专利名称：用于治疗和预防化学疗法和放射疗法诱导的细胞死亡的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及药物化学领域。特别地，本发明涉及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂治疗或预防癌症的化学疗法和放射疗法期间非癌细胞死亡的用途。
背景技术：
的描述生物体通过种种已知为可调型细胞死亡、程序性细胞死亡或编程性细胞死亡的过程消除不想要的细胞。这样的细胞死亡作为动物发育以及组织内稳态和老化的正常方面而发生(Glucksmann，A.，Biol.Rev.Cambridge Philos.Soc.2659-86(1951)；Glucksmann，A.，Archivesde Biologie76419-437(1965)；Ellis等，Dev.112591-603(1991)；Vaux等，Cell 76777-779(1994))。编程性细胞死亡调节细胞数目，有利于形态形成，去除有害的或者异常细胞，并且减少已经完成了其功能的细胞。另外，编程性细胞死亡响应各种生理应激反应例如低氧或局部缺血而发生(PCT公开申请WO96/20721)。
细胞经历的调节的细胞死亡包括浆膜和核膜起疱、细胞皱缩(核质和胞质的浓缩)、细胞器再定位和致密化、染色质凝聚和编程性细胞死亡体的产生(含有胞内物质的膜包被的颗粒)都涉及多种形态变化(Orrenius，S.，国内药物杂志(J.Internal Medicine)237529-536(1995))。
编程性细胞死亡是通过细胞自杀的内部机理实现的(Wyllie，A.H.，细胞死亡生物学和病理学(Cell Death in Biology and Pathology)，Bowen和Lockshin编著，Chapman和Hall(1981)，pp.9-34)。作为内部或者外部信号的结果，细胞激活其内部编码的自杀程序。通过小心调节的遗传程序的激活执行自杀程序(Wylie等，Int.Rev.Cyt.68251(1980)；Ellis等，Ann.Rev.Cell Bio.7663(1991))。在溶胞作用之前邻近细胞或噬菌体通常识别和清除编程性细胞死亡细胞和编程性细胞死亡体。因为该清除机理，尽管清除大量细胞但是不诱导炎症(Orrenius，S.，国内药物杂志(J.Internal Medicine)237529-536(1995))。
哺乳动物白细胞介素-1β(IL-1β)在各种生理过程中起着重要作用，包括慢性和急性炎症和自身免疫疾病(Oppenheim，J.H.，等，今日免疫学(Immunology Today)7，45-56(1986))。IL-1β被合成作为与细胞相关的母体多肽(前-IL-1β)，其不能结合IL-1受体并且是生物失活的(Mosley等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2622941-2944(1987))。通过抑制母体IL-1β向成熟IL-1β转化，能够抑制白细胞介素-1的活性。白细胞介素-1β转化酶(ICE)是负责白细胞介素-1β(IL-1β)激活的蛋白酶(Thornberry，N.A.等，自然(Nature)356768(1992)；Yuan，J.等，细胞(Cell)75641(1993))。ICE是将失活的前白细胞介素-1裂解产生成熟IL-1的底物特异性半胱氨酸蛋白酶。编码ICE和CPP32的基因是当前包括至少12个成员的哺乳动物ICE/Ced-3基因家族的成员，所述12个成员是ICE，CPP32/Yama/Apopain，mICE2，ICE4，ICH1，TX/ICH-2，MCH2，MCH3，MCH4，FLICE/MACH/MCH5，ICE-LAP6和ICErelIII。其活性位点(半胱氨酸残基)对于ICE-介导的编程性细胞死亡是必需的该半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白水解活性看起来在介导细胞死亡中是关键的(Miura等，细胞(Cell)75653-660(1993))。最近将该基因家族命名为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Alnernri，E.S.等，细胞(Cell)87，171(1996)和Thornberry，N.A.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272，17907-17911(1997))，并且根据其已知功能分为三组。表1总结了这些已知的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。
表1
IL-1也是介导多种生物反应包括炎症，败血症性休克，伤口愈合，血细胞生成和某些白血病细胞的生长中涉及的细胞因子(Dinarello，C.A.，血液(Blood)771627-1652(1991)；DiGiovine等，今日免疫学(Immunology Today)1113(1990))。
WO93/05071公开了具有下式的肽ICE抑制剂Z-Q2-Asp-Q1其中Z是N-末端保护基团；Q2是0-4个氨基酸，以使序列Q2-Asp相应于序列Ala-Tyr-Val-His-Asp的至少一部分。
WO96/03982公开了作为ICE抑制剂的具有下式的天冬氨酸类似物 其中R2是H或烷基；R3是离去基团例如卤原子；R1是杂芳基-CO或氨基酸残基。
美国专利5,585,357公开了作为ICE抑制剂的具有下式的肽酮(peptidic ketone) 其中n是0-2；各AA独立地是L-缬氨酸或L-丙氨酸；R1选自N-苄氧羰基和其它基团；R8，R9，R10各自独立地是氢，低级烷基和其它基团。
Mjalli等(生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)3，2689-2692(1993))报道了作为ICE可逆抑制剂的肽苯基烷基酮例如下式的制备 Thornberry等(生物化学(Biochemistry)33，3934-3940，1994)报道了肽酰基氧基甲基酮对ICE的不可逆灭活作用 其中Ar是COPh-2，6-(CF3)2，COPh-2，6-(CH3)2，Ph-F5和其它基团。
Dolle等，(药物化学杂志(J.Med.Chem.)37，563-564，1994)报道了作为ICE的强的时间依赖性抑制剂的P1天冬氨酸-基肽α-((2，6-二氯苯甲酰基)氧基)甲基酮的制备，例如 Mjalli等(生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)4，1965-1968，1994)报道了作为ICE强的可逆抑制剂的活化酮的制备 其中X是NH(CH2)2，OCO(CH2)2，S(CH2)3和其它基团。
Dolle等(药物化学杂志(J.Med.Chem.)37，3863-3866，1994)报道了作为ICE的不可逆抑制剂的α-((1-苯基-3-(三氟甲基)-吡唑-5-基)氧基)甲基酮的制备，例如 Mjalli等(生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)5，1405-1408，1995)报道了N-酰基-天冬氨酸酮对ICE的抑制作用 其中XR2是NH(CH2)2Ph，OCO(CH2)2环己基和其它基团。
Mjalli等(生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)5，1409-1414，1995)报道了N-酰基-天冬氨酰芳基氧基甲基酮对ICE的抑制作用
Dolle等(药物化学杂志(J.Med.Chem.)38，220-222，1995)报道了作为ICE的不可逆抑制剂的天冬氨酰α-((二苯基氧膦基)氧基)甲基酮的制备，例如 Graybill等(生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)7，41-46，1997)报道了作为ICE的抑制剂的α-((tetronoyl)氧基)-和α-((tetramoyl)氧基)甲基酮的制备，例如 Semple等(生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)8，959-964，1998)报道了作为ICE的抑制剂的肽模拟物氨基亚甲基酮的制备，例如 Okamoto等(化学制药论坛(Chem.Pharm.Bull.)47，11-21，1999)报道了通过P1羧基转化为酰胺的肽基ICE抑制剂的制备，例如
EP618223专利申请公开了作为抗炎剂的ICE的抑制剂R-A1-A2-X-A3其中R是保护基团或者任选的取代苄基氧基；A1是α-羟基或α-氨基酸残基或者下式基团 其中A环任选被羟基C1-4烷氧基取代并且Ra是CO或CS；A2是α-羟基或α-氨基酸残基或者A1和A2-起形成拟-二肽或二肽类似物残基；X是从Asp衍生的残基；A3是-CH2-X1-CO-Y1，-CH2-O-Y2，-CH2-S-Y3，其中X1是O或S；Y1，Y2或Y3是脂环族残基，以及任选地取代的芳基。
