液体之后，用PBS将每个孔洗涤两次。向每个孔加入100微升PFA/PBS，并且置于冰上10分钟固定细胞。
弃除PFA/PBS，用300微升PBS将每个孔洗涤两次，然后用250微升DB封闭。在上述测定结果的基础上，用DB系列稀释纯化的抗体，稀释从10微克/毫升乘2开始，将其100微升加给每个孔。室温下温育2小时之后用RB洗涤，加入用DB稀释1000倍的100微升碱性磷酸酶-偶联的山羊抗-人IgGγ抗体(BioSource)。室温下温育1小时之后用RB洗涤，加入100微升底物溶液，然后使用Microplate Reader(Bio Rad)测定405/655nm处的吸光度。
(5)针对TF中和活性的测定(针对Fxa产生的因子抑制活性)通过人胎盘产生的凝血因子III，Thromborel S(Boehringer AG)，用针对因子Xa-产生活性的抑制活性作为指数，测定人源化抗体的因子Xa产生-抑制活性。因此，向10微升5毫克/毫升Thromborel S和10微升抗体中加入60微升缓冲液(含有5mM氯化钙和0.1％BSA的TBS)，然后将其在室温下在96-孔板中温育1小时。用缓冲液从200微克/毫升乘5开始系列稀释抗体。
向其中各加入10微升3.245微克/毫升人因子X(CelsusLaboratories)和82.5ng/ml人因子VIIa(Enzyme Research)，并且进一步在室温下温育45分钟。加入10微升0.5M EDTA中止反应，向其中加入50微升显色底物溶液，并且使用Microplate Reader(Bio Rad)测定405/655nm处的吸光度。室温下反应30分钟之后，再次测定405/655nm处的吸光度。以没有抗体加入时30分钟吸光度变化为100％活性，通过从吸光度的每一次变化确定残留活性(％)。
通过根据所附说明书的说明，溶解Testzyme显色底物S-2222(Chromogenix)，并且以1∶1的比例与1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物溶液(0.6毫克/毫升六二亚甲基溴化物，SIGMA)混合来制备显色底物溶液。
(6)针对TF中和活性的测定(针对FX-结合的抑制活性)用人胎盘产生的凝血因子III，Thromborel S(Boehringer AG)测定针对人源化抗体的FX-结合的抑制活性，其中事先形成了TF和因子VIIa的复合物，并且使用该TF-VIIa复合物的因子Xa产生活性为指数，测定针对FX-结合的抑制活性。因此，向10微升5毫克/毫升Thromborel S和10微升82.5ng/ml人因子VIIa(Enzyme Research)中加入60微升缓冲液(含有5mM氯化钙和0.1％BSA的TBS)，然后将其在室温下在96-孔板中温育1小时。
向其中各加入10微升抗体溶液，在室温下温育5分钟，加入10微升3.245微克/毫升人因子X(Celsus Laboratories)，并且进一步在室温下温育45分钟。从200微克/毫升乘2开始用缓冲液系列稀释抗体。加入10微升0.5M EDTA中止反应，向其中加入50微升显色底物溶液，并且使用Microplate Reader(Bio Rad)测定405/655nm处的吸光度。室温下反应30分钟之后，再次测定405/655nm处的吸光度。以没有抗体加入时30分钟吸光度变化为100％活性，通过从吸光度的每一次变化确定残留活性(％)。
通过根据所附说明书的说明，溶解Testzyme显色底物S-2222(Chromogenix)，并且以1∶1的比例与1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物溶液(0.6毫克/毫升六二亚甲基溴化物，SIGMA)混合来制备显色底物溶液。
(7)针对对于血浆凝固抑制活性的中和活性的测定用人胎盘产生的凝血因子III，Thromborel S(Boehringer AG)测定的凝血酶原时间为指数测定针对人源化抗体TF的中和活性(针对血浆凝固的抑制活性)。因此，向样品杯加入100微升人血浆(Cosmo Bio)，向其中加入稀释成各种浓度的50微升抗体，并且在37℃加热3分钟。加入事先在37℃预热的50微升1.25毫克/毫升Thromborel S开始血浆凝固。使用与Amelung CR-A连接的Amelung KC-10A(两者都从M.C.Medical获得)测定凝固时间。
从80微克/毫升乘2开始用含有0.1％BSA的TBS(下文称之为BSA-TBS)系列稀释抗体。以没有抗体加入的凝固时间为100％TF血浆凝固活性，以通过Thromborel S的浓度对凝固时间作图获得的标准曲线为基础，从抗体加入的各个凝固时间计算残留TF活性。
从各种浓度的Thromborel S作出标准曲线并且测定凝固时间。向50微升适当稀释的Thromborel S加入50微升BSA-TBS，在37℃加热3分钟，加入在37℃预热的100微升人血浆开始凝固，并且测定凝固时间。从6.25毫克/毫升乘2开始，用含有25mM氯化钙的Hank缓冲液(GIBCO)系列稀释Thromborel S。在横坐标轴上对Thromborel S浓度作图，并在log-log纸上的纵坐标轴上对凝固时间作图，作出标准曲线。
(8)活性评价所有的人源化抗体，“b-b”，“i-b”和“i-b2”具有等于或大于嵌合抗体的活性(图1)。对于针对Fxa产生的抑制活性以及针对FX-结合抑制活性和针对血浆凝固抑制活性，人源化抗体“b-b”，“i-b”和“i-b2”具有等于或大于嵌合抗体的活性，活性递减顺序是“i-b2”＞“i-b”＞“b-b”(图2，3，和4)。
序列表<110>CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA<120>与血液凝固相关的疾病的预防或治疗剂<130>H795-PCT<160>104<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物MHC-G1<400>1ggatcccggg ccagtggata gacagatg 28<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物MKC<400>2ggatcccggg tggatggtgg gaagatg 27<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>M13引物M4<400>3gttttcccag tcacgac 17<210>4<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>M13引物RV<400>4caggaaacag ctatgac17<210>5<211>408<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(408)<223>编码抗-TF小鼠单克隆抗体ATR-5的H链V区的核苷酸序列<400>5atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtc aat tca gag gtt cag ctg cag cag tct ggg act aac ctt gtg agg96Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Asn Leu Val Arg1 5 10cca ggg gcc tta gtc aag ttg tcc tgc aaa ggt tct ggc ttc aac att 144Pro Gly Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cac tgg gtg aag cag agg cct gaa cag ggc ctg 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu30 35 40 45gag tgg att gga ggg aat gat cct gcg aat ggt cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc aag gcc agt ata aca gca gac aca tcc tcc aac 288Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn65 70 75
aca gcc tac ctg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gcc gtc 336Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90tat ttc tgt gct aga gac tcg ggc tat gct atg gac tac tgg ggt caa 384Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 408Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser110 115<210>6<211>381<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>单链肽<222>(1)...(60)<220>
<221>成熟肽<222>(61)...(381)<223>编码抗-TF小鼠单克隆抗体ATR-5的L链V区的核苷酸序列<400>6atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggt atc aga tgt gac atc aag atg acc cag tct cca tcc tct atg tat96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr1 5 10gca tcg ctg gga gag aga gtc act atc act tgc aag gcg agt cag gac 144Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp15 20 25att aaa agc ttt tta agt tgg tac cag caa aaa cca tgg aaa tct cct 192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro30 35 40