WO99/18781和美国申请09/168,945公开了式I的二肽 其中R1是N-末端保护基团；AA是任何天然或非天然α-氨基酸，β-氨基酸、α-氨基酸或β-氨基酸衍生物的残基；R2是H或CH2R4，其中R4是负电性离去基团，并且R3是烷基或H，前提是AA不是His，Tyr，Pro或Phe。这些二肽类化合物在以细胞为基础的系统中是令人惊奇强的编程性细胞死亡的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。这些化合物在体内具有全身性活性并且在小鼠肝编程性细胞死亡模型中是强的抗Fas-诱导致死的抑制剂，并且在大鼠局部缺血性中风模型中具有强的神经保护作用。优选的编程性细胞死亡抑制剂的例子包括Boc-Ala-Asp-CH2F，Boc-Val-Asp-CH2F，Boc-Leu-Asp-CH2F，Ac-Val-Asp-CH2F，Ac-Ile-Asp-CH2F，Ac-Met-Asp-CH2F，Cbz-Val-Asp-CH2F，Cbz-β-Ala-Asp-CH2F，Cbz-Leu-Asp-CH2F，Cbz-Ile-Asp-CH2F，Boc-Ala-Asp(OMe)-CH2F，Boc-Val-Asp(OMe)-CH2F，Boc-Leu-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Val-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Ile-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Met-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-β-Ala-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-Leu-Asp(OMe)-CH2F和Cbz-Ile-Asp(OMe)-CH2F.WO99/47154和美国申请09/270,735公开了式II的二肽 其中R1是N-末端保护基团；AA是非天然α-氨基酸或β-氨基酸残基；R2是任选被取代的烷基或H。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和编程性细胞死亡抑制剂的例子包括Boc-Phg-Asp-fmk，Boc-(2-F-Phg)-Asp-fmk，Boc-(F3-Val)-Asp-fmk，Boc-(3-F-Val)-Asp-fmk，Ac-Phg-Asp-fmk，Ac-(2-F-Phg)-Asp-fmk，Ac-(F3-Val)-Asp-fmk，Ac-(3-F-Val)-Asp-fmk，Z-Phg-Asp-fmk，Z-(2-F-Phg)-Asp-fmk，Z-(F3-Val)-Asp-fmk，Z-Chg-Asp-fmk，Z-(2-Fug)-Asp-fmk，Z-(4-F-Phg)-Asp-fmk，Z-(4-Cl-Phg)-Asp-fmk，Z-(3-Thg)-Asp-fmk，Z-(2-Fua)-Asp-fmk，Z-(2-Tha)-Asp-fmk，Z-(3-Fua)-Asp-fmk，Z-(3-Tha)-Asp-fmk，Z-(3-Cl-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-F-Ala)-Asp-fmk，Z-(F3-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-F-3-Me-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-Cl-3-F-Ala)-Asp-fmk，Z-(2-Me-Val)-Asp-fmk，Z-(2-Me-Ala)-Asp-fmk，Z-(2-i-Pr-β-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-Ph-β-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-CN-Ala)-Asp-fmk，Z-(1-Nal)-Asp-fmk，Z-Cha-Asp-fmk，Z-(3-CF3-Ala)-Asp-fmk，z-(4-CF3-Phg)-Asp-fmk，Z-(3-Me2N-Ala)-Asp-fmk，Z-(2-Abu)-Asp-fmk，Z-Tle-Asp-fmk，Z-Cpg-Asp-fmk，Z-Cbg-Asp-fmk，Z-Thz-Asp-fmk，Z-(3-F-Val)-Asp-fmk，和Z-(2-Thg)-Asp-fmk；其中Z是苄基氧基羰基，BOC是叔丁氧羰基，Ac是乙酰基，Phg是苯基甘氨酸，2-F-Phg是(2-氟苯基)甘氨酸，F3-Val是4，4，4-三氟-缬氨酸，3-F-Val是3-氟-缬氨酸，2-Thg是(2-噻吩基)甘氨酸，Chg是环己基甘氨酸，2-Fug是(2-呋喃基)甘氨酸，4-F-Phg是(4-氟苯基)甘氨酸，4-Cl-Phg是(4-氯苯基)甘氨酸，3-Thg是(3-噻吩基)甘氨酸，2-Fua是(2-呋喃基)丙氨酸，2-Tha是(2-噻吩基)丙氨酸，3-Fua是(3-呋喃基)丙氨酸，3-Tha是(3-噻吩基)丙氨酸，3-Cl-Ala是3-氯丙氨酸，3-F-Ala是3-氟丙氨酸，F3-Ala是3，3，3-三氟丙氨酸，3-F-3-Me-Ala是3-氟-3-甲基丙氨酸，3-Cl-3-F-Ala是3-氯-3-氟丙氨酸，2-Me-Val是2-甲基缬氨酸，2-Me-Ala是2-甲基丙氨酸，2-i-Pr-β-Ala是3-氨基-2-异丙基丙酸，3-Ph-β-Ala是3-氨基-3-苯基丙酸，3-CN-Ala是3-氰基丙氨酸，1-Nal是3-(1-萘基)-丙氨酸，Cha是环己基丙氨酸，3-CF3-Ala是2-氨基-4，4，4-三氟丁酸，4-CF3-Phg是4-三氟甲基苯基甘氨酸，3-Me2N-Ala是3-二甲基氨基丙氨酸，2-Abu是2-氨基丁酸，Tle是叔亮氨酸，Cpg是环戊基甘氨酸，Cbg是环丁基甘氨酸，并且Thz是硫代脯氨酸。
发明概述本发明基于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂可非常有效地防止放射和抗癌药物诱导的细胞死亡的发现。因此本发明涉及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂用于治疗、改善和预防化学疗法和放射疗法期间非癌细胞死亡以及治疗和改善癌症化学疗法和放射疗法副作用的用途。
特别地，本发明涉及治疗、改善或预防动物癌症化学疗法和放射疗法导致的口腔粘膜炎、肠胃粘膜炎、膀胱粘膜炎、直肠炎、骨髓细胞死亡、皮肤细胞死亡和脱发的方法，其包括对需要的动物施用有效量的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
附图的简要描述
图1A-C是Jurkat细胞的照片。
图1D是显示碘化丙锭(propidium iodide)摄入分析测定的细胞编程性细胞死亡的百分比的条框图。
图2A-C是Jurkat细胞的照片。
图2D是显示碘化丙锭摄入分析测定的细胞编程性细胞死亡的百分比的条框图。
图3A-C是Jurkat细胞的照片。
图3D是显示碘化丙锭摄入分析测定的细胞编程性细胞死亡的百分比的条框图。
图4是显示对照与处理动物的百分重量变化图。
图5是显示对照与处理动物的平均组粘膜炎评分图。
图6是显示对照与处理动物的粘膜炎评分为3或更高值的动物天数的百分比条框图。
本发明的详细描述本发明涉及治疗、改善或预防动物癌症化学疗法和放射疗法导致的口腔粘膜炎、肠胃粘膜炎、膀胱粘膜炎、直肠炎、骨髓细胞死亡、皮肤细胞死亡和脱发的方法，其包括对需要的动物施用有效量的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
当用化学治疗药物和/或放射方法对动物治疗以杀死癌细胞时，不期望的副作用是快速分裂的非癌细胞的编程性细胞死亡。这样的非癌细胞包括胃肠道、皮肤、头发和骨髓细胞。根据本发明，对这样的非癌细胞施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂来防止这样的细胞的编程性细胞死亡。在一个优选的实施方案中，局部施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂，例如施用给胃肠道、口腔、皮肤或头皮来防止胃肠道、口腔、皮肤或头发细胞的编程性细胞死亡但却使癌细胞死亡。因此，在一个实施例中，用化学疗法或放射疗法治疗脑癌并且通过局部施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂来保护外部的皮肤、头发细胞、胃肠道和骨髓是可能的。在口腔粘膜炎情况下，可以例如以漱口剂(mouth wash)或漱口水(mouth rinse)形式、凝胶形式，或者以口腔缓释锭剂形式施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂来防止半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活和化学治疗药物或放射方法诱导的编程性细胞死亡。在胃肠道粘膜炎情况下，可以以使得其为非全身吸收的形式或者以覆盖胃肠道表面的形式或者栓剂制剂施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂来治疗胃肠道粘膜炎。在直肠炎情况下，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂可以被作为灌肠剂或栓剂的一部分施用。在膀胱粘膜炎情况下，可以通过膀胱导管施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。为了防止放射或化学疗法引起的脱发，例如可以以洗发剂、发胶、香波或头发护理剂的形式对头皮施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。重要的是，可以在施用化学治疗药物或放射方法之前施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂，这样防止化学治疗药物或放射对正常细胞的损害作用的发生。
在优选实施方案中，所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂具有下式 或者其药学上可接受的盐；其中R1是N-末端保护基团；AA是任何天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸、α-氨基酸或β-氨基酸的衍生物的残基；R2是H或CH2R4，其中R4是负电性离去基团；并且R3是烷基或H。
这样的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂的例子包括Boc-Ala-Asp-CH2F，Boc-Val-Asp-CH2F，Boc-Leu-Asp-CH2F，Ac-Val-Asp-CH2F，Ac-Ile-Asp-CH2F，Ac-Met-Asp-CH2F，Cbz-Val-Asp-CH2F，Cbz-β-Ala-Asp-CH2F，Cbz-Leu-Asp-CH2F，Cbz-Ile-Asp-CH2F，Boc-Ala-Asp(OMe)-CH2F，Boc-Val-Asp(OMe)-CH2F，Boc-Leu-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Val-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Ile-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Met-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-β-Ala-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-Leu-Asp(OMe)-CH2F或Cbz-Ile-Asp(OMe)-CH2F.
在另一个优选实施方案中，所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂具有下式 或者其药学上可接受的盐；其中R1是N-末端保护基团；AA是非天然α-氨基酸或β-氨基酸残基；并且R2是任选被取代的烷基或H。
这样的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂的例子包括Boc-Phg-Asp-fmk，Boc-(2-F-Phg)-Asp-fmk，Boc-(F3-Val)-Asp-fmk，Boc-(3-F-Val)-Asp-fmk，Ac-Phg-Asp-fmk，Ac-(2-F-Phg)-Asp-fmk，Ac-(F3-Val)-Asp-fmk，Ac-(3-F-Val)-Asp-fmk，z-Phg-Asp-fmk，z-(2-F-Phg)-Asp-fmk，Z-(F3-Val)-Asp-fmk，Z-Chg-Asp-fmk，Z-(2-Fug)-Asp-fmk，Z-(4-F-Phg)-Asp-fmk，Z-(4-Cl-Phg)-Asp-fmk，Z-(3-Thg)-Asp-fmk，Z-(2-Fua)-Asp-fmk，Z-(2-Tha)-Asp-fmk，Z-(3-Fua)-Asp-fmk，Z-(3-Tha)-Asp-fmk，Z-(3-Cl-Ala)-Asp-fmk，z-(3-F-Ala)-Asp-fmk，Z-(F3-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-F-3-Me-Ala)-Asp-fmk，z-(3-Cl-3-F-Ala)-Asp-fmk，Z-(2-Me-Val)-Asp-fmk，Z-(2-Me-Ala)-Asp-fmk，Z-(2-i-Pr-β-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-Ph-β-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-CN-Ala)-Asp-fmk，Z-(1-Nal)-Asp-fmk，Z-Cha-Asp-fmk，Z-(3-CF3-Ala)-Asp-fmk，Z-(4-CF3-Phg)-Asp-fmk，Z-(3-Me2N-Ala)-Asp-fmk，Z-(2-Abu)-Asp-fmk，Z-Tle-Asp-fmk，Z-Cpg-Asp-fmk，Z-Cbg-Asp-fmk，Z-Thz-Asp-fmk，Z-(3-F-Val)-Asp-fmk，和Z-(2-Thg)-Asp-fmk.
实施本发明可以使用的其它半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂包括但不限于下面文献中描述的那些WO93/05071，WO93/09135，WO93/14777，WO95/26958，WO95/29672，WO95/33751，WO96/03982，WO96/30395，WO97/07805，WO97/08174，WO97/22618，WO97/27220，WO98/11109，WO98/11129，WO98/16502，WO98/16504，WO98/16505，WO98/24804，WO98/24805，EP 519748，EP 547699，EP618223，EP 623592，EP623606，EP 628550，EP 644198，U.S.5,430,128，U.S.5,434,248，U.S.5,462,939，U.S.5,552,400，U.S.5,565,430，U.S.5,585,357，U.S.5,585,486，U.S.5,622,967，U.S.5,639,745，U.S.5,656,627，U.S.5,670,494，U.S.5,677,283，U.S.5,716,929，U.S.5,739,279，U.S.5,756,465，U.S.5,756,466，U.S.5,798,247，U.S.5,798,442，U.S.5,834,514，U.S.5,843,904，U.S.5,843,905，U.S.5,847,135，U.S.5,866,545，U.S.5,843,904，U.S.5,843,905，U.S.5,847,135，U.S.866,545，U.S.5,869,519，U.S.5,874,424，U.S.5,932,549，Mjalli等，生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)32689-2693(1993)，Mjalli等，生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)41965-1968(1994)，Mjalli等，生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)51405-1408(1995)，Mjalli等，生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)51409-1414(1995)，Thornberry等，生物化学(Biochemistry)333934-3940(1994)，Dolle等，药物化学杂志(J.Med.Chem.)37563-564(1994)，Dolle等，药物化学杂志(J.Med.Chem.)373863-3866(1994)，Dolle等，药物化学杂志(J.Med.Chem.)38220-222(1995)，Graybill等，生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)741-46(1997)，Semple等，生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)8959-964(1998)和Okamoto等，化学制药论坛(Chem.Pharm.Bull.)4711-21，(1999)。
关于这里描述的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂，有用的烷基包括直链或支链C1-10烷基，更优选C1-6烷基。典型的C1-10烷基包括甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，叔丁基，3-戊基，己基和辛基。还可以期待的是本发明的化合物的苯环上两个邻接位置上取代的三亚甲基。
任选的取代基包括一个或多个烷基；卤原子；卤代烷基；环烷基；任选被一个或多个低级烷基，卤原子，卤代烷基或杂芳基取代的芳基；任选被一个或多个低级烷基，卤原子，卤代烷基或杂芳基取代的芳基氧基；芳烷基；任选被一个或多个低级烷基，卤代烷基和芳基取代的杂芳基；任选被一个或多个低级烷基，卤代烷基和芳基取代的杂芳基氧基；烷氧基；烷硫基；芳基硫基；氨基；酰氧基；任选被一个或多个低级烷基，卤代烷基和芳基取代的芳基酰氧基；任选被一个或多个低级烷基，卤原子或卤代烷基取代的二苯基氧膦基氧基；任选被一个或多个低级烷基，卤代烷基和芳基取代的杂环；任选被一个或多个低级烷基，卤代烷基和芳基取代的杂环烷基氧基；任选被一个或多个低级烷基，卤代烷基和芳基取代的部分不饱和的杂环烷基；或者任选被一个或多个低级烷基，卤代烷基和芳基取代的部分不饱和的杂环烷基氧基。
有用的芳基是C6-14芳基，特别是C6-10芳基。典型的C6-14芳基包括苯基，萘基，菲基，蒽基，茚基，薁基，联苯基，亚联苯基和芴基。
有用的环烷基是C3-8环烷基。典型的环烷基包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基和环庚基。
有用的饱和的或部分饱和的碳环基团是如上定义的环烷基，以及环烯基，例如环戊烯基，环庚烯基和环辛烯基。
有用的卤原子或卤代基团包括氟，氯，溴和碘。
有用的芳基烷基包括被任何上述C6-14芳基取代的任何上述C1-10烷基。有用的基团包括苄基，苯乙基和萘甲基。
有用的卤代烷基包括被一个或多个氟、氯、溴或碘原子取代的C1-10烷基，例如氟甲基，二氟甲基，三氟甲基，五氟乙基，1，1-二氟乙基，氯甲基，氯代氟甲基和三氯甲基。
有用的烷氧基包括被上述C1-10烷基之一取代的氧。
有用的烷硫基包括被上述C1-10烷基之一取代的硫。也包括这样的烷硫基的亚砜或砜。
有用的酰基氨基是与氨基氮连接的任何C1-6酰基(烷酰基)，例如乙酰氨基，丙酰氨基，丁酰氨基，戊酰氨基，己酰氨基以及芳基取代的C2-6取代的酰基。
有用的酰氧基是任何与氧基(-O-)连接的任何C1-6酰基(烷酰基)，例如甲酰氧基，乙酰氧基，丙酰氧基，丁酰氧基，戊酰氧基，己酰氧基等。
有用的芳基酰氧基包括在上述任何酰氧基上取代的任何上述芳基，例如2，6-二氯苯甲酰氧基，2，6-二氟苯甲酰氧基和2，6-二-(三氟甲基)-苯甲酰氧基。
有用的氨基包括-NH2，-NHR11和-NR11R12，其中R11和R12是C1-10烷基或如上定义的环烷基。