aag acc ctg atc tat tat gca aca agc ttg gca gat ggg gtc cca tca 240Lys Thr Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60aga ttc agt ggc agt gga tct ggg caa gat tat tct cta acc atc aac 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn65 70 75aac ctg gag tct gac gat aca gca act tat tat tgt cta cag cat ggt 336Asn Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly80 85 90gag agc ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys95 100 105<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物ch5HS<400>7gtctgtcgac ccaccatgaa atgcagctgg gtcat 35<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物ch5HA<400>8tgttgctagc tgaggagacg gtgactga 28<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物ch5LS<400>9gtctagatct ccaccatgag ggcccctgct cagtt 35
<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物ch5LA<400>10tgttcgtacg ttttatttcc agcttggt 28<210>11<211>104<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CDR移植引物hR5Hv1S<400>11ttctgtcgac ccaccatgaa atgcagctgg gtcatcttct tcctgatggc agtggttaca 60ggggttaact cacaggtgca gctgttggag tctggagctg tgct 104<210>12<211>108<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CDR移植引物hR5Hv28<400>12acaggtgcag ctgttggagt ctggagctgt gctggcaagg cctgggactt ccgtgaagat 60ctcctgcaag gcttccggat tcaacattaa agactactat atgcattg 108<210>13<211>108<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CDR移植引物hR5Hv4S<400>13gaatggccat agtatgtatg acccgaaatt ccagggcagg gccaaactga ctgcagccac 60atccgccagt attgcctact tggagttctc gagcctgaca aatgagga 108
<210>14<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CDR移植引物hR5Hv3A<400>14tcatacatac tatggccatt cgcaggatca ttcccaccaa tccattctag accctgtcca 60ggcctctgtt ttacccaatg catatagtag tctttaatgt tgaatccgga 110<210>15<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CDR移植引物hR5Hv5A<400>15agaagctagc tgaggagacg gtgaccaggg tgccttggcc ccagtagtcc atggcatagc 60ccgagtctct tgcacagtaa tagaccgcag aatcctcatt tgtcaggctc 110<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物hR5HvPrS<400>16ttctgtcgac ccaccatga19<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物hR5HvPrA<400>17agaagctagc tgaggagac19<210>18
<211>415<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(415)<223>编码人源化H链V区的“a”型的核苷酸序列<400>18atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc agg gcc aaa ctg act gca gcc aca tcc gcc agt 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Ser Ala Ser65 70 75att gcc tac ttg gag ttc tcg agc ctg aca aat gag gat tct gcg gtc 336Ile Ala Tyr Leu Glu Phe Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val80 85 90tat tac tgt gca aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105
ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 415Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 115<210>19<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化H链V区的“a”型的氨基酸序列<400>19Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Ala Lye Leu Thr Ala Ala Thr Ser Ala Ser Ile Ala Tyr65 70 75 80Leu Glu Phe Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>20<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3RFFS<400>20ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggccg agtcacaatc actgcagaca 60catccacgaa cacagcctac atggagctct cgagtctgag100
<210>21<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3RFBS<400>21ggagctctcg agtctgagat ctgaggacac agccatttat tactgtgcaa gagactcggg 60ctatgccatg gttct75<210>22<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3RFFA<400>22ctcagactcg agagctccat gtaggctgtg ttcgtggatg tgtctgcagt gattgtgact 60cggccctgga atttcgggtc atacatacta tggccaagaa100<210>23<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3RFBA<400>23agaaccatgg catagcccga gtctcttgca cagtaataaa tggctgtgtc ctcagatctc 60agactcgaga gctcc75<210>24<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3NMFS<400>24ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggccg agtcacaatg ctggtagaca 60
catccaagaa ccagttctcc ctgaggctct cgagtgtgac100<210>25<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3NMBS<400>25gaggctctcg agtgtgacag ccgcggacac agccgtatat tactgtgcaa gagactcggg 60ctatgccatg gttct75<210>26<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3NMFA<400>26gtcacactcg agagcctcag ggagaactgg ttcttggatg tgtctaccag cattgtgact 60cggccctgga atttcgggtc atacatacta tggccaagaa100<210>27<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组物F3NMBA<400>27agaaccatgg catagcccga gtctcttgca cagtaatata cggctgtgtc cgcggctgtc 60acactcgaga gcctc75<210>28<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)
<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源化H链V区的“b”型的核苷酸序列<400>28atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu A1a Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc cga gtc aca atc act gca gac aca tcc acg aac 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn65 70 75aca gcc tac atg gag ctc tcg agt ctg aga tct gag gac aca gcc att 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile80 85 90tat tac tgt gca aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 115<210>29<211>119<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人源化H链V区的“b”型的氨基酸序列<400>29Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>30<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源化H链V区的“c”型的核苷酸序列<400>30atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5
gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu ger Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc cga gtc aca atg ctg gta gac aca tcc aag aac 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn65 70 75cag ttc tcc ctg agg ctc tcg agt gtg aca gcc gcg gac aca gcc gta 336Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val80 85 90tat tac tgt gca aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 115<210>31<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化H链V区的“c”型的氨基酸序列<400>31Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser65 70 75 80Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>32<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3EPS<400>32ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggcag agtcacgatt actgcggacg 60aatccacgag cacagcctac atggagctct cgagtctgag100<210>33<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3EPA<400>33agaaccatgg catagcccga gtctctcgca cagaaatata cggccgagtc ctcagatctc 60agactcgaga gctcc75<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物F3PrS
<400>34ttcttggcca tagtatgtat 20<210>35<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物F3PrA<400>35agaaccatgg catagccc 18<210>36<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3VHS<400>36ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggcag agtctcgatt accgcggacg 60agtcaacgaa gatagcctac atggagctca acagtctgag100<210>37<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3VHA<400>37agaaccatgg catagcccga gtctctcgca cagaaataaa cggccgtgtc ctcagatctc 60agactgttga gctcc75<210>38<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)
<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源化H链V区的“d”型的核苷酸序列<400>38atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc aga gtc acg att act gcg gac gaa tcc acg agc 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser65 70 75aca gcc tac atg gag ctc tcg agt ctg aga tct gag gac tcg gcc gta 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val80 85 90tat ttc tgt gcg aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 115<210>39<211>119<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人源化H链的“d”型的氨基酸序列<400>39Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Aep Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>40<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源化H链V区的“e”型的核苷酸序列<400>40atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg 48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5
gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc aga gtc tcg att acc gcg gac gag toa acg aag 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Lys65 70 75ata gcc tac atg gag ctc aac agt ctg aga tct gag gac acg gcc gtt 336Ile Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90tat ttc tgt gcg aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 115<210>41<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化H链V区的“e”型的氨基酸序列<400>41Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Lys Ile Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>42<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3SSS<400>42ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggcag agtcacgatt accgcggaca60catccacgag cacagcctac atggagctca ggagcctgag 100<210>43<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3SSA<400>43agaaccatgg catagcccga gtctctcgca cagtaataca cggccgtgtc gtcagatctc60aggctcctga gctcc 75<210>44<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3CDS
<400>44ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggcaa agccactctg actgcagacg60aatcctccag cacagcctac atgcaactct cgagcctacg 100<210>45<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3CDA<400>45agaaccatgg catagcccga gtctcttgca caagaataga ccgcagagtc ctcagatcgt60aggctcgaga gttgc 75<210>46<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源化H链V区的“f”型的核苷酸序列<400>46atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Cln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgo aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25
aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aca tcc acg agc288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser65 70 75aca gcc tac atg gag ctc agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val80 85 90tat tac tgt gcg aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 115<210>47<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化H链V区的“f”型的氨基酸序列<400>47Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>48<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源的H链V区的“g”型的核苷酸序列<400>48atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60