有用的饱和或部分饱和的杂环基包括四氢呋喃基，吡喃基，哌啶基，哌嗪基，吡咯烷基，咪唑烷基，咪唑啉基，二氢吲哚基，异二氢吲哚基，奎宁环基，吗啉基，异苯并二氢吡喃基，苯并二氢吡喃基，吡唑烷基，吡唑啉基，tetronoyl和tetramoyl。
有用的杂芳基包括任何一个下述的杂芳基噻吩基，苯并[b]噻吩基，萘并[2，3-b]噻吩基，噻蒽基，呋喃基，吡喃基，异苯并呋喃基，苯并吡喃基，呫吨基，吩黄嘌呤基(phenoxanthiinyl)，2H-吡咯基，吡咯基，咪唑基，吡唑基，吡啶基，吡嗪基，嘧啶基，哒嗪基，中氮茚基，异吲哚基，3H-吲哚基，吲哚基，吲唑基，嘌呤基，4H-喹嗪基，异喹啉基，喹啉基，酞嗪基，1，5-二氮杂萘基，喹唑啉基，噌啉基，蝶啶基，咔唑基，β-咔啉基，菲啶基，吖啶基(acrindinyl)，啶基，菲咯啉基，吩嗪基，异噻唑基，吩噻嗪基，异噁唑基，呋咱基，吩噁嗪基，1，4，-二氢喹喔啉-2，3-二酮，7-氨基异香豆素，吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，1，2-苯并异噁唑-3-基，苯并咪唑基，2-羟吲哚基和2-氧代苯并咪唑基。其中杂芳基在环中含有一个氮原子，该氮原子可以是N-氧化物形式，例如吡啶基N-氧化物，吡嗪基N-氧化物，嘧啶基N-氧化物等。
优选的N-末端保护基包括叔丁氧羰基，乙酰基和苄氧羰基。
氨基酸包括任何天然存在的氨基酸例如L-型的酪氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，丝氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苏氨酸，缬氨酸，脯氨酸，赖氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，色氨酸，精氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺和半胱氨酸。非天然氨基酸的例子包括但不限于对映异构体和外消旋形式的2-甲基缬氨酸，2-甲基丙氨酸，(2-异丙基)-β-丙氨酸，苯基甘氨酸，4-甲基苯基甘氨酸，4-异丙基苯基甘氨酸，3-溴代苯基甘氨酸，4-溴代苯基甘氨酸，4-氯代苯基甘氨酸，4-甲氧基苯基甘氨酸，4-乙氧基苯基甘氨酸，4-羟基苯基甘氨酸，3-羟基苯基甘氨酸，3，4-二羟基苯基甘氨酸，3，5-二羟基苯基甘氨酸，2，5-二氢苯基甘氨酸，2-氟代苯基甘氨酸，3-氟代苯基甘氨酸，4-氟代苯基甘氨酸，2，3-二氟代苯基甘氨酸，2，4-二氟代苯基甘氨酸，2，5-二氟代苯基甘氨酸，2，6-二氟代苯基甘氨酸，3，4-二氟代苯基甘氨酸，3，5-二氟代苯基甘氨酸，2-(三氟甲基)苯基甘氨酸，3-(三氟甲基)苯基甘氨酸，4-(三氟甲基)苯基甘氨酸，2-(2-噻吩基)甘氨酸，2-(3-噻吩基)甘氨酸，2-(2-呋喃基)甘氨酸，3-吡啶基甘氨酸，4-氟代苯丙氨酸，4-氯代苯丙氨酸，2-溴代苯丙氨酸，3-溴代苯丙氨酸，4-溴代苯丙氨酸，2-萘基丙氨酸，3-(2-quinoyl)丙氨酸，3-(9-蒽基)丙氨酸，2-氨基-3-苯基丁酸，3-氯代苯丙氨酸，3-(2-噻吩基)丙氨酸，3-(3-噻吩基)丙氨酸，3-苯基丝氨酸，3-(2-吡啶基)丝氨酸，3-(3-吡啶基)丝氨酸，3-(4-吡啶基)丝氨酸，3-(2-噻吩基)丝氨酸，3-(2-呋喃基)丝氨酸，3-(2-噻唑基)丙氨酸，3-(4-噻唑基)丙氨酸，3-(1，2，4-三唑-1-基)丙氨酸，3-(1，2，4-三唑-3-基)丙氨酸，六氟缬氨酸，4，4，4-三氟缬氨酸，3-氟缬氨酸，5，5，5-三氟亮氨酸，2-氨基-4，4，4-三氟丁酸，3-氯丙氨酸，3-氟丙氨酸，2-氨基-3-氟丁酸，3-氟正亮氨酸，4，4，4-三氟苏氨酸，L-烯丙基甘氨酸，叔-亮氨酸，炔丙基甘氨酸，乙烯基甘氨酸，S-甲基半胱氨酸，环戊基甘氨酸，环己基甘氨酸，3-羟基正缬氨酸，4-氮杂亮氨酸，3-羟基亮氨酸，2-氨基-3-羟基-3-甲基丁酸，4-硫杂异亮氨酸，阿雪维菌素，鹅膏蕈氨酸，使君子酸(quisqalicacid)，2-2，3-二氢化茚基甘氨酸，2-氨基异丁酸，2-环丁基-2-苯基甘氨酸，2-异丙基-2-苯基甘氨酸，2-甲基缬氨酸，2，2-二苯基甘氨酸，1-氨基-1-环丙烷羧酸，1-氨基-1-环戊烷羧酸，1-氨基-1-环己烷羧酸，3-氨基-4，4，4-三氟丁酸，3-苯基异丝氨酸，3-氨基-2-羟基-5-甲基己酸，3-氨基-2-羟基-4-苯基丁氨酸，3-氨基-3-(4-溴代苯基)丙酸，3-氨基-3-(4-氯代苯基)丙酸，3-氨基-3-(4-甲氧基苯基)丙酸，3-氨基-3-(4-氟代苯基)丙酸，3-氨基-3-(2-氟代苯基)丙酸，3-氨基-3-(4-硝基苯基)丙酸和3-氨基-3-(1-萘基)丙酸。
一些化合物可以以立体异构体包括旋光异构体存在。本发明包括所有的立体异构体和这样的立体异构体的外消旋混合物以及根据本领域技术人员公知的方法可以分离的单一的对映异构体的用途。药学上可接受的加成盐的例子包括无机和有机酸加成盐例如盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，酒石酸盐，马来酸盐，富马酸盐，扁桃酸盐和草酸盐；以及与碱形成的无机和有机碱加成盐，例如氢氧化钠和三(羟基甲基)氨基甲烷(TRIS，tromethane)。
可以使用的药物前体的例子包括具有取代烷基的化合物，例如CH2OCH3和CH2OCOCH3(AM酯)。
根据本领域公知的方法和通过出版物、专利申请和这里引用的专利中的那些方法，可以制备半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂可以作为含有药学上可接受载体的药物组合物的一部分被施用，其中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂以有效实现其预期目的的量存在。当个体需要不同时，对各成分有效量的最佳范围的确定是本领域技术人员公知的。典型地，以0.0025-50毫克/千克要处理的哺乳动物体重/天，或者其等价量的药学上可接受的盐经口服对哺乳动物例如人施用所述化合物。优选地，口服给药量大约为0.01至大约10毫克/千克。对于肌内注射，剂量一般是大约口服剂量的一半，例如大约0.0025至大约25毫克/千克，最优选地，大约0.01至大约5毫克/千克。
单位口服剂量可以含有大约0.01至大约50毫克、优选大约0.1至大约10毫克的所述化合物。该单位剂量可以以一片或多片每片含有大约0.1至大约10、通常大约0.25-50毫克的所述化合物或者其溶剂合物的片剂每天给药一次或多次。
在局部用制剂中，所述化合物可以以大约0.01-100毫克/克载体的浓度存在。在优选实施方案中，所述化合物优选以大约0.07-1.0毫克/毫升、更优选地大约0.1-0.5毫克/毫升、最优选地大约0.4毫克/毫升的浓度存在。
对于兽药应用，根据需要可以施用更高水平。
合适的药学上可接受的载体包括赋形剂和有利于将化合物加工成药学上可以使用的制剂的助剂。优选地，这些制剂，特别是可以口服或局部施用的并且可以用于某一优选的给药类型的那些制剂，例如片剂，糖衣丸，缓释锭剂和胶囊，漱口水和漱口剂，凝胶，液体悬浮剂，洗发剂，发胶，香波，还有可经直肠给药的制剂，例如灌肠剂和栓剂，以及用于注射、局部或口服给药的合适的溶液，含有大约0.01-99％、优选大约0.25-75％的活性化合物，并且含有赋形剂。
还包括在本发明范围内的是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂的非毒性的药学上可接受的盐。通过将特定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂与药学上可接受的非毒性酸例如盐酸，富马酸，马来酸，琥珀酸，乙酸，柠檬酸，酒石酸，碳酸，磷酸，草酸等的溶液混合，形成酸加成盐。通过将特定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂与药学上可接受的非毒性碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、胆碱氢氧化物、碳酸钠Tris等的溶液混合，形成碱性盐。
可以对任何可以享有本发明有益效果的动物施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。最重要的这样的动物是哺乳动物，例如人，尽管本发明并不打算局限于此。
通过实现他们想要达到的目的的任何方法可以施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂和其药物组合物。例如，可以经肠胃外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、透皮、颊、鞘内、颅内、鼻内或局部途径给药。可替换地或者并行地，可以经口服途径给药。给药剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、并行治疗的类型，如果需要，还取决于治疗频率以及期望的作用性质。一般情况下，局部对组织施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂，保护该组织不编程性细胞死亡并且与化学治疗剂分开。例如，可以通过静脉内注射顺铂来治疗癌症例如脑癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌，并且局部施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂来治疗、改善或预防口腔或胃肠道编程性细胞死亡，例如用于治疗口腔粘膜炎的漱口剂；和用于治疗骨髓细胞死亡的IV可注射水溶液；和适合覆盖胃肠道表面的口服制剂或者用于治疗胃肠道粘膜炎包括直肠炎的灌肠剂或栓剂。所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂也可以通过膀胱导管用于治疗，改善或预防膀胱粘膜炎。可替换地或者并行地，可以局部施用给皮肤和/或头皮半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂来治疗、改善或预防头发和皮肤细胞的编程性细胞死亡。在另一个实施方案中，可以局部施用化学治疗药物或进行放射来治疗局部癌，例如脑癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌，并且通过例如静脉内注射全身施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂来治疗、改善或预防胃肠道细胞、口腔上皮细胞、骨髓细胞、皮肤细胞和头发细胞的编程性细胞死亡。在脑癌治疗中的口腔粘膜炎情况下，例如，能够例如通过静脉内注射全身性施用不穿过血脑屏障的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂后再对脑肿瘤进行照射。这将保护口腔粘膜不受放射的有害影响，但是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂将不保护脑肿瘤免受放射的治疗作用。重要的是，可以在施用放射之前施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂，这样防止放射对正常粘膜细胞的损害作用的发生。
以本身公知的方法制备本发明的药物组合物，例如利用常规混合、制粒、糖衣丸制造、溶解或冻干方法。因此，通过将活性化合物与固体赋形剂混合能够获得口服使用的药物制剂，任选地将得到的混合物研磨并且将颗粒混合物加工，如果期望或需要，加入合适的助剂之后获得片剂或糖衣丸芯。
合适的赋形剂特别是填充剂，如糖类，例如乳糖或蔗糖，甘露糖醇或山梨糖醇，纤维素制剂和/或磷酸钙，例如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及粘合剂如淀粉糊，可以使用例如玉米淀粉，小麦淀粉，水稻淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果期望，可以加入崩解剂例如上述淀粉还有羧甲基淀粉，交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或藻酸及其盐，如藻酸钠。上述助剂都是流动调节剂和润滑剂，例如硅石，滑石，硬脂酸或者其盐，如硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇。如果期望，对糖衣丸芯提供合适的包衣来抵抗胃液。为了该目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了产生抗胃液的包衣，使用合适的纤维素制剂的溶液例如乙酰基纤维素邻苯二甲酸盐或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸盐。可以向片剂或糖衣丸包衣中加入染料材料或颜料，例如用于鉴定或为了表征活性化合物剂量的组合。
可以口服使用的其它药物制剂包括由明胶制成的嵌合(push-fit)胶囊以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。嵌合胶囊可以含有颗粒形式的活性化合物，这些颗粒可以与例如乳糖的填充剂、例如淀粉的粘合剂和/或例如滑石或硬脂酸镁的润滑剂以及任选的稳定剂混合。在软胶囊中，活性化合物优选溶解于或悬浮于合适的液体中，例如脂肪油或液体石蜡。另外，可以加入稳定剂。
可以经直肠使用的可能的药物制剂包括例如栓剂，其由一种或多种活性化合物与栓剂基质的组合构成。合适的栓剂基质例如天然的或合成的甘油三酯或链烷烃。另外，也可能使用明胶直肠胶囊，其由活性化合物与碱的组合构成。可能的碱材料包括例如液体甘油三酯，聚乙二醇或链烷烃。
用于肠胃外给药的合适的制剂包括水可溶形式的活性化合物水溶液，例如，水溶盐和碱溶液。另外，适当时可以施用油性注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。合适的亲脂性溶剂或赋形剂包括脂肪油，例如芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯或聚乙二醇-400(这些化合物在PEG-400中是可溶的)。含水注射悬浮液可以含有提高悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。任选地，悬浮液也可以含有稳定剂。
还可以向组合物中混入对非癌细胞有有益作用的一种或多种另外的物质。因此，组合物也可以含有一种或多种能够提高皮肤环-AMP水平的化合物。合适的化合物包括含量大约为0.1-1％的腺苷或核酸水解物和大约0.5-5％的罂粟碱，所述含量均以组合物的重量为基础。合适的还有β-肾上腺素能激动剂，如大约0.1-2％的异丙肾上腺素或大约0.1-1％的环-AMP，两者也是以组合物的重量为基础。可以在所述药物组合物中掺入其它合适类型的另外的活性成分，包括已知对皮肤有有益作用的任何化合物。这样的化合物包括类视黄醛衍生物(retinoid)，如大约0.003-0.3％重量比的维生素A以及色原烷醇，如大约0.1-10％重量比的维生素E或其衍生物，所述含量均以组合物的重量为基础。另外，所述药物组合物中可以掺入抗炎剂和角质增塑剂(keratoplastic agent)。典型的抗炎剂是皮质类固醇，如大约0.25-5％重量比的氢化可的松或其乙酸盐，或者皮质类固醇，如大约0.025-0.5％重量比的地塞米松，所述含量均以组合物的重量为基础。用于皮肤的局部用组合物中可以含有的典型的角质增塑剂是大约0.1-20％的煤焦油或大约0.05-2％重量比的蒽林，所述含量均以组合物的重量为基础。
局部用组合物可以通过选择合适的载体优选配制成油状物、霜剂、洗液、膏剂等。合适的载体包括植物油或矿物油，白凡士林(软白石蜡)，支链脂肪或油，动物脂肪和高分子量醇(长于C12)。优选的载体是其中活性成分是可溶的那些。也可以含有乳化剂，稳定剂，湿润剂和抗氧化剂，以及如果期望掺入带来颜色或香味(fragrance)的物质。另外，在这些局部用制剂中可以应用透皮渗透增强剂。这样的增强剂的例子可以参见美国专利3,989,816和4,444,762。
优选从矿物油、自乳化蜂蜡和水的混合物配制霜剂，其中将溶解于少量油如杏仁油中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂混合物进行混合。这样的霜剂的典型的例子是包括大约40份水、大约20份蜂蜡、大约40份矿物油和大约1份杏仁油的霜剂。
通过将半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂的象杏仁油这样的植物油的溶液与温热的软石蜡混合并且使混合物冷却可以配制膏剂。这样的膏剂的典型的例子是含有大约30％重量比杏仁油和大约70％重量比软白石蜡的膏剂。
通过在合适的高分子量醇例如丙二醇或聚乙二醇中溶解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂可以方便地制备洗液。
另外，这些组合物可以含有其它药物、生长因子、伤口密封材料、载体等，这是本领域技术人员公知的或显而易见的。
在优选的实施方案中，将半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂配制成用于治疗、改善或预防口腔粘膜炎的漱口剂的一部分。这样的漱口剂是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂的水溶液，其还可以含有醇、甘油、合成的甜味剂和表面活性剂、矫味剂和着色剂。它们也可以含有抗感染药物，例如海克替啶和西吡氯铵。所述漱口剂也可以含有局部麻醉剂(例如苯佐卡因、可卡因，达克罗宁盐酸盐、利多卡因、丙美卡因盐酸盐或teracaine盐酸盐)，例如，以用来缓解放射或化学治疗诱导的溃疡的疼痛。所述漱口剂可以具有酸性或碱性pH。参见Remington’s制药科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，A.R.Gennaro(编著)，Mack出版公司，pp.1045，1046，1526和1965(1990)。