ccg aaa ttc cag ggc aaa gcc act ctg act gca gac gaa tcc tcc agc288Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser65 70 75aca gcc tac atg caa ctc tcg agc cta cga tct gag gac tct gcg gtc336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val80 85 90tat tct tgt gca aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa384Tyr Ser Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 115<210>49<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化H链V区的“g”型的氨基酸序列<400>49Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>50
<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3ADS<400>50ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggccg cgtcaccatg tcagccgaca 60agtcctccag cgccgcctat ttacagtgga ccagccttaa100<210>51<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3ADA<400>51agaaccatgg catagcccga gtctctcgcg cagaaatata tggcggtgtc cgaggcctta 60aggctggtcc actgt75<210>52<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源化H链“h”型的核苷酸序列<400>52atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg 48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg 96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10
cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc cgc gtc acc atg tca gcc gac aag tcc tcc agc288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Ser Ala Asp Lys Ser Ser Ser65 70 75gcc gcc tat tta cag tgg acc agc ctt aag gcc tcg gac acc gcc ata336Ala Ala Tyr Leu Gln Trp Thr Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile80 85 90tat ttc tgc gcg aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa384Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 115<210>53<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化H链V区的“h”型的氨基酸序列<400>53Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Ser Ala Asp Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Thr Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>54<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3MMS<400>54ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggcag agtcacgatt accgcggaca60catcgacgag cacagtcttc atggaactga gcagcctgag 100<210>55<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3MMA<400>55agaaccatgg catagcccga gtctctcgca cagtaataca cggccgtgtc ttcagatctc60aggctgctca gttcc 75<210>56<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3BMS<400>56ttcttggcca tagtatgtat gacccgaaat tccagggcag agtcaccttt accgcggaca60catccgcgaa cacagcctac atggagttga ggagcctcag 100<210>57
<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3BMA<400>57agaaccatgg catagcccga gtctctcgca caataataaa cagccgtgtc tgcagatctg60aggctcctca actcc 75<210>58<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源化H链V区的“i”型的核苷酸序列<400>58atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60
ccg aaa ttc cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aca tcg acg agc288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser65 70 75aca gtc ttc atg gaa ctg agc agc ctg aga tct gaa gac acg gcc gtg336Thr Val Phe Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90tat tac tgt gcg aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 115<210>59<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化H链V区的“i”型的氨基酸序列<400>59Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Phe65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>60
<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源化H链V区的“j”型的核苷酸序列<400>60atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt cta 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gaa tgg att ggt ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc aga gtc acc ttt acc gcg gac aca tcc gcg aac 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn65 70 75aca gcc tac atg gag ttg agg agc ctc aga tct gca gac acg gct gtt 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val80 85 90tat tat tgt gcg aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105
ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 115<210>61<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化H链V区的“j”型的氨基酸序列<400>61Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Mat His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>62<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F2MPS<400>62ttctatgcat tgggtgcgcc aggctccagg acagggcctg gagtggatgg gagggaatga 60tcctgcgaat ggccattct79
<210>63<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F2MPA<400>63agaatggcca ttcgcaggat cattccctcc catccactcc aggccctgtc ctggagcctg 60gcgcacccaa tgcatagaa 79<210>64<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源化H链V区的“b1”型的核苷酸序列<400>64atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gtg cgc cag gct cca gga cag ggc ctg 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45