在另一个优选实施方案中，将半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂配制成用于治疗、改善或预防胃肠道粘膜炎的能够覆盖胃肠道表面的口服制剂。胃肠道粘膜炎的例子包括食管粘膜炎，胃粘膜炎和肠粘膜炎。这样的配方可以含有胃抗酸剂例如碳酸铝，氢氧化铝凝胶，碱式硝酸铋，碱式水杨酸铋，碳酸钙，二羟基铝碳酸钠，水化铝酸镁，碳酸镁，氢氧化镁，氧化镁，碳酸氢钠，铋奶状液，二羟基铝氨基乙酸盐，磷酸镁，三硅酸镁和它们的混合物。其它添加剂包括但不限于H2-受体拮抗剂、助消化剂、抗呕吐剂、吸收剂和混杂试剂。参见Remington’s制药科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，A.R.Gennaro(编著)，Mack出版公司，pp.774-778(1990)。
化学治疗药物例如顺铂和放射治疗经常诱导患者从早到晚发生呕吐。因此，在一个实施方案中，与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂一起共同施用抗呕吐药来避免呕吐并且保持半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂与胃肠道接触。这样的抗呕吐药的例子包括但不限于阻断多巴胺能呕吐受体的化合物，例如甲氧氯普胺和曲美苄胺和大麻素(cannabinoid)。在化疗/放疗/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂治疗之前和/或期间可以口服施用甲氧氯普胺来防止早期呕吐反应，然后通过根据美国专利5,760,086和4,536,386的鼻内给药来防止后发呕吐。在化疗/放疗之后的期间内，可以共同施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂和抗呕吐药两者来治疗、改善或预防胃肠道粘膜炎。
在另一个实施方案中，可以将半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂配制成用于治疗、改善或预防骨髓细胞死亡的可静脉内注射的溶液。
所述组合物可以施用给温血动物，例如已经接受化疗或放疗诱导了非癌细胞死亡的人，或者更优选地，在进行化学治疗或放射治疗之前或期间施用这些组合物。
下面的实施例详细说明本发明的方法和组合物，但是本发明的方法和组合物不受此限制，其它合适的修饰和在临床治疗中常遇到的并且对本领域技术人员显而易见的不同条件和参数的采用都在本发明的精神和范围内。
实施例1半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Z-VD-fmk在Jurkat T细胞中抑制化学治疗药物或UV照射诱导的编程性细胞死亡在37℃下在5％CO2-95％湿度培养箱中在RPMI1640培养基(LifeTechnologies，Inc.)+10％FCS(Sigma Chemical Company)中培养Jurkat T白血病细胞，并且保持细胞密度在4和8×105细胞/毫升之间。在有或没有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Z-VD-fmk(10μM)下用多柔比星(1μM)或帕尼特西(20μM)或UV照射(40J/m2)处理1×106细胞，并且在37℃下温育18小时。作为对照，也用DMSO培养细胞。在18小时时用相差显微镜观察得到编程性细胞死亡刺激物诱导的任何形态学改变。通过碘化丙锭摄入分析评价细胞生存力。简要地说，将20微升含有100微克/毫升的碘化丙锭的丙锭溶液加给200微升细胞，并且转移到12×75毫米聚苯乙烯试管中，并且在流式细胞计上分析。所有的流式细胞计分析都在FACScalibur(Becton Dickinson)上进行，使用CellQuest分析软件。图1A-D说明Z-VD-fmk阻断Jurkat细胞中多柔比星诱导的细胞死亡。图2A-D说明Z-VD-fmk阻断Jurkat细胞中帕尼特西诱导的细胞死亡。图3A-D说明Z-VD-fmk阻断Jurkat细胞中UV照射诱导的细胞死亡。
图1A-C是Jurkat细胞的照片图1A，DMSO处理的对照细胞；图1B，用多柔比星(1μM)处理的细胞；图1C，用多柔比星(1μM)和Z-VD-fmk(10μM)处理的细胞。图1D是通过碘化丙锭摄入分析测定的细胞编程性细胞死亡的百分比条框图a，DMSO处理的对照细胞；b，用多柔比星处理的细胞；c，用多柔比星和Z-VD-fmk处理的细胞。
图2A-C是Jurkat细胞的照片图2A，DMSO处理的对照细胞；图2B，用帕尼特西(20μM)处理的细胞；图2C，用帕尼特西(20μM)和Z-VD-fmk(10μM)处理的细胞。图2D是通过碘化丙锭摄入分析测定的细胞编程性细胞死亡的百分比条框图a，DMSO处理的对照细胞；b，用帕尼特西处理的细胞；c，用Paclitaxel和Z-VD-fmk处理的细胞。
图3A-C是Jurkat细胞的照片图3A，DMSO处理的对照细胞；图3B，用UV照射(40J/m2)处理的细胞；图3C，用UV照射(40J/m2)和Z-VD-fmk(10μM)处理的细胞。图3D是通过碘化丙锭摄入分析测定的细胞编程性细胞死亡的百分比条框图a，DMSO处理的对照细胞；b，用UV照射处理的细胞；c，用UV照射和Z-VD-fmk处理的细胞。
实施例2在防止仓鼠发生放射-诱导的口腔粘膜炎中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂(3R，S)-5-氟-3-[(2S)-3-甲基-1-氧代-2-(苯基氨基甲酰基氧基)丁基]氨基-4-氧代-戊酸是有效的背景口腔溃疡性粘膜炎是对癌症的药物和放射治疗常见的、有疼痛感的剂量限制毒性。该疾病特征在于口腔粘膜的破坏，其导致溃疡损伤的形成。在粒细胞减少患者中，伴随粘膜炎的溃疡常常是经常导致脓毒症或菌血症的固有的口腔细菌的入侵门户。接受抗肿瘤药物治疗的患者的三分之一以上发生一定程度的粘膜炎。接受对白血病的诱导疗法或者对骨髓移植的很多条件形成治疗方案治疗的患者中其发生频率和严重程度大得多。在这些个体中，四分之三以上患者不常见中等至严重程度的粘膜炎(溃疡)。基本上在所有接受头部和颈部肿瘤放射疗法的患者中发生中等至严重程度的粘膜炎，典型地这些患者以累计照射量是15Gy开始，然后在60Gy的总剂量或者达到更高剂量时出现损伤。
临床上粘膜炎过程分四个阶段最初阶段特征在于红斑和水肿的炎症变化。也可以见到局部角化过度病区。该阶段症状轻并且通过局部麻醉可以成功地减轻。
接着粘膜破碎并且变得腐烂和萎缩，伴随明显严重的炎症变化。该阶段疼痛加剧并且可能需要NSAID形式的全身止痛治疗或适当缓解的口腔麻醉药。
粘膜炎的第三阶段症状最明显。粘膜全部厚溃疡层引起严重的不适，需要肠胃外麻醉治疗。另外，对于骨髓抑制患者，这些溃疡提供了常常是经常导致菌血症或脓毒症的口腔微生物区系的全身性入侵门户。
最后，停止抗肿瘤治疗之后大约2-3星期发生自发性愈合。
对粘膜炎的标准治疗主要是减轻性的，包括施用局部止痛剂例如利多卡因和/或全身性施用麻醉药和抗生素。目前，对粘膜炎没有令人赞同的治疗。
只是最近才意识到粘膜炎作为生物过程的复杂性。该症状看上去代表口腔粘膜细胞和组织包括结缔组织，内皮细胞、上皮细胞和炎症细胞，炎症前细胞因子和局部环境因子例如细菌和唾液的连续的相互作用。对上皮细胞和结缔组织的损伤包括导致粘膜损伤的炎症细胞因子的释放。另外，对上皮细胞的直接和间接作用导致基底层的编程性细胞死亡或坏死变化；暂停分化成新的上皮细胞。上皮细胞更新的停止导致萎缩症及随后的溃疡。
已经开发出化学治疗诱导的粘膜炎的仓鼠模型，最近，又已经开发出放射治疗诱导的粘膜炎的仓鼠模型(Sonis S.等，口腔外科.口腔医药.口腔病理(Oral Surg.Oral.Med.OralPathol.)69437-443(1990)和Sonis S.等，癌症(Cancer)852103-13(1999))。在后一种模型中，急性放射的具体剂量针对指定的粘膜，通过常规化铅屏蔽保护其它区域。已经证实该模型的再现性，放射后15至18天之间总是出现溃疡性粘膜炎。使用该模型，针对各种局部用药物的药效测试了它们对改变放射诱导的粘膜炎过程的能力。
目的该项研究的目的是评价局部或IP施用(3R，S)-5-氟-3-[(2S)-3-甲基-1-氧代-2-(苯基氨基甲酰基氧基)丁基]氨基-4-氧代-戊酸(美国专利申请60/151,077和60/158,373描述的一种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂)的作用，减弱仓鼠急性照射诱导的口腔粘膜的发生和发展。为了测定疾病的发生、过程或严重程度的统计学显著差异，将接受不同剂量化合物的仓鼠的粘膜炎评分与接受赋形剂对照的仓鼠相比较。