gag tgg atg gga ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac240Glu Trp Met Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc cga gtc aca atc act gca gac aca tcc acg aac288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn65 70 75aca gcc tac atg gag ctc tcg agt ctg aga tct gag gac aca gcc att336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile80 85 90tat tac tgt gca aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa384Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 115<210>65<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化H链V区的“b1”型的氨基酸序列<400>65Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>66<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源化H链V区的“d1”型的核苷酸序列<400>66atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gtg cgc cag gct cca gga cag ggc ctg 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gag tgg atg gga ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Met Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60ccg aaa ttc cag ggc aga gtc acg att act gcg gac gaa tcc acg agc 288Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser65 70 75aca gcc tac atg gag ctc tcg agt ctg aga tct gag gac tcg gcc gta 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val80 85 90
tat ttc tgt gcg aga gac tcg ggc tat gcc atg gac tac tgg ggc caa 384Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc 414Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser110 115<210>67<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化H链V区的“d1”型的氨基酸序列<400>67Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>68<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F2VHS
<400>68ttctatgcat tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggattg gagggaatga60tcctgcgaat ggccatctt 79<210>69<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F2VHA<400>69aagatggcca ttcgcaggat cattccctcc aatccactca agcccttgtc caggggcctg60tcgcacccaa tgcatagaa 79<210>70<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源的H链V区的“b3”型的核苷酸序列<400>70atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25
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<223>人源化H链V区的“b3”型的氨基酸序列<400>71Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>72<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(57)<220>
<221>成熟肽<222>(58)...(414)<223>编码人源化H链V区的“d3”型的核苷酸序列<400>72atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5gtt aac tca cag gtg cag ctg ttg gag tct gga gct gtg ctg gca agg96Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg1 5 10cct ggg act tcc gtg aag atc tcc tgc aag gct tcc gga ttc aac att 144Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile15 20 25aaa gac tac tat atg cat tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45gag tgg att gga ggg aat gat cct gcg aat ggc cat agt atg tat gac 240Glu Trp Ile Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp50 55 60
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<223>人源化H链V区的“d3”型的氨基酸序列<400>73Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115<210>74
<211>98<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组载体h5Lv1S<400>74gtctagatct ccaccatgag ggcccctgct cagttttttg ggatcttgtt gctctggttt60ccagggatcc gatgtgacat ccagatgacc cagtctcc98<210>75<211>98<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组载体h5Lv4S<400>75ttggcagatg gggtcccatc aaggttcagt ggctccggat ctggtaccga tttcactctc60accatctcga gtctgcaacc tgaagatttt gcaactta98<210>76<211>98<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组载体h5Lv2A<400>76cttaagaagc ttttaatgtc ctgtgaggcc ttgcacgtga tggtgactct gtctcctaca60gatgcagaca gggaggatgg agactgggtc atctggat98<210>77<211>98<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组载体h5Lv3A<400>77gatgggaccc catctgccaa actagttgca taatagatca ggagcttagg ggctttccct60ggtttctgct gataccaact taagaagctt ttaatgtc98
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<223>FR改组载体h5Lv5A<400>78tgttcgtacg tttgatctcc accttggtcc ctccgccgaa cgtgtacggg ctctcaccat60gctgcagaca gtagtaagtt gcaaaatctt cagg94<210>79<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物h5LVS<400>79gtctagatct ccaccatgag20<210>80<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物h5LvA<400>80tgttcgtacg tttgatctc 19<210>81<211>381<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(60)<220>
<221>成熟肽<222>(61)...(381)
<223>编码人源化L链V区的“a”型的核苷酸序列<400>81atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser1 5 10gca tct gta gga gac aga gtc acc atc acg tgc aag gcc tca cag gac 144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp15 20 25att aaa agc ttc tta agt tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct 192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro30 35 40aag ctc ctg atc tat tat gca act agt ttg gca gat ggg gtc cca tca 240Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60agg ttc agt ggc tcc gga tct ggt acc gat ttc act ctc acc atc tcg 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75agt ctg caa cct gaa gat ttt gca act tac tac tgt ctg cag cat ggt 336Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly80 85 90gag agc ccg tac acg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 105<210>82<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化L链V区的“a”型的氨基酸序列<400>82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Prc Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Lou Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>83<211>77<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3SS<400>83gtctggtacc gattacactc tcaccatctc gagcctccag cctgaagatt ttgcaactta60ctattgtctg cagaaca 77<210>84<211>77<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3SA<400>84tgttctgcag acaatagtaa gttgcaaaat cttcaggctg gaggctcgag atggtgagag60tgtaatcggt accagac 77<210>85<211>77<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>FR改组引物F3RS<400>85gtctggtacc gattacactc tcaccatctc gagcctccag cctgaagata ttgcaactta60ctattgtctg cagaaca 77<210>86<211>77<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F3RA<400>86tgttctgcag acaatagtaa gttgcaatat cttcaggctg gaggctcgag atggtgagag60tgtaatcggt accagac 77<210>87<211>381<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(60)<220>
<221>成熟肽<222>(61)...(381)<223>编码人源化L链V区的“b”型的核苷酸序列<400>87atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca 48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct 96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser1 5 10gca tct gta gga gac aga gtc acc atc acg tgc aag gcc tca cag gac144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp15 20 25
att aaa agc ttc tta agt tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro30 35 40aag ctc ctg atc tat tat gca act agt ttg gca gat ggg gtc cca tca240Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60agg ttc agt ggc tcc gga tct ggt acc gat tac act ctc acc atc tcg288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75agc ctc cag cct gaa gat ttt gca act tac tat tgt ctg cag cat ggt336Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly80 85 90gag agc ccg tac acg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 105<210>88<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化L链V区的“b”型的氨基酸序列<400>88Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
<210>89<211>381<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(60)<220>
<221>成熟肽<222>(61)...(381)<223>编码人源化L链V区的“c”型的核苷酸序列<400>89atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct96Gly Ile Arg cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser1 5 10gca tct gta gga gac aga gtc acc atc acg tgc aag gcc tca cag gac 144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp15 20 25att aaa agc ttc tta agt tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct 192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro30 35 40aag ctc ctg atc tat tat gca act agt ttg gca gat ggg gtc cca tca 240Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60agg ttc agt ggc tcc gga tct ggt acc gat tac act ctc acc atc tcg 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75agc ctc cag cct gaa gat att gca act tac tat tgt ctg cag cat ggt 336Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly80 85 90
gag agc ccg tac acg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 105<210>90<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化L链V区的“c”型的氨基酸序列<400>90Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>91<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F2SS<400>91gtctcttaag ttggttccag cagaaaccag ggaaatctcc taagaccctg atctactatg 60caactagtaa ca 72<210>92<211>72
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F2SA<400>92tgttactagt tgcatagtag atcagggtct taggagattt ccctggtttc tgctggaacc60aacttaagag ac72<210>93<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F2XS<400>93gtctcttaag ttggtatcag cagaaaccag agaaagcccc taagtccctg atctattatg60caactagtaa ca72<210>94<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR改组引物F2XA<400>94tgttactagt tgcataatag atcagggact taggggcttt ctctggtttc tgctgatacc60aacttaagag ac72<210>95<211>381<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(60)<220>
<221>成熟肽<222>(61)...(381)
<223>编码人源化L链V区的“b1”型的核苷酸序列<400>95atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser1 5 10gca tct gta gga gac aga gtc acc atc acg tgc aag gcc tca cag gac 144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp15 20 25att aaa agc ttc tta agt tgg ttc cag cag aaa cca ggg aaa tct cct 192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro30 35 40aag acc ctg atc tac tat gca act agt ttg gca gat ggg gtc cca tca 240Lys Thr Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60agg ttc agt ggc tcc gga tct ggt acc gat tac act ctc acc atc tcg 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75agc ctc cag cct gaa gat ttt gca act tac tat tgt ctg cag cat ggt 336Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly80 85 90gag agc ccg tac acg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 105<210>96<21l>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化L链V区的“b1”型的氨基酸序列<400>96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe20 25 30Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>97<211>381<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>单链肽<222>(1)...(60)<220>