研究设计将三十二(32)只仓鼠随机分为四个处理组，每组八(8)只动物。如下将每一组指定为不同的处理第1组赋形剂对照-局部赋形剂对照，tid(每日三次)，第-2天至第16天。
第2组以20毫克/千克施用试验化合物，每天一次，IP，第-2天至第16天。
第3组以0.36毫克/毫升(0.2毫升)施用试验化合物，局部，tid，第-2天至第16天。
第4组以0.072毫克/毫升(0.2毫升)施用试验化合物，局部，tid，第-2天至第16天。
该项研究中操作流程图总结如下i)在研究期间的每一天(第-2天至第28天)，将各动物称重并且记录其成活情况(为适应该项研究方案，从第17天开始持续至第28天，每一天都称重)。
ii)对第2组中的每一只动物在第-2天IP注射一次，并且在第-1天也注射一次。
iii)在第-2天和第-1天对第1，3和4组中的每一只动物给药三次。
iv)在第0天对每一只动物进行照射。
v)在第0天，在照射之前1小时对第1，3和4组中的动物给药，并且在照射之后两次给药。
vi)从第-2天至第16天，用局部用剂型每天对第1，3和4组中的动物给药三次。
vii)从第-2天至第16天，第2组中的动物每天一次接受IP注射。
viii)从第6天开始并且持续至(第8，10，12，14，16，18，20，22，24，26和28天)后的每一个第二天，对每一只动物照相并且评价粘膜炎分值。
材料和方法研究地点在Dana Farber癌症研究所进行对动物的照射。在位于Worcester，MA的Massachusetts Medical Center进行该项研究。
动物使用5-6周龄、项目开始时体重大约90克的雄性Golden Syrian仓鼠(Charles River Laboratories or Harlan Sprague Dawley)。用穿耳器将动物分别编号并且每只笼子关养一小组两只动物。在计划开始之前使动物适应环境至少一周。在该期间，为了排除状态不好的动物每天观察动物。
粘膜炎诱发利用急性放射方案诱发粘膜炎。在第0天对所有的动物施用单一剂量的放射(35Gy/剂量)。在焦距50厘米处用0.35毫米铜过滤系统加强的250千伏电压(15-mA)源产生照射。射线以121.5cGy/分钟的速度靶向左颊窝粘膜。照射之前通过腹膜内注射戊巴比妥钠(80毫克/千克)麻醉动物。将左颊窝外翻，使用铅屏蔽固定并且隔离。剂量和给药每天对动物局部给药三次。对于局部处理，将含有0.2毫升一种试验化合物的0.05M Tris(pH8.0)溶液的无针头结核菌素注射器插入左颊窝并且将药物储存到窝中。每天以20毫克/千克的剂量腹膜内注射一次化合物，并且药物浓度为0.05M Tris(pH8.0)中的3-6毫克/毫升。对于所有的组在第-2天开始给药。对所有组的处理持续到第16天。
粘膜炎评价在该项研究中，测定粘膜炎评分，体重变化和成活率作为结果。对于粘膜炎的评价，用吸入麻醉剂麻醉动物，并且外翻左颊窝。通过与验证的照片分值相比较目测对粘膜炎评分，范围是正常为0至严重溃疡为5(临床评分)。在描述术语中，评分定义如下分值描述0窝完全健康。没有红斑或血管舒张。
1轻度至严重红斑和血管舒张。粘膜没有糜烂。
2严重红斑和血管舒张。粘膜表面糜烂，留下脱落区。减少粘膜斑点。
3在一个或多个地方形成灰白色溃疡。溃疡由于假膜而可能呈黄色/灰色。溃疡累计大小应该等于窝的大约1/4。严重红斑和血管舒张。
4溃疡累计大小应该等于窝的大约1/2。柔韧性丧失。严重红斑和血管舒张。
5基本上全部的窝都溃疡。柔韧性丧失(只能从口腔部分取到窝组织)认为1-2的分值代表该疾病的轻度阶段，而认为3-5的分值指示中等至严重程度的粘膜炎。目测评分之后，使用标准化技术对每一只动物的粘膜照相。实验结束时，冲洗所有的照片并且将照片随机编号。最后让至少两位独立的受过训练的观察员在不知内情的情况下使用上述标准对照片分级(盲视评分)。
结果分析利用Student T检验，Mann-Whitney秩和检验(rank sum)和卡方检验(chi-square)确定测定各处理组之间的统计学差异，临界值是0.05。每个组N值是7(第2和3组)或8(第1和4组)，它对这里推荐的统计来说是适当的数值。每组大小的差异是下面描述的麻醉死亡的结果。
结果和讨论研究表征在该项研究过程中有两例死亡。第一例死亡(0.36毫克/毫升局部处理组中#23动物)发生在第8天，第二例死亡(20毫克/千克IP组中#9动物)发生在第15天。两例死亡都是由于麻醉剂量过度。没有由于处理的死亡率表明没有与这里所使用的剂量的试验化合物有关的全身性毒性。
在赋形剂对照组中，在第10天开始粘膜炎，并且在第16天达到峰值。在第16天该组的最高分值是4.0，并且直到第22天保持高于3.0。该项研究中粘膜炎的过程是使用放射方案通常观察到的典型情况。
体重赋形剂对照组对动物体重每天变化的测定(与第-2天各体重相比较的百分比)表明赋形剂对照组中的动物在研究期间增重大约为起始体重的45％(图4)。这种明显的体重增加是放射方案中未处理仓鼠的特征。
处理组接受试验化合物处理的所有三组动物以几乎线性方式增加体重，并且在该项研究结束时，与它们的起始体重相比增加了42-45％(图4)。这些组中所有的处理动物体重的增加在统计学上与赋形剂对照组相当。
粘膜炎赋形剂对照组图5给出赋形剂对照组的平均日粘膜炎分值。赋形剂对照组中粘膜炎的过程对于急性放射模型是典型的。如上所述，在第10天出现粘膜炎并且在第16天达到粘膜炎峰值。粘膜炎峰值评分是4.0。在第22天分值降低至低于3.0之前粘膜炎分值一直保持在较高水平。因为3或更高分值的临床意义，对整个研究期间测定动物发生溃疡的时间长短(图6)。在赋形剂对照组中在可能天数的58.3％的天数中动物的分值是3或更高。
腹膜内注射20毫克/千克(第2组)在第-2天至第16天腹膜内注射20毫克/千克的试验化合物导致第16天至第28天与赋形剂对照组相比粘膜炎的明显减轻(图5)。赋形剂对照组与IP处理组的日分值比较的秩和分析结果表明在第20天至第22天粘膜炎严重程度显著减轻。
动物具有3或更高分值的天数的分析(图6)表明与赋形剂对照组相比，该处理减轻了溃疡程度。与赋形剂对照组56天的溃疡天数相比，从第-2天至第16天用20毫克/千克的试验化合物处理组的溃疡天数为39天。持续的IP处理带来的溃疡24.8％减轻不具有统计学意义(p＝0.068)。
用0.36毫克/毫升和0.072毫克/毫升(第3和4组)局部处理从第-2天至第16天用0.36毫克/毫升或0.072毫克/毫升试验化合物局部处理，与赋形剂对照组相比，从第16天至第28天粘膜炎显著减轻(图5)。比较赋形剂对照组和局部0.36毫克/毫升处理组的日分值的秩和分析表明，在第18，20，22和26天粘膜炎显著减轻。比较赋形剂对照组和局部0.072毫克/毫升处理组的日分值的秩和分析表明粘膜炎减轻的显著程度较低。仅在第18天有显著减轻。该秩和分析提示对化合物的剂量响应。
动物具有3或更高分值的天数的分析(图6)表明与赋形剂对照组相比，两种局部处理都减轻了溃疡程度。与赋形剂对照组56天的溃疡天数相比，从第-2天至第16天用0.36毫克/毫升的试验化合物处理的组溃疡天数为27天。0.36毫克/毫升局部处理导致的溃疡减轻5 1.8％是高度显著的(p＜0.001)。与赋形剂对照组56天的溃疡天数相比，从第-2天至第16天用0.072毫克/毫升的试验化合物处理的组溃疡天数为42天。0.072毫克/毫升局部处理导致的溃疡减轻25％不具显著性(p＝0.061)。因此，秩和检验和卡方检验通过独立统计学方法都表明对0.36毫克/毫升剂量的局部处理显示出具有显著效果的剂量响应。
结论从第-2天至第16天局部施用0.36毫克/毫升的试验化合物表现出在该模型中防止发生显著粘膜炎的统计学意义上的显著益处。以0.072毫克/毫升浓度局部施用化合物证明粘膜炎分数减低，但是在该项研究中数据没有统计学意义。这些结果提示对于局部处理的剂量响应。
以20毫克/千克腹膜内施用试验化合物，在证明倾向于粘膜炎减轻的同时，与赋形剂对照组相比也没有获得统计学显著性。
在第16天实现峰值粘膜炎之后，试验化合物对口腔粘膜炎发生作用。从第0天至第16天溃疡发生没有明显减轻。
如该项研究期间不存在动物死亡(除了由于麻醉剂量过渡死亡之外)和所有的处理组体重增加模式几乎与对照组相同所指示的，该项研究中施用剂量下的试验化合物没有表现出毒性。
图4.体重变化百分比。每天对动物称重并且计算每一天的组平均值和平均值标准误差(SEM)。整个研究期间，所有四个研究组中的动物以几乎相同的方式增加体重。
图5.在该项研究中获得所有四组动物的平均组粘膜炎分值。误差栏代表平均值的标准误差(SEM)。将赋形剂对照组与局部或者通过腹膜内注射(IP)接受试验化合物的组相比较。当与赋形剂对照组相比时，没有一个处理组表现出从第10-16天在粘膜炎发生和严重程度方面有所减轻。相反，所有三种处理都证明在第16天之后的疾病恢复期间，粘膜炎的严重程度有所减轻。