<221>成熟肽<222>(61)...(381)<223>编码人源化L链V区的“b2”型的核苷酸序列<400>97atg agg gcc cct gct cag ttt ttt ggg atc ttg ttg ctc tgg ttt cca48Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro-20 -15 -10 -5ggg atc cga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct96Gly Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser1 5 10gca tct gta gga gac aga gtc acc atc acg tgc aag gcc tca cag gac 144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp15 20 25
att aaa agc ttc tta agt tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct 192Ile Lys Ser Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro30 35 40aag tcc ctg atc tat tat gca act agt ttg gca gat ggg gtc cca tca 240Lys Ser Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser45 50 55 60agg ttc agt ggc tcc gga tct ggt acc gat tac act ctc acc atc tcg 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75agc ctc cag cct gaa gat ttt gca act tac tat tgt ctg cag cat ggt 336Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly80 85 90gag agc ccg tac acg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 381Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 105<210>98<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化L链V区的“b2”型的氨基酸序列<400>98Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
<210>99<211>117<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>抗TF小鼠单克隆抗体ATR-5的H链V区的氨基酸序列<400>99Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Asn Leu Val Arg Pro Gly Ala5 10 15Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Gly His Ser Met Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser100 105 110Val Thr Val Ser Ser115<210>100<211>107<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>抗TF小鼠单克隆抗体ATR-5的L链V区的氨基酸序列<400>100Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly5 10 15Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Phe20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Asn Leu Glu Ser65 70 75 80Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>101<211>780<212>DNA<213>人<220>
<223>编码可溶性人TF的DNA<400>101atg gag acc cct gcc tgg ccc cgg gtc ccg cgc ccc gag acc gcc gtc48Met Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val-30 -25 -20gct cgg acg ctc ctg ctc ggc tgg gtc ttc gcc cag gtg gcc ggc gct96Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala-15 -10 -5 -1tca ggc act aca aat act gtg gca gca tat aat tta act tgg aaa tca 144Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15act aat ttc aag aca att ttg gag tgg gaa ccc aaa ccc gtc aat caa 192Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30gtc tac act gtt caa ata agc act aag tca gga gat tgg aaa agc aaa 240Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45tgc ttt tac aca aca gac aca gag tgt gac ctc acc gac gag att gtg 288Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60
aag gat gtg aag cag acg tac ttg gca cgg gtc ttc tcc tac ccg gca366Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80ggg aat gtg gag agc acc ggt tct gct ggg gag cct ctg tat gag aac384Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95tcc cca gag ttc aca cct tac ctg gag aca aac ctc gga cag cca aca432Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110att cag agt ttt gaa cag gtg gga aca aaa gtg aat gtg acc gta gaa480Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125gat gaa cgg act tta gtc aga agg aac aac act ttc cta agc ctc cgg528Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140gat gtt ttt ggc aag gac tta att tat aca ctt tat tat tgg aaa tct576Aap Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160tca agt tca gga aag aaa aca gcc aaa aca aac act aat gag ttt ttg624Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175att gat gtg gat aaa gga gaa aac tac tgt ttc agt gtt caa gca gtg672Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190att ccc tcc cga aca gtt aac cgg aag agt aca gac agc ccg gta gag720Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205tgt atg ggc cag gag aaa ggg gaa ttc aga gaa gac tac aaa gac gat768Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Asp Tyr Lys Asp Asp210 215 220gac gat aaa taa780Asp Asp Lys225<210>102<211>259<212>PRT<220>
<223>可溶性人TF的氨基酸序列<400>102Met Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val-30 -25 -20Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala-15 -10 -5 -1Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Aan Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Asp Tyr Lys Asp Asp210 215 220Asp Asp Lys225<210>103
<211>780<212>DNA<213>人<220>
<223>编码人TF的DNA<400>103atg gag acc cct gcc tgg ccc cgg gtc ccg cgc ccc gag acc gcc gtc48MET Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val-30 -25 -20gct cgg acg ctc ctg ctc ggc tgg gtc ttc gcc cag gtg gcc ggc gct96Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala-15 -10 -5 -1tca ggc act aca aat act gtg gca gca tat aat tta act tgg aaa tca 144Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15act aat ttc aag aca att ttg gag tgg gaa ccc aaa ccc gtc aat caa 192Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30gtc tac act gtt caa ata agc act aag tca gga gat tgg aaa agc aaa 240Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45tgc ttt tac aca aca gac aca gag tgt gac ctc acc gac gag att gtg 288Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60aag gat gtg aag cag acg tac ttg gca cgg gtc ttc tcc tac ccg gca 336Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80ggg aat gtg gag agc acc ggt tct gct ggg gag cct ctg tat gag aac 384Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95tcc cca gag ttc aca cct tac ctg gag aca aac ctc gga cag cca aca 432Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110att cag agt ttt gaa cag gtg gga aca aaa gtg aat gtg acc gta gaa 480Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125
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<223>可溶性人TF的氨基酸序列<400>104MET Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val-30 -25 -20Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala-15 -10 -5 -1
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys MET Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Ile210 215 220Gly Ala Val Val Phe Val Val Ile Ile Leu Val Ile Ile Leu Ala Ile225 230 235 240Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gln Ser Trp Lys Glu245 250 255Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser260
权利要求
1.一种实验动物，其中植入了其中插入了编码人组织因子(TF)的基因或者其部分并且能表达所述基因的动物细胞，所述动物是保持长时间凝固性过高状态的非人动物。
2.根据权利要求1的动物，其中所述人组织因子的部分缺少胞内区。
3.根据权利要求1或2的动物，其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。
4.根据权利要求3的动物，其中所述哺乳动物细胞是人骨髓瘤细胞。
5.根据权利要求1-4任一项的动物，其中所述动物是小鼠。
6.根据权利要求1-5任一项的动物，其中所述凝固性过高状态由至少一种下面的现象指征，包括人组织因子血浆浓度的提高，血小板减少，纤维蛋白原减少，可溶性纤维蛋白单体复合物浓度提高，以及凝血酶-抗凝血酶III复合物浓度提高。
7.产生根据权利要求1-6任一项的动物的方法，其中对非人动物植入其中插入了编码人组织因子(TF)的基因或者其部分并且能表达所述基因的动物细胞，然后选择具有持久性凝固性过高状态的动物。
8.筛选抗血栓形成剂的方法，该方法包括使用根据权利要求1-6任一项的动物。
9.用于具有持久性凝固性过高状态的疾病的预防或治疗剂，所述制剂包含对人组织因子(人TF)的抗体。
10.根据权利要求9的预防或治疗剂，其中所述抗体是多克隆抗体。
11.根据权利要求9的预防或治疗剂，其中所述抗体是单克隆抗体。
12.根据权利要求9或11的预防或治疗剂，其中所述抗体是重组抗体。
13.根据权利要求9或12的预防或治疗剂，其中所述抗体是改变的抗体。
14.根据权利要求9，12或13的预防或治疗剂，其中所述改变的抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
15.根据权利要求14的预防或治疗剂，其中所述人源化抗体是人源化抗体b-b，i-b或i-b2型。
16.根据权利要求9或权利要求12-15任一项的预防或治疗剂，其中所述抗体是修饰的抗体。
17.根据权利要求16的预防或治疗剂，其中所述修饰的抗体是抗体片段Fab，F(ab’)2或Fv，或者单链Fv(scFv)。
18.用于由感染导致的凝固性过高状态的预防或治疗剂，所述制剂包含针对人组织因子(人TF)抗体。
19.根据权利要求18的预防或治疗剂，其中所述抗体是多克隆抗体。
20.根据权利要求18的预防或治疗剂，其中所述抗体是单克隆抗体。
21.根据权利要求18或20的预防或治疗剂，其中所述抗体是重组抗体。
22.根据权利要求18或2 1的预防或治疗剂，其中所述抗体是改变的抗体。
23.根据权利要求18，21或22的预防或治疗剂，其中所述改变的抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
24.根据权利要求23的预防或治疗剂，其中所述人源化抗体是人源化抗体b-b，i-b或i-b2型。
25.根据权利要求18或权利要求21-24任一项的预防或治疗剂，其中所述抗体是修饰的抗体。
26.根据权利要求25的预防或治疗剂，其中所述修饰的抗体是抗体片段Fab，F(ab’)2或Fv，或者单链Fv(scFv)。
27.用于静脉血栓形成的预防或治疗剂，所述制剂包含对人组织因子(人TF)的抗体。
28.根据权利要求27的预防或治疗剂，其中所述抗体是多克隆抗体。
29.根据权利要求27的预防或治疗剂，其中所述抗体是单克隆抗体。
30.根据权利要求27或29的预防或治疗剂，其中所述抗体是重组抗体。
31.根据权利要求27或30的预防或治疗剂，其中所述抗体是改变的抗体。
32.根据权利要求27，30或31的预防或治疗剂，其中所述改变的抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
33.根据权利要求32的预防或治疗剂，其中所述人源化抗体是人源化抗体b-b，i-b或i-b2型。
34.根据权利要求27或权利要求30-33任一项的预防或治疗剂，其中所述抗体是修饰的抗体。
35.根据权利要求34的预防或治疗剂，其中所述修饰的抗体是抗体片段Fab，F(ab’)2或Fv，或者单链Fv(scFv)。
36.用于动脉血栓形成的预防或治疗剂，所述制剂包含对人组织因子(人TF)的抗体。
37.根据权利要求36的预防或治疗剂，其中所述抗体是多克隆抗体。
38.根据权利要求36的预防或治疗剂，其中所述抗体是单克隆抗体。
39.根据权利要求36或38的预防或治疗剂，其中所述抗体是重组抗体。
40.根据权利要求36或39的预防或治疗剂，其中所述抗体是改变的抗体。
41.根据权利要求36，39或40的预防或治疗剂，其中所述改变的抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
42.根据权利要求41的预防或治疗剂，其中所述人源化抗体是人源化抗体b-b，i-b或i-b2型。
43.根据权利要求36或权利要求39-42任一项的预防或治疗剂，其中所述抗体是修饰的抗体。
44.根据权利要求43的预防或治疗剂，其中所述修饰的抗体是抗体片段Fab，F(ab’)2或Fv，或者单链Fv(scFv)。
45.用于由血管中层增厚导致的疾病的预防或治疗剂，所述制剂包含对人组织因子(人TF)的抗体。
46.根据权利要求45的预防或治疗剂，其中所述抗体是多克隆抗体。
47.根据权利要求45的预防或治疗剂，其中所述抗体是单克隆抗体。
48.根据权利要求45或47的预防或治疗剂，其中所述抗体是重组抗体。
49.根据权利要求45或48的预防或治疗剂，其中所述抗体是改变的抗体。
50.根据权利要求45，48或49的预防或治疗剂，其中所述改变的抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
51.根据权利要求50的预防或治疗剂，其中所述人源化抗体是人源化抗体b-b，i-b或i-b2型。
52.根据权利要求43或权利要求48-51任一项的预防或治疗剂，其中所述抗体是修饰的抗体。
53.根据权利要求52的预防或治疗剂，其中所述修饰的抗体是抗体片段Fab，F(ab’)2或Fv，或者单链Fv(scFv)。
全文摘要
本发明通过植入细胞例如肿瘤细胞提供具有持久性凝固性过高状态的动物。其中对实验动物例如小鼠植入人组织因子的基因，然后通过使所述细胞生长，从而对所述实验动物持久性供给人组织因子。该动物模型对于研究和开发用于具有持久性凝固性过高状态的疾病的治疗剂是有用的。本发明还提供了用于具有持久性凝固性过高状态疾病、感染导致的凝固性过高状态、静脉血栓形成、动脉血栓形成和由于血管中层的肥大导致的疾病的预防或治疗剂，所述制剂含有针对人组织因子(人TF)的抗体作为活性成分。
文档编号A61P9/00GK1589098SQ00813720
公开日2005年3月2日 申请日期2000年9月29日 优先权日2000年9月29日
发明者齐藤浩之, 北沢刚久, 吉桥一隆, 服部有宏 申请人:中外制药株式会社