图6.动物具有3或更高粘膜炎分值的动物天数。为了检查临床显著粘膜炎的水平，如开放性溃疡描述所定义的(3或更高分值)，加合其中动物表现出高分值的天数的总数，并且表示为天数总数的百分比。利用卡方检验计算观察到的差异的统计学意义。星号表示各处理组和空白对照组动物之间的显著性差异。与赋形剂对照组相比较，该项研究中所有的三个处理组证明总体粘膜炎严重性有所减轻。只有用0.36毫克/毫升试验化合物的处理表现出统计学意义(p＜0.001)。
现在已经全面描述了本发明，本领域技术人员都明白在宽且等价范围内的条件、配方和其它参数下能够实施同样的实验而不影响本发明的范围或其任何实施方案。这里引用的所有的专利、专利申请和出版物在这里全文引作参考。
权利要求
1.治疗、改善或预防动物癌症化学疗法和放射疗法导致的口腔粘膜炎、肠胃粘膜炎、膀胱粘膜炎、直肠炎、骨髓细胞死亡的方法，其包括对需要的动物施用有效量的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂是经局部或口服施用的。
3.权利要求2的方法，其中所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂被配制成用于治疗、改善或预防口腔粘膜炎的漱口剂的一部分。
4.权利要求2的方法，其中所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂被配制成缓释颊糖锭的一部分。
5.权利要求2的方法，其中所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂被配制成栓剂的一部分。
6.权利要求2的方法，其中所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂被配制成凝胶的一部分。
7.权利要求1的方法，其中所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂通过膀胱导管施用来治疗、改善或预防膀胱粘膜炎。
8.权利要求1的方法，其中所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂作为灌肠剂的一部分施用来治疗、改善或预防直肠炎。
9.权利要求2的方法，其中所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂被配制成口服制剂，其能够覆盖胃肠表面来治疗、改善或预防胃肠粘膜炎。
10.权利要求9的方法，其中所述胃肠粘膜炎是食管粘膜炎、胃粘膜炎或肠粘膜炎。
11.权利要求1的方法，其中通过静脉内注射施用所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂来治疗、改善或预防骨髓细胞死亡。
12.权利要求1的方法，其中作为含有药学上可接受的载体的药物组合物的一部分施用所述的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
13.权利要求1的方法，其中所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂具有下式 或者其药学上可接受的盐；其中R1是N-末端保护基团；AA是任何天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸、α-氨基酸或β-氨基酸的衍生物的残基；R2是H或CH2R4，其中R4是负电性离去基团，并且R3是烷基或H。
14.权利要求13的方法，其中所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂是 Boc-Ala-Asp-CH2F，Boc-Val-Asp-CH2F，Boc-Leu-Asp-CH2F，Ac-Val-Asp-CH2F，Ac-Ile-Asp-CH2F，Ac-Met-Asp-CH2F，Cbz-Val-Asp-CH2F，Cbz-β-Ala-Asp-CH2F，Cbz-Leu-Asp-CH2F，Cbz-Ile-Asp-CH2F，Boc-Ala-Asp(OMe)-CH2F，Boc-Val-Asp(OMe)-CH2F，Boc-Leu-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Val-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Ile-Asp(OMe)-CH2F，Ac-Met-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-Val-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-β-Ala-Asp(OMe)-CH2F，Cbz-Leu-Asp(OMe)-CH2F或Cbz-Ile-Asp(OMe)-CH2F.
15.权利要求1的方法，其中所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂具有式II 或者其药学上可接受的盐；其中R1是N-末端保护基团；AA是非天然α-氨基酸或β-氨基酸的残基；并且R2是任选被取代的烷基或H。
16.权利要求15的方法，其中所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂是Boc-Phg-Asp-fmk，Boc-(2-F-Phg)-Asp-fmk，Boc-(F3-Val)-Asp-fmk，Boc-(3-F-Val)-Asp-fmk，Ac-Phg-Asp-fmk，Ac-(2-F-Phg)-Asp-fmk，Ac-(F3-Val)-Asp-fmk，Ac-(3-F-Val)-Asp-fmk，Z-Phg-Asp-fmk，Z-(2-F-Phg)-Asp-fmk，Z-(F3-Val)-Asp-fmk，Z-Chg-Asp-fmk，Z-(2-Fug)-Asp-fmk，Z-(4-F-Phg)-Asp-fmk，Z-(4-Cl-Phg)-Asp-fmk，Z-(3-Thg)-Asp-fmk，Z-(2-Fua)-Asp-fmk，Z-(2-Tha)-Asp-fmk，Z-(3-Fua)-Asp-fmk，Z-(3-Tha)-Asp-fmk，Z-(3-Cl-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-F-Ala)-Asp-fmk，Z-(F3-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-F-3-Me-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-Cl-3-F-Ala)-Asp-fmk，Z-(2-Me-Val)-Asp-fmk，Z-(2-Me-Ala)-Asp-fmk，Z-(2-i-Pr-β-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-Ph-β-Ala)-Asp-fmk，Z-(3-CN-Ala)-Asp-fmk，Z-(1-Nal)-Asp-fmk，Z-Cha-Asp-fmk，Z-(3-CF3-Ala)-Asp-fmk，Z-(4-CF3-Phg)-Asp-fmk，Z-(3-Me2N-Ala)-Asp-fmk，Z-(2-Abu)-Asp-fmk，Z-Tle-Asp-fmk，Z-Cpg-Asp-fmk，Z-Cbg-Asp-fmk，Z-Thz-Asp-fmk，Z-(3-F-Val)-Asp-fmk，或Z-(2-Thg)-Asp-fmk.
17.权利要求1的方法，其中在所述动物癌症的化学治疗或放射治疗之后施用所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
18.权利要求1的方法，其中在所述动物癌症的化学治疗或放射治疗期间施用所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
19.权利要求1的方法，其中在所述动物癌症的化学治疗或放射治疗之前施用所述半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
全文摘要
公开了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂在治疗、改善和预防化学疗法和放射疗法期间非癌细胞死亡以及治疗和改善癌症化学疗法和放射疗法的副作用方面的用途。
文档编号A61P35/00GK1379785SQ00814210
公开日2002年11月13日 申请日期2000年10月12日 优先权日1999年10月12日
发明者E·威伯, G·B·米尔斯, D·R·格林 申请人:西托维亚公司